Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Теоретическое обоснование, экспериментальное подтверждение путей передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота, усовершенствование методов диагностики и мер борьбы с ним

На правах рукописи

Галеев Рафаил Фаррахович

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ, ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ПУТЕЙ ПЕРЕДАЧИ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ И МЕР БОРЬБЫ С НИМ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Казань 2000

Работа выполнена в лаборатории гемобластозов и иммуномодуляторов Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина, в комплексной лаборатории по изучению лейкозов и злокачественных опухолей сельскохозяйственных животных Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко и Башкирском государственном аграрном университете.

Научные консультанты -

Официальные оппоненты -

доктор биологических наук, академик РАСХН, профессор Воронин Е.С

доктор ветеринарных наук, профессор Гулюкин М.И.

доктор ветеринарных наук, профессор Госманов Р.Г.

доктор ветеринарных наук, профессор Смирнов П.Н.

доктор медицинских наук, профессор Поздеев O.K.

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ (Нижний Новгород)

Защита состоится « {Су> ¿¿у?2000 г. в -7/^'часов на заседании диссертационного совета Д-120.22.01 при Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана (420074, г. Казань, ул.Сибирский тракт 35, КГАВМ)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана

Автореферат разослан «Х^^» 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доцент Муллахметова P.P.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы. Лейкоз крупного рогатого скота -хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, наносящая значительный экономический ущерб животноводству и представляющая потенциальную опасность для генофонда племенного и молочного стада (Л.К. Эрнст, В.П. Шишков, 1984; В.М.Авилов, В.М.Нахмансон, 1995; М.З.Хайруллин, 1998; Ф.Ф Хисамутдинов, 1997; Н.И.Петров, 1997 и др.). Этиологическим агентом лейкоза является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) - представитель семейства Retroviridae (Р.А.Кукайн и др., 1976; М.И.Парфанович и др., 1974; В.П.Шишков, 1977; В.А.Крикун, 1999; Miller et al., 1969; Ferrer et al., 1971; и др.) Благодаря наличию в своем составе уникального фермента - РНК-зависимой ДНК полимеразы (ревертазы), геном ВЛКРС может полностью или частично интегрироваться с геномом клетки-хозяина и долгое время существовать в форме провируса (Klintevoll, 1995). В этот период, который может продолжаться от нескольких месяцев до нескольких лет, у животных не наблюдается никаких признаков заболевания, включая отсутствие антител (Р.А.Кукайн и др., 1982; В.М.Нахмансон, 1986), поэтому особо важное значение приобретает выявление как специфических антител, так и самого вируса лейкоза (В.П.Шишков, Л.Г.Бурба, 1983; ИН.Смирнов, 1991; АВ.Валихов, 1992, 1994; Н.В.Кузнецова, 1997; Kleitevall et al., 1994; Oie, 1996). В последние годы в нашей стране и за рубежом разработаны и рекомендованы иммунологические методы (реакция диффузионной иммуиопреципитации, реакция непрямой гемагглютинации, ELISA и др.) выявления животных, инфицированных ВЛКРС (Л.Г.Бурба, А.Ф.Валихов, 1976; А.Ф.Валихов и соавт., 1977; П.Н.Смирнов, 1991; А.Ф.Валихов, 1992; П.Н.Смирнов и соавт., 1996, 1997). Следует заметить, что каждая из этих реакций в отдельности выявляет неодинаковое число положительно реагирующих животных. Наиболее полное выявление инфицированных ретровирусом животных достигается путем комплексного исследования их с помощью разных методов (Г.Ф.Коромыслов и соавт., 1979). Перспективными лабораторными методами, которые также направлены на выявление антител к главному внутреннему белку р24 и к гликопротеиду (gp 51) оболочки ретровируса по мнению Burny et al., (1985,1988) являются реакция длительного связывания комплемента (РДСК) и иммуноферментный анализ (ИФА). Для получения антигенов вируса лейкоза используют культуры клеток эмбриона овцы (ПЭО), тимуса эмбриона коровы (ТЭК), селезенки эмбриона коровы (СЭК), персистентно продуцирующих вирус лейкоза (Л.Г.Бурба и соавт., 1976; В.А. Крикун, 1976). Перед исследователями в этом плане стоит задача поиска новых подходов в более полном выделениг; вирусспецифических белков из культуральных жидкостей при получении антигенов ВЛКРС, последующей их очистки с целью приготовления диагностических препаратов высокой специфичности. Важно выяснение оптимальных сроков культивирования после засева клеток, способы их

культивирования, концентрация клеточной взвеси на единицу объема, применение различных методов обогащения сред и схем культивирования.

Почти на протяжении века ученые многих стран проводили исследования по изучению этого заболевания и лишь 1969 год вошел в историю как год открытия вируса лейкоза крупного рогатого скота - ВЖРС (Miller et al, 1969; Ferrer, 1980). В последующих работах детально изучена морфология и морфогенез вируса и установлена его онкогелная активность. Так, экспериментами на телятах доказана инфекционность и лейкозогенность BJ1KPC (Л.Г.Бурба и соавт., 1976; В.П.Шишков, 1977). Установлено также, что к ВЖРС чувствительны овцы (Olsen et al, 1978, Л.Г.Бурба, А.А.Кунаков,1983), козы (Ressang, 1976), свиньи (Г.П.Ефремов с соавт., 1979). Однако остаются неизученными чувствительность к ВЖРС лабораторных животных (кроликов) и возможность использования их для выделения, культивирования вируса, получения гетерологичных иммунных сывороток и других целей.

Показано, что болезнь появляется в хозяйствах, в основном, после ввоза племенного молодняка из стад, неблагополучных по этому заболеванию (Л.Г.Бурба, 1979). Однако пути заражения, выделения и распространения ВЖРС остаются еще мало изученными. Представляет большой интерес вертикальная (пренатальная) передача ВЛКРС от матери плоду. К началу наших исследований имелись лишь отдельные предварительные сообщения о внутриутробной передачи ВЛКРС плоду (Ferrer, 1976; Piper et al., 1979; В.М.Нахмансон и др.,1981), не изучены механизм и частота этого пути передачи вируса и степень значения его в плане оздоровления хозяйств от лейкозов.

Остается нерешенным вопрос о роли молозива и молока как факторов передачи ВЛКРС потомству и в образовании у телят колострального иммунитета. Не выяснена эпизоотологическая роль овец как источника распространения ВЖРС горизонтальным путем. Имеются единичные сообщения о создании препаратов для активной специфической иммунопрофилактики крупного рогатого скота (М.И.Парфанович и соавт., 1980, 1981, 1982; В.М.Жданов и др., 1979, 1983; Л.Г.Бурба и др., 1981;. Р.А.Кукайн и соавт., 1980; Miller et al., 1978, 1983). Однако эти сообщения до последнего времени остаются дискутабельными и требуют дальнейшего экспериментального изучения.

Борьба с лейкозом крупного рогатого скота находилась в прямой зависимости от степени изученности данного заболевания и существующих методов распознавания болезни. Фактически, систематическая борьба с лейкозом крупного рогатого скота началась после разработки прижизненного гематологического метода диагностики - "лейкозного ключа" (Götze et al., 1954). Путем гематологического исследования поголовья скота в хозяйствах, выявляли больных лейкозом и сдавали на мясо. Этим же методом выяснялась эпизоотическая ситуация по данной болезни. Впервые противолейкозные мероприятия на государственном уровне были проведены в Дании с 1959 по 1978 гг. В течение 5-6 лет было ликвидировано более 600 неблагополучных по

лейкозу ферм с убоем более 35 тыс. животных (Вепйхееп, 1963, 1973; ПеизЬиг;*, 1982). В нашей стране с индустриальным типом ведения животноводства оздоровительные мероприятия имеют свои особенности, определяемые прежде всего высокой концентрацией поголовья в хозяйствах (А.Т.Шиков, 1975; Г.А.Симонян, 1984). Широкое распространение лейкозной инфекции, отсутствие достаточного количества здоровых животных для замены поголовья неблагополучных по лейкозу стад и средств для компенсирования убытков хозяйствам при ликвидации стад, вынудили разрабатывать в нашей стране более приемлемые методы оздоровления (Г.А.Симонян, 1985; В.А.Крикун с соавт., 1984; Г.А.Симонян с соавт., 1988, 1990; Л.Г.Бурба, 1985; В.П.Шишков и соавт., 1988; П.Н.Смирнов и соавт., 1989, 1991; Ю.А.Симоварт, 1991; Ф.Ф.Хисамутдинов, 1994, 1996; М.З.Хайруллин, 1998).

В настоящее время почти во всех областях, краях и республиках РФ разрабатываются и утверждаются комплексные планы по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота (В.М.Авилов, 1990; В.А.Седов, 1990; В.М.Авилов, В.М.Нахмансон, 1995; Н.И.Петров, 1999). Эпизоотологическими наблюдениями была установлена прямая корреляция между частотой инфицированности животных ВЛКРС и числом выявляемых гематологически больных лейкозом животных. Наряду с общими закономерностями заноса и распространения ВЛКРС и общепринятыми методами проведения противолейкозных мероприятий, в каждом регионе и, даже хозяйстве, имеются свои особенности, вносящие коррективы в выяснения эпизоотической ситуация искоренения лейкоза.

Исходя из этого, представляет большой научный и практический интерес установить сроки оздоровления стад с использованием серологических методов в зависимости от степени пораженности поголовья лейкозом и ВЛКРС, породы животных, технологии ведения животноводства и методов осуществления противолейкозных мероприятий.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось научно-теоретическое обоснование и экспериментальная проработка важнейших иммунологических аспектов передачи вируса и антител потомству от коров, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, совершенствование методов и средств диагностики, мер борьбы и профилактики заболевания.

В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи:

1.2.1. Разработать новые технологии культивирования перевиваемых клеточных линий, хронически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, для получения гликопротеидного и полипептидного антигенов ВЛКРС для постановки серологических реакций.

1.2.2. Разработка и усовершенствование лабораторных .методов диагностики лейкоза:

- провести исследования по выяснению чувствительности к ВЛКРС овец и кроликов и возможности использования их в качестве биологической модели

в биопробе для выявления ВЖРС в различных материалах, содержащих этот вирус;

- разработать новые иммунологические методы - РДСК и ИФА для выявления специфических антител в сыворотке крови инфицированных ретровирусом коров и провести сравнительное изучение их чувствительности с РИД, а также гематологическим методом;

1.2.3. Изучить иммунологические аспекты передачи вируса и антител потомству от коров и овец, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота:

- изучить пренатальное заражение телят и ягнят, родившихся от матерей, больных лейкозом или только инфицированных ВЛКРС, и выяснить механизм внутриутробной передачи вируса лейкоза от коров и овец потомству;

- определить роль молозива и молока как факторов передачи ВЛКРС телятам и ягнятам, образование и напряженность колострального иммунитета у телят.

1.2.4. Изучить возможность получения иммуногенного для телят и обладающего защитным действием инактивированного препарата из ВЖРС, накопленного в перевиваемой культуре клеток ПЭО.

1.2.5. Изучить особенности распространения онкорновирусной инфекции и лейкоза крупного рогатого скота в различных территориально-географических зонах Республики Башкортостан и на основе полученных данных разработать и реализовать в условиях производства комплексную научно-обоснованную систему оздоровительно-профилактических мероприятий по лейкозу.

1.3. Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые отработаны условия и сроки стационарного и роллерного культивирования линии клеток ПЭО, ТЭК и СЭК-продуцентов ВЖРС, предложены оптимальные концентрации клеточной взвеси, объемы питательной среды и методы их обогащения. Были изучены и предложены для производства препаративного количества диагностикумов ВЖРС благоприятные режимы культивирования и питания клеток с использованием микроносителей, выяснены возможности культивированы клеточных линий в условиях суспензии. При этом была осуществлена разработка технологии культивирования клеток с периодической сменой среды, позволяющая сократить расход дорогостоящей сыворотки крови эмбрионов коров и заменить ее сыворотками крови овец, телят, лошадей, коров. Проведена оценка эффективности осаждения белков ВЛКРС из культурапьных жидкостей сульфатом аммония, полиэтиленгликолем, методом фазовых систем при различных режимах центрифугирования в сравнении с ультрафильтрацией. Были изучены и предложены оптимальные методы осаждения и центрифугирования (без применения дорогостоящих импортных ультрацентрифуг), очистки, концентрирования ВЛКРС и дана сравнительная оценка продукции антигенов вируса лейкоза клетками ПЭО, ТЭК и СЭК при различных методах и режимах. Разработаны методы обнаружения

специфических антител - РДСК и ИФА с применением в качестве антигена гликопротеид 51 ретровируса, изучена их специфичность и активность по сравнению с РИД, а также гематологическим методом выявления больных животных. Предложено использование кроликов как чувствительной биологической модели для выделения ВЛКРС из материала (кровь, суспензия органов и тканей), содержащего вирус. Экспериментально доказано пренатальное заражение телят, родившихся от коров, инфицированных ВЛКРС, и установлено, что частота внутриутробной передачи ВЖРС от матери плоду зависит от стадии болезни и наблюдается, в основном, при клинико-морфологическом проявлении лейкозов у матерей. Показано, что степень внутриутробной передачи вируса лейкоза плодам среди животных отдельных семейств была существенной, пренатальное заражение отмечалось у дочек и внучек, а также у телят, родившихся от одной и той же матери, в течение нескольких отелов. Пренатальное заражение телят происходит посредством лимфоцитов матери, содержащих ВЛКРС, проникающих через плаценту а различные сроки развития плода. При заражении плода на ранней стадии развития до образования компетентной иммунной системы отмечается толерантность организма плода ВЛКРС.

Установлено, что телята и ягнята, родившиеся от больных лейкозом или инфицированных ВЛКРС матерей, при подсосном методе выращивания получали с молозивом антитела, предохраняющих их от заражения в течение 45 месяцев при совместном содержании с инфицированными животными. Среди телят с колостральным иммунитетом 60% животных предохранялось от заражения после подкожного введения им ВЛКР.

Овцы, у которых после заражения ВЛКРС развивался инфекционный процесс без клинико-морфологического проявления лейкоза, не передавали пренатапьно вирус ягнятам. У овец не отмечали горизонтальной (контактной) передачи ВЛКРС при длительном совместном содержании здоровых и инфицированных животных.

Показана способность инактивированного ВЛКРС, накопленного в перевиваемой культуре клеток ПЭО, вызвать у телят иммунную реакцию и устойчивость к заражению вирулентным вирусом.

Изучены особенности распространения болезни, выявлены тенденции проявления эпизоотического процесса лейкоза в районах Республики Башкортостан. Установлены причины неодинаковой пораженности животноводческих ферм и тенденции к широкому распространению ВЛКРС и болезни. Изучена степень прогрессивного нарастания числа больных и инфицированных ВЛКРС животных в зависимости от их возраста. Усовершенствована система различных вариантов оздоровления неблагополучных по лейкозу хозяйств в зависимости от степени поражения стад, включая организационно-хозяйственные и специальные ветеринарио-санитарныс мероприятия с учетом категории хозяйств. Показана эффективность использования в системе противолейкозных мероприятий методов раннего выявления инфицированных и больных лейкозом животных.

1.4. Практическая значимость работы. Крупномасштабные комплексные эпизоотологические, клинико-серологические,

экспериментальные исследования позволили разработать и внедрить следующие практические предложения:

- разработана и освоена технология серийного производства антигена BJ1KPC путем усовершенствования культивирования клеток-продуцентов вируса лейкоза, применения новых питательных сред, использования сывороток крови различных видов животных при культивировании хронически инфицированных BJIKPC клеток. Эти данные вошли в следующие разработки: "Методические рекомендации по использованию сыворотки крови молодняка крупного рогатого скота, свободного от ретровируса лейкоза для наработки гликопротеидного антигена" (одобрены Ученым Советом ВИЭВ 4.04.1983г); "Методика по изготовлению и контролю гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для постановки реакции иммунодиффузии" (утв. ВАСХНИЛ, 1991); "Авторское свидетельство № 1378113 "Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для диагностических целей" (1987);

разработаны, усовершенствованы и освоены лабораторные методы (РИД, РДСК, ИФА) для выявления специфических антител в сыворотке крови инфицированных ретровирусом животных. Рассмотрены и утверждены секцией отделения ветеринарии ВАСХНИЛ "Временные методические рекомендации постановки реакции длительного связывания комплемента в микрообъемах (РДСКМ) для серологической диагностики онкорновирусной инфекции, ассоциированной с лейкозами крупного рогатого скота" (Москва, 1981), "Методика по изготовлению и контролю гликопротеинового антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для постановки реакции иммунодиффузии" (утв. Ученым Советом ВИЭВ, Москва, 1987), "Методические рекомендации по постановке реакции иммунной диффузии в агаровом геле" (утв. методической комиссией БГАУ, Уфа, 1998); "Временное наставление по применению РДСК для выявления специфических антител к возбудителю лейкоза (в порядке производственной апробации)"- (утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 30 августа1999 г.); "Временное наставление по применению набора компонентов для выявления методом ИФА специфических антител к возбудителю лейкоза (в порядке производственной апробации)" - (утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 30 сентября 1999 г.).

показана чувствительность кроликов к вирусу лейкоза крупного рогатого скота и возможность использования их для выделения вируса из материала от инфицированных животных и длительного культивирования его в организме гетерологичных животных;

- установлена внутриутробная передача вируса лейкоза телятам и степень их инфицированности, которая связана со стадией и тяжестью болезни у матери, что подтвердила необходимость удаления из хозяйств коров с высоким лимфоцитозом, как животных с повышенным риском внутриутробной передачи вируса потомству;

установлена продолжительность пассивного (колострального) иммунитета у телят и ягнят, родившихся от матерей, больных лейкозами, :понтанно или экспериментально инфицированных ретровирусом и дана количественная характеристика титра антител в динамике с использованием РИД, РДСК. Путем скармливания телятам в первые дни жизни молозива, :одержащего колостральные антитела против ВЛКРС, можно профилактировать их заражение вирусом лейкоза в течение 4-5 месяцев. Изолированное выращивание телят, свободных от ретровируса, но родившихся зт инфицированных ретровирусом матерей до исчезновения колостральных штител, является одним из мер борьбы с лейкозами крупного рогатого скота.

Полученные новые научные данные и данные эпизоотологических наблюдений по выяснению причин появления и распространения вирусной инфекции, эффективности оздоровительных противолейкозных мероприятий позволили разработать и внедрить в производство: "Программу профилактики л борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в хозяйствах, промышленных сомплексах и станциях искусственного осеменения Калужской области на 1983-1988 гг" (одобрена коллегией управления сельского хозяйства Калужского зблисполкома. Калуга, 1983)"; "План организационно-хозяйственных, 5етеринарно-санитарных и специальных мероприятий по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Башкортостан на 1997-2000 годы" (согласовано Заместителем Министра :ельского хозяйства и продовольствия и утв. Начальником Управления зетеринарии МСХиП Республики Башкортостан).

1.5. Основные положения диссертации выносимые на защиту.

1. Результаты разработки технологий культивирования перевиваемых чиний клеток, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, для юлучения гликопротеидного и полипептидного антигенов ВЛКРС с целью тостановки серологических реакций.

2. Результаты разработки РДСК и непрямого варианта шмуноферментного анализа (ИФА) для выявления специфических антител к ЗЛКРС в сыворотке крови крупного рогатого скота и их сравнительная оценка ; РИД, а также гематологическим методом.

3. Результаты изучения чувствительности к ВЛКРС телят, овец и сроликов и возможности использования их в качестве биологической модели 1ля выявления вируса в патологическом материале.

4. Пути и факторы передачи ВЛКРС и их значение в эпизоотическом 1роцессе лейкоза крупного рогатого скота.

5. Особенности распространения онкорнавирусной инфекции и лейкоза срупного рогатого скота в различных административно-географических зонах 'еспубликиБашкортостан.

6. Нучно-обоснованная усовершенствованная система борьбы с лейкозом срупного рогатого скота, результаты её испытания в модельном районе РБ.

1.6. Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и одобрены на научных конференциях и симпозиумах: Всесоюзной научной конференции "Распознавание и меры борьбы с лейкозом человека и животных" (Белая Церковь, 1982); Республиканской научно-производственной конференции "Современные проблемы профилактики и лечения зоонозных заболеваний и лейкозов" (Гродно, 1982); II съезде гематологов и трансфузиологов, Москва, 1985; Республиканской научно-производственной конференции "Диагностика, профилактика и борьба с лейкозом крупного рогатого скота (Персиановка, 1986); Республиканской конференции "Теоретические и практические вопросы ветеринарии" (Тарту, 1987-1990); Республиканской конференции "Ветеринарная медицина, экономические, социальные и экологические проблемы" (Харьков, 1990); Республиканской конференции "Состояние и пути развития животноводства в Республике Башкортостан" (Уфа, 1994, 1995, 1997, 1998).

1.7. Публикации. По теме диссертации опубликовано 58 научных работ, в том числе монография: Вирус лейкоза крупного рогатого скота (культуральные, инфекционные и иммуногенные свойства), Уфа, 1999, 152 с.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы из источников и приложений.

Материал изложен на страницах машинописного текста, иллюстрирован таблицами и рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Объем работы и методы исследований находились в зависимости от поставленных задач:

1. Гликопротеидный антиген ВЛКРС для серологических исследований зарабатывали методом культивирования клеточных линий в нашей модификации. В работе использовали культуры клеток почки эмбриона овцы (ПЭО), хронически инфицированную вирусом лейкоза крупного рогатого скота, полученную из США, а также культуру клеток тимуса эмбриона коров ТЭК-76 МВА, персистентно продуцирующих ВЛКРС. Размножение культур клеток проводили методом стационарного культивирования в плоских 1,0-литровых матрасах, роллерных установках, а также на роллерных установках с применением микроносителей "Цитолар" (НПО "Биолар" СССР) и "Цитодекс-1" ("Фармация", Швеция). При культивировании клеток использовали питательные среды ГЛА, 199, Игла, МЕМ-4, сыворотки крови эмбрионов коров, а также сыворотки телят, лошадей, овец в различных соотношениях. В качестве антибактериальных средств применяли антибиотики: стрептомицин, неомицин, каиамицин. Проведено более 300 пассажей клеток ПЭО, 200 пассажей культуры клеток ТЭК. Наработано более 1,5 млн. доз антигена ВЛКРС для РИД, РДСК и ИФА.

2. Постановку реакции длительного связывания комплемента (РДСК) для выявления антител к вирусу лейкоза осуществляли в описании В.П.Шишкова и др. (1980) в нашей модификации. В РДСК использовали антиген приготовленный нами из культуральной жидкости клеток ПЭО, в которую добавляли тритон Х-100 в конечной концентрации 0,1%. Культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 1500-2000 об/мин в течение 30 минут. В опытах применяли микрометод РДСК с использованием микротитратора Такачи. В РДСК были исследованы сыворотки крови 1235 гол. крупного рогатого скота, в том числе 47 гол. экспериментально зараженных вирусом лейкоза.

3. Постановку реакции иммунодиффузии проводили в описании Л.Г.Бурбы, А.Ф.Валихова (1977). В качестве преципитирующего антигена использовали гликопротеидный антиген ВЛКРС, приготовленный нами из хронически инфицированной культуры клеток ПЭО. Самостоятельно и с участием сотрудников ветеринарных лабораторий Калужской области и Республики Башкортостан в РИД исследовали и проанализировали более 1 млн. проб сывороток крови животных.

4. Гематологические исследования крупного рогатого скота проводили по общепринятым методам. Гематологические показатели у телят до 12 месячного возраста оценивали исходя из физиологической нормы, которые приведены в работах В.Н.Никитина (1956) и М.И.Гулюкина (1978). Взрослые животные (коровы) по результатам серологических (РИД) и гематологических исследований распределялись в соответствии со стадийностью лейкозного процесса, разработанной Г.А.Симоняном (1975). В число этих групп входили животные:

- здоровые, свободные от антител к ВЛКРС (контроль);

- инфицированные ВЛКРС (антитела имеются) с нормальными показателями крови (от 5500 до 9000 лейкоцитов в 1 мкл);

- находящиеся в предлейкозном состоянии (с количеством лейкоцитов от 10,1 до 14,0 тыс/мкл);

- находящиеся в начальной стадии лейкоза (с количеством лейкоцитов от 14,1 до 40,0 тыс/мкл при отсутствии клинических симптомов лейкоза);

- находящиеся в развернутой стадии лейкоза (с количеством лейкоцитов свыше 40,0 тыс /мкл);

- находящиеся в конечной стадии лейкоза (с наличием клинических симптомов и патологоанатомических изменений, характерных для лейкоза).

5. Иммуноферментный анализ (ИФА) по определению специфических антител осуществляли в непрямом варианте на полистироловых планшетах для иммунологических реакций производства "Медтехника" (Москва). В качестве специфического антигена для сенсибилизации планшет использовали антиген для РИД и РДСК, полученный нами из клеток ПЭО, хронически продуцирующей ретровирус. Предварительно вируссодержащую культуральную жидкость инактивировали при +56°С в течение 30 минут. Концентрацию активного гликопротеида в полученном материале определяли

методом радиальной иммунодиффузии в сравнении с препаратом очищенного гликопротеида с известной концентрацией белка (П.Н.Смирнов, 1991). Концентрация гликопротеида в препарате была доведена до 70-100 мг в мл. Результаты ИФА учитывали визуально по разнице окраски продукта реакции в опытных и контрольных отрицательных лунках, а также инструментально на спектрофотометре фирмы "Flow laboratories" при длине волны 492 нм. При этом результат считали положительным, если отношение оптической плотности положительного образца к оптической плотности отрицательного образца (Коэффициент специфичности - Ксм) был не ниже 2. Уровень антител в сыворотках крови животных параллельно определяли в РДСК.

6. Опыты по экспериментальному воспроизведению (биопроба) проводили с участием к.в.н. Мурватуллоева С.А. на 30 телятах, черно-пестрой породы, в возрасте 5-6 месяцев, на 53 овцах 1,5-2 лет породы прекос и 48 кроликах.

Подопытным животным вводили лейкоконцентрат от больной лейкозом коровы: телятам подкожно, овцам - внутрибрюшинно, кроликам -внутривенно. Животных исследовали гематологическими и серологическими методами до введения лейкоконцентр'ата и после до 120 дней (овец и телят) и 35 дней - кроликов.

7. С целью изучения возможности и частоты вертикальной (пренатальной), а также молозивом и молоком передачи BJIKPC потомству нами в течение четырех лет были проведены четыре опыта на крупном рогатом скоте лейкозного изолятора ВИЭВ.

В первом опыте были использованы 21 корова и один трехлетний бык-производитель, инфицированный BJIKPC, во втором - 16 коров и бык-производитель из предыдущего опыта, в третьем опыте - 18 коров и бык-производитель, свободный от BJIKPC, в четвертом - 17 коров и бык-производитель из третьего опыта..Все коровы, находившиеся в опытах, были инфицированы вирусом лейкоза, и у них методом биопробы на овцах в крови выявляли BJIKPC.

Всего в четырех опытах было использовано 40 коров и два быка производителя. Осеменение коров было естественное. При этом за четырехлетний период родилось 72 теленка, У двух коров наблюдали по четыре отела, т.е. они были использованы в четырех опытах, у 6 коров - по три отела, у 14 коров - по два отела и у18 коров - по одному отелу,

Животные в каждом опыте по гематологическим показателям были разделены на три группы: с нормальным количеством лейкоцитов в крови, гематологически подозрительные на лейкоз, с характерным для лейкоза персистентным лимфоцитозом.

Родившихся телят до 7-8 месячного возраста содержали совместно с матерями, используя подсосный метод выращивания, затем на привязи в одном помещении со взрослыми инфицированными BJIKPC животными.

У телят после рождения перед первым скармливанием молозива в первые 10 часов жизни в крови определяли наличие антител в РИД с гликопротеидным

антигеном ВЛКРО. Одновременно с целью выявления вируса кровь телят вводили интраперитонеально здоровым свободным от ВЛКРС овцам 8-12-месячного возраста. Овец содержали в отдельном помещении. Овец, на которых ставили биопробу, исследовали ежемесячно в течение трех месяцев на наличие антител к ВЛКРС с помощью РИД. За телятами наблюдали до 12-месячного возраста. Серологические (РИД) и гематологическое исследование их проводили один раз в три месяца.

Для изучения возможности передачи ВЛКРС с молоком больных коров опыты проводили на 15 клинически здоровых ярках 8 месячного возраста. В качестве доноров молока служили больные лейкозом коровы (содержание лейкоцитов в пределах 37,3-45,9 тыс/мкл). Подопытным овцам клеточные суспензии молока вводили внутрибрюшинно и они находились под наблюдением в течение 3-х месяцев. При этом проводили клинико-гематологические и серологические исследования на лейкоз.

8. Персистентцию колостральных антител в сыворотке крови у телят и их восприимчивость к ВЛКРС изучали на 30 телятах, родившихся от спонтанно инфицированных коров в условиях лейкозного изолятора ВИЭВ. Клинико-гематологические и серологические исследования телят проводили до приема молозива и через 1, 3, 7, 10, 15 дней после рождения, а в последующем - через двухнедельный интервалы. Телят содержали совместно с матерями в одном помещении в течение 10 месяцев.

9. Для изучения выработки антител в организме телят на введение инактивированного ВЛКРС и сроки их персистирования были подобраны телята 5-6 месячного возраста, свободные от онкорновирусной инфекции. Было проведено три серии опытов на 68 телятах черно-пестрой и швицкой породы скота. Для получения иммуногенного препарата использовали культуры клеток, хронически инфицированные ВЛКРС. Культуральные вируссодержащие жидкости концентрировали не менее 100 раз и тестировали в РИД. В качесте адъювантов использовали минеральное масло с ланолином и гидроокись алюминия. Исходя из задачи опыта препарат вводили в различных дозах одно,-двух,- и трехкратно и по различной схеме. Иммунологическую перестройку организма телят определяли по выявлению специфических антител с помощью РИД и РДСК, а также путем введения им вируссодержащих лейкоцитов в количестве 1, 2, 10 и 50 заражающих доз. За подопытными животными наблюдение вели в течение 12 месяцев.

10. При изучении эпизоотологических особенностей лейкоза крупного рогатого скота использовали ретроспективные, перспективные и экспериментальные приемы и способы исследований (М.Г. Таршис и др., 1975; И.А. Бакулов и соавт., 1975). Материалом для исследований служили многолетние данные ветеринарной статистики в Калужской области и Республике Башкортостан о выделении больных лейкозом животных и движении неблагополучных пунктов по результатам клинических, гематологических и патоморфологических исследований скота, а также зетеринарно-санитарной экспертизы убойных животных.

Непосредственно в 155 хозяйствах Калужской области и Республике Башкортостан проведены клинико-эпизоотологические исследования более 170 тыс. гол. крупного рогатого скота. При изучении эпизоотологии инфекции ВЛКРС серологическими методами обследованы животные племпредприятий и других хозяйств.

Разработку программ оздоровления хозяйств Республике Башкортостан от лейкоза крупного рогатого скота осуществляли путем разделения хозяйств по степени инфицированности животных ВЛКРС и клинического проявления болезни (В.М.Нахмасон, 1988; П.Н. Смирнов и соавт., 1992; Г.А.Симонян и соавт., 1993; В.К. Двойников, П.Н.Смирнов, 1994; Ф.Ф.Хисамутдинов, Г.А.Симонян, 1995; В.М.Авилов, В.М. Нахмасон, 1995).

Цифровой материал обрабатывали статистически с вычислением стандартной ошибки и доверительных интервалов среднеарифметических величин по М.А.Плохинскому (1971).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Результаты разработки технологий культивирования перевиваемых линий клеток, хронически инфицированных ВЛКРС, для получения гликопротеидиого антигена с целью постановки серологических реакций

В работе широко использовались культуры клеток ПЭО, ТЭК, СЭК нескольких ответвлений, персистентно продуцирующих вирус лейкоза. Проведено более 300 пассажей клеток ПЭО, 200 пассажей культуры клеток ТЭК и 25 пассажей клеток СЭК. Проведенные исследования позволили отработать оптимальные условия роллерного культивирования клеток (объемы питательной среды, концентрация клеточной взвеси сроки культивирования, сыворотки, методы обогащения). Нами установлено, что для хорошего роста клеток, образования сплошного монослоя необходим следующий объем клеточной взвеси: в 1,0-литровые флаконы - 150 мл, в 5,0 - литровые - 700 мл при концентрации клеток 7 ■ 105 в 1 мл культуральной среды. Расход сывороток при роллерном культивировании был намного меньше, а активность гликопротеидиого антигена, полученного из одного и того же объема и партии культуральной жидкости в два раза выше, чем в стационарных условиях культивирования. Длительное культивирование клеточных культур (более 30 ¡.'ассажей) с добавлением в среды сыворотки крови молодняка крупного рогатого скота, коров, овец без обработки ПЭГом снижает активность клеток, культура утрачивает способность репродукции ВЛКРС. Установили, что при культивировании клеток с добавлением в среды сывороток крови телят (до 10 пассажей) или коров (до 5 пассажей) представляется возможным получить с 1 л культуральной жидкости 1,5-2,0 тыс. доз, а при добавлении сыворотки крови эмбрионов коров 4-5 тыс. диагностических доз гликопротеидиого антигена. При использовании рутинного стационарного метода культивирования сбор вируссодержащей жидкости проводили через 7-10 суток. Нами предложен и опробован новый, более современный метод наработки антигена ВЛКРС без

пересева клеток в обычные сроки, а периодической сменой среды с использованием уже имеющегося монослоя клеток. Так, после образования монослоя клеток (обычно через 4-5 суток) в роллерных флаконах проводили сбор вирусодержащей жидкости, и в эти же флаконы вносили свежую среду. Засев клеток проводили с добавлением в культуральные среды 10% сыворотки крови эмбрионов коров и антибиотиков согласно прописи. В последующем смену среды проводили с добавлением 1-2% сыворотки крови эмбрионов коров и 5-6% сыворотки крови лошадей, овец, коров, но без добавления антибиотиков. Для приготовления антигена для ИФА использовали бессывороточную технологию культивирования, чтобы при очистке антигена потребовалось меньше усилий и получить более качественный диагностикум. Мы выяснили, что смену среды в роллерных флаконах следует проводить в различные сроки в зависимости от объема вносимой среды. Так, при смене среды через 48 часов - 100 мл. Для нового цикла производства антигена таким методом использовали маточную культуру, которая культивировалась параллельно стационарным методом и с использованием только эмбриональной сыворотки. Разработанная нами методика (технология) культивирования клеточных культур с периодической сменой среды позволяет получить вируссодержащей жидкости и антигена ВЛКРС в два раза больше (за единицу времени), чем при обычном методе культивирования. Применение такой технологии культивирования позволило в 5 раз сократить расход сыворотки крови эмбрионов коров, заменить более дешевыми и доступными сыворотками крови лошадей, коров, овец и молодняка крупного рогатого скота и получить экономический эффект в 95 тысяч рублей.

Из культуральной вируссодержащей жидкости, гликопротеидный антиген получали осаждением вирусспецифических белков ПЭГ-115 или сульфатом аммония с конечной концентрацией их в жидкости 20% и 30% соответственно. В дальнейшем перешли на разработанный нами метод осаждения белков путем одновременного применения этих компонентов. Применение комбинированного метода осаждения позволило наиболее полно осаждать вирусные белки и исключить фазу центрифугирования культуральной жидкости на дорогостоящих импортных центрифугах.

Нами использован метод очистки диагностикума высаливанием в диализных мешочках последовательно в дистиллированной воде, 2%-ном растворе хлорида натрия, в трис-буфере по разработанной схеме. Диализ против дистиллированной воды проводили при 4 °С в течение 4-6 часов, против 2%-ного раствора натрия 14-16 часов, против трис-буфера 3-4 часа при постоянном перемешивании растворов. Метод высаливания гликопротеидного антигена ВЛКРС способствует получению более очищенного и активного антигена Проведена сравнительная характеристика активности гликопротеидного антигена, полученного при культивировании клеточных культур ПЭО и ТЭК. Из культуры клеток 11ЭО выход антигена ВЛКРС на 25% больше, чем из клеточных культур ТЭК при одних и тех же условиях культивирования. Обогащение сред дополнительным количеством витаминов и

аминокислот позволило увеличить выход антигена с единицы культуральной жидкости клеток ПЭО и ТЭК нескольких ответвлений на 10-12%.

Активность и специфичность полученного гликопротеидного антигена проверяли методом титрования в реакции имммунодиффузии с применением контрольной положительной сыворотки крови в сравнении со стандартным набором диагностикумов. Пригодным для исследований считали диагностикум, образующий четкую линию преципитации с контрольной положительной сывороткой через 20-24 часа инкубирования чашек Петри с компонентами реакция при 25-27 °С во влажной камере термостата.

Применение современных подходов и методик, в том числе роллерное псевдосуспензионное (на микроносителях) культивирование, позволили нам наработать более 2000 литров культуральной вируссодержащей жидкости, из которой было получено около 1,5 млн диагностических доз гликопротеидного антигена. Кроме того по бессывороточной технологии культивирования был приготовлен антиген в объеме 38 литров.

Необходимым компонентом диагностикумов для проведения серологических исследований на лейкоз крупного рогатого скота является, наряду со специфическим гликопротеидным антигеном ВЛКРС, контрольная положительная (имеющая антитела к ВЛКРС) сыворотка КРС. Нами для получения контрольной специфической сыворотки в одном из хозяйств Калужской области была подобрана группа коров-доноров крови, больных лейкозом или спонтанно инфицированных ВЛКРС. В сыворотках крови подопытных коров на протяжении длительного периода с помощью РИД и РДСК обнаруживали высокие титры антител к вирусу лейкоза. Один раз в месяц от коров-доноров брали по 1000 мл крови, из которой в дальнейшем выделяли сыворотку и проверяли специфическую активность в РИД и РДСК. Проведенные исследования убедительно показали, что специфические антитела в высоком титре к антигену ВЛКРС обнаруживается у спонтанно зараженных вирусом коров, находящихся в стадии персистентного лимфоцитоза. Поэтому научно обосновано применение в диагностическом наборе для постановки РИД к РДСК таких сывороток. Сказанное открывает перспективу использования инфицированных вирусом лейкоза коров в качестве доноров крови.

В целом по итогам исследований нами разработаны и внедрены в производство: "Методические рекомендации по использованию сыворотки крови молодняка крупного рогатого скота, свободного от ретровируса лейкоза, для наработки гликопротеидного антигена"; "Методика по изготовлению и контролю гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для постановки реакции иммунодиффузии".

3.2. Результаты разработки РДСК для обнаружения антител к ВЛКРС и сравнительное изучение ее с РИД, а также гематологическим

методом

Источником ретровируса лейкоза для РДСК и РИД служила хронически инфицированная линия клеток почки эмбриона овцы (ПЭО). Для РДСК

использовали антиген приготовленный нами из культуральной жидкости клеток ПЭО, в которую добавляли тритон Х-100 в конечной концентрации 0,1%. Культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 1500-2000 об/мин в течение 30 минут. Антиген для РИД готовили преципитацией вируса из культуральной жидкости клеток ПЭО 10%-ным полиэтиленгликолем (ПЭГ-115).

В опыте применяли микрометод РДСК с использованием микротитра Такачи. Для определения возможности выявления специфических антител в сыворотке крови с помощью РДСК были взяты 49 коров, которые по гематологическим показателям были распределены на группы:

1 группа: Животные без гематологических изменений - три коровы;

2 группа: Подозрительные на лейкоз животные - две коровы;

3 группа; Больные лейкозом - 44 коровы.

При сравнительном анализе результатов гематологических и серологических исследований в РДСК выяснено, что РДСК оказывалась положительной при повышенном уровне лимфоцитов, тогда как при содержании их в 1 мкл крови в пределах 4-5 тыс. антитела не выявлялись. При этом установлено, что в РДСК титр антител у одной коровы при содержании в 1 мкл крови 6,0 тыс. лимфоцитов был минимальный и составлял 1:4. У четырех коров с абсолютным количеством лимфоцитов в 1 мкл крови от 7 до 13 тыс. титры антител были также минимальными 1:4 - 1:8. С другой стороны, у 5 животных, имеющих от 7 до 15 тыс. лимфоцитов в 1 мкл крови, титры антител в РДСК были равными 1:16. Остальные 39 животных с колебаниями гематологических показателей от 15 до 200 тыс. лимфоцитов в 1 мкл крови имели и титры антител соответственно от 1:16 до 1:64. Эти данные показывают, что имеется корреляция титров антител к ретровирусу лейкоза с гематологическими показателями у спонтанно инфицированных БЛВ животных.

В другой серии опытов было продолжено сравнительное изучение чувствительности РДСК и РИД при исследовании сывороток крови животных со спонтанной и экспериментальной онкорнавирусной инфекцией. В опыт были взяты:

- 10 спонтанно инфицированных онкорновирусом коров и телок, содержащихся в лейкозном изоляторе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ (содержания лимфоцитов свыше 8000 в 1 мкл.);

- 20 телят, рожденных от спонтанно инфицированных онкорновирусом родителей, исследования которых проводили в 15-дневном возрасте. Телята питались молозивом и молоком своих матерей и содержались совместно;

- 17 телят 12-месячного возраста, экспериментально инфицированных онкорновирусом, завезенных из благополучного по лейкозу хозяйства (исследованы через 60 дней после заражения);

- 30 экспериментально инфицированных онкориавирусом овец, содержащихся в отдельном помещении (исследованы через 67 дней после заражения).

Исследования показали, что в сыворотке крови подопытных животных

обнаруживались специфические антитела обеими серологическими методами. При этом в сыворотке крови спонтанно инфицированных коров антитела выявлены в РИД во всех 10 случаях, в РДСК в 9 случаях в титре 1:8 - 1:16 (одна проба была антикомплементарной); в сыворотке крови овец и телят в возрасте 12 мес. экспериментально зараженных ВЛКРС, специфические антитела обнаруживались во всех случаях, при этом титры в РДСК составляли в пределах 1:4-1:32.

Аналогичные, совпадающие результаты в РДСК и РИД были получены и при исследовании 605 коров и 175 овец, принадлежащих неблагополучным по лейкозу хозяйствам (колхоз им.Ленина и совхоз "Лопатинский") Калужской области.

При этом показано, что чувствительность РИД и РДСК по выявлению инфицированного БЛВ крупного рогатого скота одинакова за исключением того, что в РИД положительно реагирующих было на три животных больше, чем в РДСК. В то же время при исследовании сывороток крови овец РДСК оказалась более эффективной, чем РИД. Аналогичные данные получены при исследовании 514 проб сывороток крови коров, принадлежащих ГПЗ "им. Цветкова" Калужской области РФ. Хозяйство неблагополучное по лейкозу в течение 5 лет.

В РИД было выявлено 91,4% положительных и 8,6% отрицательных проб сывороток крови, а в РДСК соответственно 90,4 и 9,6%. Причем из числа положительных проб в титре 1:4 реагировали 11,4% сывороток, в титре 1:8 -20,8%, в титре 1:16-33,5%, в титре 1:32 - 26,2% и в титре 1:64-8,1%.

Таким образом, по результатам проведенных экспериментальных исследований следует констатировать, что РДСК с применением глякопротеидного gp 51 антигена ВЛКРС обладает практически одинаковой чувствительностью с РИД по выявлению инфицированных БЛВ животных. Положительной характеристикой РДСК является возможность определения антител при различном содержании их в сыворотке крови инфицированных ВЛКРС животных. Это обстоятельство открывает перспективу применения РДСК как для выявления больных лейкозом животных, так и вирусоносителей.

Кроме того, наши исследования показали, что титр антител к ретровирусу лейкоза в РДСК у спонтанно инфицированного КРС прямо пропорционален лимфоцитозу, т.е. с увеличением абсолютного количества лимфоцитов титр антител повышается. При патоморфологическом исследовании органов и тканей животных с лимфоцитозом и высоким титром антител к ретравирусу в большинстве случаев установлена опухолевая форма лейкоза. В этом отношении данные исследования подтверждаются сообщением японских ученых, изучающих взаимосвязь уровня антител к БЛВ с опухолевым развитием. Высокий титр антител у больных лейкозом животных (что было подтверждено гистологическим исследованием) может быть результатом перехода ретровирусной инфекции в опухолевую форму болезни. На основе этих данных. Коно и соавт. (1981) делают предположение, что уровень антител может быть одним из маркеров опухолевого развития, вызываемого БЛВ

инфекцией.

На основании результатов собственных исследований разработаны и утверждены: "Временные методические рекомендации постановки реакции длительного связывания комплемента в микрообъемах (РДСКМ) для серологической диагностики онкорновирусной инфекции, ассоциированной с лейкозами крупного рогатого скота" (Утв. отделением ветеринарии ВАСХНИЛ, 1981); "Методические рекомендации по постановке реакции иммунной диффузии в агаровом геле" (Утв. методической комиссией БГАУ, 1998); "Временное наставление по применению РДСК для выявления специфических антител к возбудителю лейкоза (в порядке производственной апробации)" (Утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 августа 1999 г.).

3.3. Результаты разработки иммунноферментного анализа для обнаружения специфических антител к ВЛКРС

При разработке непрямого варианта ИФА для титрования специфических антител при сенсибилизации планшетов использовали антиген для РИД, приготовленный нами из культуралыюй жидкости клеток ПЭО, хронически продуцирующих ретровирус.

Подбор условий иммобилизации антигена изучали при диапазоне рН 7,2... 10,0, используя 0,01М фосфатный и карбонатно-бикарбонатный буферный растворы. Данные исследования показали, что максимальное связывание антигена ВЛКРС с полистиролом отмечается при условии, когда рН буферного раствора равен 9,6. Сдвиг этого показателя в ту или другую сторону приводило к уменьшению адсорбционной способности антигена в лунки. Наши данные согласуются с результатами опытов Н.А.Хисматуллиной (1988), Р.Р.Юсупова (1995) при бешенстве и лихорадки Ку с.-х. животных. При этом наивысшее значение коэффициента специфичности было получено при иммобилизации антигена в количестве 60 мкг/мл в течение 3 ч при +37 °С.

Далее результаты исследований показали, что оптимальным сроком инкубации специфических антител с иммобилизованным антигеном является 2 ч при +37°С. При этом достигается максимальная чувствительность реакции (титр антител в ИФА составил 1:600 при Ксг,1=2,17±0,12; Кс„2=2,21±0,15). В более короткий срок инкубации полного связывания антигена с сыворотками не происходило, а увеличение ее продолжительности не только удлиняло время постановки реакции, но и способствовало появлению фонового окрашивания.

Специфичность, активность и эффективность разработанного варианта ИФА была доказана при исследовании проб сывороток крови короп, находящихся в учебно-опытном хозяйстве Башкирского государственного аграрного университета. Исследования проводили совместно с ведущим специалистом МСХиП РБ Гареевым К.А. В хозяйстве всего 1027 голов крупного рогатого скота, в том числе 380 коров черно-пестрой породы, гематологическое проявление лейкоза нами установленно у 33 голов КРС, в том числе 25 голов коров. Исследованием сывороток крови всего поголовья с помощью РИД выявлено специфические антитела у 626 голов (60,9%), а из 380

коров - у 311, что составляет 82%.

Пробы сывороток крови, содержащие специфические преципитирующие антитела были исследованы в ИФА. Получены положительные, совпадающие результаты. При этом титры в ИФА составляли в пределах 1:400 - 1:1600. В специальной серии опытов были исследован сыворотки крови 25 коров с гематологическими признаками лейкоза с применением РИД, РДСК и ИФА. Установлено, что со всеми тремя методами выявляются антитела. При этом в РДСК титры антител составляли у 6 коров - 1:64, у 16 - 1:32 и у 3 - 1:16. Установлено, что показатели титра в ИФА значительно выше. При титре комплементсвязывающих антител 1:64 - 1:32 показатели в ИФА 1:6400 и выше, при 1:16 титр в ИФА составляет 1:400 - 1:800.

Таким образом разработанный намн вариант ИФА обеспечивает выявление специфических антител наряду с РИД и РДСК, что открывает перспективу использования этого метода в лабораторной практике. На основании изложенного нами разработано "Временное наставление по применению набора компонентов для выявления методом ИФА специфических антител к возбудителю лейкоза (в порядке производственной апробации)" (утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 сентября 1999 г.)

3.4. Результаты изучения чувствительности к ВЛКРС телят, овец и кроликов

В опыт были подобраны 30 голов клинически здоровых бычков в возрасте 5-6 месяцев, которые по серологическим и гематологическим показателям были свободными от ретровируса. Животные были распределены на 4 группы, в первых трех по 7 голов, а в четвертой - 9 голов.

В качестве доноров инфицированных лейкоцитов в МТФ «Торопова» в опыт были взяты коровы, хронически инфицированные ВЛКРС, со следующими показателями общего количества лейкоцитов в 1 мкл: корова инв. № 145 - 21200; корова инв. № 106 - 10500, корова инв. № 81 -7300; корова инв. № 173 - 7100, свободная от ВЛКРС. Все животные черно-пестрой породы. Экспериментальное инфицирование бычков осуществляли кровью коров-доноров в количестве 2500 лейкоцитов подкожно в нижней латеральной поверхности шеи. Первую группу телят заражали кровью коровы-донора № 145, вторую - № 106, третью - № 81, а четвертую группу - № 1731 (контроль).

Исследования показали, что у подопытных телят 1-3 групп на 30-й день после введения им лейкоцитов коров, инфицированных ретровирусом, наблюдается увеличение содержания лейкоцитов в периферической крови, которое сопровождалось выработкой специфических антител. Так, к этому сроку исследований преципитирующие антитела к ВЛКРС были обнаружены у 14 из 21 зараженных. При этом положительно реагировали по 5 животных в 1 и 2 группах и четыре животных в третьей группе. В последующие сроки (60-й день) антитела выявились у всех телят первой группы и по 5 животных второй и третьей группах. У контрольных животных, которым вводили лейкоциты интактных коров антитела к ВЛКРС не выявлены.

Таким образом, исследования подтверждают имеющиеся данные о возможности использования телят для выявления ВЛКРС в лейкоцитах коров, подозрительных в заражении ретровирусом.

Для подтверждения восприимчивости овец к ВЛКРС в опыт были взяты 53 головы породы прекос в возрасте 1,5-2 лет. 45 овцам внутрибрюшинно ввели кровь больной лейкозом коровы в количестве 5 мл, а 8 овцам - лейкоцитарную массу клинически здоровой коровы в той же дозе.

Клинические наблюдения за подопытными животными вели в течение 120 дней после введения биоматериалов. Гематологические и серологические исследования проводили в 30-35, 60-65 и 100-120 дни опыта.

Результаты исследований показали, что подопытные животные оставались клинически без видимых изменений; гематологические показатели инфицированных и контрольных овец оставались в пределах физиологической нормы в течение всего периода опыта.

Серологическими исследованиями установлено, что после внутрибрюшинного введения овцам нативной крови крупного рогатого скота, инфицированного ретровирусом, антитела выявляли с помощью РДСК на 30-35 день в титре 1:4. В РИД такие сыворотки давали слабоположительную реакцию и при учете реакции их трудно было отдифференцировать от отрицательных сывороток. В более поздние сроки после заражения сыворотки крови от этих животных в РИД формировали хорошо видимую полосу преципитации.

Титры антител в сыворотках крови инфицированных ретровирусом овец были относительно невысокими и, как правило, не превышали!: 16, но обнаруживались у всех зараженных животных. Через 30-35 дней после инокулирования овцам вируссодержащего материала титр антител состазлял в РДСК 1:4, спустя 60-65 дней -1:8, а через 100-120 дней достигал 1:16. Если сравнить титры антител в сыворотках крови крупного рогатого скота и овец при экспериментальной инфекции, то динамика развития иммунного ответа у этих видов животных во многом сходна.

Таким образом, в этих опытах была показана возможность использования овец в качестве биологической модели для обнаружения ВЛКРС в лейкоцитах инфицированных коров. Наши данные подтверждают результаты исследований в этом плане ряда исследователей (Л.Г.Бурба и сотр., 1976; В.П.Шишков, 1977; Л.Г.Бурба, А.А.Кунаков, 1983; Olson etal, 1978).

С целью изучения восприимчивости кроликов к ВЛКРС был поставлен опыт на 48 кроликах. Опыты проводились совместно с к.в.н. Мурватуллоевым С.А. При этом 31 животное было инфицировано лейкоцитами коров-доноров и их плодов, сыворотки крови которых содержали антитела к ВЛКРС. Лейкоцитарную массу в дозе 1 мл вводили внутривенно. Пять кроликов были заражены лейкоцитами, взятыми у ягнят с колостральными антителами. 10 кроликов были заражены лейкоцитами крови коров и их плодов, в сыворотке крови которых антитела к ВЛКРС не были выявлены. Двум кроликам было введено по 1 мл физиологического раствора.

Исследования показали, что в сыворотке крови кроликов, которым

вводили лейкоцитарную массу от больных лейкозом коров, обнаруживаются специфические антитела, выявляемые в РИД, начиная с 21 дня после заражения. Титр антител в РДСК в эти сроки составляла в пределах 1:2 - 1:4; через 35 дней после заражения специфические антитела выявлялись уже в титрах 1:8 - 1:16.

В тоже время, в сыворотке крови кроликов, которым вводили лейкоциты крови пяти ягнят с колостральными антителами, специфические к ВЛКРС антитела не выявлены во все периоды исследования. Следовательно ягнята были свободными от ВЖРС.

Следует отметить, что биопробой на кроликах выявлено наличие ВЛКРС в лимфоцитах пятимесячного плода коровы, инфицированной вирусом лейкоза, при отсутствии вирусспецифических антител в сыворотке крови плода.

Таким образом, нами экспериментально доказано, что метод выявления ВЛКРС на кроликах в лимфоцитах инфицированных животных высокочувствительный и позволяет дифференцировать вирусносительство от колострального антителоносительства. Можно констатировать, что кролики наряду с овцами и телятами являются весьма перспективной биологической моделью для определения ВЛКРС у коров, подозрительных в заражении ретровирусом.

3.5. Результаты изучения возможности трансплацентарной передачи

вируса лейкоза крупного рогатого скота плодам, а также телятам молозивом п молоком в постнатальный период

С целью изучения возможности и частоты вертикальной (пренатальной), а также молозивом и молоком передачи ВЛКРС потомству нами в течение четырех лет были проведены четыре опыта на крупном рогатом скоте лейкозного изолятора ВИЭВ. В организации и проведении опытов принимал участие к.в.н. Мурватуллоев С.А.

В первом опыте были использованы 21 корова и один трехлетний бык-производитель, инфицированный ВЛКРС, во втором - 16 коров и бык-производитель из предыдущего опыта, в третьем опыте - 18 коров и бык-производитель, свободный от ВЛКРС, в четвертом - 17 коров и бык-производитель из третьего опыта. Все коровы, находившиеся в опытах, были инфицированы вирусом лейкоза, и у них методом биопробы на овцах в крови выявляли ВЛКРС.

Всего в четырех опытах было использовано 40 коров и два быка производителя. Осеменение коров проводили методом вольной случки. При этой за четырехлетний период родилось 72 теленка, У двух коров наблюдали по четыре отела, т.е. они были использованы в четырех опытах, у 6 коров - по три отела, у 14 коров - по два отела и у 18 коров - по одному отелу,

Животные в каждом опыте по гематологическим показателям были разделены на три группы: с нормальным количеством лейкоцитов в крови, гематологически подозрительные на лейкоз, с характерным для лейкоза псрсистентным лимфоцитозом.

Родившихся телят до 7-8 месячного возраста содержали совместно с матерями, используя подсосный метод выращивания, затем на привязи в одном помещении со взрослыми инфицированными животными.

У телят после рождения перед первым скармливанием молозива в первые 10 часов жизни определяли наличие антител в РИД с гликопротеидным антигеном BJIKPC. Одновременно с целью выявления вируса кровь телят вводили интраперитонеально здоровым свободным от BJIKPC овцам 8-12-месячного возраста. Овец содержали в отдельном помещении. Овец, на которых ставили биопробу, исследовали ежемесячно в течение трех месяцев на наличие антител к BJIKPC с помощью РИД. За телятами наблюдали до 12-месячного возраста. Серологические (РИД) и гематологическое исследование их проводили один раз в три месяца.

Результаты опытов убедительно показали, что в отдельных опытах отмечали от 11,1 до 35,2% телят, заразившихся BJIKPC пренатально. В среднем 21% телят, родившихся от инфицированных BJIKPC коров, был инфицирован в пренатальный период онтогенеза.

Ретроспективными исследованиями (В.М.Нахмансон, Е.А.Дун, Л.Г.Бурба, 1983; Ferrer et al„ 1976; Olson et al., 1978; Lieberman et а!., 1983) выявляли относительно низкий процент (от 3 до 9%) вертикальной передачи вируса лейкоза от больной матери потомству. Результаты наших опытов полностью согласуются с данными указанных авторов лишь по группам коров только инфицированных или с подозрительными на лейкозы изменениями крови. В основном транспланцентарное заражение телят отмечалось у коров с клинико-морфологическим проявлением лейкозов.

Высокий процент вертикальной передачи BJIKPC телятам в наших опытах следует объяснить тем, что исследования проводили на животных экспериментального стада крупного рогатого скота, которое в течение 15 лет селекционировали на повышение восприимчивости к лейкозу. Результаты наших исследований полностью согласуются с данными .Ferrer et al. (1976), Piper et al. (1978), которые среди животных аналогичного экспериментального стада у 18-20% телят наблюдали трансплацентарную передачу ВЛКРС.

В литературе нет данных об особенностях и механизме внутриутробного заражения телят ВЛКРС. Наши исследования показали, что пренатальная передача вируса лейкоза от матери плоду отмечалась, в основном, у коров с высоким персистентным лимфоцитозом, клиническим и морфологическим проявлением болезни, когда в органах и тканях больного животного обнаруживали пролифераты из инфицированных ВЛКРС лимфоцитов. Так, от 26 коров с высоким лейкоцитозом за четыре отела было получено 47 телят, из которых у 13 (27,6%) было установлено вертикальное (пренаталыюе) заражение ВЛКРС. В то же время, у 25 телят полученных от 23 коров, подозрительных на лейкоз или с нормальными показателями крови, только у двух животных было установлено пренатальное заражение.

Для выяснения роли молозива и молока как источника заражения телят ВЛКРС нами в течение четырех лет были проведены следующие эксперименты.

За этот период от 40 инфицированных коров было получено 72 головы телят, в том числе 57 голов родились свободными от ВЛКРС. У этих телят до получения молозива в сыворотке крови не были обнаружены специфические антитела, т.е. они не были заражены внутриутробно. Через сутки после рождения и получения молозива матери, все эти телята реагировали положительно в РИД. В их сыворотке выявлялись специфические антитела в значительных титрах. Телята находились с матерями и выращивались подсосным методом. Дальнейшие исследования показали постепенное снижение титра специфических антител в сыворотке крови у телят и к 4-5 месячному возрасту у большинства из них антитела отсутствовали.

Следует особо отметать, что в период вскармливания телят молозивом и молоком матери в течение 4-5 месяцев после рождения, у них биологической пробой на овцах не был выявлен ВЛКРС. В то же время в молозиве и суспензии клеток молока от коров-матерей биопробой на овцах был подтвержден наличие вируса, т.е. молозиво и молоко больных лейкозом коров содержит ВЛКРС. Эти данные согласуются с сообщениями ряда исследователей (В.А.Бусол и др., 1977; А.Т.Шиков и др., 1979; И.С.Докукин, 1982; А.Ф.Валихов, 1992).

После исчезновения колостральных антител, в период с 7 до 12-месячного возраста, 8 телят из 57 заразились горизонтальным путем; из 8 заразившихся 7 телят были потомками гематологически больных лейкозом коров.

Таким образом можно констатировать, что заражение животных ВЛКРС может произойти в различные периоды онтогенеза. В условиях лейкозного изолятора из 72 телят, родившихся от коров, больных лейкозом или инфицированных ВЛКРС, внутриутробно инфицировалось 15 (21%) животных. Вертикальная (пренатальная) передача вируса лейкоза наблюдалась преимущественно от коров-матерей с высоким персистентным лимфоцитозом. Среди отдельных семейств коров отмечали высокую степень пренатапьного заражения потомков вирусом лейкоза. Молозиво и молоко не являлось фактором передачи вируса телятам, если они в первые часы жизни получали молозиво от серопозитивных коров-кормилиц. В условиях лейкозного изолятора 14% телят инфицировалось в послемолочный период в 7-12-месячном возрасте.

Для проведения серологических и вирусологических исследований плодов коров в опыт были взяты 17 стельных коров, инфицированных ВЛКРС, в том числе 10 - экспериментально зараженных вирусом лейкоза. У всех экспериментально инфицированных ВЛКРС животных через 30-45 дней после заражения в сыворотке крови были обнаружены антитела к ВЛКРС, и методом биопробы на овцах в крови выявили вирус лейкоза. Наличие ВЛКРС в лимфоцитах крови спонтанно инфицированных коров было доказано также биопробой на кроликах.

Все подопытные животные были разделены на две группы: с нормальными гематологическими показателями - пять животных (I группа); с гематологическими проявлением лейкоза - 12 животных (2 группа). Согласно

схеме опытов (исп. к.в.н. Мурватуллоев С.А.) коров обеих групп убивали в различные сроки стельности, подвергали патоморфологическому исследованию, околоплодную жидкость и плоды исследовали на наличие ВЛКРС и антител к нему.

Результаты серологического исследования околоплодной жидкости и плодов коров первой группы были отрицательными. В них не были обнаружены антигены ВЛКРС. Отрицательные результаты были получены также в биопробе при внутрибрюшинном введении овцам крови и гомогената селезенки плодов коров этой группы.

В группе коров с гематологическим проявлением лейкоза в сыворотке крови одного 6-месячного и одного 8,5-месячного плодов были обнаружены антитела к гликопротеидному антигену ВЛКРС. Известно, что после 100 дней пренатального развития плоды коров могут синтезировать собственные антитела (Schults, 1973; Schults et al., 1973). Следовательно, эти плоды заразились ВЛКРС и у них развился инфекционный процесс. Биопробой на кроликах из лимфоцитов крови этих плодов был выделен ВЛКРС.

В сыворотке крови остальных плодов коров этой группы антитела к вирусу лейкоза не были выявлены. Однако в лимфоцитах крови одного из них биопробой на кроликах был выявлен вирус.

3.6. Результаты изучения антигенных и иммуногенных свойств инактивнровашюго ВЛКРС

Анализируя данные литературы по экспериментальной разработке специфических средств иммунопрофилактики онковирусной инфекции и лейкоза крупного рогатого скота, можно сказать, что исследователи идут к решению этой проблемы разными путями. Так, ряд исследователей (Л.Г.Бурба и соавт., 1981; В.П.Шишков и соавт., Р.А.Кукайн и соавт., 1983; Miller et al., 1978, 1983) для создания вакцинного препарата использовали инактивированный ВЛКРС, выращенный в культуре клеток ПЭО. С появлением методов генной инженерии стало возможным создание вакцины против ретровируса на основе рекомбинантной технологии с использованием в качестве вектора вирус оспы (А.В.Сверчков и др., 1990; А.Ф.Валихов и др., 1990, 1992).

В своих исследованиях мы изучили иммуногенные и антигенные свойства культурального ВЛКРС, инактивированного этиленимином.

Из культуральной жидкости хронически инфицированной линии клеток почки эмбриона овцы вирус осаждали ПЭГ-115 (конечная концентрация 20%) с последующим концентрированием ресуспендированного в трис-буфере (рН-7,2) преципитата ультрафильтрацией под давлением через мембрану РМ-10. Полученный препарат давал полосу преципитации в геле агара в разведении 1:64, в РДСК 1:128 при использовании положительной сыворотки крови крупного рогатого скота, содержащей антитела против гликопротеидного антигена ретровируса лейкоза. Концентрация гликопротеидного антигена в препарате составила 75 мкг/мл, что было определено методом радиальной

иммунодиффузии по Манчини с использованием в качестве стандартного антигена ретровируса с известной концентрацией белка. Контроль на инфиционность препарата проводили методом биопробы на овцах. Одной овце - культуральную жидкость, в которую было добавлено 0,05% этиленимина последующим инкубированием при 37 °С в течение 24 часов; другой -культуральную жидкость без обработки. У первой овцы не установлено появление вирусопецифических антител, тогда как у второй овцы развилась инфекция, сопровождающаяся появлением антител к ретровирусу (срок наблюдения 2 месяца).

Таким образом, обработка культуральной жидкости 0,05% этиленимином приводила к утрате инфекционности ретровируса лейкоза. В качестве адъюванта использовали минеральное масло с 10% ланолина. Инактивированный вирус и адьювант смешивали поровну до получения стойкой эмульсии. Препарат вводили подкожно в области шеи в объеме 1,0 мл одно-, двух-, трехкратно через каждые 2 недели (группа 1) или однократно в объеме 2,5 мл (группа 2).

Выявлено, что однократное введений вакцины телятам слабо стимулирует иммунный ответ. Повторные инъекции (двукратное и трехкратное) препарата вызывают выраженную выработку антител. Введение нативной крови от больной лейкозом коровы в количестве 2, 10 и 50 заражающих доз (5000, 25000 и 125000 лейкоцитов) стимулирует у иммунизированных животных антителообразование, выявляемое в РИД и РДСК. Биопробой на овцах в крови иммунизированных, а затем зараженных телят, вирус не обнаруживался.

Введение 2-, 10- и 50-кратной минимальной заражающей дозы лейкоцитов неиммунизированным (контрольным) телятам привело к развитию у всех животных выраженной онковирусной инфекции через 30-45 дней после введения вируса.

Приведенные данные показывают наличие иммуногенных свойств препарата, полученного на основе инактивации вируса лейкоза крупного рогатого скота.

В дальнейшем нами было проведено изучение длительности персистенции антител в организме телят, которым вводили инактивированный препарат в больших дозах. Опыты проводены на 17 телятах черно-пестрой и швицкой пород скота.

Инактивированный вирус лейкоза крупного рогатого скота, предварительно сорбированный на гидроокиси алюминия, вводили подопытным животным внутримышечно трехкратно с интервалом 2-4 недели. Доза препарата в разных опытах колебалась от 10 мл до 35-40 мл на одно введение в зависимости от поставленной цели. В дальнейшем все животные опытных и контрольных групп подвергались регулярным гематологическим и серологическим (РИД) исследованиям. После первой вакцинации в сыворотках крови подопытных телят обнаруживали антитела к ВЛКРС в низких титрах. На 14-20 день после повторной вакцинации титр антител к ВЛКРС в сыворотках

крови вакцинированных телят в РДСК составлял 1:4 - 1:8 и была отмечена положительная реакция иммунодиффузии. Для получения более высоких титров антител подопытным животным вводили третий раз иммуногенный препарат, при этом титр антител в сыворотках крови вакцинированных телят в РДСК составлял 1:16. В дальнейшем проводили гематологические и серологические исследования через каждые 30 дней в течение 18 месяцев (срок наблюдения). До 12 месяцев у вакцинированных животных постоянно обнаруживали антитела к ВЛКРС, а затем слабую реакцию в РИД и РДСК. На 15 и 17 месяцах наблюдали выпадение реакции иммунодиффузии и РДСК соответственно.

Таким образом, обработка культуральных вируссодержащих жидкостей этиленимином приводит к полной инактивации вируса лейкоза крупного рогатого скота, что было установлено методом постановки биопробы на овцах. Трехкратное введение препарата вызывает в организме животных образование вирусспецифических антител, которые обнаруживали реакцией иммунодиффузии и реакцией длительного связывания комплемента (срок наблюдения 18 месяцев).

3.7. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

На первом этапе совместно с Государственной ветеринарной службой республики Башкортостан провели системный эпизоотологический анализ и организовали серологический мониторинг с применением разработанных нами диагностических подходов. Провели исследования 65780 проб сывороток крови коров, быков - производителей, нетелей и телочек старше 6-месячного возраста из хозяйств и индивидуального сектора 12 районов с использованием серологического теста- реакции иммунодиффузии (РИД) с применением полученного нами антигена - гликопротеида 51.

Из обследованного поголовья скота, в частности, в Ашкадарском совхозе Мелеузовского района носителями вируса лейкоза оказались 46,7% животных, в индивидуальном секторе - 27% коров и телочек. В колхозе им. Сапавата этого же района и индивидуальном секторе 56,6 процентов животных оказалось инфицированными. Из 279 проб крови, полученных от коров Лрслановского совхоза, положительные в РИД результаты были равны 78,8 1роцентов.

Принимая это во внимание, в 1997 г. с участием Государственной ютеринарной службы, с помощью РИД исследовали 1 млн. 147 тысяч 40 голов срупного рогатого скота. Выявлено положительно реагирующих инфицированных) животных по республике 111264 головы, что составляет ',7% вирусоносительства к исследованному поголовью. Гематологическим методом исследовали 49992 головы и выделено с высоким лимфоцитозом 3481 олова, что составляет 6,9% больных животных.

В целом, проведенные эпизоотологические, клинические, ерологические и гематологические исследования показали, что из имеющихся

в Республике 2008 МТФ свободными от лейкоза оказались 308 (198 хозяйств в 40 районах), что составляет 15,3%.

При этом следует отметить высокий процент инфицированности и вирусоносительства среди крупного рогатого скота в хозяйствах Мелеузовского (47,5%), Благовещенского (42,5%), Кармаскалинского (20%), Уфимского (28,3%), Абзелиловского (18%), Бирского (21%) районов, где в отдельных хозяйствах инфицированность достигает до 60-80% к исследованному поголовью.

С целью разработки научно-обоснованных предложений по усовершенствованию мер борьбы в республике мы провели комплексные исследования в Мелеузовском районе.

В хозяйствах Мелеузовского района, так же как и других регионах, случаи лейкоза крупного рогатого скота обнаруживали по данным клинических симптомов и паталогоанатомических изменений, характерных для заболевания лейкозом. Разработка и внедрение гематологического метода ("лейкозный ключ") выявления больных по крови животных не только подтвердили рост заболеваемости, но и выявили относительную степень пораженности поголовья хозяйств лейкозом.

В течение многих лет в районе использовали лишь гематологический метод прижизненной диагностики лейкоза. Исследования проводили в каждом хозяйстве выборочно, по 200-300 коров. Результаты этих исследований давали возможность подтвердить наличие заболевания лейкозом среди поголовья скота данного района. При этом, представлялось возможным ориентировочно судить о степени распространенности болезни. Внедрение серологического метода выявления инфицированных ВЛКРС, так же не могло указать на истинную эпизоотическую ситуацию по степени распространенности лейкозной инфекции. Так как эти исследования так же носили выборочный характер.

По данным многочисленных авторов (Н.Т.Васильев, 1959; Н.В.Румянцев, 1967; О.Э.Альбре, 1958; В.К.Паракин и соает., 1973; Э.М.Нымм и соавт., 1975; Э.Я.Яунслейнис, 1974 и др.), выборочные гематологические и даже серологические исследования не в состоянии выяснить истинную эпизоотическую ситуацию в стаде как по лейкозу, так и по ретровирусной инфекции. По этим причинам, до 1996 г. не представлялось возможным говорить о степени распространенности лейкоза и лейкозной инфекции в хозяйствах Мелеузовского района. Для этого было необходимо по опыту других исследователей (Г.А.Симонян с соавт., 1990; Ф.Ф.Хисамутдинов, 1996; П.Н.Смирнов с соавт., 1989; Р.С.Москапик, 1989 и др.), хотя бы однократно подвергать все поголовье старше 6-месячного возраста комплексным гематологическому и серологическому исследованиям.

Исходя из этого, нами совместно с районной и республиканской ветеринарной лабораториями весной 1997 г. все поголовье крупного рогатого скота старше 6-месячного возраста было исследовано гематологическим и

урологическим методами. Из 34 хозяйств района только одно из них оказалось благополучным.

С целью разработки научно-обоснованных предложений по усовершенствованию мер борьбы в республике мы провели комплексные исследования в Мелеузовском районе (модельный район).

При исследовании 12067 коров и нетелей по РИД было выявлено :еропозитивных 3879 голов или в среднем по району 32,14%, а из 8325 телок ларше 6-месячного возраста - 810 голов или 9,72%. Среди исследованных по -ематологии 11806 коров и нетелей больными оказались 395 голов (3,34%). Эти средние показатели отражают относительно высокую степень заболеваемости и анфицированности животных. Однако, широкие пределы колебания :видетельствуют о крайне неодинаковой степени поражения поголовья отдельных хозяйств. Пределы колебания количества больных и инфицированных коров и серопозитивных телок варьируют в пределах 0,5512,9; 2,35-69,85 и 1,65-23,24% соответственно.

Для четкого определения степени пораженности поголовья отдельных •рупп хозяйств и выбора более оптимального варианта проведения оздоровительных мероприятий, все хозяйства района подразделили на три -руппы: с незначительным числом серопозитивных коров (как более «¡формативного показателя степени пораженности стада), с умеренным и высоким числом их. Число больных лейкозом и инфицированных коров и 1етелей, а также серопозитивных телок в среднем по группам составило - в тервой группе 0,89; 4,54 и 3,17%; во второй группе - 1,95; 20,12 и 6,74%; в гретьей группе - 5,41; 51,02 и 13,82% соответственно.

Наши данные согласуются с данными многочисленных авторов Г.А.Симонян с соавт., 1985; Ф.Ф.Хисамутдинов, 1996; П.Н.Смирнов с соавт., 1983; П.Н.Петров, 1988; А.Т.Татарчук с соавт., 1996; Bendixen, 1973; Vlammerickx, 1972;Evermannetal., 1987).

Изучение эпизоотической ситуации в неблагополучных по лейкозу созяйствах со смешенными породами, мы установили, что инфекционио -гатологический процесс у обоих категорий пород протекает почти одинаково. \боригенные породы скота при контакте с источниками инфекции, т.е. шфицированными животными черно-пестрой породы, заражаются в те же ;роки и в том же проценте случаев, что и завозные животные. Это дает нам юнование считать, что местные породы скота как утверждают некоторые «¡следователи (А.М.Лактионов, 1972; Н.И.Королев, 1981;Т.М.Билль с соавт., 1980; С.М.Федорова, 1989; З.П.Молчанов, 1975; Э.Я.Яунлейнис, 1974 и др.) не 1ейкозоустойчивы. Наши исследования согласуются с мнением Г.А.Симонян и ф. авторов в том, что отсутствие лейкоза среди аборигенных пород нашей :траны в довоенные годы объяснялось не их устойчивостью, а географическим удалением местного поголовья скота от мест разведения неблагополучных город животных. Вместе с тем, относительную устойчивость аборигенных кивотных можно отнести к частоте проявления болезни у инфицированного юголовья. Из числа инфицированных животных, повышение показателей

крови, характерные для заболевания, в одни и те же сроки, мы отмечали среди завозных пород в 6,6, а местных - в 4,8% случаев. Отсюда следует, что черно-пестрая порода скота изнеженная, более чувствительная к любой патологии, к ненормальным условиям кормления и содержания. Аборигенные породы, приспособленные к местным условиям содержания, показали свою сравнительно относительную устойчивость.

Как по данным гематологических, так в последующем и серологических исследований, многие авторы устанавливали в своих регионах тенденцию к увеличению числа больных и инфицированных ВЛКРС животных (В.А.Бусол, 1976; Г.А.Симонян., 1984; В.М.Лемеш, 1996; Ю.П.Смирнов. 1996; Э.М.Нымм с соавт., 1975; СЛ.Логановский с соавт.. 1979; Э.В.Адомавичус. 1979; Т.ИЛахт с соавт., 1982). Исходя из этого, нами были анализированы экспертизы диагностических исследований крупного рогатого скота хозяйств района с 1992 по 1997 гг. Мы также установили неуклонный рост числа как больных лейкозом, так и инфицированных ВЛКРС животных. Так, за пять лет, число больных лейкозом животных увеличилось с 218 (3.7%) в 1992 г. до 376 (5%) в 1996 г. Это несмотря на ежегодную, хотя и не полную сдачу на мясо части больных животных Число инфицированных ВЛКРС животных повысилось с 726 (16,8%) в 1992 г. до 2047 (27,5%) в 1996 г. При этом следует учесть, что ежегодно из числа серопозитивных коров до 30% сдавались на мясо, вследствие выбраковки их по причинам потери продуктивности и воспроизводительной функции.

Перед нами встала задача установить механизм ежегодного нарастания числа больных и инфицированных животных. Оказалось, что при ежегодном исследовании выявляется определенное число больных и инфицированных животных. От этого количества часть была оставлена с предыдущего года на передержке, вторая часть заболела и заразилась в течении текущего года, третья часть была сдана на мясокомбинат (больные и потерявшие продуктивность и воспроизводительную функцию коровы), а остальные остались в стаде на передержке. Эта процедура повторялась из года в год, в результате чего накапливалось в стаде число, как больных, так и серопозитивных животных. Интересно отметить, что число ежегодно заболевших лейкозом и заразившихся ВЛКРС коров находилось в пределах 2,25,0 и 11,3 - 13,7% к общему поголовью коров и 55,2 - 85,3 и 46,0 - 60,7% к количеству больных и инфицированных коров соответственно. Отсюда следует что выявленные при первом исследовании количество больных и серопозитивных животных, заболели и инфицировались не только в текущем году, но и в течение предыдущих лет. Значит, в стадах, где не проводятся оздоровительные мероприятия, происходит ежегодное нарастание числа больных и серопозитивных животных.

Анализируя результаты комплексных гематологических и серологических исследований всего поголовья крупного рогатого скота старше 6 - месячного возраста, мы установили некоторую закономерность. Была установлена зависимость количества больных лейкозом коров и

инфицированного поголовья, т.е. коров. Число последних в несколько раз превышает таковое больных коров и серопозитивного молодняка. Так, в группе хозяйств с наименьшей степенью пораженности поголовья, степень инфицированности коров в пять раз превышает число больных лейкозом коров и почти в два раза - серопозитивных телок. В группах хозяйств с высокой степенью пораженности лейкозом, это преимущество составляет уже в 10 и 4 раза соответственно. Отсюда следует, что инфицирование коров и телок идет опережающими темпами, чем заболевание лейкозом коров.

Таким образом, при отсутствии возможности поголовного комплексного гематологического и серологического исследований крупного рогатого скота хозяйства, ориентировочную эпизоотическую ситуацию по лейкозу и вирусной инфекции можно установить по результатам выборочной проверки коров РИД.

По вопросу возраста животного, при котором наиболее часто проявляется лейкоз, в литературе имеются разноречивые мнения. Одни авторы считали, что лейкоз наиболее часто поражает средний возраст, другие наиболее часто обнаруживали опухолевую форму лейкоза в возрасте 4-8, а третьи - 5-7 лет. Мы в своей работе проанализировали результаты гематологических и серологических исследований животных в зависимости от их возраста. При этом было установлено, что в стадах с наименьшей пораженностью вирусом, геропозитивные телята обнаруживаются в возрасте 12 месяцев (1,7%), а зольные лейкозом - в возрасте нетелей (0,4%). По мере их роста, уже в возрасте первотелок число их возрастает до 4,7% и 0,9% соответственно. В стадах с щеренной и сильной степенью пораженности, серопозитивные телята обнаруживаются уже в возрасте 6 месяцев (1,0 - 6,8%), а больные лейкозом - в юзрасте 18 месяцев (0,9%). В возрасте коров эти показатели могут трогрессивно нарастать до 53,2 и 5,1% соответственно.

Далее было установлено, что степень проявления лейкоза в «благополучном стаде находится в зависимости от продолжительной шфицированности коров. Ежегодно из числа серопозитивных коров •ематологические показатели повышаются до уровня больных в 1,8, и до уровня подозрительных в заболеваний лейкозом - у 2,5% животных.

Эти данные имеют принципиальное значение, так как определяют сроки ематологических исследований серопозитивного поголовья коров при фоведении оздоровительных мероприятий.

В течении многих лет разработка и проведение противолейкозиых чероприятий было сопряжено с определенными трудностями, обусловленными ггсутствием полных данных о причине и механизме развития лейкозного фоцесса, о путях и факторах заноса и распространения болезни в ранее благополучные регионы и хозяйства.

Поэтому, система мероприятий по борьбе с лейкозом крупного рогатого кота находилась в постоянном совершенствовании по мере накопления новых аучных данных о заболевании.

В течение десятилетий противолейкозные мероприятия проводились утем выявления гематологических больных лейкозом животных и сдачи их на

мясо. Однако, добиться ощутимых результатов при этом не удалось никому (Л.А.Князева, 1967; И.С.Докукин, 1971; А.И.Кузин с соавт., 1972; С.К.Приедниекс с соавт., 1973; В.К.Паракин с соавт., 1973; А.К.Аузиня, 1974; Г-.М.Нымм с соавт., 1975; А.Т.Шиков, 1975; Г.Л.Цымбал, 1977; М.В.Печерская с соавт., 1985; А.Ф.Бублий, 1980; Bendixen, 1963; Hoff-Jorgenscn et.al., 1978; Flensurg, 1982 и др.).

В хозяйствах нашего района, также как и в других регионах, противолейкозные мероприятия проводились путем выбраковки и сдачи на мясо гематологически больных животных. Однако, при каждом исследовании выявлялись новые животные с повышенными показателями крови, характерными для лейкоза.

Для выяснения возможности искоренения лейкоза в хозяйствах с разной степенью инфицированности взрослого поголовья, мы использовали три варианта, исходя из опыта других исследователей (Г.А.Симонян и соавт., 1990; В.П.Шишков и соавт., 1988; Ф.Ф.Хисамутдинов, 1996; М.З.Хайруллин, 1998)

По первому варианту оздоровление неблагополучных по лейкозу хозяйств путем единовременной выбраковки и сдачи на мясо больных и инфицированных ВЛКРС животных, мы провели в 4-х колхозах, в которых число серопозитивного поголовья не превышало 7,0 %.

Оздоровительные мероприятия, проведенные в этих хозяйствах путем единовременной выбраковки и сдачи на мясо больных и инфицированных животных, позволили полностью искоренить лейкоз и вирусную инфекцию в сроки от 6 до 12 месяцев.

Второй метод оздоровления неблагополучных по лейкозу хозяйств путем разделения поголовья скота на две обособленные группы используются повсеместно по всей стране (П.Н.Смирнов с соавт., 1980; В.П.Шишков с соавт., 1988; Г.А.Симонян с соает., 1990; Р.С.Москалик, 1996).

Вместе с тем, эффектавность и сроки оздоровления чрезвычайно ; j-знообразны. Этот метод используется в стадах с умеренной степенью инфицированное™ поголовья скота, т.е. от 10 до 30%. В нашем районе таким методом намечено оздоровить 13 хозяйств, в которых число серопозитивных коров находится в пределах 12,5-24,0%.

Для оздоровления этим методом нами были отобраны два хозяйства. Первое хозяйство имело одно, а второе - два отделения, поэтому мы преследовали цель установить сроки оздоровления при размещении поголовья на одном и на двух отделениях, при котором достигается полная изоляция неблагополучной группы животных от оздоравливаемой, т.е. серонегативной. В обоих хозяйствах число серопозитивных коров составляет 16,8 и 22,4% соответственно, завоз племмолодняка • черно-пестрой породы из неблагополучных по лейкозу регионов проводился за последние 8-10 лет. В первом хозяйстве больные по крови обнаруживались с 1993 г., а во втором -еще с 1988 г.

Разумеется, что полное искоренение инфекции в первом хозяйстве должно несколько растянуться, так как оздоравливаемая и неблагополучная

руппы будут размещаться на одном отделении, при котором трудно полностью сключить изоляцию источника инфекции. В первом хозяйстве с одним тделением, серопозитивных коров разместили в одном изолированном оровнике и исключили контакт с оздоравливаемой группой. Для исключения еревода в общее стадо потенциально инфицированного теленка из еблагополучной группы, мы потомство от них кормили молозивом и молоком оров-кормилиц, свободных от лейкоза и BJIKPC, исключали зараженных нутриутробно телят из воспроизводства. В результате этих мер, уже через 9 юсяцев прекратилось выделение серопозитивных животных в здоравливаемой группе, а через 12 месяцев в группе молодняка, куда ереводились и телки от инфицированных матерей.

В хозяйстве, где оздоровление проводилось путем изолированного одержания серопозитивных и серонегативных групп животных на удаленных (руг от друга отделениях, выделение новых РИД - положительных животных з едоравливаемой группе прекратилось через 9 месяцев.

Большие трудности по данным многочисленных авторов представляют одоровление хозяйств с высокой степенью инфицированностью поголовья. Три наличии 40-80% серопозитивных коров и еще 10-20 % потенциально щфицированных животных в инкубационной стадии, делает оздоровление [утем разделения стада на две изолированные группы не эффективным. В [ашем районе такие стада составляют 40 % всех хозяйств.

Замена всего инфицированного поголовья не представлялось юзможным, из-за отсутствия финансовых средств.

Исходя из этого, нами предприняты попытки проведения »здоровительных мероприятии в одном хозяйстве путем выращивания дарового молодняка от больных и инфицированных коров.

Еще в 1996 г. в начале проведения оздоровительных мероприятий в хозяйстве было 54,4% серопозитивных коров и 10 % телок, чисто клинически юльных составляло 3,8 %. Частичная сдача на мясо больных и шфицнрованных животных несколько уменьшило их число, но не давало одежды на оздоровление. При последующем исследовании весной 1997 г. шфицнрованных коров осталось 39,3%; телок - 5,0 %, а больных коров 2,6%. 4з трех отделений одно было выбрано для размещения серонегативного лолодняка, а на двух остальных оставалось все поголовье неблагополучных соров. Последние подвергались только гематологическому исследованию со ¡дачей на мясо вновь выявленных больных лейкозом коров. По расчетам, <сходя из ежегодного ремонта маточного поголовья в 30-40%, через 2-3 года )се коровы неблагополучных ферм должны быть выбракованы по причинам ютери продуктивности и воспроизводительной функции. Эта группа коров г, юлгода один раз подвергалась гематологическому исследованию. При каждом >чередном исследовании уменьшалось число вновь выявленных "ематологически больных животных. Потомство от них с 6-месячного возраста троперялась по РИД и отрицательно реагирующие переводились на полированную ферму молодняка, а положительно реагирующие телки - на

откорм. Исследование коров серопозитивных отделений показало, что ежегодно из числа неблагополучных по лейкозу групп коров, болезнь проявляется лишь у 1,8 % коров, а у 2,5 % - отмечается незначительное повышение числа лейкоцитов, характерных для подозрительных в заболевании лейкозом. Установленные другими исследователями 5-10% ежегодного проявления лейкоза в неблагополучных по лейкозу хозяйствах, свидетельствует об их передержке и переходе из года в год, т.е. в последующие годы. Оздоровление этим методом показало, что через 3-4, максимум 5 лет все поголовье коров неблагополучной группы выбраковывается по причинам потери продуктивности и сдачи их на мясо. За этот же срок, при ежеквартальном серологическом исследовании телок с 6 месячного возраста и удаления из стада РИД - положительных, представляется возможным создать достаточное количество здоровых неделей для замены коров и искоренении лейкоза и ретровирусной инфекции.

4. ВЫВОДЫ

1. Теоретически обоснованы и экспериментально осуществлены пути оздоровления (профилактики и ликвидации) лейкоза крупного рогатого скота на основе получения новых данных в закономерностях передачи вируса потомству и подходов в диагностике.

2. Впервые усовершенствована технология и освоено производство диагностикума на основе стационарного, роллерного и псевдосуспензионного культивирования перевиваемых клеток (ПЭО, ТЭК-76 МВА и др.), продуцирующих вирус лейкоза крупного рогатого скота.

3. Разработаны и рекомендуются впервые реакция длительного связывания комплемента и метод иммуноферментного анализа, предназначенных для выявления специфических антител к вирусу лейкоза в сыворотке крови больных животных.

4. В качестве лабораторных методов выявления возбудителя лейкоза крупного рогатого скота наряду с телятами и овцами, впервые рекомендуется биологическая проба на кроликах. Установлено, что при введении кроликам лимфоцитов, содержащих вирус лейкоза, у них выявляются специфические антитела на 21-35 день определяемые серологическим методом.

5. В контролируемых опытах подтверждена возможность передачи вируса лейкоза от матерей потомству. И при этом частота передачи вируса лейкоза от больной матери потомству в значительной степени зависела от стадии и клиники проявления заболевания.

6. Одним из научно-обоснованных показателей внутриутробной передачи вируса лейкоза от матери плоду является наличие специфических антител и вируса лейкоза в органах плода.

7. Телята, родившиеся от инфицированных лейкозом коров и не содержащих в сыворотке крови специфических антител, являются свободными от лейкоза.

8. Установлено, что с молозивом и молоком коров, инфицированных ВЛКРС, новорожденные телята получают антитела и колостралыгый яммунитет сохраняется у них в течение 4-5 месяцев. При подкожном введении лм лимфоцитов, содержащих ВЛКРС, 60 % телят предохранились от иражения.

9. Эпизоотологические, клинические, серологические и гематологические 1сследования показали, что из имеющихся в Республике Башкортостан 2008 лолочно-товарных ферм в 1700 хозяйствах выявлены инфицированные ВЖРС кивотные. При этом высокий процент инфицированное™ и шрусоносительства установлено среди крупного рогатого скота в хозяйствах 4елеузовского (47,5%), Благовещенского (42,5%), Кармаксалинского (20%), /фимского (28,3), Абзелиловского (18%), Бирского (21%) районов, где в »тдельных хозяйствах инфицированность достигает до 60-80% к ¡сследованному поголовью.

10. Степень пораженности стад лейкозом зависит от количества и давности авоза племенных животных; продолжительности неблагополучия стад; яоевременной выбраковки и сдачи на мясо вновь выявленных больных (ейкозом коров и изоляции серопозитивных животных; эффективности гроводимых противолейкозных мероприятий.

12. По уровню пораженности крупного рогатого скота ВЖРС хозяйства екомендуется распределять на три группы: с незначительным поражением (до 0%); с умеренным (от 10 до 20 %) и с высоким уровнем поражения (30% и ыше).

13. Сроки и эффективность оздоровительных мероприятий находятся в рямой зависимости от степени пораженности поголовья, наличия золированных ферм и методов искоренения:

- оздоровление хозяйств от лейкоза и бессимптомной онкорнавирусной инфекции удается осуществлять в течение 6-12-18 мес. при условии удаления из стада всех серопозитивных животных после каждого серологического исследования, проводимого с интервалом 3-6 месяцев;

- оздоровление хозяйств, когда инфицированность составляет 20-30% осуществляется в течение 2-2,5 лет путем разделения стада на две группы (серопозитивную и серонегативную) с раздельным их содержанием и изолированным выращиванием серонегативных телочек с 6-ти месячного возраста;

- оздоровление от лейкоза неблагополучных хозяйств со значительным поражением поголовья (30-50%) удается проводить путем постепенного ввоза неинфицировакных первотелок (нетелей) и обособленного их размещения в коровнике, при условии ежеквартального серологического контроля животных в процессе их использования.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании многолетних исследований этиологии лейкоза, биологических свойств вируса лейкоза крупного рогатого скота, методов диагностики, а также широких серо-эпизоотологических исследований нами были разработаны и внедрены в производство следующие практические предложения:

1. Методика по изготовлению и контролю гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для постановки реакции иммунодиффузии (утв. ветеринарной секцией ВАСХНИЛ, Москва, 1981);

2. Временные методические рекомендации постановки реакции длительного связывания комплемента в микрообъемах (РДСКМ) для серологической диагностики онкорновирусной инфекции, ассоциированной с лейкозами крупного рогатого скота(утв. ветеринарной секцией ВАСХНИЛ, Москва, 1981);

3. Методические рекомендации по использованию сыворотки крови молодняка крупного рогатого скота, свободного от ретровируса лейкоза для наработки гликопротеидного антигена (одобрены Ученым Советом ВИЭВ 4.04.1983);

4. Программа профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в хозяйствах, промышленных комплексах и станциях искусственного осеменения Калужской области на 1983-1988 гг. (одобрена коллегией Управления сельского хозяйства Калужского облисполкома, Калуга, 1983);

5. Методика по изготовлению и контролю гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для постановки реакции иммунодиффузии (утв. Ученым Советом ВИЭВ, Москва, 1987);

6. План организационно-хозяйственных, ветеринарно-санитарных и специальных мероприятий по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Башкортостан на 1997-2000 годы (утв. начальником Управления ветеринарии при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия РБ, Уфа, 1997);

7. Методические рекомендации по постановке реакции иммунной диффузии в агаровом геле (утв. Методической комиссией БГАУ, Уфа, 1998);

8. Временное наставление по применению РДСК для выявления специфических антител к возбудителю лейкоза (утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 августа 199.9 года в порядке производственной апробации);

9. Временное наставление по применению набора компонентов для выявления методом ИФА специфических антител к возбудителю лейкоза (утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 сентября 1999 г.);

10. Монография "Вирус лейкоза крупного рогатого скота (культуральные, инфекционные и иммуногенные свойства)", г.Уфа, 1999 г.

6. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Гапеев Р.Ф., Валнхов А.Ф., Гулюкин М.И., Мурватуллоев в.А. Вирусологическое исследование телят, рожденных от коров, инфицированных онкорнавирусом //Доклады ВАСХНИЛ. -1981. -№ 10. -С. 44-46.

2. Галеев Р.Ф. , Валихов А.Ф., Шишков В.П. Результаты опыта по иммунизации крупного рогатого скота против эксперименталыюй-БЛВ-инфекции // В книге: "Вирусы рака и лейкоза" - 1981. - С. 54-56.

3. Галеев Р.Ф., Бурба Л.Г., Альгштейн А.Д., Гриненко Н.Ф. Выявление антител к онкорнавирусу у спонтанно и экспериментально инфицированных жвачных животных/Труды ВИЭВ.-1981. - Том 54. - С. 71-74.

4. Валихов А.Ф., Галеев Р.Ф. Динамика иммунного ответа у телят при введении инактивированного иммуногена на основе глмко-протеида вириона ретровируса лейкоза //Бюллетень ВИЭВ. - 1982. - Вып. 48. - С. 12-13.

5. Галеев Р.Ф., Валихов А.Ф., Мурватуллоев С.А. Трансплацентарная передача ретровируса лейкоза (БЛВ) от инфицированных коров потомству // Распознавание и меры борьбы с лейкозами человека и животных. Тезисы докл. Всесоюзн. конф. - Белая Церковь. - 1982. -С. 196-197.

6. Галеев Р.Ф., Залевский Д.И. Наработка гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота в роллерных установках // Калужский межотраслевой центр НТИ. Информационный листок № 189-83. - 4 с.

7. Галеев Р.Ф., Бурба Л.Г., Валихов А.Ф. Воспроизведение лейкоза у генетически предрасположенных к заболеванию телят// Современные проблемы профилактики и лечения зоонозных заболеваний и лейкозов. Тез. докл. республ. научно-производ. конф.- Гродно. -1982. -С. 198-199.

8. Галеев Р.Ф., Бурба Л.Г., Валихов А.Ф. Сравнительное серологическое исследование телят, родившихся от больных лейкозом и здоровых коров '/Калужский межотраслевой центр НТИ. Информац. листок № 207-83 - 4 с.

9. Галеев Р.Ф., Бурба Л.Г., Валихов А.Ф. Сравнительная характеристика серологических реакций и гематологических показателей при выявлении спонтанно инфицированных ретровирусом лейкоза крупного рогатого скота // Калужский межотраслевой центр НТИ. Информац. листок № 238-83. - 4 с.

10. Галеев Р.Ф., Бурба В.П., Шишков В.П., Валихов А.Ф. Опыты но иммунизации крупного рогатого скота против экспериментальной ЕДС-¡шфекции //Труды ВИЭВ. -1983. -Том 53. - С. 56-58.

11. Галеев Р.Ф. , Залевский Д.И. Стандартизация биологических препаратов для серологической диагностики крупного рогатого скота, шфицированного вирусом лейкоза // Калужский межотраслевой центр НТИ. Янформац. листок № 269-83. - 4 с.

12. Галеев Р.Ф., Залевский Д.И. Иммунный ответ у овец в, РИД и РДСК при жспериментальном инфицировании ретровирусом лейкоза крупного рогатого жота // Труды ВИЭВ. -1983. -Том 59. - С. 64-67.

13. Галеев Р.Ф., Залевский Д.И. Динамика иммунного ответа телят при »ведении инактивированного вируса лейкоза крупного рогатого скота //

Калужский межотраслевой центр НТИ. Информац. листок № 342-83. - 4 с.

14. Галеев Р.Ф., Залевский Д.И. Колостральный иммунитет у телят родившихся от лейкозных коров // Труды ВИЭВ. -1983. -Том 58. - С. 134-136.

15. Галеев Р.Ф., Залевский, Такташев Ш.С. Влияние различны) питательных сред на длительность культивирования "ин витро" перевиваемо? линии клеток почки эмбриона овцы и репродукцию вируса лейкоза крупногс рогатого скота //Калужский межотраслевой центр НТИ. Информац. листок Л! 48-84.-4 с.

16. Галеев Р.Ф., Залевский Д.И., Такташев Ш.С. Сравнительное изученш серологических методов диагностики лейкозов крупного рогатого скотг //Калужский межотраслевой центр НТИ. Информац. листок № 150-84. - 4 с.

17. Галеев Р.Ф., Залевский Д.И. Влияние экспозиций центрифугированш вируссодержащей жидкости на активность антигена ретровируса лейкоза /, Калужский межотраслевой центр НТИ. Информац. листок № 155-84. - 4 с.

18. Галеев Р.Ф. Изучение активности гликопротеидного антигене ретровируса лейкоза, полученного при культивировании в роллерны> установках // Иммунология и иммунная терапия лейкозов человека и животных. Тез. докл. Всесоюзн. конф. -Ташкент. -1984. - С. 113-114.

19. Галеев Р.Ф., Задевский Д.И. Оценка эффективности осаждения белкоЕ вируса лейкоза крупного рогатого скота из культуральных вирусосодержащш жидкостей сульфатом аммония и полиэтиленгликолем // Калужский межотраслевой центр НТИ. Информац листок № 166-84. -4 с.

20. Галеев Р.Ф. Активность гликопротеидного антигена вируса лейкоза, полученного различными методами культивирования // Калужск. межотраслевой центр НТИ. Информац. листок № 250-84. - 4 с.

21. Парфанович М.И., Симонян Г.А., Лазаренко A.A., Залевский Д.И., Галеев Р.Ф. Исследование инактивированной целыювирионной вакцины из вируса лейкоза крупного рогатого скота // Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных. Тез. докл. Всесоюз. конф. - Ташкент. -1984. - С. 159.

22: Галеев Р.Х. Характеристика методов выявления вируса в биологических материалах инфицированного ретровирусом лейкоза крупного рогатого скота// Калужск. межотраслевой центр НТИ. Информационный листок № 48-85. -4 с.

23. Галеев Р.Ф. Использование сыворотки крови спонтанно инфицированных вирусом лейкоза коров в качестве контроля для постановки РДСК и РДП // Калужск. межотраслевой центр НТИ. Информац. листок № 167-85. -4 с.

24. Галеев Р.Ф. Получение гликопротеидного антигена БЛВ ддя постановки реакции диффузионной преципитации с использованием сернокислого аммония // Калужск. межотраслевой центр НТИ. Информац. листок № 214-85.-4 с.

25. Галеев Р.Ф. Изучение иммунного ответа у овец при экспериментальном инфицировании ретровирусом лейкоза крупного рогатого скота // Калужск.

межотраслевой центр НТИ. Информационный листок № 217-85. .-4 с. ,

26. Галеев Р.Ф. Методика культивирования клеточных культур. ПЭО, фонически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, для юлучения гликопротеидного антигена // Калужск. межотраслевой центр НТИ. 1нформационный листок № 222-85. -4 с.

27. Галеев Р.Ф. Изучение внутриутробной передачи ретровируса лейкоза it спонтанно инфицированной коровы потомству //Калужск. межотраслевой (ентр НТИ. Информационный листок № 254-85. - 4 с.

28. Галеев Р.Ф., Залевский Д.И., Крикун В.А., Конюхов А,ф. Сультивирование перевиваемой линии клеток тимуса эмбриона коровы на штательных средах гидролизат лактальбумина и 199 // Калужск. кжотраслевой центр НТИ. Информац. листок № 276-85. - 4 с.

29. Парфанович М.И., Симонян Г.А., Лазаренко A.A., Залевский Д.И., "алеев Р.Ф. Иммуногенность и защитные свойства инактивированной вакцины [з вируса лейкоза крупного рогатого скота //XI съезд гематологов. Тезисы докл. ■Москва.-1985. - С. 328.

30. Галеев Р.Ф. Характеристика различных модификаций реакции [иффузной преципитации для серологической диагностики инфицированного LIB крупного рогатого скота // Калужск.. межотраслевой центр НТИ. 1нформационный листок № 291-85. - 4 с.

31. Галеев Р.Ф. Характеристика гематологических показателей и ерологических реакций у хоров, спонтанно инфицированных вирусом лейкоза 'XI съезд гематологов и трансфизиологов. Тез.доклд., Москва, 1995. - С.338.

32. Галеев Р.Ф. Получение гликопротеидного антигена вируса лейкоза рупного рогатого скота культивированием клеток почки эмбриона овцы на шкроносителях //Калужск.межотраслевой центр НТИ. Информац. листок ■ •№ 9-86. -4 с.

33. Галеев Р.Ф. Изучение активности, репродукции вируса лейкоза рупного рогатого скота в различных культурах клеток //Калужск. (ежотраслевой центр НТИ. Информац. листок № 105-86. - 4с.

34. Галеев Р.Ф. Сравнительное исследование специфичности и активности ликопротёидного антигена вируса лейкоза животных //Калужск. межотраслеой ентр НТИ. Информац.листок № 331-86. - 4 с.

35. Галеев Р.Ф., Залевский Д.И., Петракова Н.С. Иммунный ответ у телят а введение инактивированного вируса лейкоза крупного рогатого скота Калужск. межотраслевой центр НТИ. Информац .листок № 347-86. - 4с.

36. Парфанович М.И., Симонян Г.А., Залевский Д.И., Галеев Р.Ф. 1ротективные свойства инактивированной цельновирионной вакцины против ейкоза крупного рогатого скота //В сб..'"Диагностика, профилактика и борьба лейкозом кр. рог. скота". -Персиановка. -1986. -С. 10-14.

37. Симоварт Ю.А., Залевский Д.И., Кондричева H.H., Галеев Р.Ф. Опыт рименения РИД в противолейкозном комплексе в ЭССР //В кн.: Теоретические и практические вопросы ветеринарии". -Тарту. -1987. -С. 9857.

38. Михалева Е.А., Залевский Д.И., Галеев Р.Ф. Способ получен! антигена вируса лейкоза кр. рог .скота для диагностики целей. // Авторск< свидетельство № 1378113 1.11.1987.

39. Галеев Р.Ф., Кондричева H.H., Залевский Д.И. Инфекционные свойсп молока коров больных лейкозом // Калужск. межотраслевой центр HTI Информац. листок № 298-88. - 4 с.

40. Галеев Р.Ф., Арупонян В.Г. Технология культивирования клеток почк эмбриона овцы для получения гликопротеидного антигена вируса лейкоза К] рог. скота . с целью постановки реакции иммунодиффузии //Калужа межотраслевой центр НТИ. Информац. листок № 260-88 —7 с.

41. Галеев Р.Ф. Серологическое и гистологическое исследования сайгаке на лейкоз // Калужск. межотрасл. центр НТИ. Информационный листок № 16^ 89. - 4 с.

42. Галеев Р.Ф. Результаты контролируемых опытов с использование] РИД и РДСК на овцах и телятах по экспериментальной передаче ВЛКРС колостралыюму иммунитету и внутриутробной передаче в сравнительно) аспекте //Калужск. межотрасл. центр НТИ. Информац. листок № 36-89. - 4с.

43. Галеев Р.Ф. Выращивание клеток ПЭО, персистентно продуцирующи ВЛКРС, на микроносителях с использованием оборудования и посуды дл роллерного культивирования// Калужск. межотрасл. центр НТК Информационный листок № 290-89. -4 с.

44. Галеев Р.Ф. Изготовление диагноста кума лейкоза кр. рог. скот псевдосуспензионным методом// Калужск. межотраслевой центр НТК Информац. листок №. 347-89. - 4 с.

45. Галеев Р.Ф., Кондричева H.H., Берднакова И.Б., Залевский Д.И Изучение инфекционных свойств молока больных лейкозом коров //В кн. "Теоретические и практические вопросы ветеринарии". Тарту, 1990. - С. 109 111.

46. Галеев Р.Ф., Залевский Д.И., Бердникова И.Б., Стасенко Л.Г Выявление антител у быков-производителей в динамике// В кн. "Теоретические и практические вопросы ветеринарии". -Тарту. -1990. - С .105 108.

47. Залевский Д.И., Валихов А.Ф., Бурба Л.Г.„ Галеев Р.Ф. Персистенцш антител вируса лейкоза крупного рогатого скота в организме вакцинированные животных // В кн.: "Теоретические и практические вопросы ветеринарии". -Тарту.-1990.-С. 102-104.

48. Галеев Р.Ф. Комбинированное осаждение ВЛКРС из культурально? жидкости клеток ИЗО в целях получения "двойного" антигена вируса лейкозг //Калужск. межотрасл. центр НТИ. Информационный листок № 139-90. - 4 с.

49. Галеев Р.Ф. Очистка вируса лейкоза крупного рогатого скота для получения специфического и активного антигена// Калужск. межотрасл. центр НТИ. Информационный листок № 213-90. - 4с.

50. Галеев Р.Ф. Выявление антител к ВЛКРС у эмбрионов коров // В сб.: "Ветеринарная медицина, экономические, социальные и экологические

юблемы". -Харьков. -1990. - С. 90.

51. Галеев Р.Ф. Результаты экспериментальных исследовании телят и >ров-доноров по определению взаимосвязи носительства BJ1KPC с уровнем [тителообразования // Калужск. межотрасл. центр НТИ. Информац. листок № '-91. -4 с.

52. Галеев Р.Ф. Инфицирование экспериментальных телят минимальной абильной дозой крови (2500 лейкоцитов) от коров-доноров в различных адиях инфекционного процесса// Калужск. межотрасл. центр НТИ. 1формационный листок № 321-91. -4 с.

53. Галеев Р.Ф., Давлетов А.Г. Лейкоз крупного рогатого скота // В фиале "Сельские узоры". - Уфа. -1993. - С.14.

54. Галеев Р.Ф., Давлетов А.Г. Изолированное содержание условно орового крупного рогатого скота в неблагополучных по лейкозу хозяйствах // сб.: "Состояние и пути развития животноводства в Республике Башкортостан, зисы докладов. - Уфа. -1994. — С. 15-16.

55. Галеев Р.Ф., Давлетов А.Г. Принципы оздоровления стад крупного гатого скота с высоким процентом инфицированности вирусом лейкоза И В .: "Состояние и пути развития животноводства в Республике Башкортостан", зисы докладов. - Уфа. - 1994. - С. 17-18.

56. Галеев Р.Ф., Самигуллин И.Ш., Хакимов Э.Н. Лейкозы животных облема профилактики и борьбы в Башкортостане// Журнал «Сельские эры». — Уфа. -1999. -№ 1. -С. 10-11.

57. Галеев Р.Ф., Гареев Г.А. Пассивный иммунитет при лейкозе // Журнал ельские узоры». - Уфа. -1999. -№ 2. -С.13-14.

58. Галеев Р.Ф. Вирус лейкоза крупного рогатого скота (культуральные, фекционные и иммуногенные свойства)// Монография. -Уфа. -1999. -152 с.

1.1. Актуальность проблемы. Лейкоз крупного рогатого скота -хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, наносящая значительный экономический ущерб животноводству и представляющая потенциальную опасность для генофонда племенного и молочного стада (Л.К. Эрнст, В.П. Шишков, 1984; В.М.Авилов, В.М.Нахмансон, 1995; М.З.Хайруллин, 1998; Ф.Ф Хисамутдинов, 1997; Н.И.Петров, 1997 и др.). Этиологическим агентом лейкоза является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) - представитель семейства Retroviridae (Р.А.Кукайн и др., 1976; М.И.Парфанович и др., 1974; В.П.Шишков, 1977; В.А.Крикун, 1999; Miller et al., 1969; Ferrer et al., 1971; и др.) Благодаря наличию в своем составе уникального фермента - РНК-зависимой ДНК полимеразы (ревертазы), геном ВЛКРС может полностью или частично интегрироваться с геномом клетки-хозяина и долгое время существовать в форме провируса (Klintevoll, 1995). В этот период, который может продолжаться от нескольких месяцев до нескольких лет, у животных не наблюдается никаких признаков заболевания, включая отсутствие антител (Р.А.Кукайн и др., 1982; В.М.Нахмансон, 1986), поэтому особо важное значение приобретает выявление как специфических антител, так и самого вируса лейкоза (В.П.Шишков, Л.Г.Бурба, 1983; П.Н.Смирнов, 1991; АВ.Валихов, 1992, 1994; Н.В.Кузнецова, 1997; Kleitevall et al., 1994; Oie, 1996), В последние годы в нашей стране и за рубежом разработаны и рекомендованы иммунологические методы, в частности реакция иммунной диффузии (РИД) и др. для выявления животных, инфицированных ВЖРС (Л.Г.Бурба, А.Ф.Валихов, 1976; А.Ф.Валихов и соавт., 1977; П.Н.Смирнов, 1991; А.Ф.Валихов, 1992; П.Н.Смирнов и соавт., 1996, 1997). Следует заметить, что каждая из этих реакций в отдельности выявляет неодинаковое число положительно реагирующих животных. Наиболее полное выявление инфицированных ретровирусом животных достигается путем комплексного исследования их с помощью разных методов (Г.Ф.Коромыслов и соавт., 1979). Перспективными лабораторными методами, которые также направлены на выявление антител к главному внутреннему белку р24 и к гликопротеиду (gp 51) оболочки ретровирура по мнению Burny et al., (1985,1988) являются реакция длительного связывания комплемента (РДСК) и иммуноферментный анализ (ИФА). Для получения антигенов вируса лейкоза используют культуры клеток эмбриона овцы (ПЭО), тимуса эмбриона коровы (ТЭК), селезенки эмбриона коровы (СЭК), персистентно продуцирующих вирус лейкоза (Л.Г.Бурба и соавт., 1976; В.А. Крикун, 1976). Перед исследователями в этом плане стоит задача поиска новых подходов в более полном выделении вирусспецифических белков из культуральных жидкостей при получении антигенов BJTKPC, последующей их очистки с целью приготовления диагностических препаратов высокой специфичности. Важно выяснение оптимальных сроков культивирования после засева клеток, способы их культивирования, концентрация клеточной взвеси на единицу объема, применение различных методов обогащения сред и схем культивирования.

Почти на протяжении века ученые многих стран проводили исследования по изучению этого заболевания и лишь 1969 год вошел в историю как год открытия вируса лейкоза крупного рогатого скота - BJIKPC (Miller et al, 1969; Ferrer, 1980). В последующих работах детально изучена морфология и морфогенез вируса и установлена его онкогенная активность. Так, экспериментами на телятах доказана инфекционность и лейкозогенность BJIKPC (Л.Г.Бурба и соавт., 1976; В.П.Шишков, 1977). Установлено также, что к ВЛКРС чувствительны овцы (Olsen et al, 1978, Л.Г.Бурба, А.А.Кунаков,1983), козы (Ressang, 1976), свиньи (Г.П.Ефремов с соавт., 1979). Однако остаются неизученными чувствительность к ВЛКРС лабораторных животных (кроликов) и возможность использования их для выделения, культивирования вируса, получения гетерологичных иммунных сывороток и других целей.

Показано, что болезнь появляется в хозяйствах, в основном, после ввоза племенного молодняка из стад, неблагополучных по этому заболеванию (Л.Г.Бурба, 1979). Однако пути заражения, выделения и распространения ВЛКРС остаются еще мало изученными. Представляет большой интерес вертикальная (пренатальная) передача ВЛКРС от матери плоду. К началу наших исследований имелись лишь отдельные предварительные сообщения о внутриутробной передаче ВЛКРС плоду (Ferrer, 1976; Piper et al., 1979; В.М.Нахмансон и др.,1981), не изучены механизм и частота этого пути передачи вируса и степень значения его в плане оздоровления хозяйств от лейкозов.

Остается нерешенным вопрос о роли молозива и молока как факторов передачи ВЛКРС потомству и в образовании у телят колострального иммунитета. Не выяснена эпизоотологическая роль овец как источника распространения ВЛКРС горизонтальным путем. Имеются единичные сообщения о создании препаратов для активной специфической иммунопрофилактики крупного рогатого скота (М.И.Парфанович и соавт., 1980, 1981, 1982; В.М.Жданов и др., 1979, 1983; Л.Г.Бурба и др., 1981; Р.А.Кукайн и соавт., 1980; Miller et al., 1978, 1983). Однако эти сообщения до последнего времени остаются дискутабельными и требуют дальнейшего экспериментального изучения.

Борьба с лейкозом крупного рогатого скота находилась в прямой зависимости от степени изученности данного заболевания и существующих методов распознавания болезни. Фактически, систематическая борьба с лейкозом крупного рогатого скота началась после разработки прижизненного гематологического метода диагностики - "лейкозцого ключа" (Götze et al., 1954). Путем гематологического исследования поголовья скота в хозяйствах, выявляли больных лейкозом и сдавали на мясо. Этим же методом выяснялась эпизоотическая ситуация по данной болезни. Впервые противолейкозные мероприятия на государственном уровне были проведены в Дании с 1959 по

1978 гг. В течение 5-6 лет было ликвидировано более 600 неблагополучных по лейкозу ферм с убоем более 35 тыс. животных (Bendixeen, 1963, 1973; Flensburg, 1982). В нашей стране с индустриальным типом ведения животноводства оздоровительные мероприятия имеют свои особенности, определяемые прежде всего высокой концентрацией поголовья в хозяйствах (А.Т.Шиков, 1975; Г.А.Симонян, 1984). Широкое распространение лейкозной инфекции, отсутствие достаточного количества здоровых животных для замены поголовья неблагополучных по лейкозу стад и средств для компенсирования убытков хозяйствам при ликвидации стад, вынудили разрабатывать в нашей стране более приемлемые методы оздоровления (Г.А.Симонян, 1985; В.А.Крикун с соавт., 1984; Г.А.Симонян с соавт., 1988, 1990; Л.Г.Бурба, 1985; В.П.Шишков и соавт., 1988; П.Н.Смирнов и соавт., 1989, 1991; Ю.А.Симоварт, 1991; Ф.Ф.Хисамутдинов, 1994,19%; М.З.Хайруллин, 1998).

В настоящее время почти во всех областях, краях и республиках РФ разрабатываются и утверждаются комплексные планы по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота (В.М.Авилов, 1990; В.А.Седов, 1990; В.М.Авилов, В.М.Нахмансон, 1995; Н.И.Петров, 1999). Эпизоотологическими наблюдениями была установлена прямая корреляция между частотой инфицированности животных ВЛКРС и числом выявляемых гематологически больных лейкозом животных. Наряду с общими закономерностями заноса и распространения ВЛКРС и общепринятыми методами проведения противолейкозных мероприятий, в каждом регионе и, даже хозяйстве, имеются свои особенности, вносящие коррективы в выяснения эпизоотической ситуация искоренения лейкоза.

Исходя из этого, представляет большой научный и практический интерес установить сроки оздоровления стад с использованием серологических методов в зависимости от степени пораженности поголовья лейкозом и ВЛКРС, породы животных, технологии ведения животноводства и методов осуществления противолейкозных мероприятий.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось научно-теоретическое обоснование и экспериментальная проработка важнейших иммунологических аспектов передачи вируса и антител потомству от коров, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, совершенствование методов и средств диагностики, мер борьбы и профилактики заболевания.

В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи:

1.2.1. Разработать новые технологии культивирования перевиваемых клеточных линий, хронически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, для получения гликопротеидного и полипептидного антигенов ВЛКРС для постановки серологических реакций.

1.2.2. Разработка и усовершенствование лабораторных методов диагностики лейкоза:

- провести исследования по выяснению чувствительности к ВЛКРС овец и кроликов и возможности использования их в качестве биологической модели в биопробе для выявления ВЛКРС в различных материалах, содержащих этот вирус;

- разработать новые иммунологические методы - РДОС и ЙФА для выявления специфических антител в еыворотке крови инфицированных ретровирусом коров и провести сравнительное изучение их чувствительности с РИД, а также гематологическим методом;

1.2.3. Изучить иммунологические аспекты передачи вируса и антител потомству от коров и овец, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота:

- изучить пренатальное заражение телят и ягнят, родившихся от матерей, больных лейкозом или только инфицированных ВЛКРС, и выяснить механизм внутриутробной передачи вируса лейкоза от коров и овец потомству;

- определить роль молозива и молока как факторов передачи ВЛКРС телятам и ягнятам, образование и напряженность колострального иммунитета у телят.

1.2.4. Изучить возможность получения иммуногенного для телят и обладающего защитным действием инактивированного препарата из ВЛКРС, накопленного в перевиваемой культуре клеток ПЭО.

1.2.5. Изучить особенности распространения онкорновирусной инфекции и лейкоза крупного рогатого скота в различных территориально-географических зонах Республики Башкортостан и на основе полученных данных разработать и реализовать в условиях производства комплексную научно-обоснованную систему оздоровительно-профилактических мероприятий по лейкозу.

Х.З. Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые отработанны условия и сроки стационарного и роллерного культивирования линии клеток ПЭО, ТЭК и СЭК-продуцентов ВЛКРС, предложены оптимальные концентрации клеточной взвеси, объемы питательной среды и методы их обогащения. Были изучены и предложены для производства препаративного количества диагностикумов ВЛКРС благоприятные режимы культивирования и питания клеток с использованием микроносителей, выяснены возможности культивирования клеточных линий в условиях суспензии. При этом была осуществлена разработка технологии культивирования клеток с периодической сменой среды, позволяющая сократить расход дорогостоящей сыворотки крови эмбрионов коров и заменить ее сыворотками крови овец, телят, лошадей, коров. Проведена оценка эффективности осаждения белков ВЛКРС из культуральных жидкостей сульфатом аммония, полиэтиленгликолем, методом фазовых систем при различных режимах центрифугирования в сравнении с ультрафильтрацией. Были изучены и предложены оптимальные методы осаждения и центрифугирования (без применения дорогостоящих импортных ультрацентрифуг), очистки, концентрирования ВЛКРС и дана сравнительная оценка продукции антигенов вируса лейкоза клетками ПЭО, ТЭК и СЭК при различных методах и режимах. Разработаны методы обнаружения специфических антител - в РДСК и ИФА с применением в качестве антигена гликопротеид 51 ретровируса, изучена их специфичность и активность по сравнению с РИД, а также гематологическим методом выявления больных животных. Предложено использование кроликов как чувствительной биологической модели для выделения ВЛКРС из материала (кровь, суспензия органов и тканей), содержащего вирус. Экспериментально доказано пренатальное заражение телят, родившихся от коров, инфицированных ВЛКРС, и установлено, что частота внутриутробной передачи ВЛКРС от матери плоду зависит от стадии болезни и наблюдается, в основном, при клинико-морфологическом проявлении лейкозов у матерей. Показано, что степень внутриутробной передачи вируса лейкоза плодам среди животных отдельных семейств была существенной, пренатальное заражение отмечалось у дочек и внучек, а также у телят, родившихся от одной и той же матери, в течение нескольких отелов. Пренатальное заражение телят происходит посредством лимфоцитов матери, содержащих ВЛКРС, проникающих через плаценту в различные сроки развития плода. При заражении плода на ранней стадии развития до образования компетентной иммунной системы отмечается толерантность организма плода ВЛКРС.

Установлено, что телята и ягнята, родившиеся от больных лейкозом или инфицированных ВЛКРС матерей, при подсосном методе выращивания получали с молозивом антитела, предохраняющих их от заражения в течение 45 месяцев при совместном содержании с инфицированными животными. Среди телят с колостральным иммунитетом 60% животных предохранялось от заражения после подкожного введения им ВЛКРС.

Овцы, у которых после заражения ВЛКРС развивался инфекционный процесс без клинико-морфологического проявления лейкоза, не передавали пренатально вирус ягнятам. У овец не отмечали горизонтальной (контактной) передачи ВЛКРС при длительном совместном содержания здоровых и инфицированных животных.

Показана способность инактивированного ВЛКРС, накопленного в перевиваемой культуре клеток ПЭО, вызвать у телят иммунную реакцию и устойчивость к заражению вирулентным вирусом.

Изучены особенности распространения болезни, выявлены тенденции проявления эпизоотического процесса лейкоза в районах Республики Башкортостан. Установлены причины неодинаковой пораженности животноводческих ферм и тенденции к широкому распространению ВЛКРС и болезни. Изучена степень прогрессивного нарастания числа больных и инфицированных ВЛКРС животных в зависимости от их возраста. Усовершенствована система различных вариантов оздоровления неблагополучных по лейкозу хозяйств в зависимости от степени поражения стад, включая организационно-хозяйственные и специальные ветеринарно-санитарные мероприятия с учетом категории хозяйств. Показана эффективность использования в системе противолейкозных мероприятий методов раннего выявления инфицированных и больных лейкозом животных.

1.4. Практическая значимость работы. Крупномасштабные комплексные эпизоотологические, клинико-серологические, экспериментальные исследования позволили разработать и внедрить следующие практические предложения :

- разработана и освоена технология серийного производства антигена ВЛКРС путем усовершенствования культивирования клеток-продуцентов вируса лейкоза, изыскания новых питательных сред, использования сывороток крови различных видов животных при культивировании хронически инфицированных ВЛКРС клеток. Эти данные вошли в следующие разработки: "Методические рекомендации по использованию сыворотки крови молодняка крупного рогатого скота, свободного от ретровируса лейкоза для наработки гликопротеидного антигена" (одобрены Ученым Советом ВИЭВ 4.04.1983г); "Методика по изготовлению и контролю гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для постановки реакции иммунодиффузии" утв. ВАСХНИЛ, 1991); "Авторское свидетельство № 1378113 "Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для диагностических целей" (1987);

- разработаны, усовершенствованы и освоены лабораторные методы (РИД, РДСК, ИФА) для выявления специфических антител в сыворотке крови инфицированных ретровирусом животных. Рассмотрены и утверждены секцией отделения ветеринарии ВАСХНИЛ "Временные методические рекомендации постановки реакции длительного связывания комплемента в микрообъемах (РДСКМ) для серологической диагностики онкорновирусной инфекции, ассоциированной с лейкозами крупного рогатого скота" (Москва, 1981), "Методика по изготовлению и контролю гликопротеинового антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для постановки реакции иммунодиффузии" (утв. Ученым Советом ВИЭВ, Москва, 1987), "Методические рекомендации по постановке реакции иммунной диффузии в агаровом геле" (утв. методической комиссией БГАУ, Уфа, 1998) ; "Временное наставление по применению РДСК для выявления специфических антител к возбудителю лейкоза (в порядке производственной апробации)"- (утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 30 августа1999 г.); "Временное наставление по применению набора компонентов для выявления методом ИФА специфических антител к возбудителю лейкоза (в порядке производственной апробации)" - (утв. Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 30 сентября 1999 г.).

- показана чувствительность кроликов к вирусу лейкоза крупного рогатого скота и возможность использования их для выделения вируса из материала от инфицированных животных и длительного культивирования его в организме гетерологичных животных;

- установлена внутриутробная передача вируса лейкоза телятам и степень их инфицированности, которая связана со стадией и тяжестью болезни у матери, что подтвердила необходимость удаления из хозяйств коров с высоким лимфодитозом, как животных с повышенным риском внутриутробной передачи вируса потомству; установлена продолжительность пассивного (колострального) иммунитета у телят и ягнят, родившихся от матерей, больных лейкозами, спонтанно или экспериментально инфицированных ретровирусом и дана количественная характеристика титра антител в динамике с использованием РИД, РДСК. Путем скармливания телятам в первые дни жизни молозива, содержащего колостральные антитела против ВЛКРС, можно профилактировать их заражение вирусом лейкоза в течение 4-5 месяцев. Изолированное выращивание телят, свободных от ретровируса, но родившихся от инфицированных ретровирусом матерей до исчезновения колостральных антител, является одним из мер борьбы с лейкозами крупного рогатого скота.

Полученные новые научные данные и данные эпизоотологических наблюдений по выяснению причин появления и распространения вирусной инфекции, эффективности оздоровительных противолейкозных мероприятий позволили разработать и внедрить в производство: "Программу профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в хозяйствах, промышленных комплексах и станциях искусственного осеменения Калужской области на 1983-1988 гг" (одобрена коллегией управления сельского хозяйства Калужского облисполкома. Калуга, 1983)"; "План организационно-хозяйственных, ветеринарно-санитарных и специальных мероприятий по профилактике и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Башкортостан на 1997-2000 годы" (согласовано Заместителем Министра сельского хозяйства и продовольствия и утв. Начальником Управления ветеринарии МСХиП Республики Башкортостан).

1.5. Основные положения диссертации выносимые на защиту.

1. Результаты разработки технологий культивирования перевиваемых линий клеток, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, для получения гликопротеидного и полипептидного антигенов ВЛКРС с целью постановки серологических реакций.

2. Результаты разработки РДСК и непрямого варианта иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови крупного рогатого скота и их сравнительная оценка с РИД, а также гематологическим методом.

3. Результаты изучения чувствительности к ВЛКРС телят, овец и кроликов и возможности использования их в качестве биологической модели для выявления вируса в патологическом материале.

4. Пути и факторы передачи ВЛКРС и их значение в эпизоотическом процессе лейкоза крупного рогатого скота.

5. Особенности распространения онкорнавирусной инфекции и лейкоза крупного рогатого скота в различных административно-географических зонах Республики Башкортостан.

6. Научно-обоснованная усовершенствованная система борьбы с лейкозом крупного рогатого скота, результаты её испытания в модельном районе РБ.

1.6. Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и одобрены на научных конференциях и симпозиумах: Всесоюзной научной конференции "Распознавание и меры борьбы с лейкозом человека и животных" (Белая Церковь, 1982); Республиканской научно-производственной конференции "Современные проблемы профилактики и лечения зоонозных заболеваний и лейкозов" (Гродно, 1982); II съезде гематологов и трансфузиологов. Москва, 1985; Республиканской научно-производственной конференции "Диагностика, профилактика и борьба с лейкозом крупного рогатого скота (Персиановка, 1986); Республиканской конференции "Теоретические и практические вопросы ветеринарии" (Тарту, 1987-1990); Республиканской конференции "Ветеринарная медицина, экономические, социальные и экологические проблемы" (Харьков, 1990); Республиканской

16 конференции "Состояние и пути развития животноводства в Республике Башкортостан" (Уфа, 1994, 1995, 1997, 1998).

1.7. Публикации. По теме диссертации опубликовано 58 научных работ, в том числе монография: Вирус лейкоза крупного рогатого скота (культуральные, инфекционные и иммуногенные свойства), Уфа, 1999, 152 с.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы из£76источников и приложений.

6.ВЫВОДЫ

1. Теоретически обоснованы и экспериментально осуществлены пути оздоровления (профилактики и ликвидации) лейкоза крупного рогатого скота на основе получения новых данных в закономерностях передачи вируса потомству и подходов в диагностике.

2.Впервые усовершенствована технология и освоено производство диагностикума на основе стационарного, роллерного и псевдосуспензионного культивирования перевиваемых клеток (ПЭО, ТЭК-76 МВА и др.), продуцирующих вирус лейкоза крупного рогатого скота.

3.Разработаны и рекомендуются впервые реакция длительного связывания комплемента и метод иммуноферментного анализа для выявления специфических антител в сыворотке крови больных лейкозом животных.

4. В качестве лабораторных методов выявления возбудителя лейкоза крупного рогатого скота наряду с телятами и овцами, впервые рекомендуется биологическая проба на кроликах. Установлено, что при введении кроликам лимфоцитов, содержащих вирус лейкоза, у них выявляются специфические антитела на 21-35 день, определяемые серологическим методом.

5. В контролируемых опытах подтверждена возможность передачи вируса лейкоза от матерей потомству. И при этом частота передачи вируса лейкозаW больной матери потомству в значительной степени зависела от стадии и клиники проявления заболевания.

6. Одним из научно-обоснованных показателей внутриутробной передачи вируса лейкоза от матери плоду является наличие специфических антител и вируса лейкоза в органах плода.

7. Телята, родившиеся от инфицированных лейкозом коров и не содержащих в сыворотке крови специфических антител, являются свободными от лейкоза.

8. Установлено, что с молозивом и молоком коров, инфицированных ВЛКРС, новорожденные телята получают антитела и колостральный иммунитет сохраняется у них в течение 4-5 месяцев. При подкожном введении им лимфоцитов, содержащих ВЛКРС, 60 % телят предохранились от заражения.

9. Эпизоотологические, клинические, серологические и гематологические исследования показали, что из имеющихся в Республике Башкортостан 2008 молочно-товарных ферм в 1700 хозяйствах выявлены инфицированные ВЛКРС животные. При этом высокий процент инфицированности и вирусоносительства установлено среди крупного рогатого скота в хозяйствах Мелеузовского (47,5%), Благовещенского (42,5%), Кармаксалинского (20%), Уфимского (28,3), Абзелиловского (18%), Бирского (21%) районов, где в отдельных хозяйствах инфицированность достигает до 60-80% к исследованному поголовью.

10. Степень пораженности стад лейкозом зависит от количества и давности завоза племенных животных; продолжительности неблагополучия стад; своевременной выбраковки и сдачи на мясо вновь выявленных больных лейкозом коров и изоляции серопозитивных животных; эффективности проводимых противолейкозных мероприятий.

11. По уровню пораженности крупного рогатого скота ВЛКРС хозяйства рекомендуется распределять на три группы: с незначительным поражением (до 10%); с умеренным (от 10 до 20 %) и с высоким уровнем поражения (30% и выше).

12. Сроки и эффективность оздоровительных мероприятий находятся в прямой зависимости от степени пораженности поголовья, наличия изолированных ферм и методов искоренения:

- оздоровление хозяйств от лейкоза и бессимптомной онкорнавирусной инфекции удается осуществлять в течение 6-12-18 мес. при условии удаления

236 из стада всех серопозитивных животных после каждого серологического исследования, проводимого с интервалом 3-6 месяцев;

- оздоровление хозяйств, когда инфицированность составляет 20-30% осуществляется в течение 2-2,5 года путем разделения стада на две группы (серопозитивную и серонегативную) с раздельным их содержанием; и изолированным выращиванием серонегативных телочек с 6-ти месячного возраста.

- оздоровление от лейкоза неблагополучных хозяйств со значительным поражением поголовья (30-50%) удается проводить путем постепенного ввоза неинфицированных первотелок (нетелей) и обособленного их размещения в коровнике, при условии ежеквартального серологического контроля животных в процессе их использования.