Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Антигенные и иммуногенные свойства лептоспир в составе ассоциированной вакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллеза и лептоспироза овец

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

ОД

На правах рукописи

•• - У

ЕЛИСЕЕВ Анатолий Константинович

АНТИГЕННЫЕ И ИШУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ЛЕПТОСПИР В СОСТАВЕ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ХЛАМИДИОЗА, КАМПИЛОБАК-ТЕРИОЗА, САЛЬМОНЕЛЛЁЗА И ЛЕПТ0СПИР03А ОВЕЦ

16.00.03,- Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории ассоциированных вакцин Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук В.И.Белоусов

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук М.Н.Соколов кандидат ветеринарных наук В.В.Шорохов

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко

Защита диссертации состоится f? июня 1998 года в /^часов на заседании специализированного совета К 120.17.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности по адресу: 141142, Московская обл.. Щёлковский район, п/о Кашинцево, ВНИТИБП.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.

Автореферат разослан /^"мая 1993 года.

Учёный секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Ю.Д.Фролов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы обусловлена всё ещё довольно широким распространением лептоспироза, вызывающего массовые аборты и рождение нежизнеспособного молодняка у животных в том числе и овец.

Анализ данных ветеринарной отчётности за 1991-1996 гг. показал, что в овцеводческих хозяйствах Поволжья, Северного Кавказа и Восточной Сибири регистрируются инфекционные болезни, нарушающие функции воспроизводства у овец. Заболевания такого рода поражают до 4,5% овцематок, среди которых на долю лептоспироза приходится 0,6%, сальмонеллёза - 0,6%, кампилобактериоза - 1,0% и хламидиоза 2,3%. Для профилактики этих,болезней применяют в основном моновакцины, однако их применение связано с введением большого количества адъювантных и депонирующих веществ, оказывающих отрицательное воздействие на иммунный статус животных.

В этой связи одной из наиболее актуальных проблем для.ветеринарных -специалистов является разработка новых ассоциированных вакцин, в состав которых введены антигены лептоспир.

В нашей стране уже создан ряд ассоциированных вакцин: вакцина против лептоспироза и змкара крупного рогатого скота, лептоспироза и парвовирусной инфекции свиней (Малахов Ю.А., Кириллов Л.В.); вакцина "ПЛА"- против парвовирусной инфекции, лептоспироза, болезни Ауески (Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г. и др.).

Зарубежные фирмы производят разнообразные по составу ассоциированные вакцины для различных видов животных (крупный рогатый скот, свиньи, овцы, пушные звери, собаки), где антигены лептоспир объединяют с парвовирусами,вирусами диареи, инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, бешенства, чумы плотоядных, пасте-реллами и др. микроорганизмами.

Цель работы. Изучить антигенные, иммуногенные свойства лептоспир в составе ассоциированной вакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироза овец.

Задачи исследования:

- определить оптимальные соотношения антигенов лептоспир с антигенами хламидий, кампилобактерий и сальмонелл для конструирования ассоциированной вакцины;

- изготовить и испытать опытную серию ассоциированной вак-

цины на основе иммунологически сбалансированных количеств хлами-дий, кампилобактерий, сальмонелл и лептоспир.

- изучить антигенные и иммуногенные свойства лептоспир е составе ассоциированной вакцины против хламидиоза, кампилобакте-риоза, сальмонеллёза и лептоспироза в опытах на золотистых хомячках, кроликах и овцах .в сравнении с коммерческой вакцино£ против лептоспироза животных;

- исследовать сроки формирования и продолжительность иммунитета против лептоспироза у лабораторных животных и овец, вакцинированных ассоциированным препаратом;

- провести производственные испытания эффективности антигенов лептоспир в составе ассоциированной вакцины;

Научная новизна. Изучены антигенные и иммуногенные свойстве лептоспир в ассоциации с хламидиями, кампилобактериями, сальмонеллами, что явилось предпосылкой для создания ассоциированной инактивированной вакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироза овец. Установлены сроки формирования, напряжённость и продолжительность иммунитета против лептоспироза при иммунизации овец ассоциированной вакциной.

Новизна полученных результатов подтверждена патенте!* N2086259 "Ассоциированная инактивированная вакцина против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироза овец", зарегистрированным в Государственном реестре изобретение 10.08.97г.

Практическая значимость работы

1. Установлена возможность включения антигенов лептоспир е состав ассоциированной вакцины против хламидиоза, кампилобакте-

• риоза, сальмонеллёза и лептоспироза овец для её производства V показана эффективность её использования в ветеринарной практике.

Применение ассоциированной вакцины в овцехозяйствах, неблагополучных по хламидиозу, кампилобактериозу, сальмонеллёзу и лептоспирозу, позволяет предотвратить до 1007. абортов инфекционной этиологии. Выход ягнят в вакцинированной группе составил 90£, до вакциниции этот показатель составлял 75%.

2. Материалы диссертации использованы при подготовке нормативно-технической документации на инактивированную ассоциированную вакцину против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза

и лептоспироза овец "Овивак" (ТУ, наставление, инструкция), утверждённую 07.04.97г. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России;

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- IV и У-й Всероссийских конференциях "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов" (г.Щёлково, ВНИТИВП, 1991-1996г);

- Всероссийской научно-практической конференции "Вирусные болезни с/х. животных" ( г.Владимир, ВНИЯИ, 1995); ' '.

- Всероссийской конференции "Проблемы инфекционных болезней молодняка сельскохозяйственных животных" (г.Москва, МГАВМиБ, 1996Г); '

- Второй Международной научно-практической' конференции "Актуальные проблеммы ветеринарной медицины" ( г.Москва; 25-27 июня 1997Г);

- Межрегиональной научно-практической'конференции. "Обеспечение стабилизации АПК в условиях рыночных форм хозяйствования" ( г.Воронеж, ГАУ, 1997г.);

- на заседаниях Учёного Совета ВНИТЙЕП, 1992-1997гг. ■

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, включает введение,• обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и практические предложения. В списке литературы 544 источника, из них 243 иностранных. Работа иллюстрирована 24 таблицами, 3 графиками и 2 гистограммами. В приложении представлены документы, подтверждающие наиболее важные этапы исследований.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в период 1991-1997 гг. во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности, ВГНКИ ветпрепаратов, ВИЭВ, НИИВВС и Армавирской биофабрике.

Производственные испытания ассоциированной вакцины проводили в хозяйствах Читинской области на поголовьи 17000 овцематок тервого и второго окотов.

Для проведения экспериментальйых работ использовали производственные штаммы: Leptospira Grippotyphosa (ВГНКИ-1); Leptospira Tarassovi (ВГНКИ-4); Leptospira Pomona (ВГНКИ-6); Leptospira Sejroe (ВГНКИ-5); Salmonella typhimurium N371; Salmonella abortusovis N372; Salmonella dublin N373; Chlamydia psittaci var.ovis (N8 ВИЭВ); Campylobacter fetus subspecies fetus N30.

Антигенную и иммуногенную активность лептоспир в ассоциированной вакцине оценивали в опытах на кроликах, золотистых хомячках и овцах. Всего было использовано 90 овец, 198 кроликов, 860 золотистых хомячков.

Антигенную активность лептоспир в ассоциированной вакцине, динамику накопления специфических антител к лептоспирам и длительность их выявления у вакцинированных кроликов изучали в РМА и ИФА. Кроликам препарат вводили однократно внутримышечно в дозе по 15 млн лептоспир каждого серовара. Сыворотку крови кроликов исследовали через 7, 14, 21, 28, 36, 40, 45, 60 и 90 дней после введения антигена. .

Иммуногенную активность образцов вакцин (ЕД50) устанавливали путём определения 50%-ной эффективной дозы для золотистых хомячков, выраженной в миллионах микробных клеток (по методике Кербера в модификации Ашмарина). Оптимальнук иммунизирующую дозу ассоциированной вакцины, включающую лептос-пиры серогрупп: Помона, Тарассови, Гриппотифоза, Сейро, Усоль-цев, Харджио вначале определяли на лабораторных животных, затек овцах, при одно и двукратном введении различных доз ассоциированной вакцины с последующим исследованием сыворотки крови иммунизированных животных на нарастание титра иммуноглобулинов в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции микроагглютинации (РМА) в сравнении с моновакцинами.

Превентивные свойства сывороток крови иммунизированных животных исследовали на золотистых хомячках массой 40-50 гр. При этом считали, что овцы сохраняют невосприимчивость к лептоспирозу в том случае, если сыворотка крови защищает от гибели не менее 40% хомячков, заражённых 50%-ной летально! дозой лептоспир (Ю.А.Малахов с сотр.1977г.).

Изготовленные серии ассоциированных вакцин были проконтролированы согласно методическим указаниям по бактериологическому

контролю стерильности ветеринарных биопрепаратов, утверждённых ГУВ Госагропрома СССР 30.06.80. N115-6a;

Безвредность ассоциированной вакцины определяли путём её введения 5 морским свинкам подкожно в дозе 2,0 см3 и 5 белым мышам - в дозе 0,5 см3. Препарат считали безвредным при выживании всех животных и отсутствии признаков заболевания.

Стабильность эмульсинвакцины определяли выдерживанием препарата в термостате при 37°С в течение 14 суток. Эмульсию считали стабильной, если не происходило расслоения на фракции.

Концентрацию лептоспир в 1 см3 культуры определяли в счётной камере Петрова-Хауссера или Тома по прилагаемой к ним методике.

Статистическая обработка. Полученные результаты статистически обработаны по методике, описанной К.Пирсоном.

2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ СООТНОШЕНИЙ АНТИГЕНОВ ЛЕПТОСПИР В СОСТАВЕ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ХЛАЩЦИОЗА, КАМПИЛ0БАКТЕРИ03А, САЛЬМОНЕЛЛЁЗА И ЛЕПТОСПИРОЗА ОВЕЦ

Предварительными исследованиями in vitro и in vivo изучена совместимость антигенов хламидий, кампилобактерий и сальмонелл.

По результатам серологических исследований и опытов с контрольным заражением рассчитано оптимальное количество микробных клеток каждого антигена в прививной дозе: для хламидий - 60 мкг (суспензия с титром 6,5 lg ЭДД5о/0,2 см3); кампилобактерий - 35 млрд микробных кл.; сальмонелл абортусоЕИс - 16 млрд кл.; сальмонелл тифимуриум - 12 млрд кл.; сальмонелл Дублин - 10-11 млрд

КЛ

На следующем этапе перед нами стояли задачи:

- выявить наличие или отсутствие конкуренции между лептос-пирозным и сальмонеллёзным, кампилобактериозным. хламидийным антигенами, используемыми при изготовлении ассоциированной вакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и.лептоспи-роза овец;

- определить оптимальную концентрацию лептоспир в составе ассоциированной вакцины, при которой достигается наилучшая защита животных от вышеупомянутых заболеваний, вызывающих инфекционную патологию беременности у овец.

Для решения этик задач были изготовлены опытные серии ассоциированных вакцин, где использовали инактивированные формалином суспензии антигенов хламидий, кампилобактерий, сальмонелл и леп-тоспир, концентрация трёх антигенов оставалась постоянной, а концентрация лептоспир варьировала от 5 до 15 млн микробных клеток в дозе (по каждому из штаммов лептоспир Pomona, Grippotypho-sa, Tarassovi, Sejroe).

При испытании различных образцов ассоциированной вакцины с концентрацией лептоспир 5 и 10 млн микробных клеток каждого штамма в дозе не удавалось достичь достаточного уровня иммунитета по сравнению с моновакциной против лептоспироза. Титры антител к лептоспирам в РМА в среднем по группе кроликов, иммунизированных ассоциированной вакциной с содержанием 5 млн микробных клеток лептоспир каждого штамма в дозе, составляли 1:100-1:200, а по серовару sejroe - 1:50-1:100. В группах кроликов, иммунизированных ассоциированной вакциной с содержанием по 10 млн. микробных клеток'лептоспир каждого штамма в дозе, титры антител к лептоспирам были ниже, чем при иммунизации моновакциной. Так, титр антител у кроликов при иммунизации моновакциной составил в ИФА 1:14933, в РМА 1:1600-1:3200, а при иммунизации ассоциированной вакциной эти показатели равнялись в ИФА 1:8533, в РМА 1:400.

С целью повышения эффективности ассоциированной вакцины против лептоспироза, было увеличено количество лептоспирозноГЪ антигеца до 15 млн клеток (по каздому из 4 серогрупп лептоспир) в дозе. Приготовленные серии ассоциированных вакцин были испытаны на иммуногенность. Сыворотки крови кроликов исследовали в РМА и ИФА через 25 дней после вакцинации. Результаты представлены в таблице 1. Из таблицы видно, что при введении в состав вакцины антигенов•лептоспир в концентрации 60 млн клеток (по 15 млн клеток каждого штамма лептоспир в прививной дозе) титры антител у кроликов, вакцинированных ассоциированной вакциной, были не ниже; чем у кроликов, иммунизированных моновакциной, и составляли в основном 1:3200. Вакцина создаёт активный иммунитет против лептоспироза и соответствует требованиям инструкции при биологическом контроле препарата.

Активностиь антигенов лептоспир при вакцинации кроликов ассоциированной., вакцинои против хламидиоза, кампилобактери-оза, садьмонеллеза и лептоспироза __п-5

Серия вакцины, концентрация Доза см3 Метод введ. Титры антител

лептоспир в вакцине ИФА РМА

Pomon. Таг. Grip. Sej г.

Ассоциированная

вакцина Серия 03(эм) 2,0 в/м 1:25600 1:1600 1:1600 1:1600 1:800

60 млн кл. в дозе 1:3200 1:3200 1:3200 1:1600

Моновакцина 2,0 в/м 1:25000 1:3200 1:1600 1:3200 1:800

против лептоспироза 03/1-Л 60 млн кл. в дозе

Сравнивая титры антител к лептоспирам, регистрируемые у кроликов при вакцинации ассоциированной вакциной и моновакциной против лептоспироза, мы пришли к выводу, что присутствие в вйк-цине антигенов сальмонелл, кампилобактерий и хламидий не влияет на антигенную активность лептоспир.

Для изучения иммуногенной активности лептоспир в составе ассоциированной вакцины провели опыт по иммунизации золотистых хомячков с последуюидам их заражением (через 30 дней) вирулентным штаммом L.Pomona. Результаты представлены в таблице 2.

Табл.2

Результаты сравнительного изучения иммуногенности лептоспир в составе ассоциированной вакцины против хламидиоза, кампилооактериоза, садьмонеллеза и лептоспироза и моновакцины против лептоспироза

Серия вакц. Концтр. лептос. млн кл. в дозе Доза вакц. см3 К-во вакц хомя чков Результаты заражения

выжило пало ЕД50 см3

03 ассоц. вакцина 03/1-Л моно-вакц. Контр. 60,0 60,0 не вакц; 11 0,5 № 1Н-НЫ 10 IS 1 I 0 i О j 0,021 0,023

Из таблицы видно, что иммунизирующие свойства лептоспир в ассоциированной и моновакцине находятся на одном уровне (ЕД50 для ассоциированного препарата равна 0,021 см3, для моновакцины против лептоспироза - 0,023 см3).

В дальнейших экспериментах изучали влияние лептоспир на хламидии, кампилобактерии и сальмонеллы. Для этого были изготовлены опытные бивалентные серии препаратов:

1-я серия включала лептоспиры и хламидии;

2-я серия - лептоспиры и кампилобактерии;

3-я серия - лептоспиры и сальмонеллы.

Изготовленные препараты, после контроля на безвредность, испытаны на антигенную и иммуногенную активность в опытах на лабораторных животных в сравнении с соответствующими моновакцинами: против хламидиозного аборта овец; сальмонеллёзного аборта овец; кампилобактериоза овец; лептоспироза животных.

Количество микробных клеток в би- и моновакцинах соответствовало установленным оптимальным соотношениям антигенов в одной прививной дозе. Результаты исследований влияния лептоспир на иммунизирующие свойства хламидий, кампилобактерий и сальмонелл представлены в таблице 3.

Табл.3 '

Изучение влияния антигенов лептоспир.на иммунизирующие свойства хламидии, кампилобактерии и сальмонелл

Состав вакцин Показатели иммуногенности

хламидии кампилобак. сальмонел. лептоспиры

ИФА % защ ИФА РА ИФА % заш РМА ЕЙ50 млн м клет-.

Лептосп+ хламид. 1:8000 80 - - - - Рош 1:1600 Таг 1:430 йгур1:3200 Без 1:400 2,25

Лептосп+ кампилоб - - 1:7900 1: 430 - - Рош 1:1600 Таг 1:800 Сгур1:1600 Без 1:400 2,25

Лептосп+ сальмон. - - - - 1: 8000 100 Рош 1:800 Таг 1:400 Сгур1:1600 Эез 1:400 3,16

Лептосп. Хламид. Камгшл. Сальмон. 1:8000 100 1:9530 1:440 1:9800 100 Рош 1:1600 Таг 1:400 Сгур1:3200 БеЗ 1:400 2,17

Проведённые исследования показали, что антигены лептоспир не подавляют активность хламидий, кампилобактерий и сальмонелл, не влияют на формирование иммунитета при введении в организм жи-

вотного в смеси в применяемых концентрациях. Титры антител,регистрируемые в серологических реакциях, и процент защиты вакцинированных животных показывают, что лептоспиры в ассоциации с другими антигенами не менее активны в сравнении с монопрепаратом. ЕД50 в препаратах (лептоспиры + хламидии и лептоспиры + кампилобакгерии) составляет - 2,25 млн клеток лептоспир, в моновакцине против лептоспироза - 2,17 млн клеток лептоспир. Титр антител к лептоспирам Помона, Гриппотифоза, Тарассови, Сейро как при иммунизации moho-, так и бивалентными препаратами, варьировал от 1:400 до 1:3200. Следует отметить, что и лептоспиры не являлись конкурирующим агентом для хламидий, кампилобактерий и сальмонелл.

В результате проведённых экспериментов было установлено оптимальное количество лепгоспирозного антигена в составе ассоциированного препарата (60 млн кл. всех штаммов лептоспир в одной прививной дозе). Это соотношение мы использовали при изготовлении опытно-промышленных серий ассоциированной вакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироза овец.

2.3. ИЗГОТОВЛЕНИЕ ОПЫТНОЙ СЕРИИ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ХЛАМИДИОЗА, КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА, САЛЬМОНЕЛЁЗА И ЛЕПТОСПИРОЗА ОВЕЦ.

Для приготовления ассоциированной вакцины использовали отдельно инактивированные антигены лептоспир, хламидий, сальмонелл и кампилобактерий.

Лептоспиры культивировали на твин-альбуминовой среде по специальной прописи, разработанной во ВНИТИБП, патент N2088258 от 27.08.97г. Производственные штаммы и матровые расплодки лептоспир культивировали отдельно в сывороточной среде. Культуры из флаконов с наибольшим накоплением типичных по морфологии и с наиболее активной подвижностью лептоспир засевали в бутыли со стерильной питательной средой и культивировали при 27-28°С в течение 5-7 дней до накопления не менее 100 лептоспир в поле зрения микроскопа. Для приготовления производственных культур лептоспир, матровой расплодкой каждого штамма засевали реактор в соотношении 1:10 (1 часть культуры лептоспир и 9 частей питательной среды).

При управляемом режиме культивирования на 4 сутки достигали накопления лептоспир 1,5 млрд кл/см3. После культивирования все штаммы лептоспир объединяли, соблюдая процентное соотношение каждого штамма лептоспир (по 25% Pomona, Tarassovi, Grippotypho-sa, по 8,3% Усольцев, ВГНКИ-5, hardjo). Смесь культур инактиви-ровали формалином в 0,22-ной конечной концентрации в течение 12 часов при комнатной температуре.

Инактивированные и сконцентрированные антигены кампилобак-терий, -сальмонелл, хламидий и лептоспир объединяли в экспериментально установленных оптимальных соотношениях из расчёта содержания 38 млрд сальмонелл, 35 млрд кампилобактерий, 60 мет хламидий с титром 6.5 lg ЭЛД50/О,2 см3 и 60 млн лептоспир в дозе.

В реактор с адъювантом антигены вносили при включённой мешалке в последовательности: лептоспиры, кампилобактерии, сальмонеллы и хламидии. Смесь антигенов обьединяли с масляным адъюЕан-том в соотношении 1:1 и эмульгировали на коллоидной мельнице. Температура эмульгируемой смеси не должна превышать 28°С. Всего изготовлено 125 литров ассоциированной вакцины.

2.4. ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ И ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ ЛЕПТОСПИР В АССОЦИАЦИИ С КАШИЛОБАКТЕРИЯМИ, ХЛАМИДИЯМИ, САЛЬМОНЕЛЛАМИ (опыты на лабораторных животных)

Антигенные'свойства лептоспир в ассоциации с кампилобакте-риями, хламидиями и сальмонеллами изучали по титрам антител в сыворотках крови иммунизированных кроликов. Исследования сывороток крови вакцинированных кроликов показали, что уровень антител к лептоспирам после применения ассоциированной и моновакцины против лептоспироза не отличался и составлял е ЙФА 1:12800-1:25600, в РМА от 1:800 до 1:3200. Средний титр антител в РМА в обеих группах животных был одинаков и составил не ниже 1:1600.

Сыворотки крови кроликов, вакцинированных внутримышечно ассоциированной и моновакциной против лептоспироза в дозе 2,0 см3, проверены на превентивную активность на золотистых'хомячках. Сыворотка крови вакцинированных кроликов защищала от гибели 80Z хомячков при заражении вирулентной культурой лептоспир Pomona в дозе 10 LD50. Это свидетельствует о приобритении кроликами ус-

тойчивости к заболеванию лептоспирозом после их вакцинации ассоциированной вакциной.содержащей антигены лептоспир. Сыворотки крови кроликов, вакцинированных ассоциированной и моновакциной, обладали выраженной превентивной активостью. Через 40 дней после вакцинации 50%-ная протективная активность сыворотки крови кроликов, иммунизированных ассоциированным препаратом, составила 0,021. см3, а иммунизированных моновакциной - 0,023 см3. Таким образом, антигены лептоспир в составе ассоциированной вакцины обеспечивают формирование у кроликов иммунитета такой же напряжённости, что и моновакцина против лептоспироза.

2.5. ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ЛЕПТ0С-ПИРАМ ПРИ ИММУНИЗАЦИИ КРОЛИКОВ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНОЙ

Динамику накопления специфических антител к лептоспирам оценивали в ИФА по титру антител в сыворотке крови кроликов, иммунизированных ассоциированной вакциной. Для сравнительного контроля использовали коммерческую вакцину против лептоспироза животных. В опыте использовали животных, не имеющих в сьшоротке крови изучаемых антител. Вакцину кроликам вводили в объёме 2 см"3 внутримышечно.

Кроликов распределили на 2 группы по 5 животных в каждой:

- первую группу кроликов иммунизировали ассоциированной вакциной против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироза овец;

- вторую группу - моновакциной против лептоспироза;

- третью группу не иммунизировали (контроль).

Динамику накопления противолептоспирозных иммуноглобулинов класса М и в изучали при-исследовании сыворотки крови в ИФА на 5,7,11,15,19,25,33,40,45,60 и 90 день после иммунизации. У кроликов, иммунизированных моновакциной против лептоспироза, регистрировали на 5-7-й день титрах 1:200-1:400, до 15 дня происходило увеличение количества иммуноглобулинов с максимальным значением на 15-й день (1:10000), затем иммуноглобулины этого класса снижались к 26-30 дню до 1:50. У кроликов, иммунизированных ассоциированной вакциной, 1дМ регистрировали также с 5-7-го дня 1:400, максимальные титры антител регистрировали на 15-10

дни 1:14000, затем происходило постепенное снижение их количества к 26-33 дням до 1:100.

Иммуноглобулины класса G после иммунизации ассоциированной и моновакциной против лептоспироза регистрировали с 11-го дня соответственно 1:300 и 1:200, достигая максимума накопления на 26-40 день. Титр в ИФА составил 1:25000 (моновакцина) и 1:25600 (ассоциированная вакцина). IgG к лептоспирозному антигену, входящему в состав ассоциированной вакцины, после максимальных значений медленно снижались до 60 дня, но выявлялись в течение • 90 дней, тигры антител были в пределах 1:25-1:10О.

Таким образом, иммуноглобулины класса M появляются после вакцинации на 5-7-й день, максимальное накопление происходит к 15-18 дню, а затем идёт постепенное снижение их количества к 26-33 дням. IgG появляются на 11 сутки с максимальным накоплением к 33 дню и снижением их до минимума к 90 дню, что характерно и для моновакцин.

В результате изучения динамики накопления антител к л'ептос-пирам в сыворотках крови кроликов, иммунизированных ассоциированной вакциной, было установлено отсутствие какой-либо конкуренции с антигенами хламидий, кампилобактерий и сальмонелл, т.к. уровень нарастания тигров антител к антигенам лептоспир одинаков как при иммунизации ассоциированной вакциной, так и моновакциной против лептоспироза.

2.6. ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ И ИММУН0ГЕННЫХ СВОЙСТВ ЛЕПТОСПИР В СОСТАВЕ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ХЛАМИДИОЗА, КАМПИЛ0БАКТЕРИ03А, САЛЬМОНЕЛЛЁЗА И ЛЕПТОСПИРОЗА ОВЕЦ (опыт на суягных овцах)

Для опыта использовали 15 суягных клинически здоровых овцематок. Подопытные животные были получены из благополучного по лептоспирозу хозяйства. Ассоциированную и моновакцину вводили овцам в дозе 2 см3 в параректальное пространство, сыворотки крови исследовали в ИФА и РМА в течение 120 дней после вакцинации.

Результаты исследования в РМА сывороток крови овец, вакцинированных ассоциированной вакцинои .против хламидиоза, кампилобактериоза. сальмонеллеза и __ лептоспироза'

Наименование Титры антител в РМА после вакцина через ... дней МШИ

антигена 5 10 25 35 45 60 90

Gripp-sa 1:30 1:80 1:120 1:20 1:20 1:10 1:10

Pomona 1:10)1:20 1:160 1:80 1:2011:101 '1:10

Tarassovi 1:20|1:20 1:40 1:20 - 1:10|1:10

Sea roe 1:10|1:10 1:80 1:40 1:10 - -

В среднем 1719132±321100152140±28117д61lOtO110¿ 0

Моновакцина против лептоспироза 1:20 1:30 1:80 1:60 1:20 1:20 1:10

Контроль - - - - - -

Анализируя полученные данные было установлено, что при иммунизации овец ассоциированной вакциной титры антител в РМА регистрируются в сыворотке крови овец на 5-е сутки после вакцинации (1:17-9), максимальное их накопление происходит к 25 дню(1:100-52). К исходу 90 суток титры в РМА снижаются до 1:10^0.

Бротиволептсспирозные иммуноглобулины класса M регистрировали у овец на 5-7 сутки с максимальным накоплением на 12-15 сутки (1:14000-1:15000), затем их количество постепенно снижалось. К 30 дню содержание IgM от применения ассоциированной и моновакцины регистрировали в титрах соответственно 1:200 и 1:100. Специфические иммуноглобулины класса G у овец появляются на 7-15 дни (1:200-1:400), с максимальным накоплением к 33-40 дням ( титр в ИФА после применения ассоциированной вакцины -1:25600, после применения моновакцны - 1:25000), снижаясь к 60 ДНЯМ ДО 1:1600-1:2000.

Данные РМА и ИФА свидетельствуют, что динамика накопления IgM и IgG к лептоспирам в сыворотке крови овец, вакцинированных ассоциированной вакциной, существенно не отличается от динамики накопления IgM и IgG к лептоспирам при иммунизации моновакшной против лептоспироза. Это указывает, что лептоспирозный антиген ассоциированной Еакцины вызывает в организме овец выработку про-гиволептоспирозных антител на том же уровне, что и моновакцина ¡гротив лептоспироза используемая в ветеринарной практике.

2.7. РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНОЙ ИММУНИЗИРУЮЩЕЙ ДОЗЫ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ХЛАМИДИОЗА, КАМПИЛ0БАКТЕРИ03А, САЛЬМО-НЕЛЛЁЗА И ЛЕПТ0СПИР03А ОВЕЦ'

Изучение влияния дозы ассоциированной вакцины на формирование иммунитета к лептоспирам проводили на суягных овцематках.

Для подбора оптимальной иммунизирующей дозы ассоциированную вакцину, хранившуюся 12 месяцев при температуре 4-8° С, вводили суягным овцематкам (срок суягности один месяц) в область подх-востовой складки в дозах:

первая группа (10 голов) - 1 см3;

вторая группа (10 голов) - 2 см3;

третья группа (10 голов) - 3 см3;

четвёртая группа (10 голов) - 2+2 см3, интервал 20 дней;

пятая группа (10 голов) - моновакцина по наставлению.

Для контроля пятую группу животных иммунизировали моновакциной против лептоспироза. После вакцинации за животными былс установлено клиническое наблюдение с ежедневной термометрией, £ также проводили исследование сыворотки крови в ИФА на наличие .противолепгоспирозных антител и иммуногенную активность.

Через 12 часов после вакцинации у всех животных, иммунизированных как ассоциированной, так и моновакциной, наблюдали повышение температуры тела до 40,3 - 40,5°С, которая приходила '] норму через 2-3 дня. На месте введения вакцин образовывалась болезненная отёчность, исчезающая через 5-7 дней. Отмечены уплотнения размером до перепелиного яйца. При выборочном убое в об ласти введения вакцин обнаруживали гранулёмы размером 2x4 смг содержащие гомогенную массу. При убое вакцинированных животны через 3 месяца на месте введения обнаружены гранулёмы размеро 1,5x2 см2 (соединительная ткань). Таким образом, ассоциированна вакцина, изготовленная с адъювантом, включающим масло ПЭС-3 ланолин, по реактогенности не отличается от моновалентных масля ных вакцин. Овцематки всех групп окотились без патологии и срок.

Результаты исследования в ИФА сыворотки крови овец, вакцинированных различными дозами ассоциированной вакцины

Доза вакци- Титр противолептоспирозных антител в ИФА на день

нации 5 10 15 30 60 90 120

1 1:50 1:200 1 800 1:1600 1:100 1 10 -

О <С 1:200 1:1600 1 12800 1:25600 1:1600 1 80 -

О о 1:200 1:800 1 12800 1:25600 1:3200 1 800 1:100

2+2 1:1600 1:3200 1 12800 1:25600 1:1600 1 800 1:200

Моно-вакц.. 1:200 1:800 1 6400 1:25000 •1:1600 1 80 1:20

Результаты серологических исследований, представленные в таблице, показывают, что оптимальной иммунизирующей дозой явля-гтся 2 см3 вакцины. Динамика накопления и титры антител у живот-шх, иммунизированных моновакциной против лептоспироза на 90-й 1ень, не отличались от титров антител, регистрируемых после им-<унизации животных ассоциированной вакциной в дозе 2 см3. Доза 3 :м3 обеспечивала более высокие титры антител, чем 2 см3 только к ¡альмонеллам, титры антител'к другим антигенам не превышали зна-гений при вакцинации животных дозой 2 см3.

Двукратное введение ассоциированной вакцины по 2 см3 не побивает иммуногенности препарата, однако титры антител в РМА и ФА регистрируются в более высоких значениях длительное время до 4-5 месяцев после вакцинации), что затрудняет проведение се-ологической диагностики лептоспироза животных вследствие невоз-ожности дифференциации поствакцинальных титров антител от ин-екционных.

Иммунизированных овец ассоциированной вакциной против хла-идиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироза зарзжа-и на 110-й день суягности вирулентным штаммом "Манихино" серог-/ппы L.Pomona в дозе 2х105 кл.см3. Всего было сформировано 5 эупп по 6 голов. Результаты опыта представлены е таблице ¡5.

Из таблицы видно, что 100%-ной защиты против лептоспироза эстигали иммунизацией овец ассоциированной вакциной з дозе 2,0 13. Двукратное введение вакцины 2+2 см3 (с интервалом 20 дней) >еспечивает 100% защиту жиеотных от заболевания лептоспирозом и юртов, однако в этом случае регистрировали высокие титры анти-'Л и длительную их циркуляцию в крови.

Активность антигенов лептоспир в ассоциированной вакцине в зависимости от дозы вакцинации овец

Гр. ж-х Доза вак цины. Активность антигенов лептоспир после 40 дней с момента вакцинации

(СМ3) иммуногенность% титры антител в ИФА

1 1 50 1: 6000+1025

2 2 100 1:14000+1370

3 3 83,4 1:10000+1125

4 2+2 100 1:16000+1000

5 Моновакцина 100 1:14000+1370

2.8. ИЗУЧЕНИЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ИММУНИТЕТА У ОВЦЕМАТОК, ВАКЦИНИРОВАННЫХ АССОЦИИРОВАННОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНОЙ ПРОТИВ ХЯАМИДЙОЗА, КАМПИЛОВАКТЕРИОЗА, САЛЬМОНЕЛЛЁЗА И ЛЕПТОСПИРОЗА

Для изучения продолжительности иммунитета к лептоспироз

овцематок вакцинировали ассоциированной вакциной за 2,4,6,8,10

12,15 и 18 месяцев до осеменения. На 110-й день суягности ове

заражали L.Pomona (штамм "Манихино") в дозе 2х105 клеток. Ре

зультаты опыта представлены в таблице 7. „, ,

Табл.?

Результаты изучения продолжительности иммунитета у овец

Сроки вакцинации овец (месяц) Кол-во вакцин. живот-х Лептоспиры

% защиты ж-х от абортов обнаружение лептоспир

После окота ,Контроль , (не вакц-ны) 5 f ) +

+• обнаружен возбудитель лептоспироза (лептоспироурия) _ не обнаружен возбудитель лептоспироза

Из таблицы видно, что длительность иммунитета к лептоспирс зу у овцематок, вакцинированных ассоциированной вакциной прот] 'хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироз; составляет 12 месяцев.

2.9. . ОПРЕДЕЛЕНИЕ СРОКА АКТИВНОСТИ ЛЕПТ0СПИР03Н0Г0 АНТИГЕНА В СОСТАВЕ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ В ПРОЦЕССЕ ЕЁ ХРАНЕНИЯ

Изготовленную серию ассоциированной вакцины контролировали согласно требованиям ТУ. Вакцину, прошедшую контроль, заложили на хранение при температуре 4-8°С и через 3,6,9,12,15 и 18 месяцев проводили контроль иммуногенной активности лептоспирозного антигена, включённого в состав ассоциированной вакцины.

Иммуногенную активность лептоспир определяли на золотистых хомячках после указанных сроков хранения ассоциированной вакцины. Препарат вводили в дозах ОД см3, 0,02 см3, 0,004 см3. Через 30 дней после иммунизации животных заражали внутрибрюшинно вирулентными культурами лептоспир Pomona и Grippotyphosa в дозах 10 Ю5о(2х105кл./см3).Результаты изучения представлены в таблице 8.

Табл.3

Иммуногенность лептоспир в составе ассоциированной вакцины в процессе ее хранения

Длит-сть хранения (мес) Доза вак-ции (см3) K-bo вакц и зараз*, ж-х Результат заражения

L.Pomona 1 L.Srippotyphosä

пал/жив1 ЕДво Г3*/«®! №¡0

После изготовления ¡8 W 2,09х10~3 ш 1,78х10~3

6 Ufo ;§ W 2,09х10~3 й •1.78Х10"3

9 ;§ 2,88х10~3 ?? 2,45х10"3

12 S ш 3,39х10~3 w 2/8 2,88х10~3

15 § щ 5,49х10~3 ш a/v 4,68хЮ~3

18 § ш 1,23х10~2 §/§ 1,7х10~2 7/о i

Контроль (не вакцин-ны)| 10/0 | - | 10/0 |

Из таблицы видно, что антигены лептоспир сохраняют иммуни-ирующие свойства в составе ассоциированной вакцины в течение 12 есяцев хранения при температуре 4-8°С, через 15 месяцев иммуно-енность ассоциированного препарата снижается на 20-40%.

2.10. ИСПЫТАНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ АНТИГЕНОВ ЛЕПТОСПИР В СОСТАВЕ ИНАКТИВИРОВАННОЙ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ХЛАМИДИОЗА, КАМПИЛ0БАКТЕРИ03А, САЛЬМОНЕЛЛЁЗА И ЛЕПТ0СПИР03А ОВЕЦ В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ

Для проведения производственных испытаний на Армавирской биофабрике была изготовлена опытно-промышленная серия ассоциированной вакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонел-лёза и лептоспироза овец, которая прошла биологический контроль на иммуногенносгь, безвредность и стерильность. Вакцину готовили и контролировали согласно "Временной инструкции по изготовлению и контролю ассоциированной инактивированной вакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироза овец".

Испытания вакцины проведены в хозяйствах Кыринского районг Читинской области, стационарно неблагополучных по сальмонеллёзу, хламидиозу, где также выявлялись положительно реагируюшде животные на лептоспироз (Pomona, Srippotyphosa и Sejroe) и кампило-бактериоз. В хозяйствах этого района аборты регистрировались ) 2-30% овцематок. Вакцину применяли согласно наставлению по применению. Перед проведением опыта у животных брали кровь из ярёмной вены для серологических исследований. Овец иммунизировали ] параректальное пространство в дозе 2 см3 через один месяц посл< осеменения. В Кыринском районе вакцинировано 17000 овцемато! первого и второго окотов. Статистическую обработку данных прс® ли по вакцинированной группе овец и контрольной.

Табл.9

Эффективность применения ассоциированной вакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллеза и лептоспироза овец в неблагополучных по этим заболеваниям хозяйствах

Группы животных Общее кол-во животных Количество заболевших животных

Всего В %

Вакцинированная Контрольная 17000 17000 67 365 0,3 2,14

При учёте эффективности вакцинации было установлено, что у 17000 вакцинированных овцематок, абортировало 67, что составляв 0,3%. Причины абортов в опытной группе устанавливали диагност! ческими исследованиями в ветеринарной лаборатории и они не бьи связаны с профилактируемими заболеваниями.

18

Из 17000 овцематок контрольной группы абортировало 3%, из них - 2,14% (365 абортов) по данным ветеринарной лаборатории были сальмонеллёзной, хламидиозной и лептоспирозной этиологии.

Учёт эффективности вакцинации проводили по методу для оценки значимости расхождения частот X2 (критерий Пирсона). После произведённых вычислений получили значение Х2=20,9, при степени свободы у=1, табличная величина Х2о. 95= 3,9; Х2о.99= 6,6, поэтому можно утверждать , что вакцинация достоверно снизила число абортов у овец, связанных с профилактируемыми заболеваниями.

Коэффициент эпизоотологической эффективности вычисляли по формуле: 1ш (Ь _ а) _ 100 (2>14 _0)3)

= " £ = 2Л4 =

где Е - коэффициент эпизоотологической эффективности, а - заболеваемость среди привитых, Ь - заболеваемость в контрольной группе. Е = 85,9%

Индекс эпизоотологической эффективности к определяли по

4Ю№: V - „Ь _ „?.!«_ х

"а ~ о]гк 1' ' где к - индекс эффективности,

а - заболеваемость среди привитых, Ь - заболеваемость в контрольной группе.

В результате математических вычислений мы получили следую-Яе данные: X2 = 20,9; Р = 0,001; Е = 85,9%; к=7,1 ; где

X2- существенность разницы между опытными и теоретическими

(ожидаемыми) числами, Р - вероятность,

Е - коэффициент эпизоотологической эффективности, к - индекс эпизоотологической эффективности.

Анализ генеральной совокупности данных показал, что эффект акцинации на уменьшение заболеваемости в иммунизированной груп-е, по сравнению с контрольной, достоверен с вероятностью более 5% и не является случайным. Событие с вероятностью, равной ,9537, достоверно и оно произойдёт в 95,37% случаев. Выход яг-чт в опытной (вакцинированной) группе составил 90%, в контроль-"зм (непакци'кированной) -75%.

• Это свидетельствует о ишуногенной активности антигеног лептоспир в составе изготовленной ассоциированной инактивирован-ной вакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёзг и лептоспироза овец.

3. В Ы В О Д Ы

1. Экспериментальными исследованиями подобраны оптимальны! концентрации антигенов лептоспир в составе ассоциированной вакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироза овец, которые составляли для L. Pomona, Tarassóvi Grippotiphosa, Sejro по 15 млн микр. клеток в дозе.

2. Антигены лептоспир при введении в организм овец в соста ве ассоциированной вакцины в рекомендуемых концентрациях не ус тупают по иммуногенности антигенам лептоспир коммерческих моно вакцин против лептоспироза. ЕД50 антигенов лептоспир соответс твенно были равны 0,021см3 и 0,023см3.

3. У овец, иммунизированных ассоциированной вакциной, фор мируется активный иммунитет к лептоспирам через 30 дней поел иммунизации. Максимальное накопление IgG к лептоспирам регистри руется на 30-33 день после вакцинации с титрами антител в ИФА д 1:25600.

4. У овец, вакцинированных ассоциированной вакциной титр антител в РМА регистрируются с 5 дня (1:17), достигая максимам ных значений на 25 день (1:100), и снижаются к 90 дню до 1:1С При иммунизации овец моновакциной против лептоспироза урове! антител и длительность их регистрации в РМА не превышал значен! полученных при применении ассоциированной вакцины.

5. Антигены лептоспир не подавляют активность антигене хламидий, кампилобактерий и сальмонелл при введении в органи; животных в составе ассоциированной вакцины. Присутствие в вакщ не антигенов хламидий, кампилобактерий и сальмонелл не влияет i антигенную и иммуногенную активность лептоспир.

6. Продолжительность иммунитета против лептоспироза пос. вакцинации овец ассоциированной вакциной составляет 12 месяце: Через 15 месяцев после иммунизации протективная активность сыв< ротки крови овец снижается на Z0-40Z.

7. Заражение овец, вакцинированных ассоциированной вакцин* вирулентным штаммом лептоспир Pomona, предохранет от аборт*

100% овцематок. В контрольной (невакцинированной ) группе при экспериментальном заражении абортировало 60% овцематок и 80% являлись лептоспироносителями.

8. Вакцинация овец ассоциированной вакциной против хламиди-оза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироза в неблагополучных по лептоспирозу хозяйствах обеспечивала сокращение числа абортов с 6-20% до 0,3%, при повышении выхода ягнят на 15-20%.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработана специфическая профилактика абортов у овец хла-чидиозной, кампилобактериозной, сальмонеллёзной и лептоспирозной этиологии, подготовлена и утверждена нормативно-техническая документация:

- Технические условия - 9384-005 на изготовление ассоциированной инактивированной вакцины протиЕ хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироза мелкого рогатого скота, ут-зерждённые 07.04 1997г. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России;

- Наставление по применению ассоциированной инактивирован-■юй вакцины против хламидиоза, кампилсбактериоаа, сольмснеллега. I лептоспироза мелкого рогатого скота, утверждённое 07.04. 1997г. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России;

"Временная инструкция по изготовлению и контролю ассоциированной инактивированной вакцины против хламидиоза, кампилобакте-жоза, сальмонеллёза и лептоспироза мелкого рогатого скота", ут-зерждённая директорм ВНИТИВП А.Я.Самуйленко.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ П0 ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сазанова Э.Я., Шкварук Т.Я., Белоусов В.И., Елисеев А.К. ¡лияние различных адъювантов на антигенную активность вакцин [ротиЕ лептоспироза // Тезисы доклада IV-й Всесоюзной конферен-[ии "Научные основы технологии промышленного производства вете-шарных препаратов". М.- 1991,- С.83-34.

2. Белоусов В.И., Сазанова Э.Я., Шкварук Т.Я., Елисеев А. К., 'оболева Г.Л., Сусский Е.В., Усольцев В.М. Испытание безбелковой реды для культивирования лептоспир // Тез. докл. "Научные осно-

вы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов". М.,-1991.-С.143-144.

3. Белоусов В.И., Клюкина В.И., Елисеев А.К., Кочиш И.И. Пс лучение компонентов ИФА для выявления специфических антител * лептоспирам, сальмонеллам, кампилобактериям и хламидиям //"Вирусные болезни с/х животных". Сб. научн. трудов, г. Владимир, 1995г.-С.74.

4. Елисеев А.К., Белоусов В.И. Подбор адъювантов к ассоциированной вакцине против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмо-неллёза и лептоспироза овец //"Вирусные болезни с/х животных", Тез. докл., 1995.-С.192.

5. Белоусов В.И., Клюкина В.И., Елисеев А.К. Изучение накопления специфических иммуноглобулинов М и 6 к хламидиям, сальмонеллам и кампилобактериям после вакцинации кроликов ассоциированной вакциной против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонел-лёза и лептоспироза овец //"Научные основы технологии промышлен ного производства ветеринарных биопрепаратов" Тез.докл. 1996.-С.158-159.

6. Белоусов В.И., Елисеев А.К., 'Клюкина В.И. Динамика на копления противолептоспирозных антител при иммунизации овец ас социированной вакциной против, хламидиоза,кампилобактериоза сальмонеллёза и лептоспироза //"Научные основы технологии про мышленного производства ветеринарных биопрепаратов" Тез.докл.-1996.-С.162-163.

7. Белоусов В.И., Елисеев А.К. Изучение активности лептос пирозного антигена в составе ассоциированной вакцины против хла мидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироза ове //"Научные основы технологии промышленного производства ветери нарных биопрепаратов". Тез.докл.,1996.-С. 160-161.

8. Белоусов В.И., Елисеев А.К. Влияние различных адъюванто на активность лептоспирозного антигена в составе ассоциированно вакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллёза лептоспироза овец //Тез.докл. Всеросс. конф."Инфекционные болез ни молодняка с/х животных". М.-1996.-С.43-45.

9. Елисеев А.К., Клюкина В.И. Разработка тест-системы дл изучения иммуногенной активности ассоциированной вакцины проти хламидиоза. кампилобактериоза, сальмонеллёза и лептоспироза ове