Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Конструирование ассоциированной пятивалентной вакцины против вирусных болезней птиц инактивированной эмульсионной

На правах рукописи

ДОЛГОВ Дмитрий Львович

КОНСТРУИРОВАНИЕ АССОЦИИРОВАННОЙ ПЯТИВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПТИЦ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЭМУЛЬСИОННОЙ

16.00.03 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологиеи и иммунология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

0031Т1515

Владимир - 200о

003171515

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г Владимир)

Научный руководитель —

Официальные оппоненты -

Ведущее учреждение -

доктор ветеринарных наук Борисов Владимир Владимирович

доктор ветеринарных наук, профессор Шумилов Константин Васильевич,

ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ», г Москва),

доктор биологических наук, профессор Фомина Наталья Васильевна,

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им К И Скрябина (ФГОУ «МГАВМиБ», г Москва)

ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» (ГНУ «ВНИИВВиМ», г Покров)

Защита диссертации состоится 25 июня 2008 г в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220 015 01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу 600901, г Владимир, мкр Юрьевец, ФГУ «Федеральный ценгр охраны здоровья животных»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан 22 мая 2008 г

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник -^ЖС^^^е^-тг- Г М Семенова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В условиях современного промышленного птицеводства, характеризующегося интенсивным выращиванием птиц на ограниченных площадях, возникает опасность возникновения массовых инфекционных болезней, которые приводят к значительным экономическим потерям (В В Малушко, 1982, Р Н Коровин, 1990, П В Каргилл и Д Джонстон, 2004) При этом, большую значимость приобрели такие вирусные инфекции, как ньюкаслская болезнь (НБ), синдром снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76), инфекционный бронхит кур (ИБК), инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) и реовирусный теносиновит (РВТ) Распространение этих заболеваний в последнее время приобрело мировой масштаб (А В Борисов и соавт, 1998, JT А Венгеренко, 2004, Э Д Джавадов, 2003, 2004)

Кроме общих противоэпизоотических мероприятий, краеугольным камнем борьбы с этими болезнями является специфическая профилактика, заключающаяся в массовой иммунизации поголовья птиц живыми и инактивированными вакцинами по специально разработанным схемам (В И Смоленский, 1996, ЭД Джавадов, 2004, ПВ Каргилл, 2004, В В Борисов, 2007 и др )

Однако нередко эпизоотическая обстановка, складывающаяся на птицеводческих предприятиях, диктует многократное применение птицам различных возрастных групп биопрепаратов против 8-11 инфекционных болезней Вследствие часто повторяющихся массовых вакцинаций практически не прекращается воздействие стресс-факторов и нагрузка на иммунную систему птиц, что отрицательно сказывается на формировании надежной защиты, а также приводит к увеличению затрат труда ветеринарных специалистов при выполнении массовых иммунизации (В Н Ирза и соавт, 2000,2002, И К Рождественский и О Ф Хохлачев, 2003)

В последние годы зарубежная и отечественная ветеринарная практика все чаще использует ассоциированные инактивированные эмульсионные вакцины с обратным типом эмульсии, применение которых эффективно дополняет использование живых вакцин и позволяет обеспечить у привитых кур напряженный уровень иммунного ответа на протяжении всего продуктивного периода, снизить потери молодняка птиц от инфекционных заболеваний в раннем возрасте за счет передачи потомству высокого уровня материнских антител (Е Sakai et al, 1992, А С Дубовой и соавт, 1995, 1998, Э Д Джавадов и соавт, 2003, 2004, Окачина В I и соавт, 2004, J Н Breytenbach, 2004)

Однако публикации, посвященные этой тематике, содержат в основном описание иммунобиологических свойств (иммуногенность, безвредность) ассоциированных инактивированных вакцин против вирусных болезней птиц и не касаются таких важных вопросов, возникающих при конструировании биопрепаратов, как определение параметров оптимального соотношения специфических компонентов в дисперсной фазе и среде (адъювант) В

доступной литературе имеются отдельные данные, отражающие зависимость «доза-эффект» у живых вакцин против НБ, ИББ, ИБК и РВТ, а также у некоторых инактивированных моновалентных биопрепаратов (С А Гусев, 1999, А В Борисов, 2000, В И Шкиря, 2000, ЕС Кочеткова, 2002, С В Фролов, 2005, В В Борисов, 2007)

Поиски адъюванта для производства вакцин, сбалансированного по целому ряду важных требований (высокая эффективность, физическая стабильность, низкие реологические показатели, безвредность, универсальность, технологическая совместимость, доступность, низкая стоимость), остаются актуальными и по сей день и по ряду причин осуществляются на эмпирическом уровне Многими исследователями, как экспериментально, так и на практике, доказаны преимущества использования масляных адъювантов с обратным типом эмульсии в производстве инактивированных вакцин для птиц (PD McKercher, 1986, В В, Борисов, 1997, Н Stone, 1997, 1998, 1999, С.А Гусев, 1999, Э Д Джавадов, 2000, В Н Ирза, 2000)

В A Bokhout et al (1986) и В А Сергеев (1998) сообщили, что размер частиц дисперсной фазы эмульсии и ее гомогенность напрямую влияют на иммунологические свойства инактивированных эмульсионных вакцин, поскольку биопрепараты с размером частиц эмульсии менее 1 мкм более доступны для захвата макрофагами и последующей презентации клеткам иммунной системы Однако эти экспериментальные работы выполнялись с использованием сложных и нестандартных методик определения размера частиц дисперсной фазы, что ограничивает их широкое применение

Открытие метода лазерной дифракционной гранулометрии позволяет значительно упростить процедуры контроля качества физических свойств эмульсионных биопрепаратов и внедрить их в производственный процесс (D.T O'Hagan et al, 1991, J Vaija et al, 1995)

Таким образом, определение таких наиболее важных в технологическом аспекте величин и показателей, как минимальные титры инфекционной активности специфических компонентов в прививном объеме до этапа инактивации, компонентный состав дисперсной фазы, дисперсная среда (адъювант) при конструировании ассоциированной пятивалентной инактивированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ является весьма актуальным для ветеринарной биотехнологии и требует своего решения

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является определение основных технологических параметров (минимальные титры инфекционной активности специфических компонентов в прививном объеме, компонентный состав дисперсной фазы, дисперсная среда - адъювант) при изготовлении ассоциированной пятивалентной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи.

• подобрать и обосновать оптимальный компонентный состав (соотношение специфических антигенов в дисперсной фазе, дисперсную среду) ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц,

• разработать методику концентрирования вируса инфекционного бронхита кур для изготовления ассоциированной вакцины,

• выбрать масляный адъювант, позволяющий получать стабильную и безвредную ассоциированную вакцину против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, с выраженными иммуногенными свойствами,

• разработать с использованием современного оборудования количественный метод оценки эмульсии типа «вода-масло», получаемой в процессе изготовления инактивированных вакцин,

• изучить физические и иммунобиологические свойства ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц,

• разработать нормативную документацию на ассоциированную инактивированную эмульсионную вакцину против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур,' синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц

Научная новизна Подобран и обоснован оптимальный компонентный состав ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц

Определены оптимальные технологические параметры концентрирования инактивированного вируса ИБК с помощью проточной ультрафильтрации для изготовления ассоциированной вакцины

Изучена стабильность ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ с типом эмульсии «вода-масло» на различных этапах эмульгирования с помощью стандартных методов, а также при последовательном воздействии температуры минус 40°С и плюс 37°С

С помощью метода лазерной дифракционной гранулометрии проведен количественный анализ дисперсных свойств ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ с типом эмульсии «вода-масло» в процессе изготовления

Изучены физические и иммунобиологические свойства ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ,

ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, приготовленной с учетом обоснованных технологических параметров

Практическая значимость Для практического использования предлагаются следующие методические указания, которые проверены комиссионно, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ»

1 «Методика экспресс-определения стабильности эмульсионных вакцин с типом эмульсии «вода-масло»» (2005 г),

2 «Методика концентрирования вируса инфекционного бронхита кур с помощью проточной ультрафильтрации» (2008 г),

3 «Методика лазерной гранулометрии эмульсионных вакцин» (2008 г)

Результаты научных исследований были использованы при составлении следующей нормативной документации

• Промышленный регламент на производство вакцины ассоциированной против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной серии «Пентавис»,

• СТО на вакцину ассоциированную против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированную эмульгированную серии «Пентавис» (СТО 004955270082-2008),

• Инструкция по применению вакцины ассоциированной против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной серии «Пентавис»

Основные положения, выносимые на защиту.

• Компонентный состав ассоциированной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульсионной

• Метод концентрирования вируса инфекционного бронхита кур с помощью проточной ультрафильтрации

• Метод экспресс-определения стабильности эмульсионных вакцин с типом эмульсии «вода-масло»

• Количественный метод изучения дисперсных свойств эмульсионных вакцин

• Результаты оценки иммунобиологических и физических свойств ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц

Апробация результатов работы Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «IV Украинская конференция по птицеводству с международным участием» (Харьков, 2003 г), «Международная научная конференция молодых ученых» (Владимир, 2004 г), «Актуальные проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса Проблемы агроэкономики, ветеринарной медицины и биотехнологии в животноводстве» (Иваново, 2005 г), «Международная научно-практическая конференция молодых ученых «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику»» (Владимир, 2008 г), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 20032008гг

Публикация результатов исследований По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 1 работа опубликована в издании по перечню ВАК

Доля личного участия соискателя Представленные в диссертации экспериментальные исследования и анализ полученных результатов выполнены автором самостоятельно В ходе работы практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ФГУ «ВНИИЗЖ» и ФГУ «ВГНКИ» доктор биологических наук А П Пономарев (раздел «Разработка методики концентрирования вируса ИБК с помощью проточной ультрафильтрации»), кандидаты ветеринарных наук С В Фролов и В Ю Кулаков (раздел «Обоснование компонентного состава ассоциированной инактивированной эмульгированной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ»), кандидаты ветеринарных наук Д А Лозовой и Ю В Зуев, А А Егоров (раздел «Разработка методики экспресс-определения стабильности эмульсионной вакцины с типом эмульсии «вода-масло»»), кандидаты ветеринарных наук О А Борисова, В Н Ирза, Т В Оковытая, С К Старов, Г И. Кожаева (раздел «Изучение иммуногенной активности ассоциированных вакцин на основе различных масляных адъювантов»), за что выражаем им искреннюю благодарность за оказанную помощь

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который состоит из 288 источников, в том числе 119 работ на русском языке Работа иллюстрирована 16 таблицами, 25 рисунками и дополнена приложением документов, подтверждающих внедрение результатов работы в ветеринарную практику

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Вирусы. НБ (производственный штамм «Ла-Сота»), ИБК (производственный штамм «Н-52»), ССЯ-76 (производственные штаммы «БИСС», «В8/78»), ИББ (производственный штамм «К-58») и РВТ (производственный штамм «1133»)

Куры В лабораторных экспериментах в условиях ФГУ «ВНИИЗЖ» было вакцинировано более 1000 голов птиц в возрасте от 40 до 110 сут яичных кроссов «Хайсекс Браун» и «Хайсекс Белый», доставленных с птицефабрик «Кинешемская» Ивановской области и «Ковровская» Владимирской области, а также цыплят, выращенных на базе ФГУ «ВНИИЗЖ» Птицы были как серонегативными к вирусам НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, так и предварительно вакцинированными живыми вакцинами против этих болезней

Сыворотки крови. В экспериментах было исследовано более 3000 проб сывороток крови птиц, взятых в различные сроки после иммунизации опытными и опытно-промышленными сериями ассоциированных вакцин До исследований сыворотки хранили при температуре минус 20°С

Инактивация вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ. Для инактивации инфекционной активности вирусов использовали димер аминоэтилэтиленимина с различными концентрациями и параметрами, согласно общепринятым методикам

Определение оптимальных титров инфекционной активности вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в ассоциированной вакцине Базовыми оценками содержания антигенов вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в ассоциированной вакцине принимали фактические титры их инфекционной активности в вируссодержащем материале, установленные до процедуры инактивации - 10,5 lg ЭИД50/см3, 7,2 lg ЭИД50/см3, 7,0 lg ЭИД50/см3, 7,0 Ig ЭИДзо/см3 и 7,0 lg ТЦД50/см}, соответственно

Для удобства последующих вычислительных операций использовали условный показатель титра вируса, характеризующий минимально возможную концентрацию частиц инактивированного вируса (lgTu„), которая фактически находилась в вакцине соответственно предшествующей оценке lgT0 (ЭИДзо/см3) и заданной величине разведения антигена D Необходимые расчеты производили по формуле lgTun = lgT0- lgD [1]

Определение оптимального компонентного состава ассоциированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ. На основании расчетов оптимальных титров инфекционной активности вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в прививном объеме ассоциированной вакцины выяснили минимальные показатели титров инфекционной активности этих вирусов до инактивации Для определения компонентного состава поливалентной вакцины проводили сопоставление расчетных и

фактических величин концентраций инактивированных вирусов, выражая их отношения через коэффициент концентрации (К) и коэффициент кратности концентрации (Кк), расчетные показатели которых использовались для этой цели Коэффициент концентрации (К) определяли по формуле К= lgTun / lgT0) [2], где То - титр инфекционной активности нативного вируса, Ти„ -рассчитанный минимальный титр вируса Коэффициент кратности концентрации (Кк) определяли по формуле Кк= 1 / К [3]

Концентрирование ин активированного вируса ИБК Концентрирование инактивированного вируса ИБК методом проточной ультрафильтрации проводили на установке для ультра- и микрофильтрации «Сартокон-мини» (фирма «Sartorius») с использованием кассетных полисульфоновых модулей с пропускной способностью от 50 до 300 кДа Содержание общего белка в полученных концентратах устанавливали при измерении оптической плотности на спектрофотометре «BIO-RAD» (США) в проходящем пучке света с длиной волны 260 и 280 нм, с последующим вычислением по методу Бредфорда.

Изготовление экспериментальных образцов ассоциированной вакцины. Для иммунизации птиц готовили экспериментальные образцы ассоциированной вакцины на основе различных масляных адъюванюв Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA M 70 VG, Montanide ISA 50 V2, Montanide ESSAI PS 60404 (SEPPIC, Франция), и «Бионит» (Россия), образующих эмульсию типа «вода-масло» Стерильные адъювапты помещали в сосуд гомогенизатора «Silverson Sealed Unit» (Великобритания), и при скорости вращения ротора 1000 об/мин вносили смесь антигенных компонентов, после чего скорость вращения ротора увеличивали до 6000 об/мин Весовое соотношение адъювантов Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA M 70 VG, Montanide ESSAI PS 60404 и «Бионит» к антигенсодержащей жидкости (дисперсная фаза) составляло 70 30, а объемное соотношение адъюванта Montanide ISA 50 V2 составляло 50 50

Оценка физических свойств полученных образцов ассоциированной вакцины Образцы ассоциированных вакцин считали хорошего качества в следующих случаях Стабильность эмульсии - при хранении образцов при температуре 37°С в течение 14 сут, а также их центрифугировании отсутствовало отслоение водной фракции на дне пробирки, а отслоение верхней масляной фракции не превышало 10% от общего столба эмульсии, в ходе экспресс-теста отслоение водной фракции на дне пробирки не превышало 15% от общего столба эмульсии Вязкость - кинематическая вязкость вакцинной эмульсии не превышала 200 мм2/с Гранулометрический состав эмульсии — средний диаметр частиц дисперсной фазы вакцинной эмульсии не превышал 5,0 мкм, а индекс гомогенности (Span) составлял не более 2,4

Оценка иммуногенной активности ассоциированной вакцины.

Сущность метода заключается в определении способности вакцины вызывать

у привитой птицы выработку специфических антител Уровни сывороточных антител к вирусам НБ и ССЯ-76 определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) согласно действующим методическим указаниям и выражали в логарифмах с основанием 2 (Iog2) Специфическую активность сывороток к вирусам ИБК, ИББ и РВТ исследовали с помощью диагностических ИФА наборов фирмы Synbiotics (Франция) и ВНИИЗЖ и выражали в виде обратных значений

Оценка местных тканевых реакций на введение ассоциированной вакцины Наблюдение за клиническим состоянием привитых птиц и наружный осмотр области введения ассоциированной вакцины осуществляли ежедневно на протяжении 21 сут после прививки, по завершении этого периода проводили послеубойную визуальную оценку состояния тканей в месте инъекции на разрезе Результаты определения реактогенного действия вакцины оценивали комплексно, учитывая клиническое состояние птиц, результаты наружного осмотра, а также результаты послеубойной оценки степени поражения тканей, которую проводили по критериям предложенным Н Stone (1997)

Статистическая обработка результатов исследований. Для

обработки результатов исследований использовали статистические методы, применяемые в биологии

2.2. Результаты исследований

Обоснование компонентного состава ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ныокаслскон болезни, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсалышй болезни и реовирусного

теносиновита птиц

Расчет оптимального компонентного состава ассоциированной вакцины Было изготовлено 13 опытных образцов инактивированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ на основе адъювата Montanide ISA 70 VG, с различным содержанием антигенов

В соответствии с принятой технологией изготовления максимальное содержание антигенсодержащего материала в вакцине (D) составляло 30% (т е D!=0,300) Кроме этого, из инактивированных вирусов ИБК, ИББ и РВТ были приготовлены составы, включающие 1/2, 1/3, 1/4 и 1/5 (D]=0,15, D2=0,1, D3=0,075, D4=0,06), а из вирусов НБ и ССЯ-76 - 1/5, 1/6, 1/7,5 и 1/15 (D,=0,06, D2=0,05, D3=0,04, D4=0,02) указанной концентрации Было создано 14 групп из серонегативных к вирусам НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ цыплят в возрасте 40 сут по 5 голов в каждой, которых прививали внутримышечно в объеме 1,0 см3

Экспериментальные данные по- соответствующим специфическим компонентам, входящим в состав вакцин, характеризующие их иммуногенные свойства, представлены в табл 1 и 2

Таблица 1

Влияние концентрации инактивированных вирусов НБ и ССЯ-76 на иммуногенную активность ассоциированной вакцины против НБ, ИБК,

ССЯ-76, ИББ и РВТ

Разведение антигена Титр инфекционной активности вируса в вакцине, исходный и в соответствии с кратностью разведения, \е ЭПД50/см3 Титр антнтел к вирусу у кур в РТГА, iog2

НБ (10,5)

1/5 (D,=0.06) 9,3 9,2±0,4

1/6 (D2=0,05) 9,2 9,8±0,6

1/7,5 (D3=0,04) 9,1 8,8±0,5

1/15 (D4=0,02) 8,8 8,2±0,4

Минимальный титр 5

ССЯ-76 (7,0)

1/5 (D,=0,06) 5,8 11,6±0,2

1/6 (D2=0,05) 5,7 12,0±0,1

1/7,5 (D3=0,04) 5,6 12,0±0,1

1/15 (D4=0,02) 5,3 10,4±0,2

Минимальный титр 5

Показано, что ассоциированные эмульсионные вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ с максимальным (50-ти кратным) разведением инактивированных вирусов НБ и ССЯ-76 в водной фазе вызывали у привитых птиц формирование высоких уровней гуморальных антител значительно превышающих минимальные титры, используемые для оценки эффективности вакцины по этим компонентам (5 log2)

Данные, представленные в табл 2, свидетельствуют о том, что вакцина, содержащая в дисперсной фазе суспензию инактивированного вируса ИБК, разведенную в 16,7 раза, индуцировала у цыплят низкий уровень антител (755±221) по сравнению с минимально необходимым - 1642 Формирование титра антител (4196±164), превышающего минимально необходимый, стимулировал биопрепарат с 6,7-кратным разведением вируса ИБК Вакцина с максимальным (16,7-ти кратным) разведением инактивированных вирусов ИББ и РВТ в водной фазе вызывала у птиц образование уровней гуморальных антител, превышающих протективные титры, используемые для оценки эффективности вакцины 2810 и 2150, соответственно

Инакгивированные вирусы НБ и ССЯ-76 имели высокий запас иммуногенной эффективности, даже при 50-кратном их разведении они обеспечивали у привитых цыплят формирование высоких титров антител, а инактивированные вирусы ИББ и РВТ, разведенные в 16,7 раз, вызвали образование уровней антител, сравнимых с минимально необходимыми титрами

Таблица 2

Влияние концентрации инактивированных вирусов ИБК, ИББ и РВТ на иммуногенную активность пятивалентной вакцины против НБ, ИБК,

ССЯ-76, ИББ и РВТ

Титр инфекционной

Разведение антигена активности вируса в вакцнне, исходный и в соответствии с Титр антител к вирусу у кур в ИФА

кратностью разведения, 1йЭИД5„/см3, 1й ТЦД;о/см3

ИБК (7,2)

1/2 (Dj=0,15) 6,4 4196±164

1/3 (D2=0,1) 6,2 1108±380

1/4 (D3=0,075) 6,1 691±182

1/5 (D4=0,06) 6,0 755±221

Минимальный титр , 1642

ИББ (7,0)

1/2(D,=0,15) 6,2 5642±213

1/3(D2=0,1) 6,0 4893±376

1/4 (D3=0,075) 5,9 4597±551

1/5 (D4=0,06) 5,8 4112±182

Минимальный титр 2810

РВТ (7,0)

1/2 (D]=0,15) 6,2 2544±374

1/3 (D2=0,1) 6,0 2329±760

1/4 (D3=0,075) 5,9 2055±902

1/5 (D4=0,06) 5,8 2025±347

Минимальный титр 2150

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что изменение концентрации инактивированных вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в дисперсной фазе ассоциированной эмульсионной вакцины влияет на ее иммуногенные свойства и подчиняется зависимости «доза-эффект»

В дальнейшем были проведены расчеты минимальных титров инфекционной активности вирусов (до этапа инактивации), входящих в состав пятивалентной инактивированной вакцины, с использованием статистических методов В результате изучения иммуногенного действия вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в составе ассоциированной вакцины были построены 5 регрессионных моделей, выражающих зависимость «доза-эффект» Определяли влияние концентрации антигена в препарате на уровень антител, создаваемого вакциной в привитом стаде

Установлено (табл 3), что коэффициенты корреляции показателей lgTu„ и Тяг для всех совокупностей превышали величину г=0,81, что свидетельствует о весьма устойчивой связи типа «титр инфекционной активности вируса -*■ титр антител» Используя уравнения регрессионной модели, рассчитанные для каждого из 5 антигенов, входящих в состав

инактивированной вакцины, определили требуемые титры инфекционной активности вирусов в прививном объеме до инактивации С учетом статистических характеристик регрессионной модели данные величины находились в диапазоне доверительного интервала (7,25<^Тип<7,83) для вируса НБ, (6,01<^Тип<6,33) для вируса ИБК, (3,03<^Тип<3,61) для вируса ССЯ-76, (5,37<^Ти-<5,49) для вируса ИББ и (5,8<^Гип<6,1) для вируса РВТ

Таблица 3

Расчетные показатели концентрации антигенов, входящих в состав пятивалентной инактивированной вакцины

Антиген Уравнение типа У= А+Вх* р** Расчетные титры ннфекцнонной активности, 18 ЭИД50/смЗ, ТЦД50/смЗ

в прививком объеме вакцины, ^Тщ,, и диапазон доверительного интервала (Р<0,05) до инактивации, №

НБ Т5ег= - 14,4+2,57х 0,82 7,54, (7,25-7,83) 9,05

ИБК Т5ег =-53,35+8,91х 0,91 6,17,(6,01-6,33) 7,55

ССЯ-76 Т5ег= -4,5 +2,86х 0,81 3,32,(3,03-3,61) 4,83

ИББ Т5СГ= -17,05+3,66х 0,99 5,43, (5,37-5,49) 6,71

РВТ Т5СГ=-5,99+1,37х 0,96 5,94 (5,8-6,1) 7,32

Примечание * У - прогнозируемое значение титра антител в привитом поголовье для заданной концентрации антигена в вакцине А - параметр положения по

оси ординат, В - регрессионный коэффициент, ** - коэффициент корреляции

Дальнейшие расчеты показателей необходимых титров инфекционной активности вирусов в прививном объеме до инактивации выполняли на основании прогнозируемых оценок, вычисленных по соответствующим уравнениям, для вируса НБ - ^Тип=7,54, ИБК - ^Тип=б,17, ССЯ-76 -^Тш=3,32, ИББ - ^Ти„=5,43 и РВТ - ^Тип=7,32 При этом, с целью более осторожного прогноза, использовали значения верхней границы доверительного интервала данных показателей ^+Тип р<0,05 - 7,83 для вируса НБ, 6,33 для вируса ИБК, 3,61 для вируса ССЯ-76, 5,49 для вируса ИББ и 6,1 для вируса РВТ

Поскольку содержание антигенсодержащего материала в эмульсии составляет 30% (т е В=0,3), а содержание каждого из 5 компонентов соответственно 6% (30%/5=6%, т е 0=0,06), то значения титров были скорректированы соответственно коэффициенту разбавления материала

На основании проведенных расчетов определили минимальные титры инфекционной активности вирусов, входящих в состав пятивалентной инактивированной вакцины, до технологического этапа инактивации,

которые позволят обеспечить необходимый уровень иммуногенной активности биопрепарата

Исследования взаимосвязей показателей иммунологического действия вакцины предоставили возможность объективного прогноза наиболее важных в технологическом аспекте величин Были определены оценки необходимых титров инфекционной активности вирусов в прививном объеме пятивалентной вакцины, что, в свою очередь, позволило установить критерии для величин инфекционных титров этих вирусов в материале до инактивации Для удобства в практическом использовании (учитывая возможную ошибку экспериментальной оценки инфекционного титра) полученные показатели были округлены для вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ до значений 9,0, 7,5, 4,8, 6,7 ^ ЭИД50/см3 и 7,3 ТЦЦ50/см\ соответственно

Таблица 4

Количественные показатели для определения компонентного состава пятивалентной инактивированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76,

ИББ и РВТ

Вирус Фактический титр (lgT0) ннфскцнонной активности (М±ш) до инактивации п=10, lg ЭИД50/см3, lg tuiwcm3 Расчетный титр инфекционной активности до инактивации, ^ ЭИД5о/см3, тцд50/см3 К' Кк2

НБ 10,6 ±0,14 9,0 0,025 40

ИБК 7,3 ± 0,05 7,5 1,7 0,6

ССЯ-76 7,2 ±0,13 4,8 0,004 251

ИББ 6,8 ± 0,09 6,7 0,8 1,3

РВТ 7,6 ± 0,04 7,3 0,5 2,0

Примечание: 1 - коэффициент концентрации, 2 - коэффициент кратности концентрации

В табл 4 представлены результаты статистических расчетов инфекционной активности нативных вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, расчетных титров этих вирусов, необходимых для изготовления инактивированной вакцины, а также коэффициенты концентрации Показано, что титры инфекционной активности вирусов НБ, ССЯ-76, ИББ и РВТ превышали расчетные минимальные титры для изготовления поливалентной вакцины, и их вычисленные коэффициенты концентрации выполняют необходимое условие (К<1)

Только инфекционный титр вируса инфекционного бронхита кур был ниже расчетного минимального титра (К>1) Поэтому при компоновке пятивалентной вакцины необходимо увеличивать объем инактивированного вируса ИБК в водной фазе как минимум в 1,7 раза за счет снижения объемов инактивированных вирусов НБ и ССЯ-76, которые имеют более чем Ю- и

100-кратный запас концентрации по инфекционной активности Таким образом, окончательно схема компоновки ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ представлена в табл 5

Таблица 5

Компонентный состав пятивалентной инактивированной вакцины

Антиген НБ ССЯ-76 ИБК ПББ РВТ

Объем 0,5 0,5 2,0 1,0 1,0

Разведение 1 9 1 9 1 1,5 1 4 1 4

Примечание: принимая 1 (единицу) за условный полный объем при равном объемном соотношении антигенов

Поскольку титры инфекционной активности производственных расплодок вирусов НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ представлены в виде средних значений из выборки в 10 вариант, то можно считать эти показатели технологическими и окончательными, поэтому рассчитанный компонентный состав для пятивалентной инактивированной эмульсионной вакцины является также окончательным, и он был рекомендован к использованию в технологии производства биопрепарата

Разработка методики концентрирования вируса ИБК с помощью проточной ультрафильтрации. Как было показано выше, инактивированный вирус ИБК обладает недостаточной иммуногенной активностью в составе ассоциированной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ, поэтому требуется увеличение его объема в водной фазе за счет уменьшения концентрации других специфических антигенных компонентов Если повышение концентрации вируса ИБК в прививном объеме за счет увеличения его объемного содержания по каким-либо причинам невозможно, то в качестве альтернативного способа можно использовать концентрирование Для этого использовал^ метод проточной ультрафильтрации, как наиболее щадящий и технологичный Было сконцентрировано 4 партии суспензии инактивированного вируса ИБК объемом по 10 л каждая через фильтры с отсекающей способностью от 30 до 300 кДа со средней кратностью концентрирования по объему 30 раз Наиболее оптимальным оказалось использование фильтрующих модулей с отсекающей способностью более 50 кДа, поскольку при этом потери вируса в фильтрат были минимальными Далее с использованием данных модулей были получены 5- и 10-кратные концентраты инактивированного вируса ИБК, на основе которых были изготовлены эмульсионные вакцины

Результаты иммунизации цыплят обычной вакциной против ИБК и концентрат-вакцинами представлены в табл 6, из которых следует, что вакцина с исходным антигеном индуцировала 4-кратную сероконверсию до титра 1 5913, а биопрепараты, приготовленные из 5- и 10-кратных

концентратов, вызывали образование антител в более высоких уровнях 1 12327 и 1 17884, соответственно

Таблица 6

Иммуногенная активность вакцин, содержащих концентраты инактивированного вируса ИБК

Кратность концентрата вируса ИБК в вакцине Титры антител в ИФА через, сут.

До вакцинации 14 28

исходный 1 1490 1 1781 1 5913

5 1 3203 1 12327

10 1 13813 1 17884

Контроль 1 1600 1 1523

Таким образом, применение проточной ультрафильтрации с использованием модулей с отсекающей способностью более 50 кДа для концентрирования вируса ИБК было эффективным и приводило к значительному увеличению антигенной активности вакцины Полученные в ходе этих экспериментов результаты легли в основу «Методики концентрирования вируса инфекционного бронхита кур при помощи проточной ультрафильтрации», которая была одобрена ученым советом и утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ»

Разработка методов контроля физических свойств инактнвированных эмульсионных вакцин

Разработка методики экспресс-определения стабильности эмульсионной вакцины с типом эмульсии «вода-масло» В опытах был разработан простой и быстрый в технологическом плане экспресс-метод определения стабильности масляных вакцин с типом эмульсии «вода-масло» путем последовательного замораживания и оттаивания эмульсии Принцип предлагаемого метода определения стабильности эмульсий обратного типа заключается в том, что образец инактивированной вакцины замораживали при температуре минус 40°С в течение 1 ч, после чего пробирки с вакциной помещали на 1 ч в термостат с температурой 37°С В результате такого воздействия р нестабильных и неоднородных эмульсиях происходило отслоение водной фазы Для сравнения новой методики с методом «быстрого старения» и пробой центрифугированием бьши изготовлены образцы эмульсионных вакцин с продолжительностью эмульгирования от 2 до 12 мин, и проведены параллельные эксперименты На основе полученных результатов были предложены следующие критерии оценки стабильности эмульсионных вакцин при исследовании в экспресс-методе по отслоению водной фазы более 15% - не удовлетворительно, от 5 до 15% -удовлетворительно и менее 5% - хорошо Данная методика была опробована при определении стабильности нескольких образцов эмульсионных вакцин

различных производителей, а также при определении стабильности вакцинной эмульсии на нескольких этапах ее диспергирования при промышленном производстве Новый тест был более чувствительным по сравнению с определением стабильности эмульсии центрифугированием и требовал минимальных затрат времени в сравнении с тестами «быстрого старения» Результаты этих экспериментов легли в основу методики «Экспресс-метод определения стабильности инактивированной вакцины с обратным типом эмульсии «вода-масло»», одобренной ученым советом и утвержденной директором ФГУ «ВНИИЗЖ»

Разработка метода лазерной гранулометрии эмульсионных вакцин Из доступных методов количественного изучения дисперсных свойств эмульсий наибольший интерес и перспективу представляет лазерная дифракционная гранулометрия, которая была успешно адаптирована и испытана Для этого с использованием лабораторного оборудования было изготовлено 5 образцов эмульсионных вакцин с различной степенью готовности (предэмульсия, эмульгирование в течение от 1 до 7 мин) Результаты измерений частиц дисперсной фазы эмульсий типа «вода-масло» лазерной гранулометрией с помощью анализатора «Microtrac S3 500» (США) контролировали визуальной оценкой состояния эмульсии на световом микроскопе «Olympus ВХ40» (Япония) Испытуемый метод показал, что размер частиц дисперсной фазы эмульсии зависит от времени диспергирования водно-масляной смеси, те с увеличением времени диспергирования средний размер частиц становится меньше, что визуально подтверждалось микроскопическими исследованиями Исследования показали возможность использования описанного метода в качестве одного из звеньев контроля качества вакцины непосредственно в процессе промышленного производства биопрепаратов, который позволял быстро и точно определять размер частиц дисперсной фазы эмульсии и ее однородность Эти результаты легли в основу «Методики лазерной гранулометрии эмульсионных вакцин», которая была одобрена ученым советом и утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ»

Изучение иммунобиологических и физических свойств ассоциированных вакцин на основе различных адъювантов

На основе определенного оптимального компонентного состава вакцины нами были изготовлены несколько образцов ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины с использованием нескольких масляных адъювантов Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA M 70 VG, Montanide ISA 50 V2, Montanide ESSAI PS 60404 (SEPPIC, Франция) и масляный адъювант фирмы «Бионит» (Россия)

Изучение физических свойств ассоциированных вакцин на основе различных масляных адъювантов Оценивали такие физические параметры приготовленных вакцин, как тип полученной эмульсии, стабильность вакцинной эмульсии (использовали метод центрифугирования, метод

«быстрого старения», экспресс-метод), гранулометрические свойства (средний размер частиц эмульсии, гомогенность) и кинематическая вязкость

Все образцы имели кинематическую вязкость значительно ниже предела, установленного нормативной документацией - 200 мм2/с Определение стабильности образцов ассоциированных вакцин в тестах центрифугирования, «быстрого старения» и экспресс-метода показало хорошее качество эмульсии почти у всех испытуемых образцов, за исключением ассоциированной вакцины, приготовленной на основе масляного адъюванта Montanide ISA 50 V2, поскольку во всех тестах было обнаружено отслоение водной фракции При изучении результатов лазерной гранулометрии образцов ассоциированной вакцины было обнаружено, что масляные адъюванты Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA M 70 VG, Montanide ESSAI PS 60404 и «Бионит» образуют так называемую «тонкую» эмульсию, что подтверждается средним диаметром частиц дисперсной фазы вакцинных эмульсий, которые имели следующие значения 0,821 мкм, 0,921 мкм, 3 мкм и 1,082 мкм, соответственно, с индексом гомогенности (Span) не более 0,9 Такие размеры частиц дисперсной фазы эмульсий обратного типа являются допустимыми, поскольку известно, что наиболее оптимальной иммунологической эффективностью обладают вакцины, размер микрочастиц которых менее 5 мкм При изучении гранулометрического состава эмульсионной вакцины, изготовленной на основе масляного адъюванта Montanide ISA 50 V2, было обнаружено, что средний диаметр частиц дисперсной фазы составил 10,04 мкм, и размер частиц колебался в широких пределах - от 7,65 до 14,1 мкм При этом прослеживается прямая зависимость между крупным размером частиц дисперсной фазы вакцины, изготовленной на основе адъюванта Montanide ISA 50 V2, и ее неудовлетворительной стабильностью. -

Изучение иммуногенной активности ассоциированных вакцин на основе различных масляных адыовантов. Экспериментальными ассоциированными инактивированными биопрепаратами против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ, приготовленными с использованием масляных адъювантов серии Montanide и «Бионит», вакцинировали птиц в возрасте 90 сут, внутримышечно, в прививном объеме 1,0 см3 Подопытные птицы были получены из товарного птицеводческого хозяйства яичного направления, где ранее были иммунизированы живыми вакцинами против НБ, ИБК, ИББ и РВТ в соответствии со схемой специфической профилактики, принятой на птицефабрике Изучение иммуногенной активности каждого специфического компонента в составе ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ проводили в динамике, отбирая образцы крови у цыплят до вакцинации (Д/В), а также через 14, 28 и 60 сут после нее Показано, что все испытуемые вакцины, содержащие различные адъюванты, вызывали у привитых птиц формирование выраженного иммунитета к вирусу НБ, причем повышение титров антител происходило постепенно в соответствии со сроками взятия крови (табл 7)

Таблица 7

Антигенная активность экспериментальных образцов ассоциированных вакцин, изготовленных на основе

различных масляных адыовантов

Адыовант Титры антител к антигену / сут после вакцинации

НБ 1о22 ИБК* ССЯ-76,1о§2

Д/В 14 28 60 Д/В 14 28 60 Д/В 14 28 60

М 1БА 70 Ув 7,2±0,3 13,1±0,5 14,7±0,3 16,4±0,3 3184±782 7133±965 9442±1328 8582±481 Н/О 7,8±0,4 9,4±0,4 10,5±0,5

М КАМ Ув 7,5±0,3 8,9±0,3 11,2±0,4 12,0±0,6 4082±724 4134±713 6492±674 7065±1460 Н/О 5,8±0,5 10,1±0,7 11,2±0,4

М ША 50 У2 6,4±0,4 12,8±0,5 13,5±0,4 14,4±0,4 2793±657 5788±637 7967±997 10720±1402 Н/О 7,3±0,7 9,8±0,2 10,4±0,5

М Ев8А1 РБ 60404 6,0±0,2 7,2±0,2 9,1±0,7 10,2±0,5 3955±659 4422±861 5442±1254 9026±355 Н/О 5,0±0,5 7,4±0,5 10,7±0,5

«Бионит» 7,1 ±0,4 12,7±0,7 14,6±0,6 15,2±0,3 3485±557 5316±420 6847±781 7985±983 Н/О 7,5±0,3 9,7±0,6 10,3±0,9

Контроль 6,5±0,3 6,1±0,3 6,0±0,5 6,7±0,2 4537±1089 1891±331 1968±486 1731±409 Н/О Н/О Н/О Н/О

Продолжение таблицы 7

Адыовант Титры антител к антигену / сут после вакцинации

ИББ* РВТ*

д/в 14 28 60 Д/В 14 28 60

М 1ЭА 70 УО 3008±476 3485±640 7235±841 6406±621 2758±132 3507±439 4376±616 3708±367

М 1БА М Ув 3123±644 4113±498 5667±737 6230±563 2613±196 2926±325 3988±547 4130±871

М ИА 50 У2 3234±513 4416±634 5306±397 5500±489 2530±207 3912±396 4856±716 4061±731

М Е88А1 Р8 60404 2712±377 3727±789 5370±833 .4768±816 2331±168 3064±177 4387±284 4651±368

«Бионит» 3011±398 3639±691 4908±885 5710±913 2677±341 3555±410 3901±399 4532±461

Контроль 3490±590 3100±509 3298±735 3097±402 2624±169 2103±99 200Ш61 1821±151

Примечания Н/О - не обнаружено, Д/В - до вакцинации, * - титры антител определены в ИФА и выражены в виде обратных значений

В абсолютных значениях показателей титров антител к вирусу НБ наибольшей иммуногенной активностью обладали вакцины, изготовленные на основе адъювантов Montamde ISA 70 VG, Montanide ISA M 70 VG и «Бионит», через 14 сут после прививки, уровни антител у птиц составляли от 12,7 до 13,1 log2, такая же зависимость наблюдалась и на 28 сут после иммунизации - титры антител увеличились до 14,4-16,4 log2 Вакцины, имеющие в своем составе адъюванты Montanide ISA 50 V2 и Montanide ESSAI PS 60404, обладали менее выраженной иммуногеностью, через 28 суг после вакцинации значения титров антител у кур составляли 11,2±0,4 log2 и 9,1 ±0,7 log2, соответственно Следует отметить, что у всех птиц уровни специфических антител к вирусу НБ через 28 сут после иммунизации значительно превышали минимальный защитный уровень - 5,0 log2 Также, у всех кур иммунизированных экспериментальными ассоциированными вакцинами отмечалась сероконверсия в отношении вируса ИБК

Все 5 образцов вакцин индуцировали у привитых птиц напряженный иммунитет к вирусу ССЯ-76, причем динамика его развития по срокам исследования была сравнимой для всех испытанных препаратов Однако в группах птиц, вакцинированных биопрепаратами на основе масляных адъювантов Montanide ISA M 70 VG и Montanide ESSAI PS 60404, динамика образования титров антител была несколько ниже первой группы, представленной адъювантами Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA 50 VG и «Бионит», уровни антигемагглютининов у птиц через 14 сут сосгавляли 5,8±0,5 log2 и 5,0±0,5 log2, а через 28 сут - 10,1±0,7 log2 и 7,4±0,5 Iog2, соответственно Тем не менее, через 60 сут после вакцинации их уровни были сравнимы с препаратами первой группы

Испытуемые ассоциированные биопрепараты обладали иммуногенной активностью и по специфическому компоненту ИББ, но динамика формирования иммунитета у привитых птиц была неравномерной, через 14 сут после вакцинации отмечали незначительный прирост титров антител, а наиболее значительный подъем был зафиксирован через 28 сут, который продолжался до 60 сут

Высокий иммунитет к вирусу РВТ создавался при применении всех ассоциированных инактивированных эмульсионных вакцин, причем повышение титров антител происходило постепенно, и к 28 сут после прививки в группах птиц, получивших биопрепараты на основе масляных адъювантов Montanide ISA M 70 VG и «Бионит», достигали значений -3988±547 и 3901±399, соответственно, а в группах кур, иммунизированных вакцинами на основе Montanide ISA 70 VG, Montamde ESSAI PS 60404 и Motanide ISA 50 V2, титры антител были примерно одинаковыми и имели значения в пределах 4376-4856, т е превышали требуемый минимальный защитный уровень специфических антител - 2150

Изучение реактогеиных свойств ассоциированных вакцин изготовленных на основе различных адъювантов. С этой целью была проведена вакцинация птиц внутримышечно, в область груди, по 1,0 см3

биопрепаратами на основе масляных адъювантов серии Montanide и «Бионит» По окончании срока наблюдений (21 сут) всех птиц подвергали эвтаназии, вскрывали места введения и оценивали изменения тканей по критериям, предложенным H Stone (1997)

Результаты осмотра мест инъекции биопрепаратов показали, что реактогенные свойства эмульсионных вакцин, изготовленных на основе различных адъювантов, были разными - от легкой степени до сильных поражений Так, наибольшей реактогенностью обладала ассоциированная вакцина на основе масляного адъюванта Montanide ISA M 70VG, которая вызывала у цыплят в местах введения сильные воспалительные реакции Вакцины на основе масляных адъювантов Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA 50 V2, Montanide ESSAI PS 60404 и «Бионит» индуцировали в месте инъекции изменения тканей легкой степени, без развития выраженных воспалительных реакций

Таким образом, ассоциированная инактивированная вакцина с эмульсией обратного типа, полученная на основе адъюванта Montanide ISA 70 VG, имела стабильную эмульсию, была безвредна для цыплят и обладала выраженными иммуногенными свойствами по всем пяти антигенным компонентам (НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ), индуцировала более чем двукратный прирост титров антител относительно фоновых уровней и может быть рекомендована для «бустерной» иммунизации птицепоголовья

Комиссионные испытания ассоциированной вакцины против НБ, ИБК,

ССЯ-76, ИББ и РВТ

В соответствии с приказом директора ФГУ «ВНИИЗЖ» на базе лаборатории аденовирусных инфекций птиц были проведены комиссионные испытания эффективности ассоциированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ инактивированной эмульсионной

Компоновку биопрепарата осуществляли согласно рассчитанным технологическим критериям, полученную смесь инактивированных вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ объединяли с масляным адъювантом Montanide ISA 70 VG в весовом соотношении 30 70, и диспергировали с помощью лабораторного гомогенизатора «Silverson Sealed Unit»

Испытание иммуногенной активности опытной вакцины осуществляли на 20 цыплятах в возрасте 70 сут, 10 из которых иммунизировали внутримышечно в прививном объеме 1 см3, а 10 оставили в качестве контрольной группы Отбор крови для получения сывороток осуществляли до вакцинации, через 14, 28 и 60 сут после ее проведения Сыворотки крови исследовали методом РТГА на наличие антител к вирусам НБ и ССЯ-76 и методом ИФА (коммерческие наборы фирмы «Synbiotics») на наличие антител к вирусам ИБК, ИББ и РВТ

Результаты исследований титров антител у привитых птиц к каждому антигенному компоненту ассоциированной вакцины приведены в табл 8

Таблица 8

Результаты комиссионных испытаний иммуногенной активности ассоциированной вакцины

Антигенный компонент Титры антител

Минимальные титры Фактические титры, сут наблюдений

ДЛВ 14 28 60

НБ 5 log2 6,7±0,9 11,1±0,5 13,4±0,3 16,7±0,3

Контроль 6,2±0,6 6,9±0,5 6,5±0,7 5,9±0,9

ИБК 1642* 1524±402 4135±265 9552±567 8692±381

Контроль 1673±165 1709±455 1668±398 1743±404

ССЯ-76 5 log2 н/о 8,8±0,4 12,3±0,6 10,4±0,4

Контроль н/о н/о н/о н/о

ИББ 2810* 1733±300 3421±399 5177±390 4867±686

Контроль 1887±487 1924±505 1799±571 1744±724

РВ 2150* 2388±332 4007±879 4320±544 5329±507

Контроль 2299±409 2103±388 2244±421 2509±390

Примечания Д/В - титры антител до вакцинации, н/о - не обнаружено,* - два минимальных положительных значения

Установлено, что титры антител к вирусам НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ у цыплят через 28 сут после прививки значительно увеличивались по сравнению с исходными титрами, в несколько раз превышали требуемые минимальные титры ко всем антигенным компонентам вакцины и сохранялись на высоком уровне в течение всего срока наблюдений (60 сут) Опытный образец вакцины обладал высокой иммуногенной активностью и вызывал у цыплят формирование высокого уровня антител к вирусу НБ, причем прирост титров регистрировался в течение всего срока наблюдений и достигал максимального значения 16,7±0,3 log2 через 60 сут По компонентам ИБК и ССЯ-76 наивысший прирост антител наблюдался через 28 сут и составлял 9552±567 и 12,3±0,6 log2, соответственно Испытуемая вакцина обладала высокой иммуногенной активностью и вызывала формирование высоких титров антител к вирусу ИББ с достижением максимальных значений через 28 сут после вакцинации - 5177±390, а к вирусу РВТ прирост титров антител происходил равномерно в течение всего эксперимента и достигал максимального значения 5329±507 через 60 сут после иммунизации В заключение отмечено, что вакцина вызывала формирование титров антител, которые более чем в 2 раза превышали минимальные защитные титры, обеспечивающих защиту от соответствующих инфекций При макроскопическом осмотре мест введения вакцины отмечены изменения тканей легкой степени по классификации Н Stone

Производственные испытания экспериментальной серии ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в условиях птицефабрики «Ивановский бройлер» показали высокую эффективность биопрепарата Ремонтный молодняк в количестве 12000 голов, предварительно праймированный живыми

вакцинами против НБ, ИБК, ИББ и РВТ согласно схемам, принятым на предприятии, прививали в возрасте 70 сут ассоциированной вакциной Через 1 мес после иммунизации в опытной группе птиц был отмечен, относительно исходных значений, более чем двукратный прирост титров антител к специфическим компонентам вакцины, которые оставались на высоком уровне в течение всего срока наблюдений (280 сут)

Таким образом, в результате проведенных исследований были установлены и обоснованы такие важные с технологической точки зрения критерии, как оптимальный сбалансированный состав специфических компонентов в дисперсной фазе и эффективная дисперсная среда (масляный адъювант Montanide ISA 70 VG) для ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, имеющей стабильные физические свойства, низкую реактогенность и выраженную иммуногенную активность Основные технологические параметры изготовления ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, определенные в ходе лабораторных исследований, были положены в основу комплекта НД (Промышленный регламент, СТО, инструкция по применению) на данный биопрепарат

3. ВЫВОДЫ

1 Определены и обоснованы основные технологические параметры (минимальные титры инфекционной активности специфических компонентов в прививном объеме, компонентный состав дисперсной фазы, дисперсная среда - адъювант) для изготовления ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни птиц,| инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц

2 Установлены минимальные титры инфекционной активности вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в прививном объеме ассоциированной эмульсионной вакцины, обеспечивающие у кур выработку протективных уровней антител к этим компонентам Эти величины должны составлять для антигена НБ - 7,54 lg ЭИД50/см3, ССЯ-76 - 3,32 Ig ЭИД50/см3, ИБК - 6,17 lg ЭИД50/см3, ИББ - 5,43 lg ЭИД50/см3 и РВТ - 5,94 lg ТЩЬо/см3

3 Определены минимальные значения титров инфекционной активности вирусов до инактивации, необходимые для изготовления ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины для вируса НБ - 9,0 lg ЭИД50/см3, ИБК - 7,5 lg ЭИД50/см3, ССЯ-76 - 4,8 lg ЭИД50/см\ ИББ - 6,7 lg ЭИД50/см3 и РВТ -7,3 lg ТЦЦ50/см3

4 Разработан метод концентрирования инактивированного вируса ИБК с помощью проточной ультрафильтрации, позволяющий при 30-кратном по объему концентрировании увеличить активность вирусного материала при исследовании в Б-ИФА с 1 3200 до 1 204800

5 Для технологического контроля при производстве инактивированных биопрепаратов с типом эмульсии «вода-масло» разработан экспресс-метод

определения стабильности вакцин, основанный на последовательном воздействии на образец низкой и высокой температуры

6 Разработан количественный метод оценки дисперсных свойств (размер частиц дисперсной фазы и гомогеннсть эмульсии) эмульсионных вакцин с типом эмульсии «вода-масло» с помощью лазерной дифракционной гранулометрии

7 При сравнительных испытаниях масляных адъювантов серии Montanide и «Бионит» в составе ассоциированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ показано, что биопрепарат на основе адъюванта Montanide ISA 70 VG превосходил другие вакцины по физическим (стабильность, реологические показатели) и иммунобиологическим (иммуногенность, безвредность) свойствам

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предложены следующие методики, которые одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ»

1 «Методика экспресс-определения стабильности эмульсионных вакцин с типом эмульсии «вода-масло»» (2005 г),

2 «Методика концентрирования вируса инфекционного бронхита кур при помощи проточной ультрафильтрации» (2008 г),

3 «Методика лазерной гранулометрии эмульсионных вакцин» (2008 г)

Результаты научных исследований по определению основных технологических параметров при конструировании ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ были использованы при составлении следующей нормативной документации, одобренной ученым советом, утвержденной директором ФГУ «ВНИИЗЖ»

1 Промышленный регламент на производство ассоциированной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной серии «Пентавис»,

2 СТО на ассоциированную вакцину против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированную эмульгированную серии «Пентавис» (СТО 004955270082-2008),

3 Инструкция по применению ассоциированной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и

реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной серии «Пентавис»

5. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Определение размера частиц дисперсной фазы инактивированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 /ДА Лозовой, В В Борисов, А А Егоров, Д Л. Долгов // Птахшництво Материал1 IV Украшско1 конференции по птахивництву з мшнародною участю - вип 53 - xapkib, 2003 - С 586-591

2 Изучение иммуногенных свойств концентратов инактивированного вируса инфекционного бронхита кур /ДА Лозовой, В В Борисов, Д.Л. Долгов, Н Н Луговская, С В Фролов, А П Пономарев // Птахтнитцтво Материал! V Украшско1 конференции по птахивництву з мшнародною участю - вип 55 - Харив, 2004 - С 539-543

3 Ассоциированная инактивированная вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, реовирусного теносиновита и инфекционной бурсальной болезни птиц и ее физико-биологические свойства / В В Борисов, Д А Лозовой, Д.Л. Долгов, А В Борисов, Н Н Луговская, В Н Ирза, Т В Оковытая, С К Старов, Г И Кожаева // Труды Федерального центра охраны здоровья животных - Владимир, 2005 - Т 3 - С 292-302

4 Влияние концентрации балластных белков в водной фазе инактивированной вакцины на стабильность эмульсии / Д Л. Долгов, Д А Лозовой, В В Борисов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных - Владимир, 2005 - Т 3 - С 303-308

5 Лозовой, Д А Изучение дисперсных свойств вакцины с обратным типом эмульсии разными методами /ДА Лозовой, В В Борисов, Д.Л. Долгов, А А Егоров // Акт пробл и перспект разв агропром комплекса Пробл агроэкономики, вет мед и биотехнол в жив-ве - Иваново, 2005 - Т 2 -С 121-128

6 Экспресс-тест определения стабильности масляных вакцин с эмульсией обратного типа //ДА Лозовой, В В Борисов, Д Л. Долгов, В И Филатов, ЮВ Зуев // Сб научн тр ВГНКИ - М , 2005 -т65 - С 119-128

7 Контроль физических свойств инактивированных эмульсионных вакцин против вирусных болезней птиц /ДА Лозовой, В В Борисов, Д.Л. Долгов, Борисов А В , Егоров А А // Сб науч тр ВГНКИ - М , 2005 - Т 66 - С 99-106

8 Долгов, ДЛ Динамика формирования гуморальных антител к вирусам НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ у кур, привитых ассоциированной инактивированной вакциной / Д Л. Долгов, В В Борисов, С В Фролов, А В Борисов//Ветеринарная патология -2007 - №4 - С 147-152

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»), 90 экз , 2008 г

Актуальность темы. В условиях современного промышленного птицеводства, характеризующегося интенсивным выращиванием птиц на ограниченных площадях, возникает опасность возникновения массовых инфекционных болезней, которые приводят к значительным экономическим потерям (57, 68, 81). При этом, большую значимость приобрели такие вирусные инфекции, как ньюкаслская болезнь (НБ), синдром снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76), инфекционный бронхит кур (ИБК), инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) и реовирусный теносиновит (РВТ). Распространение этих заболеваний в последнее время приобрело мировой масштаб (14, 26, 37, 38).

Кроме общих противоэпизоотических мероприятий, краеугольным камнем борьбы с этими болезнями является специфическая профилактика, заключающаяся в массовой иммунизации поголовья птиц живыми и инактивированными вакцинами по специально разработанным схемам (4, 12, 22, 43, 57, 58, 70, 81, 100, 102, 113, 116, 143, 194).

Однако нередко эпизоотическая обстановка, складывающаяся на птицеводческих предприятиях, диктует многократное применение птицам различных возрастных групп биопрепаратов против 8-11 инфекционных болезней. Вследствие часто повторяющихся массовых вакцинаций практически не прекращается воздействие стресс-факторов и нагрузка на иммунную систему птиц, что отрицательно сказывается на формировании надёжной защиты, а также приводит к увеличению затрат труда ветеринарных специалистов при выполнении массовых иммунизаций (54, 55, 93).

В последние годы зарубежная и отечественная ветеринарная практика всё чаще использует ассоциированные инактивированные эмульсионные вакцины с обратным типом эмульсии, применение которых эффективно дополняет использование живых вакцин и позволяет обеспечить у привитых кур напряженный уровень иммунного ответа на протяжении всего продуктивного периода, снизить потери молодняка птиц от инфекционных заболеваний в раннем возрасте за счёт передачи потомству высокого уровня материнских антител (40, 41, 146, 158, 253).

Однако публикации, посвященные этой тематике, содержат в основном описание иммунобиологических свойств (иммуногенность, безвредность) ассоциированных инактивированных вакцин против вирусных болезней птиц и не касаются таких важных вопросов, возникающих при конструировании биопрепаратов, как определение параметров оптимального соотношения специфических компонентов в дисперсной фазе и среде (адъювант). В доступной литературе имеются отдельные данные, отражающие зависимость «доза-эффект» у живых вакцин против НБ, ИББ, ИБК и РВТ, а также у некоторых инактивированных моновалентных биопрепаратов (14, 15, 16, 20, 35, 36, 73, 115, 118).

Поиски адъюванта для производства вакцин, сбалансированного по целому ряду важных требований (высокая эффективность, физическая стабильность, низкие реологические показатели, безвредность, универсальность, технологическая совместимость, доступность, низкая стоимость), остаются актуальными и по сей день и по ряду причин осуществляются на эмпирическом уровне. Многими исследователями, как экспериментально, так и на практике, доказаны преимущества использования масляных адъювантов с обратным типом эмульсии в производстве инактивированных вакцин для птиц (18, 35, 36, 39, 235, 258, 259).

В.А. Bokhout et al. (1986) и В.А. Сергеев (1998) сообщили, что размер частиц дисперсной фазы эмульсии и её гомогенность напрямую влияют на иммунологические свойства инактивированных эмульсионных вакцин, поскольку биопрепараты с размером частиц эмульсии менее 1 мкм более доступны для захвата макрофагами и последующей презентации клеткам иммунной системы. Однако эти экспериментальные работы выполнялись с использованием сложных и нестандартных методик определения размера частиц дисперсной фазы, что ограничивает их широкое применение.

Открытие метода лазерной дифракционной гранулометрии позволяет значительно упростить процедуры контроля качества физических свойств эмульсионных биопрепаратов и внедрить их в производственный процесс (256,271).

Таким образом, определение таких наиболее важных в технологическом аспекте величин и показателей, как минимальные титры инфекционной активности специфических компонентов в прививном объёме до этапа инактивации, компонентный состав дисперсной фазы, дисперсная среда (адъювант) при конструировании ассоциированной пятивалентной инактивированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ является весьма актуальным для ветеринарной биотехнологии и требует своего решения.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является определение основных технологических параметров (минимальные титры инфекционной активности специфических компонентов в прививном объёме, компонентный состав дисперсной фазы, дисперсная среда -адъювант) при изготовлении ассоциированной пятивалентной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• подобрать и обосновать оптимальный компонентный состав (соотношение специфических антигенов в дисперсной фазе; дисперсную среду) ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц;

• разработать методику концентрирования вируса инфекционного бронхита кур для изготовления ассоциированной вакцины;

• выбрать масляный адъювант, позволяющий получать стабильную и безвредную ассоциированную вакцину против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, с выраженными иммуногенными «рвойствами;

• разработать с использованием современного оборудования количественный метод оценки эмульсии типа .«вода-масло», получаемой в процессе изготовления инактивированных вакцин;

• изучить физические и иммунобиологические свойства ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц;

• разработать нормативную документацию на ассоциированную инактивированную эмульсионную вакцину против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц.

Научная новизна. Подобран и обоснован оптимальный компонентный состав ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц.

Определены оптимальные технологические параметры концентрирования инактивированного вируса ИБК с помощью проточной ультрафильтрации для изготовления ассоциированной вакцины.

Изучена стабильность ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ с типом эмульсии «вода-масло» на различных этапах эмульгирования с помощью стандартных методов, а также при ' последовательном воздействии температуры минус 40°С и плюс 37°С.

С помощью метода лазерной дифракционной гранулометрии проведен количественный анализ дисперсных свойств ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ с типом эмульсии «вода-масло» в процессе изготовления.

Изучены физические и иммунобиологические свойства ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ,

ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, приготовленной с учётом обоснованных технологических параметров.

Практическая значимость. Для практического использования предлагаются следующие методические указания, которые проверены комиссионно, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ»:

1. «Методика экспресс-определения стабильности эмульсионных вакцин с типом эмульсии «вода-масло»» (2005 г.);

2. «Методика концентрирования вируса инфекционного бронхита кур с помощью проточной ультрафильтрации» (2008 г.);

3. «Методика лазерной гранулометрии эмульсионных вакцин» (2008 г.).

Результаты научных исследований были использованы при составлении следующей нормативной документации:

• Промышленный регламент на производство вакцины ассоциированной против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной серии «Пентавис»;

• СТО на вакцину ассоциированную против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированную эмульгированную серии «Пентавис» (СТО 004955270082-2008);

• Инструкция по применению вакцины ассоциированной против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной серии «Пентавис».

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

• Компонентный состав ассоциированной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульсионной. Метод концентрирования вируса инфекционного бронхита кур с помощью проточной ультрафильтрации.

• Метод экспресс-определения стабильности эмульсионных вакцин с типом эмульсии «вода-масло».

• Количественный метод изучения дисперсных свойств эмульсионных вакцин.

• Результаты оценки иммунобиологических и физических свойств ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц.

Апробация результатов работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: «IV Украинская конференция по птицеводству с международным участием» (Харьков, 2003 г.), «Международная научная конференция молодых учёных» (Владимир, 2004 г.), «Актуальные проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса: Проблемы агроэкономики, ветеринарной медицины и биотехнологии в животноводстве» (Иваново, 2005 г.), «Международная научно-практическая конференция молодых учёных «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику»» (Владимир, 2008 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2003-2008гг.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 1 работа опубликована в издании по перечню ВАК.

Доля личного участия соискателя. Представленные в диссертации экспериментальные исследования и анализ полученных результатов выполнены автором самостоятельно. В ходе работы практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ФГУ «ВНИИЗЖ» и ФГУ «ВГНКИ»: доктор биологических наук А.П. Пономарёв (раздел «Разработка методики концентрирования вируса ИБК с помощью проточной ультрафильтрации»); кандидаты ветеринарных наук С.В. Фролов и В.Ю. Кулаков (раздел «Обоснование компонентного состава ассоциированной инактивированной эмульгированной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ»); кандидаты ветеринарных наук Д.А. Лозовой и Ю.В. Зуев, А.А. Егоров (раздел «Разработка методики экспресс-определения стабильности эмульсионной вакцины с типом эмульсии «вода-масло»»); кандидаты ветеринарных наук О.А. Борисова, В.Н. Ирза, Т.В. Оковытая, С.К. Старов, Г.И. Кожаева (раздел «Изучение иммуногенной активности ассоциированных вакцин на основе различных масляных адъювантов»), за что выражаем им искреннюю благодарность за оказанную помощь.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который состоит из 288 источников, в том числе 119 работ на русском языке. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 25 рисунками и дополнена приложением документов, подтверждающих внедрение.результатов работы в ветеринарную практику.

5. ВЫВОДЫ

1. Определены и обоснованы основные технологические параметры (минимальные титры инфекционной активности специфических компонентов в прививном объёме, компонентный состав дисперсной фазы, дисперсная среда -адъювант) для изготовления ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц.

2. Установлены минимальные титры инфекционной активности вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в прививном объёме ассоциированной эмульсионной вакцины, обеспечивающие у кур выработку протективных уровней антител к этим компонентам. Эти величины должны составлять для / антигена: НБ - 7,54 lg ЭИД50/см3; ССЯ-76 - 3,32 lg ЭИД50/см3; ИБК - 6,17 lg ЭИД50/см3; ИББ - 5,43 lg ЭИД50/см3 и РВТ - 5,94 lg ТЦД50/см3.

3. Определены минимальные значения титров инфекционной активности вирусов до инактивации, необходимые для изготовления ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины для вируса: НБ - 9,0 lg ЭИД50/см3; ИБК - 7,5 lg ЭИДбо/см3; ССЯ-76 - 4,8 lg ЭИД50/см3; ИББ - 6,7 lg ЭИД50/см3 и РВТ - 7,3 lg ТЦДбо/см3.

4. Разработан метод концентрирования инактивированного вируса ИБК с помощью проточной ультрафильтрации, позволяющий при 30-кратном по объёму концентрировании увеличить активность вирусного материала при исследовании в Б-ИФА с 1:3200 до 1:204800.

5. Для технологического контроля при производстве инактивированных биопрепаратов с типом эмульсии «вода-масло» разработан экспресс-метод определения стабильности вакцин, основанный на последовательном воздействии на образец низкой и высокой температуры.

6. Разработан количественный метод оценки дисперсных свойств (размер частиц дисперсной фазы и гомогеннсть эмульсии) эмульсионных вакцин с типом эмульсии «вода-масло» с помощью лазерной дифракционной гранулометрии.

7. При сравнительных испытаниях масляных адъювантов серии Montanide и «Бионит» в составе ассоциированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ показано, что биопрепарат на основе адъюванта Montanide ISA 70 VG превосходил другие вакцины по физическим (стабильность, реологические показатели) и иммунобиологическим (иммуногенность, безвредность) свойствам.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предложены следующие методики, которые одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ»:

1. «Методика экспресс-определения стабильности эмульсионных вакцин с типом эмульсии «вода-масло»» (2005 г.);

2. «Методика концентрирования вируса инфекционного бронхита кур при помощи проточной ультрафильтрации» (2008 г.);

3. «Методика лазерной гранулометрии эмульсионных вакцин» (2008 г.).

Результаты научных исследований по определению основных технологических параметров при конструировании ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ были использованы при составлении следующей нормативной документации, одобренной учёным советом и утверждённой директором ФГУ «ВНИИЗЖ»:

1. Промышленный регламент на производство ассоциированной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной серии «Пентавис»;

2. СТО на ассоциированную вакцину против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни й реовирусного теносиновита птиц инактивированную эмульгированную серии «Пентавис» (СТО 00495527-0082-2008);

3. Инструкция по применению ассоциированной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной серии «Пентавис».