Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Средства специфической профилактики и диагностики хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллеза и лептоспироза животных

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Всероссийский научно-исследовательский н технологический институт биологической промышленности

Всероссийский государственный научно-исследоьат ельский институт контроля, стандартизации и сертификации .-ч^ , ветеринарных препаратов

С*-

На правах рукописи

БЕЛОУСОВ ВАСИЛИЙ ИВАНОВИЧ

УДК 619:616.98:579.083.13:615.372 .

СРЕДСТВА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ П ДИА1ИОСТИКИ ХЛАМИДЙОЗА, КАМПИЛОКАКТЕИКПЛ, САЛЬМОНЕЛЛЕЗА И ЛЕПТОСПИРОЗА ЖИВОТНЫХ.

16.00.03 - ветеринарная микробиология, ВИрусОЛОГИЯ, 1ПИЮ01ОЛОП1Я, микологця и иммунодошя

Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена во Всероссийском государственном научно-|ц спсиовательском институте контроля, стандартизации и , сертификации ветеринарных препаратов, во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической 'промышленности, но биопредпрнятнях Роса! робиопрочя.

Научный консультант - член-корреспондент РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор А.Н. ПАНИН

Официальные оппоненты:

1 Доктор ветеринарных наук, профессор К. В. Шумилов

2. Доктор медицинских наук, профессор К},В. Ананьина

3. Доктор ветеринарных наук, профессор В. А. Бурлаков

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко.

Защита диссертации состоится /& ¿¿ую/^чг 1997 г. н^/х——часов на заседании диссертационного совета Д. 120.85.01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Минсельхозпрода России (123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д.5, ВГНКИ). ..

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийскою государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации, и сертификации ветеринарных препаратов Минсельхозпрода России. /

Автореферат разослан "

Ученый секретарь ,

диссертационного поре (а V ^ ^ А. Кдаырен

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Необходимость создания ассоциированных вакцин продиктована появлением вспышек целого ряда смешанных болезней. возникших при интенсивных методах ведения животноводства. в связи с перегруппировками большого количества животных на ограниченных площадях, а также при наличии природных очагов болезни.

В овцеводческих хозяйствах у овец часто регистрируются аборты и мертворождения, вызываемые целым рядом полиэтилогическнх болезней. Массовые аборты инфекционной природы, и как следствие яловость и бесплодие, наносят значительный экономический ущерб овцеводству.

В России наибольшая пораженность овцепоголовья хламидиями. кампилобактериями, сальмонеллами и лептоспирами регистрируется в Поволжском. Северо-кавказском. Уральском и Восточно-Сибирском районах России. Поэтому применение в этих регионах ассоциированной вакцины одновременно против нескольких регистрируемых болезней значительно повысит эффективность и снизит затраты на проведение ветеринарных мероприятий.

Разработанная в 1978 г. авторами ВГНКИ ветпрепаратов поливалентная депонированная вакцина против лептоспироза животных нуждается в совершенствовании в направлении повышения иммуноген-ности и стандартности, а также механизации и автоматизации технологических процессов производства.

Требуют дальнейшего усовершенствования питательные среды и разработка режима управляемого культивирования лептоспир в биореакторах, а также методы диагностики хламидиоза и лептоспироза животных. В настоящее время наиболее эффективным методом серологической Диагностики хламидиоза является ЙФА. Наборы'ИФА применяются сейчас в большинстве развитых стран, как в медицине, так н ветеринарии.

Для эффективного выделения лептоспир пригодны эффективные альбуминовые и твин-альбуминовые среды, для обнаружения лептоспир - реакция иммунофлуорёсценции.

Цель и задачи исследований. Разработать и внедрить специфическую профилактику и диагностику хламидиоза. кампилобактериоза, сальмонеллеза и лептоспироза животных по заданию Главного управления ветеринарии МСХ СССР (1989) и программам НИР (1980-1995).

В задачи исследований входило:

- разработать ассоциированную вакцину против хламидиоза. кампилобактериоза, сальмонеллеза и лептоспироза овец, подобрать оптимальные соотношения антигенов и адъюванта в препарате:

- исследовать иммунобиологические свойства вакцины в лабораторных и производственных условиях;

- усовершенствовать промышленную технологию производства вакцины против лептоспироза животных (разработка питательной среды, режима управляемого культивирования лептоспир в биореакторах и методов концентрирование лептоспир);

- разработать набор ИФА для диагностики хламидиоза овец;

- разработать флуоресцирующий глобулин для диагностики лептоспироза животных:

- разработать методы идентификации производственных штаммов лептоспир и дифференциации Ь. 1тегп^япзот I. МПеха в реакции ДНК - ДНК гибридизации.

Научная новизна. Впервые создана ассоциированная вакцина против хламидиоза. кампилобактериоза, сальмонеллеза и лептоспироза овец. Определены основные параметры ассоциированной вакцины (совместимость и концентрация антигенов, оптимальное соотношение компонентов), обеспечивающие формирование иммунитета ко всем антигенам такой же напряженности и продолжительности, как и соответствующие моновакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллеза и лептоспироза (патент 94030862 (029122) от 03.08.94г.).

Разработана питательная среда процесс управляемого культивирования лептоспир на теин-альбуминовой среде по значимым биотехнологическим показателям (РО^,и концентрация твин-80),. позволяющие повысить накопление лептоспир в 6-10 раз (1.5 млрд/мл) и стабильность биологической активности препарата (патент 95114193 (024121) ОТ 08.08.95 г.).

Доказана возможность применения мембранной технологии для концентрирования лептоспир. Промшленнг«; модули ВПУ-15ПА с селективностью мембраны по молекулярному весу белка 15000 „ обеспечивают концентрирование лептоспир в 10-30 раз с высокой скоростью без изменения их биологических свойств (патент 2030915 от 31.10.90 Г.).

разработаны набор для иммуноферментной диагностики хламиди-

оза и флуоресцирующий глобулин для выявления лептоспир. позволяющие повысить эффективность лабораторной диагностики хламидиоза на 17,5%. и лептоспироза животных на 5,2-19.83!.

Из ДНК лептоспир сероьара Pomona получена плазмида pLp 41. которая в peaKiwH ДНК-ДНК гибридизации позволяет идентифицировать производственные штаммы лептог-чф (ВГНКИ 1-6) на генетическом уровне и дифференцировать L.interrogans от L.biflexa.

Новизна полученных результатов подтверждена также авторскими свидетельствами:

- авторское свидетельство Н 1102101 "Вакцина против лептоспироза сельскохозяйственных животных и способ ее изготов-

:лёния"; : .

- авторское свидетельство Н 1102105 "Вакцина против лептос-пироза сельскохозяйственных животных и способ ее изготов-ния"; v';v.

- авторское свидетельство Н 1102106 "Вакцина против лептос-пироза сельскохозяйственных животных и способ ее изготовления"; ■

- авторское свидетельство N 1102102 "Вакцина протчв лептоспироза сельскохозяйственных животных и способ ее изготовления"; .

- авторское свидетельство N 1102103 "Вакцина против лептоспироза сельскохозяйственных животных и способ ее изготовления";

- авторское свидетельство N1102104 "Вакцина против лептос-' пироза сельскохозяйственных животных и способ ее изготовления".

Практическая значилюсть. На основе полученных результатов внедрены в биологическую промышленность и ветеринарную практику:

- вакцина ассоциированная инактивированная против хламидио-за, кампилобактериоза, сальионеллеза' и лептоспироза овец;

- методы диагностики хламидиоза и лептоспироза животных;

- промышленная технология произволете вакцины против лептоспироза животных (опытно-промышленный регламент производства); методы генетического картирования штампов лептоспир.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях и симпозиумах:

Всесоюзном симпозиуме "Актуальные проблемы лептоспироза", (Москва, 1979г), VII и VIII Всесоюзном симпозиуме "Актуальные проблемы лептоспироза". Киев, 1979г., (Тбилиси. 1983г.). III Всесоюзной научно-производственной конференции, (Махачкала, 1981г.), Всесоюзной научной конференции "Разработка, апробация и государственный контроль ветеринарных препаратов, (Москва. 1981г.). Всесоюзной конференции "Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней общих для человека и животных,(Львов. 1988г.), VII Evropean and IX USSR Leptospirosis research Conference, (Moscow, 1990г.). Всесоюзной научной конференции "Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов, (Москва, 1991г.), IV Всесоюзной и V Всероссийской конференциях "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. (Москва, 1991, 1996г.), Всероссийской научно-практической конференции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных", (Владимир. 1995г.), Всероссийской научной конференции "Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных. (Москва, 1996г.): Всемирном конгрессе по лептоспирозу (г.Нант Франция. 1996г.): Ученых советах ВГНКИ ветпрепаратов (19801983г.г,) и ВНИТИБП в (1989-1996г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 42 статьи. получено 3 патента, 6 авторских свидетельств, 2 заключительных отчета по законченным научно-исследовательским работам, 11 нормативно-технических документов на изготовление, контроль и применение вакцин и диагностикумов. Участвовал в разработке инструкций по профилактике и ликвидации хламидиоза и лептоспироза животных.

основные положения, выносимые на защищ

}. Результаты работы по созданию и внедрению ассоциированной ннактивированной вакцины против хламидиоза, кампилобактерио-за, сальмонеллеза и лептоспироза овец.

2. Результаты разработки, испытания и внедрения набора ИФА для диагностики хламидиоза овец.

3. Результаты разработки, испытания и внедрения флуоресцирующего глобулина для диагностики лептоспироза жиьотных.

4. Результаты разработки, испытания и внедрения способа изготовления вакцины против лептоспироза животных.

5. Результаты разработки, испытания и внедрения питательной среды для культивирования лептоспир.

6. Результаты разработки методов идентификации производственных штаммов лептоспир и дифференциации L.interrogans от L.biflexa с использованием ДНК-зондов.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности. Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов, на биопредприятиях АО "Росагробиопром" и хозяйствах страны с 1979 ПО 1996г.

В проведении экспериментальных работ использовали:

Шшш микроорганизмов: Ch. psittaci (N8. ВИЭВ); Campylobacter fetus sub. intestinalis (N30); Salmonella abortusovis (N 372): Salmonella dublin (N373); Salmonella typhimurium (N371).

Референтные штаммы Leptospira Interrogans и L.biflexa 26 серологических групп.

Лроизводственные штаммы лептоспир (штамм, серогруппа): ВГНКН-1. Grippotyphosa: ВГНКИ-2, Icterohaemorrhagiae; ВГНКИ-3, Canicola; ВГНКИ-4, Tarassovt, ВГНКИ-5. balcanica, 2685. hardjo. Усольцев Sejroe; ВГНКИ-6, Pomona..

Питательные средыг хламидии культивировали в 6-7 суточные куриных эмбрионах и перевиваемой линии клеток Vero, кампилобак-терии в ПЖА с 155 глицина, с 0,0235 цистина, с 535 ферментативного гидролизина, 5% аминопептида и мясо-пептонном печеночном бульоне (МППБ) с 5% ферментативного гидролизина, сальмонеллы - в НПА, МПБ, бульоне Хоттингера. Лептоспиры культивировали на сывороточной и питательной среде на разработанных нами безбелковой и твин-альбуминовой средах, аналогичных прописям Ellilghausen, Мс-Cullouch и Shemberg.

Приборы и оборудование, технологические линии: Микроскопы: люминесцентный марки "Люмам", биологический марки "Биолам", рН-метры. автоклавы ВК-75 и ТП-560; термостаты и термальные комнаты с температурой (28Н и J7-1)° C, холодильники с температурой

(+4*2 и -10*5))С, ферментеры с системой обвязки и автоматизации для культивирования микроорганизмов АК-Я10, АНКУМ-2М, Фермус. Биор 0.1 и 0,25. центрифуги АСГ -ЗМ. 0TP-101K, Т-24, оборудование для ИФА фирмы Dynateck, ультрафильтрационные установки УПЛ-0,6, УФУ - ВНИТИБП.

Животные: Овцы в возрасте 2 года - 80 гол. крупный рогатый скот в возрасте 5-6 месяцев - 37 гол., свиньи - 144 гол., кролики массой 3,О кг - 473 гол., морские свинки массой 300-400 г. -73.i гол, белые мыши массой 16-18 г. - 1720 голов, золотистые хомячки массой 40-60 г. - 2000 голов.

Разработка компонентов набора ИФА для определения специфических антител к хлатдиям, камтиюбахтершш, сальмонеллам

и летоспирам.

Антигенами ИФА служил экстракт ультразвуковго дезинтеграта клеток упомянутых возбудителей в оптимальных сорбционных дозах 5-20 мкг/см/. Положительные для НФА сыворотки получали от больных и переболевших животный, отрицательные сыворотки-использова-ли сыворотки крови здоровых овец и кроликов, Отрицательно реагирующих со специфическими антигенами.

Изотипспецифические анти-IgM и анти-IgG коныогаты кролика и овцы попучали по методу Hakane (1966г.). используя в качестве фермента пероксидазу хрена и изотипспецифические антисыворотки с титром 1:64 для IgG и 1:32 для IgM изотипов антител.

Специфические IgM и IgG антитела к антигенам определяли непрямым вариантом ИФА.

Молекулярное клонирование ЛИК летюстр: Хромосомную ДНК из биомассы лептоспир выделяли по методу Мармура. Плазмидную ДНК векторов и рекомбинантньгх клонов Е. Coll выделяли методом щелочного лизиса, предложенного Blrnbolm Н.С.. Doly J.А. (1979) и с" использованием кипячения (Holmes. Quigley, 1981).

Созданную клонотеку изучали в реакциях дот-блот гибридизации с радиактивно мечеными ДН^-зондами. котор..а являлись препаратами суммарных нуклеиновых кислот L. Interrogans и L. blflexa. и других бактерий (работа проведена в лаборатории молекулярном биология ВИЭВ совместно с Г.Ф. Коромысловуи. С.К. Артошинмм.к И.Н.Гюриной).

Определение им'мюгенности вакцин: Иммуногенную активность ассоциированной вакцины против хламидиоза проверяли на морских свинках, против сальионеллеза - на морских свинках и белых мышах. против лептоспироза - на золотистых хомячках, а также использовали следующие серологические методы: иммуноферментный анализ (ИФА - хламидиоз, кампилоба териоз, сальмонеллез, лептос-гафоз). реакцию агглютинации - РА (кампилобактериоз, сальмонеллез), реакцию микроагглютинации - РИА (лептоспироз).

Работу проводили совместно с сотрудниками ВНИТИБЛ. ВНЭВ, ВГНКИ ветпрепаратов, НИЙВВС Ставропольской и Армавирской биофабрик (А. Я. Самуйленко. Т.Я.Шкварук. В.И.Клюкина, Ю.Д.Караваев, U.A. Лучко, Й.П.Иренков, Л.Н.Панин, К.Н.Груздев, Ю.А.Малахов. С.Н.Чудина, Г.Л.Соболева, В.Н.Усольцев, В.И.Ситьков, В.Н.Мелеш-ко. Е.В.Сусский. С.Н.Ярцев). ;

2. г. Конструирование ассоциированной инактивированноа вакцины прошв хлалшаиоза. калашлобакшериоза, саль/ионеллеза и лептоспироза мелкого рогатого скот

Анализ ветеринарной отчетности за 1991-1995 гг. ю заболеваемости овец хламидиозом. кампилобактериозом, сальмонеллезом и лептоспирозом показал, что хламидиоз, камггалобак.териоз, сальмонеллез и лептоспироз) регистрируются у овец в Поволжском, Северо-Кавказском.' Уральском и Восточно-Сибирском районах, причем наибольшая пораженность овцепоголовья этими болезнями в Поволжском и Северо-Кавказском районах.

• В целом за 1991-1995 годы инфицированность овец хламидиями составила 2,3SS, кампилобактериямй 1.0%, сальмонеллами и лептос-пйрами - по 0,656. »...'.

• Учитывая это обстоятельство Главное управление ветеринарии МСХ СССР, дало заявку на создание такой вакцины трем институтам -ВНИТИБП, ВГНКИ ветпрепаратов и ВИЭВ. '

Аналогов разрабатываемой нами ассоциированной вакцины против хламидиоза. кампилобактериоза, сальмоь^ллеза- и лептоспироза овец не существует.

Для создания ассоциированной вакцины из 9 компонентов (хла-мидии, кампилобактерии, сальмонеллы: абортус овис, дублин. тифи-муриум и лептоспиры: Grippotyphosa, Pomona, Tarassovi. Sejroe). не уступающей по эффективности моновакцинам, предварительно исс-

ледовали совместимость антигенов in vitro и in vivo, рассчитали количество микробных клеток каждого антигена в прививной дозе, оптимальное соотношение антигенов в препарате, количество и состав адьюванта.

Конструирование препарата осуществляли с таким расчетом, чтобы одна доза для вакцины с масляным адыовантом составляла 2, о см*, для вакцины с гидроокисью алюминия - 3,0 см?.

Для проведения эксперимента выбран план, построенный на основе совмещения неполной блок-схемы с планом типа 2 . Этот план позволяет сократить число опытов и с достаточной точностью описать поведение откликов в исследуемом факторном пространстве. В полном факторном плане число опытов равно 3*"11683, в выбранном плане число опытов равно 104. Этот план использовался для определения оптимального состава ассоциированной вакцины как по результатам острых опытов, так и по серологическим показателям.

Исследовали вдаяние концентрации следующих компонентов: xl

- хламидий. х2 - кампилобактерий, хЗсальмонеллы абортус овис, х4 - сальмонеллы тифимуриум, х5 - сальмонеллы Дублин, хб - лептоспиры Помона. х7 - лептоспиры Тарассови. х8 - лептоспиры Грип-потифоза, х9 - лептоспиры Сейро.

Эффективность вакцины определяли в острых опытах на основе эффективности каждого из его компонентов (отклики yl - у9).

В результате проведения регрессионного анализа получены уравнения регрессии для Каждого отклика (модели представления экспериментальных данных) на 5Ж-ном уровне. При анализе эффективности антигенов по каждому показателю найдены оптимальные значения которые составляли: для хламидий - 60 мкг. для кампилобактерий - 30 млрд.кл., Sal.abortüsovis -16 млрд.кл.. Sal.typhi-murium - 12 млрд.кл.. Sal.dublin - 10 млрд.кл.. Д.ропкта. Taras-sovi, Grippotyphosa - по 12 млн.кл. и L.sejroe - 10 млн.кл. в дозе. ■ •'■■ '..'".■■. .

С помощью регреси^нного анализа определены также титры антител в зависимости от концентрации'антигенов в вакцине. В результате анализа двумерных хечений уравнений регрессий ланалогично анализу. результатов острь-ч опытов) найдены значения компонент, обеспечивающих-наибольшие титры.

Они составляли: . для хламидий 57 мкг. для кампилобактерий

- 30 млрд.кл.. Sal.abortüsovis - 14 млрд.кл., Sal.typlilmuriura и

Ба1.<1иЫ1п - по 10 млрд. кл., 1.ропюпа. Тагаззоу1. Сг1рро1ур1юза - по 12 млн. кл. и Ь.эе^ое - 10 млн.кл. в дозе.

Найденные значения компонент по результатам острых опытов и по титрам антител в серологических реакциях согласуются дру! с другом. Поэтому полученные значения компонент выбраны для изготовления опытно-промышленных серий ассоциированной вакцины.

На Армавирской биофабрике изготовлено 2 опытно-промышленные серии вакцины объемом по 125 л для проведения исследований на лабораторных животных (кроликах, морских свинках, хомячках) и овцах.

2.2.1. Сравнительные испытания ассоциированной вакцины против хлашдиоза. катилобактериоза, сальмонелпеза и лептоспироза овец с моновакцинат

Для' подтверждения оптимальности найденного состава ассоциированной вакцины проведены сравнительные испытания сконструированной вакцины с соответствующими моновакцинами (вакцинами против хламидиозного и сальмонеллезного аборта овец и вакцинами против кампилобактериоза овец и лептоспироза животных^ Результаты сравнительных испытаний ассоциированной вакцины по всем антигенам приведены в табл. 1.2.3.4.

Таблица 1

результаты сравнительного испытания эффективности антигенов хламидий в составе ассоциированной вакцины против хламидиоза. кампилобактериоза. саЛьмонеллеза и лептоспироза (опыт на морских свинках)

Серия вакцины . Т---— "1 | Кол-во 1 1 1---:- |Результат острого опыта

1 |пало и |заболело 1 ' I выжилоI% выжив 1

1.Ассоциированная 1 1 1 1 20 | 20 I 100 1

2. Ассоциированная 2 1 I 1 20 1 2 8 | 90

3.Моновакцина против хламидиозного аборта овец 1 1 1 1 20 I 2 1 8 1 90 |

Контроль (невакцинир.) ! 1 20 I 20 | 4 1 20 > <

Результаты сравнительных испытаний антигенов сальмонелл в составе ассоциированной вакцины против хламидиоза. кампилобактериоза, сальмонеллеза и лептоспнроза (опыт на морских свинках)

Серия 1 Количество Заражающий ——-—— Результат.острого

вакцины {вакцинированных штамм опыта

1 н зараженных

1 животных пало выжило % выж

1.Ассоцииро- Г 10 S.abortusovl3 0 10 100

ванная вакцина 1 10 S.typhlmuriua 1 9 90

( 10 S.dublin 1 9 90

2.Моновакцина 1 10 S.abortusovls 1 9 90

против сальмо- 1 ю S. typhlmuriam 1 9 90

неллеза аборта 1 10 S.doblln 2 8 80

овец I V

Контроль г ю ^ S.abortusovls 10 0 0

(невакцинйр.) 1 10 S.typhlmuriam 9 1 10

1 10 1,. . S.dublln _,___;_ 9 .1 1 ..... ' 1 10

Таблица 3

Результаты изучения эффективности антигена кампилобактерий . в составе ассоциированной вакцины против хламидиоза. кампилобактериоза, сальмонеллеза И лептоспироза овец

1 Серия 1 Кол-во вакцины ¡вакцинир. ¡кроликов 1 ■ —- —-------- Результат РА

кролики

| 1 1 ■ 1 1 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |ср. титр

------------ 1 1. Ассоцииро- I 5 ванная вакцина! 1 1 1 III 1:400| 1:400|1:8001 li400|l:400| 1:440 1 I I 1 1 1 1 1 1 1

_ ..... . д 2.Вакцина про-| тив кампилобак. I 5 ■ • . териоза овпц | > Г 1 1 .1 1 1 I I I I 1:40011:40011:8001.1:Й00|1:4001 1:480 I I I 1 1 | 1 1 1 - .......1. ... .

- и -

Результаты изучения эффективности антигенов лептоспир Ротопа и Сг1рро1ур1кт з составе ассоциированной вакцины против хламидиоза, канпилобактериоза. сальмонеллеза и лептоспироза овец (опыт на золотистых хомячках) Заражение лептоспирами Ропюпа "Манихино"

Серия вакцины Кол-во вакцин хомяч. (гол) Доза ин Кол-во заражен. животных Результат заражения лептоспирами Рошопа ИД50 (см|)

пало живы

1.Ассоциированная вакцина оооо 0.5 0.1 0.02 0.004 оооо 0 ' 1 ' ' 3 5 10 9 7 . 5 0,021

4.Ва£цина против лептоспироза (произвол, серия} . ОООО ч 0.5 0.1 0.02 0.004 оооо 0 1 4 8 10 9 6 2 0.023

Контроль <невакцннир.) 10 •10. . 0

Заражение лептоспирами Grippotyphosa

1.Ассоциированная вакцина 10 10 10 10 оооо и ****** оооо 0 ■ 2 '.: 3 4 10 8 7 6 0,019

4.Вакцина против лбп-.тоспмроза (пройзводст, серия) 10 10 10 10 0.5 0.1 0.02 0.004 10 . 10 10 10 0 1 ; 4 8 10 • 9 6 2 0,023

Контроль (невакцннир.) 10 9 1

. Результаты, представленные в таблицах 1-4. показывают, что ассоциированная вакцина по всем компонента»., входящим в ее состав. не уступает по эффективности моновакцинам, и может применяться в практических условиях в регионах, где среда овцепого-ловья регистрируются эти болезни.

2. 2.2. Разработка оптимальной иммунизирующей возы ассоциированной вакцины против хламидиоза, кампшюбактериоза.

сальлюнеллеза и лептоспироза овец

Изучение влияния дозы ассоциированной вакцины на формирование иммунитета к хламидиям, кампилобактериям, сальмонеллам и лептоспирам проводили на кроликах и суягных овцематках.

Ассоциированную вакцину вводили суягным овцематкам {срок суягности один месяц) в параректалыюе пространство в дозах (по 10 голов на дозу): 1 см*. 2 см3. 3 см* и 2+2 см3 (с интервалом между инъекциями 20 дней).

Для сравнения животных иммунизировали также моновакцинами против хламидиоза, кампшюбактериоза. сальионеллеза и лептоспироза животных.

Проведенные исследования ползали, что ассоциированная вакцина. изготовленная на масле ПС-3 с ланолином, по реактогенности не отличается от моновалентных ^масляных вакцин.

Овцематки всех групп окотились без патологии в срок, на месте введения у животных обнаружены гранулёмы размером 1,5-2,0 см. проросшие соединительной тканью.

По шесть голов суягных овцематок, иммунизированных различными дозами ассоциированной вакцины на 110 день беременности заразили возбудителями: хламидиозного аборта овец - перитонеально в дозе 1x10*/?' ЭЛД50/си3 (1-5 группы), C.Fetus fetus-перорально в дозе 16 млрд. клеток (1-4,6 группы). Sal. abortusovis - в рубец в дозе 30 млрд/кл (1-4,7 группы), лептоспирами Pomona, шт. "Манихино"-внутрибрюшинно в дозе2х10* кл/см (1-4.8 группы).

Проведенные исследования показали, что оптимальной дозой иммунизации по всем антигенам, входящим в состав вакцины, является 2,0 см/.

Введение препарата в дозе 3'см* не обеспечивало формирование 100% иммунитета к хламидиям и лептсспирам. Двукратное введе-. ние вакцины 2+2 см* обеспечивало 100% защиту животных от болезни и абортов, однако при этом регистрировали высокие титры антител и длительную их циркуляцию в крови.

2.2.3. Динамит накопления ишунозлобуллиное М и G у овец, вакцинированных оптимальной дозой ассоциированной вакцины прошв яламиЗиоза. кампилобаютериоза, сальжонеллеза и леп-тоспироза

Ассоциированную инактивированную вакцину ввели 10 взрослым овцам в дозе 2сь? в параректальное пространство и сыворотку крови исследовали в ИФА в течение 120 дней после вакцинации. Параллельно по 3 овцы иммунизировали моновакцинами в дозах, аналогичных ассоциированному препарату. Результаты исследования показали, что в крови овец IgM ко всем компонентам вакцины появляются на 5-7 сутки И накапливаются до 12-20 суток. К 30 дню содержание IgM от применения ассоциированной и моновакцин составляло соответственно: к хламидиям 1:2000 и. 1:2500, к кампилобактериям -1:500 и 1:600, к сальмонеллам и лептоспирам - 1:1000 и 1:2000.

IgG ко всем антигенам, входящим в состав вакцины, появлялись на 7-15 день. Максимальное накопление IgG ко всем антигенам регистрировалось на 30-35 дни. Титры антител в ИФА достигали: к хламидиям (1:16000), к кампилобактериям (1:10000), к сальмонеллам (1:32000), к лептоспирам (1:25600). К 90 дню титры антител снижались до 1:4000 - 1:1600). •

Таким образок динамика накопления IgM и,IgG у овец, иммунизированных ассоциированной и моновакцинами, одинакова. IgG от применения моновакцин накапливались в несколько больших количествах. чем от применения ассоциированной вакцины.

2.2.4. Изучение длительности имкунтет у овцематок, вакцинированию: ассоциированной иноютивированноа вакциной против хламиЗиоза. калтилобаюпериоза, •сальжшеллеза и летоспироза Для изучения продолжительности иммунитета, к хламидиозу,

кампилобактериозу,' сальмонеллезу и лептоспирозу по 6 овцематок привили ассоциированной вакциной непосредственно после окота, затем через 2.4,6,8.10 и 12 месяцев). . '

На 110 день суягности всех овец заражав и возбудителем хла-мидиозного аборта овец в дозе бхЮ5* ЭЛД50/см5. кампилобактери-оза (С. Fetus sub. fetus в дозе 16 млрд/кл, Sal.abórtusovls) 30 млрд/кл И L.pomona шт. Манихино в дозе 2x10s клеток.

В результате эксперимента установлено, что вакцинированные овцы имчунны к хламидиям, кячпилобактериям. сальмонеллам и леп-

тоспирам в течение года. '

3.2.5. Определение срока годности ассоциированной вакцины против хлатдиоза. катипабактершзза. сальмонеллеза и леп-тостроза овец

Вакцину, прошедшую контроль, заложили на хранение в холодильник при +4-8°С и через 3,6,9.12,15 и 18 «есяцев испытывали на инмуногенную и антигенную активность каждый антиген в вакцине.

Проведенные исследования показали, что в вакцине антигены хламидиА и кампилобактерий обладают иммуногеннюи свойствами в течение 15 месяцев (к 24 месяцам активность снижается на 5055), антигены сальмонелл и лептоспир - 12 месяцев (через 18 месяцев активность снижается на 20-301).

2.2.6. Результаты испытания ассоциированной инахтширован-ноа вакцины пропив хлатдиоза. катилобактериоза. сальмонел-леза и лекюсгшроза в производственные условиях

На Армавирской биофабрике была изготовлена опытно-промышленная серия вакцины объемш 125 литров. Вакцина после проведения контроля применена в одном совхозе Улетовского района н 18 хозяйствах Кыринского района Читинской области, где регистрировались аборты инфекционной этиологии (от 255 до 3058).

В военсовхозе N6 Улетовского района вакцинировано 6000 голов через месяц после осеменения, в Кыринском районе - 17051 голов овцематок первого и второго окота перед осеменением. В качестве контроля служили отары невавдинированных животных этихже хозяйств и других хозяйств района.

В военсовхозе N6 выход ягнят в вакцинированной группе составил 9035, в невакцинированной - 75%.

У вакцинированных овцематок зарегистрировано 7 абортов (1,17%). у невакцинированных 365 абортов (6,155).

Аборты у вакцинированных овец не были связаны с профилакти-руемыми заболеваниями.

У овец контрольной группы зарегистрированы аборты от хлами-диоза, сальмонеллеза, реже лептоспироза и кампилобактериоза.

В хозяйствах Кыринского района после применения ассоциированной вакцины аборты среди вакцинированнх овец прекратились.

Среди невакцинированных овец аборты регистрировались (преимущественно хлзмидиозной и сальмонеллезной этиологии и режз вследствие лептоспироза).

В среднем в отарах с поголовьем 700-800 голов абортировало от 8 до 30 голов, а в совхозе "Луч" абортировало (в основном от хламидиоза 150 (21.4%) из 700 голов. По результатам НИР на вакцину утверждена нормативно-техническая документация (ТУ, инструкция и наставление по применению).

2.3. Усовершенствование пролашшешюа технологии производства вакцины прошв лептоспироза животных Цель наших исследований - конструирование безбелковой и твнн-альбуминовой сред из отечественных компонентов и разработка режима управляемого культивирования лептоспир в биореакторах позволяющие получать высокое накопление всех штаммов лептоспир (L.interrogans) без изменения их морфологии, антигенной структуры и снижения иммуногенностн вакцины против лептоспироза.

2.3.1. Оптимизация состава безбелковой среды для культивирования лептоспир

При конструировании состава среды за основу взяты компоненты по прописи Sternberg.

Перед приготовлением среды все соли металлов дважды перек-ристаллизовывали. Подобран следуклций состав среды (мг/л): Na2HP04 - Й31. 0; КН2Р04 - 69.0: MgS04 - 150.0; НН4С1 - 3.0: Fe-S04. - 3,0; СаС1£ - 4.0; этилендиаминтетраукусной кислоты динат-риевая соль - 10.0; глицерин - 200.0 (по весу); твин-80 - 250,0 (по веоу); L-аспарагин500,0; витамины В1 - 5,0 и BU - 2,0.

.Все компоненты, растворенные в фосфатном буфере, стерилизовали автоклавированием при 121* G в течение( 15 мин. Витамины В1 и В12 вносили в среду асептически после стерилизации.

На изготовленной безбелковой среде из отечественных компонентов культивировали производственные шт;. мы лептоспир Pomona. Taraasovl, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Canlcola, Sejroe (ВГНКИ-5, hardjo, Усольцев) в стационарных условиях. Для контроля. лептоспиры культивировали также в сывороточной среде. Результаты представлены в таблице 5.

- íe

Изучение ростовых свойств безбелковой питательной среды для культивирования лептоспир

Среда Накопление ..¿птоспир (млн/см*)»

Pomona Tarassovi Grippotyphosa Ictero-haem. Cani-cola ВГНКИ-5 Sejroe hardjo Усольц

Безбелковая 65 45 48 46 76 85, 120 68

Сывороточная 95 90 130 70 70 80 70 70

* Примечание: учет результатов через 5 дней культивирования.

Результаты исследований показали, что испытуемая среда обеспечивает рост всех производственных штаммов лептоспир. однако накопление лептоспир Tarassovi. Gri^potyphosa и Icterohae-morrhagiae было низким (45-48 млн. клеток/см?). Наилучший рост наблюдали у лептоспир серогруппы Sejroe (ВГНКН-5-85 млн/см'; hardJo - 120 млн/см3: Усольцев - 68 млн/см®).

Следует отметить, что добавление к испытуемой безбеяковой среде сыворотки крови барана в объеме 0.5% обеспечивает хороший рост всех производственных штаммов (накопление лептоспир составляет от 80 до 130 млн/см^).

Лересевы производственных штаммов лептоспир на безбелковой среде через каждые 5-Ю дней показали, что накопление лептоспир и изменение их морфологии и антигенной структуры^ в течение двух пассажей не происходит. Каздый штамм реагирует с групповьвм агглютинирующими сыворотками в титрах, предусмотренных наставлением по их применению.

На пятом - седьмом пересевах прекратили рост штаммы: Pomona. Tarassovi и Icterofiaemorrhagiae.

Из пятисуточиых культур лептоспир Pomona; Grippotyphosa и Sejroe (ВГНКИ-5. haríjo. Усольцев), выращенных на безбелковой среде, приготовлена экспериментальная серия ва-цины. Концентрация лептоспир каждого штамма перед введением в вакцину была стандартизована до 70 млн/см*. В качестве контроля изготовили также вакцину из лептоспир, выращенных на сывороточной среде.

Вакцины испытывали на кроликах (табяииа 6).

Результаты исследования в РМА сыворотки крови кроликов, иммунизированных вакцинами, приготовленными на безбелковой и сывороточной средах

п=5

Серия вакц. Среда "1 Доза введ. лептоспир А МЛН/СЛ --------- Результат РИА с лептоспирами

Рошопа Тагаэ-ЗОУ1 Сг1рро-1урпоза 5е,)гое

ВГИКИ-5 Наг<1;)о Усольц

1 2 3 Безбелк. Сыворот. Безбелк. +0.5сыв. барана 40 40 40 1:1040 1:1450 1:1260 1:400 1:800 1:800 1:800 1:1600 1:960 1:400 1:800 1:880 1:400 1:400 1:540 1:200 1:800 1:800

Проведенные исследования показали пригодность безбелкоьой среды для выращивания ряда производственных штаммов лептоспир з течение двух пассажей. Для улучшения накопления лептоспир и снижения расходов сыворотки крови бараьов рекомендуется при производстве вакцины против лептоспироза к безбелкозой среде предложенного состава добавлять 0.5% сыворотки крови овец-доноров.

2.3.2. Оптимизация состава тсин-альбуминовой среды для

культивирования лептоспир

Оптимизацию состава твин-альбуминовой среды проводили со следующими отечественными компонентами: бычий сывороточный альбумин. Твин-80. I - аспарагин. глутамин, пролин, пируват натрия, витамины В1 и В12, На2НР04, КН2Р04, Для обеспечения стерильности в питательную среду добавляли фторурацил из расчета 100 мкг/см.3. В качестве контроля служила исльзуемая в производстве сывороточная среда. Оптимизацию состава твин-альбуминовой среды осуществляли с помощью математической теории планирования многофакторных экспериментов, статистической обработки материалов и регрессионного анализа. Всего было испытано 306 вариантов сред.

По результатам вычисленных эффектов всех уровней каждого фактора выявляли оптимальную концентрацию компонентов, входящих в состав среды. Качество питательной среды оценивалось на основе накопления используемых производственных штаммов (млн кл/сц}).

По результатам проведенных экспериментов найден оптимальный состав твии-альбуминовой питательной среды для культирирования

лептоспир: альбумин - 0,25 - 301, твин-80 - 0.06-0,07*; L-acna-рагин - 0,6 -0.9 мкг/см3; пролин - 275 •• 350 мкг/см'; глютамин 325 - 400 мкг/см3; пируват На - 190-260 мкг; витамин В1 -0,18-0.22 мкг/см1; витамин BI2 - 0,36-0,44 мкг/см*. При этом накопление лептоспир в стационарных условиях культивирования дос-. тигало 150 - 180 млн.кл./см^

2.3.3. Разработка режима управляеюго культивирования лептоспир в биореакторах.

. Установлено, что для культивирования в ферментере необходимо использовать посевные культуры лептоспир в экспоненциальной фазе роста. В результате предварительных экспериментов в процессе периодического процесса культивирования были отобраны значимые биотехнологические параметры еН, р02 и концентрация твин-80. Затем были осуществлены управляемые по этим параметрам процессы периодического культивирования.

Управляемое культивирование лептоспир на твин-альбуминовой среде в предложенном состава питательной среды позволило интенсифицировать процесс за счет сокращения продолжительности выращивания лептоспир 6-8 суток, до 4 суток, при этом достигали болев высокого накопления живых клеток. (1.1-1,7x10 кл/см ) по сравнению с традиционной технологией (1.0-2. Oxl(f кл/ск^).

Максимальное накопление жизнеспособных клеток в усовершенствованной питательной среде в стационарной фазе роста составило для лептоспир Помона, Тарассови и Иктерот.эррагия в мирд/см/ соответственно 1.7-0.27: 1,4-0.31; 1,1*0,17 клеток.

Результаты культивирования лептоспир в ферментере представлены в таблице 7.

Изучение роста лептоспир Pomona, Та.assovi и Icterohaemorrhaglae в ферментерах

П=<1

Показатели Дни культивирования

0 1 2 3 4 5

рН< (ед.рН) 7,72 7.65 7,62 7.5 7,45 7,5

еН (МВ) +370 +350 +340 +320 +300 +320

р02(%) 70 54 34 28 32 37

toC 27 27 27 26,9 27 27

Обороты мешалки 100 100 100 100 120 120

Накопление Ь лептоспир(млрд/см/О 0.02 0.13 0.27 1.2 1,7 1.5

Представленные в таблице результаты показывают, что после засева матровой культуры лептоспир рН среды снижается с 7,72 до 7,45 к концу 4 суток, на 5 сутки рН незначительно пов. лается до 7.5,

Парциальное давление 02 в начале культивирования в ферментере составляло 70 55. Интенсивное потребление кислорода при одинаковых оборотах мешалки наблюдалось в течение трех суток культивирования. В это же время отмечали увеличение накопления лептоспир с 0,13 до 1,2 млрд. кл/си? ..

Для удлиннення срока логарифмической фазы н повышения накопления лептоспир нами после снижения pÓ2 до 2856 с помощью изменения'скорости вращения мешалки со 100 до 120 об/мии. и подачи стерильного воздуха р02 поддерживали на уровне 30% от насыщения, В это же время в растущую культуру добавляли Твин-80 в количестве 0.Ó05S. При подаче воздуха и твина-80 происходило небольшое снижение рН (с 7,5 до 7.25) н увеличение р02 (с 28 до 32%) с

одновременным увеличением концентрации лептоспир с 1.2 до 17 » •

млрд.кл/см . Определена лимитирующая концентрация твин-80, кото-

рая составляла 0.15-0,25 мг X. ,■

На 5 сутки культивирования рост лептоспир прекратился, что связано с повышением рН. р02, концентрации Твин-80 и снижением концентрации лептоспир (1.5 млрд.кл/см1).

Поддержание разработанных параметров в сочетании с• питательной средой, близкой к оптимальной, позволяет иметь длительность фазы приспособления 5.5 час, фазы логарифмического роста 21-39 час, минимальное время генерации 5,33-6,78 час и получить при этом накопление лептоспир.до 1.7 клрд/сиЗ.

• По результатам отработки режимов культивирования лептоспир в ферментере нами на оптимизированной питательной среде из куль-' тур лептоспир Рогаопа, Тагаззоу1 и 1с1егоьаеяоггЬав1ае' были изготовлены 2 опытно-промышленные серии вакцины н испытаны в опытах на лабораторных (кроликах, хомячках) и сельскохозяйственных животных (крупном рогатом скоте, свиньях, овцах).

■ Испытания проведены в сравнении с вакцикрй, изготовленной на сывороточной среде (таблица 8).

Таблица 8

Результаты исследования сыворотки крови кроликов, вакцинированных опытной и производственной сериями вакцины против лептоспироза животных

п-5

N серии Лоза Высота титра антител в РИА с лептоспирами

в/в смЗ МЛН.КЛ Ропюпа Тагаззру1 1с1епЛаеаогт1)ав

1. 2. З.пронзв 0,75 0,75 0,75 50 50 50 1:1450+179 1:1760+178 1:1440+187 1:1180+105 1:1440+187 1:1280+137 1:960+73 1:1280+97 1:970+217

Вакцина, изготовленная на твин-альбуминовой среде, по антигенной активности не уступала.аналогичному препарату, изготовленному на сывороточной среде. У вакцинированных кроликов средний титр антител составил соответственно в ррэкции микроагтлюти-

нации (PMA) 1:1345+137 и 1:1230+180.

При испытании вакцины на крупном рогатом скоте, свиньях и овцах установлено, что в сыворотке крови вакцинированных животных антитела к лептоспирам появляются на 5-7 день.

У телят через 15 дней после вахцинации титры антител варь-ровали от 1:35+10 до 1:95+15, к 60-му дню титры достигали максимальных значений - 1:189+18 1:486+17. Через 12 месяцев после вакцинации, титры антител независимо от введенной вакцины варьировали в пределах 1:10+3 - 1:67+11.

У коррв титры антител в крови достигали максимума - (1:143+23) к 30 дню и затем в течение года варьировали от 1:44 до 1:96.

Средний титр антител у свиней был максимальным на 45 день после иммунизации и равнялся для лептоспир Pomona. Tarassovi и Icterohaemorrhaglae соответственно 1:112+37, 1:95+12, 1:65+12. Для коммерческой вакцины эти показатели равнялись 1:106+17, 1:78+19 и 1:75+17. Затем титр антител постепенно снижался и через 90 дней составлял 1:10-1:20.

У ягнят антитела к лептоспирам появлялись на 5-7 день в титре 1:50 - 1:80. нарастая к ¿0-25 дню до значений 1:286+70 -1:430+45. Через 3 месяца после вакцинации титр антител снизился до 1:40+15 - 1:94+19 и в более низких титрах (1:5 - 1:17) регистрировался в течение 180 дней.

Результаты изучения протективных свойств сыворотки крови вакцинированных свиней показали, что поросята, иммунизированные опытной серией вакцины, устойчивы к лептоспирозу н лептоспироно-сительству. ЕД50 для опытной серии вакцшм составляла 0,023 сиз. а для производственной - 0,020 сиз.-

В соответствии с договором между ВНИТИБЛ и Дейартаментом ветеринарии ИСХП РФ в Тульской области в 1994 г. проведен анализ эпизоотической ситуация и разработали меры борьбы с лептоспиро-зом животных. Были признаны неблагополучными по - лептоспирозу крупного рогатого скота 60 хозяйств и лептоспsippäy, свиней - 32 хозяйства.

На опытяо-промшленнои оборудовании ВШГШЙ изготозлено и применено в неблагополучных хозяйствах области в 1934 году - 50. в 1995-1996 годах - по 100 литров вакцины против лептоспироза 1 и 2 вариантов. Всего привито 10 тысяч голов крупного рогатого

скота и 7 тысяч свиней. Осложнений у вакцинированных животных не установлено.

В комплексе противолептоспирозиых мероприятий с применением изготовленной вакцины за этот период оздоровлено 22 неблагополучных пункта среди крупного рогатого скота и 15 - среди свиней. Г.о результатам НИР подготовлен и утвержден опытно-промышленный регламент на производство вакцины против лептоспироза животных.

2.3.4. Разработка методов концентрирования лептоспир

Изучена возможность использования мембранной технологии для получения очищенных и концентрированных лептоспир. пригодных для производства вакцины и иммуноферментного анализа (ИФА).

Всего испытано 15 различных мембран (УАМ-150. УАМ-500, ВПУ-15ПА. Владипор. Мифил).

Исследования показали, что при фильтрации питательной среды без бактериальных клеток (контроль) и с лептоспирами производительность процесса практически не менялась при использовании мембраны ВПУ-15ПА (удельная производительность равнялась 0.35 мл/(мин»см|). Это свидетельствовало о том. что концентрирование биологической суспензии (БС) проходило под контролем, белкового гелевого слоя, образованного на поверхности мембран.

Применение мембран позволило во всех случаях концентрировать БС лептоспир в 10-30 раз по объему. При этом также увеличивалась концентрация сывороточных белков. Содержание белка при концентрировании ВС на мембранах УАМ, ВПУ (в 9-19 раз по объему) возрастало в 6-17 раз. что показало высокую селективность данных мембран по белку. В связи с этим необходимо дополнительно очищать БС от балластных белков.

Для выбора оптимального режима диафильтрации изучали степень очистки БС до и после концентрирования ее на полых волокнах ВПУ-15ПА. Ступенчатую диафильтрации проводили против ФБР.

При диафильтрации против 4 объемов ФБР из БС удаляли 86-89% белка и достигали 10-кратного концентрирования ее по объему и по содержанию бактериальных клеток.

Таким образом, проведенные исследования показали целесообразность использования для концентрирования лептоспир мембранных модулей ВПУ-15ПА. Предел задерживания мембраны по молекулярному весу белка составлял 15000 Д. В институте создана промышленная

установка УФУ-ВНИТИБП с поверхность» фильтрации 6 м|.

В технологии производства вакцины против лептоспироза этап концентрирования лептоспир трихлоруксусной кислотой заменен на ультрафильтрацию.

2. 4. Изыскание эффективта средств лечения животных -

лептоспироносителеа

Применяемые в настоящее время антибиотики и другие антибактериальные препараты при лептоспнрозе животных (стрептомицин, канамицин. диамидин, дитетрациклин) Имеют существенный недостаток - лечебный эффект достигается их многократным парентеральным введением в течение 3-5 дней. Между тем в практике имеется ряд новых антибиотиков с широким спектром действия, лептоспироцидная активность которых не:изучена.

Нами изучен терапевтический эффект трнхогтола, тримеразина, гентамицина, тетраолеана, неоветина. Эффективность испытуемых препаратов изучали на 24 3-4 - месячных подсвинках, экспериментально зараженных лептоспирами серогруппы Pomona.

Трнмеразин, тетраолеан. трихопол и неоветин были не эффективны при лечении больных лептоспирозом животных, а гентамиции в дозе - ДО тыс.ЕЯ/кг н фармазнн-200 в дозе - 0,05 ил/кг при однократном введении в терапевтической дозе обеспечивают стерилизация организма свиней от лептоспир серогруппы Pomona.

V, Гентамицин и фармазнн-200 рекомендован для лечения больных лептоспирозом свиней в хозяйствах,, неблагополучных по лептоспи-розу.

Лечение свиней - лептоспироносителеа в неблагополучных хозяйствах Тульской области обеспечивало прекращение лептоспироно-сительства при однократном введение указанных препаратов р рекомендованных дозах. Вылечено 200 поросят 4 - месячного возраста.

2.5. Разработка флуоресцирующего глобулина для диагностики

лептоспироза животных

Для изготовления флуоресцирующего глобулина использовали два вида сырья:

1. Поливалентную лечебную сыворотку против лептоспироза животных, изготавливаемую на биопредприятиях (ТУ 46-21187-75);

2. Поливалентную агглютинирующую сыворотку, получаемую пу-

тем смешивания моновалентных сывороток или путем гипериммуннза-ции кроликов смесью культур лептоспир шести серогрупп.

Из гипериммунных сывороток крови готовили флуоресцирующие глобулины: моновалентные - к лептоспирам Каиикола и Иктерогенор-рагия. бивалентный - Тарассови и Гебдомадис, трехвалентный - По-мона.Тарассови и Гебдомадис. Поливалентный - лептоспирам шести серогрупп. регистрируемых на территории России. Препарат подвергали сублимационной сушке.

2.5.1. Испытания флуоресцирующего глобулина для диагностики лептоспироза в лабораторных условиях Оценку эффективности лабораторной диагностики лептоспироза проводили с использованием изготовленного глобулина на патматериале от экспериментально зараженных лептоспирами животных. Препараты сравнивали между собой и с обычными методами лабораторной диагностики лептоспироза.

В глобулине, изготовленном из кроличьей сыворотки, содержалось 0,855. а в глобулине из воловьей сыворотки - 0.9% белка. Красящий титр кроличьего глобулина составил 1:8, воловьего 1:32. Обе серии были специфичны, не окрашивали микроорганизмы других видов.

Диагностическая ценность флуоресцирующего глобулина из воловьей и кроличьей сывороток при исследовании 100 проб патологического материала, инфицированного лептоспирами. была одинаковой. Так. глобулин из воловьей сыворотки выявил лептоспиры в 89, ОХ, из кроличьей - 89 . 235 случаев.

Таким образом, флуоресцирующий глобулин для диагностики лептоспироза может быть изготовлен из гипериммунной кроличьей, и из лечебной сыворотки крови волов.

На Краснодарской биофабрике было изготовлено 15 серий флуоресцирующего глобулина, в том числе моновалентных-2. бивалентных и трехвалентных - по одному и поливалентных - 11.

У изготовленных препаратов после прохождения контроля устанавливали активность на препаратах, приготовленных из культур лептоспир 18 серологических групп.

Изготовленные препараты были специфичны. Моновалентные флюоресцирующие глобулины не обладали серогрупповой специфичностью и выявляли лептоспиры не только гомологичных, но и гсгерологич-

ных серогрупп, и в связи с недостаточной широтой спектра окрашивания не пригодны для выявления всех представителей рода лептос-пир. Дальнейшие исследования проводили с поливалентным глобулином.

2.5.2. Диагностическая ценность поливалентного флуоресцирующего глобулина в реакции иммунофлуоресцещии (РИФ), тето-польноа микроскопии и метода выделения культур легипоспир Результаты исследования различных объектов, инфицированных лептоспирами, показали, что РИФ с использованием испытуемого поливалентного глобулина более эффективна.

ТабЛ!ца 9

Сравнительная оценка эффективности методов лабораторной диагностики лептоспироза у сельскохозяйственных животных

Исследуемый материал С в и Н ь и

Метод исследования

Микроскопия Выделение культур Р И ®

исследовали обнаружили % исследовали выделили ли 1 % иссле довали обнаружили %

Почки Моча Плоды 237 265 48 9 14 3.8 5.3 237 X 48 29 1 12,2 2.1 237 265 48 30 23 1 12,6 8,7 2,1

ИТОГО: ' 550 23 4,2 285 • 30 10.5 550 54 9,8

Крупный рогатый скот

Почки Моча Плоды 210 209 35 6 1 2.8 2,8 210 2 35 - - 210 209 35 1 7 1 0,5 3.3 2,8

ИТОГО: 454 7 1.5 247 - - 454 9 2.0 х - из мочи свиней посевы на питательные среды не делали.

Представленные в таблице материалы свидетельствуют о том. что рн;' не уступает, а иногда эффективнее метода выделения культур !Г значительно эффективнее темнопольной микроскопии. При исс-

ледовании мочи люминесцентным методом свиньи-лептоспироносители выявлены в 9.8*. а крупный рогатый скот - в 2.0% случаях. При темнопольной микроскопии эти показатели равнялись соответственно 4.2* и 1,5%. Из плодов крупного рогатого скота выделить культуру лсптоспир не удалось, в то время как в РИФ они были обнаружены в одном случае. Через 2 суток хранения патматериала лептоспир обнаруживали только флуоресцирующим глобулином.

Таким образом, проведенные исследования ползали, что люминесцентная микроскопия с использованием поливалентного флуоресцирующего глобулина является эффективным методом диагностики лептоспироза у сельскохозяйственных животных, позволяют обнаруживать в культурах, крови, паренхиматозных органах, объектах внешней среды лептоспир любой из известных серогрупп.

2.5.3. Изготовление и испытание флуоресцирующего глобулина для диагностики лептоспироза в производственны! условиях Центральная ветеринарная лаборатория по распоряжению ГУВ МСХ СССР (письмо N 111 - 18 от 18.02.1980 г.) провела комиссионную проверку флуоресцирующего глобулина. Комиссия признала препарат специфичным. активным, эффективным при лабораторной диагностике лептоспироза и рекомендовала испытать его в широком производственном опыте в ветеринарных лабораториях.

Результаты испытания глобулина в ветлабораториях показали, что общепринятыми методами лептоспир выявляли в 3.2% случаев, а люминесцентным методом- в 4.1% случаев.

По результатам проведенных исследований утверждена Нормативно-техническая документация (ТУ, инструкция, методические указания по лабораторной диагностике) на флуоресцирующий глобулин для диагностики лептоспироза животных, препарат используют ветеринарные лаборатории страны с 1981 г. Рекламации на качество глобулина в ВШИ ветпрепаратов не поступало.

2.6. Разработка шест-системы ИФА для серологической диагностики хламидиоза овец

Мы поставили перед собой цель создать набор ИФА для серологической диагностики хламидиоза овец.

Для изготовления антигена использовали желточные мешки эмбрионов, павших на 6-9 дни после заражения, йтаммами хламидий

"Улетово" ВНИТИБП или Й 8 ВИЭВ, с инфицированностью хламндиями на 3-4 креста с инфекционным титром 106,0 ЭЛД50/0.2гмЗ. За основу изготовления хламидйозного антйгена был взят метод ультразвуковой дезинтеграции клетш.

Активность положительного антигена стандартизовали по концентрации белка. Установлено, что при концентрации бежа в антигене 0,05-0,08 мг/смЗ регистрируются наивысшие титры антител в ИФА (1:3200 - 1:6400).■ Более концентрированный антиген снижал показатели ИФА.

Для стабилизации биологической активности хламидийного антигена использовали различные режимы высушивания и защитные средь». * • •"-..•.„

Исследования показали, что наиболее приемлемой защитной средой является 1,5* декстран, несколько ниже активность антигена, высушенного в 356 декстране, остальные концентрации декстрана и сахарозы не обеспечивали высокой активности антигена, особенно в процессе его хранения. ,

Таким образом, нами была разработана технология производства хламндайного антнгена, позволивиая сохранить его акптность в течение 18 месяцев.

2.6. Í. Получение положительные к хлсшдиям сыаороток Отработаны схемы получения гипериммунной хламидийной сыворотки на кроликах и овцах.

г Для иммунизации кроликов использовали очищенную суспензию хламидий (штатом Н 8 ВИЭВ и "Улетойо" ВНИТИБП). а также антиген хламидцй, полученный с использованием физических методов дезинтеграции клеток хламидий и стандартизированный по белку, иммунизацию проводили" по трем схемам.'

Наилучшей схемой "признана 7 кратная подкожная иммунизация кроликов с интервалом 7 дней очищенным антигеном хламидий с адъютантом в дозах 50-200 юг. , с последующей двукратной внутривенной иммунизацией в дозах 50 н 100 мкг без адаованта. Титр антител в ИФА составил не ниже 1:6400, в РСК - 1:64.

В связи с тем, что существуют технологические и организационные сложности получения хламидийной сыворотки на суягных овцах. ми в своей работе попытались получить активную сыворотку на несуягных животных. •

Суспензию хламидай вводили овцам подкожно однократно в дозе 5»ЮС/ ЗЛД 50/0. г см . На 5-7 день после заражения IgM регистрировались в РСК в титре 1:5, в ИФА - 1:100.

На 20 день антитела в ИФА выявлялись в максимальных титрах 1:1600 - 1:3200 затем постепенно снижались»

Для поддержания высоких титров антител (1:3200 - 1:6400), регистрируемых в ИФА мы проводили дополнительную иммунизацию овец антигеном хламидий, используемым для постановки ИФА.

Антиген вводили овцам подкожно 5-кратио в дозах 50 - 100 икг с интервалом 10 дней. Шестую инъекцию вводили внутривенно в дозе 70 мкг. Активность вывороток составила в РСК не ниже 1:64, в ИФА - 1:6400.

Таким образом показано, что схема иммунизации несуягных овцематок приемлема для получения активной хламидийной сыворотки.

2.6.2. отработка оптилшьта условий постановки ИФА

Результаты титрования антигенов показали, что интенсивность реакции возрастала при увеличении сорбционной дозы антигенов, для хламндийного антигена насыщающая доза была равна 300 нг/смЗ. Дальнейшее увеличение концентрации антигена не приводило к увеличению интенсивности реакции.

Титрование антисывороток на соответствующих антигенах позволило определить рабочее разведение для хламидийной сыворотки - 1:800.

Для проверки специфичности хламидийный антиген титровали в ИФА с гомологичными и гетерологичными сыворотками.

Результаты титрования показали, что положительная сыворотка с гомологичным антигеном имеет титр не нижё значения 1:2560. Титр гетерологичных сывороток с исследуемым антигеном не превышал значения 1:80.

Предлагаемая тест-система была апробирована при исследовании сывороток крови, абортировавших от хламидиоза в экспериментальных и полевых условиях и вакцинированных против хламидиоза овец, а также здоровых овец и больных сальмонеллезом, листерио-зом и бруцеллезом.

Исследования проводили в сравнений с РСК.

Титры антител у абортировавших животных достигали при исследовании в РСК 1:16 - 1:128, в ИФА - 1:6400 - 1:102400. Все сы-

воротки крови экспериментально зараженных хламиднями овец положительно реагировали и в РСК и в ИФА, однако в ИФА антитела регистрировали в более ранние сроки (3-5 сутки), чем в РСК (6-7 сутки).

Высота титров антител к хламидиям в сыворотке крови экспериментально зараженных животных составила 1:8-1:256, в ИФА - до 1:51200.

В сыворотке крови вакцинированных овец антитела к хламидиям выявляли в ИФА на 5 день после вакцинации (1:320 - 1:1280).

Затем титры антител повышались в течение 20-30 дней и достигали значений в ИФА - 1:12800 - 25600, в РСК - 1:8. Через 60 дней после вакцинации в РСК антитела к хламидиям не выявлялись, в ИФА титры антител варьировали через 60 дней в пределах 1:400 -1:600, через 90 дней - 1:100 - 1:400, через 150 дней - 1:10 -1:50.

Проведенные исследования показали, что обследование на хла-кидиоз вакцинированных животных с помощью ИФА следует проводить не раньше, чем через 3 месяца после иммунизации.

В результате исследований сыворотки крови экспериментально и естественно зараженных хламидиозом овец, а также здоровых не-вакцинированных животных нами установлен диагностический титр, который равен 1:200 (0П492=0.2).

2. 6.3. Вневрение метода ишунофермектоа диагностики хлакц-

диоза овец в ветеринарную щхаатку.

В 1995 году набор для нммуноферментноЯ диагностики хламиди-оза овец прошел апробацию в профильной лаборатории ВГНКИ ветпре-паратов и Государственной межведомственной комиссии по испытанию ветеринарных биологических препаратов в Российской Федерации и рекомендован для применения в ветеринарных диагностических лабораториях.

Метод иммуноферментной диагностики хламидиоза овец освоен ветврачами-серологами 35 областей Российской Федерации.

Рекламаций на качество отправленных наборов не поступало. Заключения ó сравнительных испытаниях набора ИФА поступили из Тамбовской. Иркутской. Читинской областей и НИИ ветеринарии Восточной Сибири.

Результаты проведенных сравнительных исследований в произ-

водственных условиях показали, что из 421 исследуемой Пробы в РСК положительно реагировали 83 (19.7%). а в ИФА - 155 (37,2%) проб, т.е. в ИФА больных хламидиозом животных выявлено на 17.5% больше, чем в РСК.

Следует отметить, что сыворотки крови, положительно реагирующие на хламидиоз в РСК. в 100% случаев реагировали положительно в ИФА.

Проведенные исследования показали, что ИФА с использованием предлагаемого набора на 17,5% эффективнее РСК и может с успехом применяться в ветеринары • лабораториях вместо трудоемкой РСК.

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены: ТУ на набор, временная инструкция по изготовлению и контролю набора и Временное наставление для иммуноферментной диагностики хламидиоза овец.

2.7. Разработка методов идентификации производственные

штаммов лептоспир и дифференциации L. Interrogans от L. bif-

leía :

Мы поставили своей целью применить метод молекулярного клонирования ДНК лептоспир для их идентификации и дифференциации,

2.7.1. Создание и анализ клонотеки ДНК L. interrogans серо-

eapa Pomona

Объектом для клонирования служил препарат хромосомной ДНК штамма ВГНКИ-6 (серовар Pomona) серогруппы Pomona.

Хромосомную ДНК штамма ВГННИ-6 расщепляли, на отдельные фрагменты эндонуклеазной рестрикции EcoR 1 в условиях неполного гидролиза и из общего набора рестриктов выделяли препаративным электрофорезом Фрагменты размером 1-4 тп.н. Полученные фрагменты ДНК лигировали с плазмидой рИС. 19. Всего получено 44 клона с рекомбинантным фенотипом Амр + lacZ-.

Аиишз подученной клонотеки •

Препараты ДНК 44 пяазмид расщепляли рестриктазой EcoRI и анализировали при помощи электрофореза в 0,8% агарозном геле, что позволило выделить вставки клонированной ДНК и определить их размер. Анализ данных показал, что 42 рекомбинштше плазмиды содержали по 1-3 фрагмента чужеродной ДНК, размеры которых варь-

ировали от 0.4 до 3,6 т.п.н.. что соответствует по размерам диапазону клонированных фрагментов.

Принадлежность клонированных фрагментов к лептоспирозной ДНК была подтверждена в реакциях дот-блот гибридизации с радиак-тивномечеными ДНК-зондами, которые являлись препаратами суммар-ьых нуклеиновых кислот L.Interrogans и L.blflexa. иерсиний, Е.coll. бруцелл, микоплазм и других бактерий.

Замечено, что наибольшее количество клонированных фрагментов в составе рекомбинантных плазмид имели комплементарные последовательности в геноме лептоспир серогрупп Pomona и Canlcola и единичные клоны давали положительные сигналы с ДНК-штаммов се-рогруппы Тарассови.

Проанализировав радиоавтографы, для дальнейших исследоЕаний из созданной клонотеки выбрали рекомбинантные плазмиды pLp 23, pLp 37. pLp 41.

2.7. 2. Реакция блоя-гибридиэсщии для дифференциации производственных витков летстоспир.

На данном этапе работы исследовали возможность применения рекомбинантных плазмид pLp 23. pLp37 и pLp41 для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации.

Результаты блот-гибридизации Hind III фрагментов тотальной ДНК штаммов лептоспир с ДНК - зондами pLp 23, pLp 37, pLp 41 представлены в таблице 10. г Таблица 10

Результаты блст-анализа

Штаммы лептоспир Размеры гибридизующихся Hind Ill-фрагментов геномной ДНК лептоспир с ДНК-зондом

pLp 23 pip 37 plp41

ВГНКИ-1 ВГНКй-2 ВГНКН-3 ВГНКИ-4 ВГНКИ-5 ВГНКИ-6 Moskva-5 Каширский Perepelicyn 493 Poland РОПиШ 4.9 4.8 4.7 3.6 4.8 3.6 4,8 3,6 4,8 3,6 4.8 4.9 4.6 3.6 4,8 3.6 4,8 3.6 4.8 4.7 4,6 4,8 3.6 5.0 4.7 4.0 2.9 4.6 4.0 2,9 4.8 4.5 4,0 4.7 4,0 2,0 4.8 4.7 2,9 5,0 4,0 4,8 4,6 4,0 2,9 4,8 4,0 4.8 4.8 4.6 4.0 2.9 5,1 4,7 2.8 1.4 4.5 3.5 5.0 4,5 5.1 2.9 2,4 2.0 1.7 4,8 4.5 3,5 4.8 3.5 2.6 5.1 4.7 4.5 2,8 1.4 5.0 4.5 5.1 4.5 2.9 2,4 2,0 1.7 5.1 4,7 4.5 3.5 2,9 5,0 4.5 3.5

С ДНК-зондом pLp 23 идентичные профили гибридизации характерны для штаммов ВГНКИ-4 и ВГНКИ-3, хотя все производственные и референтные штаммы давали чрезвычайно слабый гнбридизационный сигнал.

При гибридизации с ДНК-зондом pLp 37 не отмечено различий У штаммов ВГНКИ-З. ВГНКИ-5, ВГНКИ-2. Следовательно. pLp 23 и pLp 37 не пригодны для дифференциации производственных штаммов лептоспир друг от друга.

При специфическом "нарезании" ДНК производственных штаммов рестриктазой Hlnd III с последующим электрофоретическим разделением полученных фрагментов ДНК обнаруживали уникальное распределение полос после гибридизации с зондом pLp 41. Производственные штаммы отличались друг от друга числом и размером гибридизующих-ся фрагментов, а также интенсивностью сигналов радиоавтографии. Характерно наличие дискретных полос для штамма ВГНКИ-1 (Grlpppo-typhosa) по всему треку и интенсивного гибридизацнонного пятна для штамма ВГНКИ-4 (серогруппа (Tarassovl). Для штамма ВГНКИ-6 (Pomona) характерны три гибридизационные полосы размером 4,8:3,5:2,6 т.п.н.: для ВГНКИ-2 (IcterohaeBorrhagiae)- 4.5 н 3.5 т.п.н.; для ВГНКИ-З (Canicola) - 5.0 и 4.5 т.п.н.

Таким образом, наряду с общими для нескольких штаммов фрагментами каждый производственный штамм лептоспир имел индивидуальный гибридизующийся фрагмент.

Блот-гибридизация Hlnd III фрагментов ДНК штаммов лептоспир с ДНК-зондом pip 41 показала идентичные профили гибридизации для производственного штамма ВГНКИ-1 и референтного штамма Moskva-5. Также нами установлено, что нельзя точно отличить блот-гибриди-зацией с ДНК-зондом pLp 41 производственный штамм ВГНКИ-З и референтный штамм Каширский относящиеся к сергруппе Canicola. Однако блот- гибридизация с ДНК-зондом pLp 41 различала производственные штаммы ВГНКИ-4. ВГНКИ-5 и ВГНКИ-6 серогрупп Tarassovl, Sejroe и Pomona соответственно от их референтных штаммов Регере-llcyn, 493 Poland и Pomona.

2. 7.3. Реакция дот-блот гибридизации для дифференциации

L. interrogans от L.biflexa

Лептоспиры по размеру генома (2,0-2,5«10 Дальтон) не отличаются от других эубактерий, в тоже время наблюдается статистически достоверное различие в размере генома между сапрофитными и паразитическими штаммами лептоспир. При перекрестной гибридизации ДНК штаммов паразитических лептоспир с ДНК сапрофнгов процент гомологии составляет 3-10%. Такой низкий уровень ДНК позволяет рассматривать паразитические и сапрофитные лептоспиры в качестве самостоятельных видов генетических комплексов. Анализ подобия нуклеотйдных последовательностей ДНК отдельно у паразитических и сапрофитных лептоспир показывает, что каждая из этих групп генетически неоднородна.

Проведенные исследования показали, что из всех полученных нами плазмд, плазмида pLp 41 может быть использована для дифференциации L. interrogans от L.biflexa.

Приведенные ниже данные позволяют оценить специфичность pLp 41 для этой работы.

В работе использовали все серовары лептоспир L.interrogans и L.biflexa.

Из каждого штамма выделяли ДНК.

Для" учета результатов использовали радиоавтографию.

Результаты проведенных исследований представлены на рис.1.

1 г 3 4 5

А 9 0 « О 9

В О 9 9 0 О

С О 9 9 0 9

D 9

Рис.1. Радиоавтографы дот-гибридизации ДНК-зондов pLp 41 с препаратами ДНК L. Inteгrгogans и Х.ЬШеха, иммобилизованные на нитроцеллюлозной мембране: Линия А: L.pomonд, Д. 1агаззоУ1, Ь.ро1оп1са.1.<!1}а1г1, I. згааД-гаК: Линия В: Ь иЫЛсотМ,. 1.811егтап1. L.pyrogenes, L.ball^ml.

L.canicola; Линия С: L.lousiana. L.grippotyphosa. L.bratisiava. L.kabura: Линия D: Dl-L.copenhagenl. D2-L.semaranga. D3-L.patoc. D4-L.andamana.

Из рисунка видно, что в местах нанесения ДНК сероваров L.interrogans отмечали положительные сигналы гибридизации в виде темных пятен на рентгеновской пленке, а в местах нанесения ДНК L.biflexa - положительные сигналы.отсутствовали.

Таким образом, полученные плазмиды pLp23, pLp 37. pLp 41 можно использовать для изучения систематики патогенных лептос-пир. поиска возможностей их идентификации и дифференциации на осьове сравнения геномов. Плазмиду pLp 41 рекомендуется использовать для идентификации штаммов лептоспир. используемых биопромышленностью в производстве вакцины, а также для дифференциации L.interrogans от L.biflexa. •

3. ВЫВОДЫ

1. В России у овец регистрируются аборты, мертворожденна и гибель молодняка от хламидиоза, кампилобактериоза. сальмонеллеза и лептоспироза в Доволжском, Северо-Кавказском, Уральском и Восточно-Сибирском регионах чаще, чем в других регионах. Инфицированное» овец в этих регионах составила: хламидиями-2.3%. кампи-лобактериями-1,0%, сальмонеллами и лептоспирами - по 0,6%.

2. Для профилактики у овец абортов инфекционной этиологии создана ассоциированная вакцина против хламидиоза. кампилобактериоза. сальмонеллеза и лептоспироза. Разработана промышленная . технология производства вакцины.

3. Экспериментальными исследованиями определены оптимальные соотношения антигенов в составе ассоциированной вакцины. В одной прививной дозе ассоциированной вакцины содержится: хламидий - 60 мкг. кампилобактерий - 20 млрд.кл., abortusovis - 16 млрд.кл.,

S,typhlmurlum - 12 млрд.кл., S.dublln - 10 млрд.кл.. лептоспир Pomona, Tarassovl и Grlppotyphosa - no 12 млн.кл. и L.Sejroe -11 млн.кл. Применение вакцины в неблагополучных хозяйствах позволило сократить число абортов у овец с 6-20% до 1,1%, повысить вь'ход ягнят на 20%.

4. Оптимизирован состав твин-альбуминовой среды из отечественных компонентов для культивирования лептоспир: альбумин -0.25-0,30%; твин-80 - 0,06-0,07%; L-аспарагнн - 0,6-0,9 мкг/cil ; пролин - 275-350 мкг/см3, глутамин - 325-400 мкг/cfl ; пируват На - 190-260 мкг/см3; витамины: В1 - 0,18-0,22 мкг/см.^; В12 -0,36-0.44 мкг/см3. обеспечивающий накопление в стационарных условиях культивирования 160-200 млн.клеток/см3.

5. Показана пригодность для культивирования лептоспир (особенно hardjo) безбелковой среды из отечественных компонентов (мг/л): На2НР04 - 531,0; КН2Р04 - 69,0; MgS04 - 150,0; НН4С1 -3.0; FeS04 - 3,0; СаС12 - 4,0; ЭДТА - 10,0; глицерин - 200,0; твин-80 - 250,0; L-аспарагин - 500,0; В1 - 5,0; В12 - 2.0.

6. Разработана, испытана и предложена для внедрения технология производства вакцины против лептоспироза животных, включающая управляемый по р02 и концентрации твин-80 процесс периодического культивирования лептоспир с использованием оптимизированной твин-альбуминовой среды, что позволило увеличить выход бактериальной массы в 6-10 раз (1,5-1,7 млрд.кл./см ), по сравнению с традиционной технологией (80-100 млн.кл/см4), повысить стабильность, биологической активности препарата.

7. Разработан способ концентрирования лептоспир путем ультрафильтрации на полых волокнах ВПУ-15ПА в 10-30 раз без изменения их антигенных и иммуногенных свойств.

8. Усовершенствована диагностика хламндиоза овец в ИФА и лептосгтирозаживотныхв РИФ. Набор ИФА эффективнее РОС при серологической диагностики хламидноза овец на 17.5%. флуоресцирующий глобулин для диагностики лептоспироза животных позволяет повысить эффективность обнаружения лептоспир в патматериале на 5.2-19.8%.

,9. Отработан способ лечения свиней-лептоспироносителей ген-тамицином и фармазином-200. Однократное внутримышечное введение генiaw дина в дозе 10 ткс.ЕД/кг и фармазина-200 в дозе 0.05 of:/к-г мясом телз обеспечивало прекращение лептоспироносительст-

ва.

10. Отработан метод выделения высокоочищенных препаратов ДНК из биомассы лептоспир. Выделена рекомбинантная плазмида pip 41 размером 3880 пар нуклеотидов. пригодная в качестве видоспеци-фического гибридизационного зонда. Плазмидный зонд гибридизуется только с- ДНК лептоспир вида L.interrogans и не гибридизуется с ДНК L.biflexa иерсиний, кишечной палочки, бруцелл, микоплазм и других микроорганизмов. Показана возможность использования плаз-миды pLp 41 в качестве ДНК-зонда для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕРОЖЕНИЯ

Разработаны и предложены для ветеринарной практики (в соавторстве):

1. Вакцина ассоциированная инактивированная против хламиди-оза. кампилобактериоза, сальмонеллеза и лептоспироза мелкого рогатого скота (ТУ-938430-005 от 07.04.1997г.)

2. Набор для икмуноферментной диагностики хламидиоза овец (ГУ-930800-004 ОТ 31.03.1997г.).

3. Флуоресцирующий глобулин для диагностики лептоспироза животных (ТУ-10-19-65-39 от 10.04.1989г.)

4. Разработан новый способ изготовления вакцины против лептоспироза животных (решение о выдаче патента по заявке 95114193/13(024121) от 08.08.1995г.; опытно-промышлённый регламент производства вакцины).

5. Разработан метод концентрирования бактерийных суспензий и лечебно-профилактических сывороток с использованием ультрафильтрации на полых волокнах (Патент 20309115 от 20.03.1995г.; Методические рекомендации ВНИТИВП от 07.12.1994г:).

6. Предложены для лечения свиней-лептоспироиосителей гента-мицин и фармазин-200. Препараты вводить внутримышечно однократно в дозах: гентамицин 10 тыс.ЕД/кг, фармазин-200 - 0.005см//кг массы тела.

7. Предложены методы идентификации производственных штамМоЕ лептоспир и дифференциации L.interrogans от L.biflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации (Методические рекомендации Департамента ветеринарии MCXII РФ от 11.12.1996г.)

8. Материалы диссертации вошли в:

- санитарные правила СП 3.1.091-96 и ветеринарные правила ВП 13.3.1310-96. Профилактика и борьба с заразными болезнями общими 7ля человека и животных. Раздел 8. ^ептоспи-роз М.1996 г., с. 136-147 (утверждены Департаментом ветеринарии МСХП РФ 18 июня 1996 г. и Госкомсаиэпнднадзором России 31 мая 1996 г.).

- инструкцию о мероприятиях по борьбе с лептоспирозом животных:

- инструкцию о мероприятиях по борьбе с хламидиозом животных;

- Государственный Стандарт СССР. Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики лептоспироза.

5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ БЕЛОУСОВА ВАСИЛИЯ ИВАНОВИЧА

1. В.И.Белоусов. Использование реакции иммунофлуоресценции ^РИФЛв диагностике лептоспирозного аборта у коров // Науч.труды Л^Белоус&Г^ ^ ^ерев'атенко. Применение реакции иммунофлуоресценции при диагностике лептоспироза // Науч.труды Ленинградского СХИ, 1978.Т.349, с. 38-39.

3. В.И.Белоусов. Экспериментальный лептоспироз у нетелей // В кн."Лептоспирозы", Киев, 1979, с.188-189

с 4. В.И.Белоусов. Диагностическое значение обнаружения про-тиволептоспирозных антител в сыворотке крови абортированных плодов // В кн. "Лептоспирозы", Киев, 1979, с.78-79.

5. В. И. Белоусов. Оценка мероприятий против лептоспироза, проводимых в некоторых хозяйствах // В кн. "Лептоспирозы", Киев, 1979, С.122-124.

6. В. И. Белоусов. Дифференциация абортов лептоспирозной этиологии у крупного рогатого скота // Тезисы докладов Всес. науч-нотехнич. конф.молодых ученых, М., ВДНХ,1981,с.232-234

7. Ю.А.Малахов. В.И.Белоусов, В.С.Соловьева, А.П.Самохвалов, Г.Л.Соболева. Поствакционный иммунитет при лептоспирозе у сельскохозяйственных животных // Проблемы ветеринарной иммунологии М., 1985, с.94-96.

8. Б.И.Антонов, В.И.Белоусов, В.В.Борисова. Лабораторная диагностика лептоспироза сельскохозяйственных животных // Тези-

сы док. VIII Всес. конф. по лептоспирозам.Тбилиси, 1983, с.262-264.

9. Ю.А.Малахов, В.И.Белоусов, В.С.Соловьева. Г.Л.Соболева. Г.М.Осипова. В.В.Шорохов. Флуоресцирующие глобулины для диагностики лептоспироза // Ж.Ветеринария. 1984, НИ. с.68-70.

10. в.М.Усольцев, В.И.Белоусов. Эффективность флуоресцирую- ; щего глобулина для диагностики лептоспироза // Э.И.Передовой на-учно-произ. опыт в биология, промышлен. М.. 1986. N12. с.8-9.

П. В.И.Белоусов. Вспышка лептоспироза у лошадей // Проблемы интенсиф.

«ив-ва в Казахской СССР.Тезисы докл. респ.научно-проектн. конф.мол. ученых и специал. в г.Чимкенте Алма-Ата. 1986 г.. с 100-101

12. В.И.Белоусов, Н.Н.Мороз. Лептоспироз в свиноводческом комплексе // Матер.Всес. конф.эпиз. зпидимиология, ср-ва д-ки,терапии и сп. проф.инф. болезней общих для человека и ж-х. Львоа 1988, с.142-143.

13. В.М. Авилов. В.И.Белоусов. Диагностика лептоспироза животных в РСФСР// Матер.Всес. конф.эпиз. эпйдимнология, ср-ва д-ки.терапии и сп. проф.инф. болезней общих для человека и ж-х. Львов 1988, с.132-133.

14. А.Я.Саыуйленко, В.И.Белоусов. Т.А.Авдеева, В.И.Еремец. Перспективы научных исследований в технологии производства ветеринарных биопрепаратов // Сб.научн.тр. ВГНКИ ветпрепаратов. Науч. основы производства вет.пр., М., 1989, с. 3-8.

15. В.И.Белоусов, З.Я.Сазанова, А.К.Елисеев. Использование ИФА для оценки качества вакцины против лептоспироза собак // Сб.научн.тр. ВГНКН ветпрепаратов. Науч. основы производства вет.пр.. М., 1989, С.224.

16. С.К.Артюшин, В.И.Белоусов. Н.Н.Быкова. И.Н.Тюрина. Молекулярное клонирование ДНК 1.Ротопа // Сб.научн.тр. ВГНКИ ветпрепаратов Науч.основы производства вет.пр. . М.. 1989. с. 106.

17. В.И.Белоусов, Э. Я.Сазанова. Т.Я.Шкварук. А.К.Елисеев, Г.Л.Соболева. Е.В.Сусский, В.М.Усольцев. Испытание безбелковой среды для культивирования лептоспир у Сб.научн.тр. ВГНКИ ветпрепаратов Науч.основы производства вет.пр.. М.. 1989, с.143-144.

18. И.Н.Тюрина. В. И.Белоусов. Н.Н.Быкова. С.К.Артюшин. ДНК-зонд для идентификации и дифференциации лептоспир // Ж. Ветеринария. 1993, Н8, С.22-24.

19. В.И.Белоусов, Т.Я.Шкварук, С.П.Панферова. А.Ф.Нарыгина. Получение очищенных и концентрированных лептоспир /.' Ж. Ветеринария, 1993, N8, С.29-32.

20. В.И.Белоусов. В.И.Клюкина. А.К.Елисеев. И.И.' чиш. Получение компонентов ИФА для выявления специфических антител к лептоспирам, сальмонеллам, кампилобактериям и хламидиям // Ви-русн. болезни с/х ж. Тезисы док. Всерос. науч. прак. конф.. Г.Владимир. 1995. Сб.науч. трудов ВНИИЗЖ, с.74.

21. В.И.Белоусов, В.И.Клюкина, И.И.Кочиш. Разработка набора для иммуноферментной серодиагностики хламидиоза овец // Вирусн. болезни с/х ж. Тезисы док. Всерос. науч. прак. конф., г.Владимир, 1995, Сб.науч. трудов ВНИИЗЖ, с.76.

22. В.И.Белоусов. В.И.Клюкина. Н.И.Кочиш. Применение фермента при очистке вирусных антигенов для ИФА // Вирусн. болезни с/х ж. Тезисы док. Всерос. науч. прак. конф., Г.Владимир, 1995, Сб.науч. трудов ВНИИЗЖ. с. 77.

23. А.К.Елисеев, В.И.Белоусов. Подбор адъювантов к ассоциированной вакцине против хламидиоза,кампилобактериоза,сальмонел-леза и лептоспироза овец // Вирусн. болезни с/х ж. Тезисы док. Всерос. науч. прак. конф., Г.Владимир. 1995, Сб.науч. трудов ВНИИЗЖ. с. 192.

24. В.И.Белоусов. Исследование основных показателей при культивировании лептоспир в биореакторе // Научные основы техн. промышл. пр-ва ветер, био пр-тов. Тезисы докл. V Всеросс. конф. ВНИТИБП, Щелково. 1996, с. 97-98.

25. В.И.Белоусов, И.Н.Тюрина. Использование твинальбумино-вой среды при производстве вакцины против лептоспироза животных А Научные основы техн. промышл. пр-ва ветер, био. пр-тов. Тезисы докл. V Всеросс. конф. ВНИТИБП. Щелково, 1996. с.116-117.

26. В.И.Белоусов, И.Н.Тюрина. Дифференциация штаммов ВГНКИ-1 и Мозкуа-5 возбудителя лептоспироза серогруппы Сг1рро-1урЬоза на субсеровариантном уровне с помощью ДНК зондов в реакции блот-гибридизации // Научные основы техи. промыял. пр-ва ветер. био. пр-тов. Тезисы докл. V Всеросс. конф. ВНИТИБП. Щелково, 1996. с.132.

27. В.И.Белоусов. В.И.Клюкина. А.К.Елисеев. Сравнительная диагностика хламидиоза овец с использованием реакций связывания комплемента и иммуноферментного анализа // Научные основы техн.

• ■ ' ' I

промышл. пр-ва ветер, био. пр-тов. Тезисы докл. V Всеросс. конф.

ВНИТИБП. Щелково. 1996. с.155-156.

28. В.И.Белоусов. В. И. Клюкина. А.К.Елисеев. Изучение накопления спец. иммуноглобулинов Н и С к хламидиям. сальмонеллам и кампилобактериям после вакцинации кроликов ассоциированной вакциной против хламидноза. кампилобактериоза. сальмонеллеза и лептоспироза овец // Научные основы техн. промышл. пр-ва ветер; био. пр-тов. Тезисы докл. V Всеросс. конф. ВНИТИБП, Щелково, 1996, с.158-159.

29. В.И.Белоусов, В.И.Клюкина. А.К.Елисеев. Динамика накопления противолептоспирозных антител при иммунизации овец ассоциированной вакциной против хламидиоза, кампилобактериоза. сальмонеллеза и лептоспироза // Научные основы техн. промышл. пр-ва ветер, био. пр-тов. Тезисы докл. V Всеросс. конф. ВНИТИБП, Щелково. 1996, с.162-163.

30. В.И.Белоусов. А.К.Елисеев. Изучение активности лептос-пирозного антигена в составе ассоциированной вакцины против хла- ■ мидиоза. кампилобактериоза. сальмонеллеза и лептоспироза овец // Научные основы техн. промышл. пр-ва ветер, био. пр-тов. Тезисы докл. V Всеросс. конф. ВНИТИБП. Щелково, 1996, с.160-161.

31. В.И.Белоусов. Испытание экспериментальных образцов сухой вакцины против лептоспироза собак // Научные основы техн. промышл. пр-ва ветер, био. пр-тов. Тезисы докл. V Всеросс. конф. ВНИТИБП, Щелково, 1996, с1.164.

32. В. И.Белоусов. Результаты гематологических исследований больных лептоспирозом абортировавших коров и гистологические изменения в органах абортированных плодов // Научные основы техн. промышл. пр-ва ветер, био. пр-тов. Тезисы докл. V Всеросс. конф. ВНИТИБП. Щелково. 1996, с.165-166.

33. В.М.Усольцев, В.И.Белоусов. изыскание эффективных средств лечения животных-лептоспироносителей // Научные основы техн. промышл. пр-ва ветер, био. пр-тов. Тезисы докл. V Всеросс. конф. ВНИТИБП. Щелково, 1996, с.180-181.

34. В. И. Белоусов, В.И. Клюкина, N. А.Лучко, А. Н. ТрубицкиЯ. Разработка набора для серологической диагностики кампилобактериоза овец // Тезисы док. Веер.научн. конференции "инфекционн. болезни мол. с/х ж-ных". И., 1996, с.17-19.

35. В.И.Белоусов. Изучение эффективности вакцины против

лептоспнроза живот., изготовленной с использованием различных питательных сред // Тезисы док. Всер.иаучн. конференции "Инфек-цпоин. болезни мол. с/х я-ных". Н., 1996, с. 40-43.

36. В. Н. Белоусов, А. К. Елисеев... Влияние различных адъювангов на активность лептоспирозного антигена в составе ассоциированной вакцины против хламидиоза.кампилобактериоза, сальмонеллеза и лвптосгщроза овец // Тезисы док. Всер.иаучн. конференции "Иифчк-ЦП05П1. болезни МОЛ. С/Х 8-НЫХ". И.. 1996, с.43-45.

37. В .¡(.Белоусов, А.А.Маслак. Опыт разработки ассоциированной ннактивироваиной вакцины для иммунизации овец против абортов инфекционной этиологии // Тезисы док. идуч. -произ. кош}. "Шлет Курской б-ки и агробиопрсму» Курск, 1996, с. 47-52.

38. V.Belousov, I.Turlna. Differentiation of Leptospira atralus VCRKI-l and Kosk»a5 of Grippotyphoaa serovar at serova-riant level by GHA prole in the blotHybrldizatlon test // Intern. Leptospirosis society. First Beating ((antes (France) 9-12 Sept. 1996 p.D-4.

39. V.Belousov. The controlled cultivation of the in dust-rial Leptospira strains In the bloreactor // Intern. Leptospirosis society. First ceeting Kantes (France) 9-12 Sept. 1996 p. 1-2.

40. B.H. Белоусов. Разработка резана управляемого культивирования производственных отагаез лоптоспир в биореакторе // ».Ветеринария. 1997, Н 6. с,22-26,

41. В. II. Белоусов. В.П.Еремец. А.Я.Самуйленко. Соверяенство-ваияе основных этапов промызлеиного производства при создании ассоциированных вакцин // Тез.докл. 2-ofl кеядун. научно-практ. вся®. Актуальные проблею вет. сан. контр, сельскохоз. продукции. ч.2. AKtyanbH. пробл. вет. кед. Москва. 1997. с.61.

• 42. В.И.Белоусов, A.It.Елисеев, А.А.Наслак. И.А.Лучко, И.П.Иренхов. Изучение иинуногенности экспериментальных серий вакцин против сальмонеллеза овец.// Тез. докл. 2-ой Межд. науч-нопракт. конф. Актуальные проблемы вет.сан.контр.сельскохоз. продукции. ч.2. Актуальн. пробл. вет. мед. Москва, 1997, с.183-184.

ННИИВСГЭ, 1997 г., I'.Москва, Звенигородское та., 5, эяк. 2670/1, tv та ж'300 "К?.