Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Сравнительное морфо-функциональное исследование клеток гемолимфы шмелей рода BOMBUS

7 / 4 У У. X

Российский государственный педагогический университет имени А.И. Герцена Бирский государственный педагогический институт

На правах рукописи

Лопатина Ирина Константиновна

Сравнительное морфо-функциональное исследование клеток гемолимфы шмелей рода ВотЬив

16.00.02. - патология, онкология и морфология животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

профессор, доктор биологических наук

К.М. Суханова

Бирск- 1998.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 35

2.1. Материал исследования 3 5

2.2. Морфологические и цитохимические методики 38

2.2.1. Фиксация и окраска мазков для морфологического анализа 39

2.2.2. Фиксация и окраска мазков для цитохимиче-скогого анализа 39

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. МОРФОЛОГИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ФОРМЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ГЕМОЛИМФЫ ЗЕМЛЯНОГО ШМЕЛЯ ВОМВШ ТЕМШ8Т1Ш (Ь.) 44

3.1. Морфофункциональные особенности гемоцитов земляного шмеля 45

3.2. Динамика клеточного состава гемолимфы и количественного соотношения гемоцитов личинок земляного шмеля 70

3.3. Изменение структуры гемолимфы у куколок и имаго земляного шмеля 72

Глава 4. МОРФОЛОГИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ФОРМЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ГЕМОЛИМФЫ ГОРОДСКОГО ШМЕЛЯ ВОМВШ НУРЖЖЦМ (Ь.) 82

4.1. Морфофункциональная характеристика гемоцитов городского шмеля 83

4.2. Изменение состава и количественного соотношения ге-моцитов у личинки городского шмеля 105

4.3. Динамика состава и соотношение гемоцитов куколок и имаго городского шмеля 110

4.4. Заключение 118

Глава 5. СРАВНИТЕЛЬНАЯ МОРФОЛОГИЯ ФОРМЕННЫХ

ЭЛЕМЕНТОВ ГЕМОЛИМФЫ ИМАГО ШМЕЛЕЙ 120

5.1. Обзор морфологических особенностей гемоцитов 121

5.2. Характеристика состава и количественного соотношения гемоцитов 137

5.3. Заключение 141 Глава 6. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 143 ВЫВОДЫ 167 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 170 ЛИТЕРАТУРА 171

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Изменение экологического состояния природы, исчезновение некоторых видов животных, обусловленное хозяйственной деятельностью человека, ставит на современном этапе развития человечества важнейшую задачу охраны редких видов животных и растений, которая представляет собой часть проблемы сохранения генофонда живых организмов нашей планеты. Исчезновение вида или уменьшение его численности является невосполнимой потерей не только как объекта хозяйственного использования, но и как составной части природного биогеоценоза, участвующей в миграции химических веществ.

В настоящее время значительно возрастает активное наступление человека на природу, освоение новых территорий, интенсивное и, не всегда экологически грамотное, использование все новых средств борьбы с вредителями сельского хозяйства, в результате действия которых гибнут полезные насекомые, особенно опылители растений.

Дикие опылители играют немаловажную роль в опылении ряда сельскохозяйственных культур семейства бобовых и в первую очередь шмели, которые незаменимы в семеноводстве клевера. Сейчас из года в год численность шмелей резко снижается, некоторые виды занесены в Красную книгу, появилась необходимость их охраны и восстановления. Можно указать множество причин уменьшения численности шмелей, например, сплошное выкашивание лугов и выпас скота, особенно приносящие большой урон видам, гнездящимся на поверхности земли, применение инсектеци-дов и сплошное распахивание земель. Их нужно учитывать в разработке мер охраны и привлечения шмелей.

В нашей стране и в других странах проводятся эксперименты по доместикации шмелей, показавшие возможность сохранения и увеличения видов шмелей в районах интенсивного земледелия и в пригородных зонах (Гребенников, 1984).

Охрана и разведение полезных видов насекомых должны опираться на знание физиологического состояния отдельных особей и популяции в целом. В настоящее время для характеристики состояния популяций и прогнозирования численности видов насекомых стали использовать анализ клеточного состава гемолимфы (Сиротина, 1948, 1961; Сиротина, Черная, 1965; Glinski, 1969; Миселюнене, 1976; Запольских, 1983, 1998 и др.).

Гемолимфа насекомых весьма лабильна и при незначительных изменениях физиологического состояния организма наблюдаются заметные и вполне определяемые изменения структуры и количественного соотношения гемоцитов. Использование гематологического контроля в местах проведения агротехнических мероприятий позволит определять степень влияния удобрений и ядохимикатов на жизнедеятельность шмелей и других диких опылителей растений. Метод анализа гемолимфы дает возможность выявить те стадии онтогенетического развития, на которых воздействие ядовитых веществ окажется менее патогенным. Критерием для определения изменения состава и морфологии гемоцитов при различных заболеваниях и действии химических веществ будет служить морфо-функциональная характеристика гемолимфы нормально развивающихся насекомых. Поэтому знание морфологии и функциональной активности гемоцитов имеет важное практическое значение. Исследование гемолимфы насекомых разных отрядов дало возможность выявить значительные различия в составе и функциональной активности форменных элементов (Arnold, 1972).

Это открывает новые пути использования структуры гемолимфы в таксономических целях.

Клеточный состав гемолимфы исследован у сравнительно небольшого числа видов перепончатокрылых насекомых. В литературе имеются достаточно полные сведения о форменных элементах гемолимфы медоносной пчелы (Шишкин, 1956, 1957, 1958, 1959; Соколов, 1963, 1964, 1966; Glinski, 1969; Wille, Vecchi, 1974; Запольских, 1983; Vecchi, Sabelli, Wille, 1978; Домацкая, Гробов, 1980).

Было проведено исследование гемолимфы некоторых видов пилильщиков (Строганова, Гулий, 1973; Запольских 1976, 1977; Запольских, Суханова, Семенов, 1989).

Представлены в литературе результаты исследования форменных элементов некоторых видов муравьев (Запольских, Ко-тельникова, Хамидуллина, 1981). Гемолимфы других многочисленных видов перепончатокрылых насекомых, в том числе и шмелей, важнейших из диких опылителей, не изучалась, хотя многие из них имеют большое народнохозяйственное значение.

В настоящее время также мало работ в которых проводится определение видовых различий состава гемолимфы насекомых.

Цели и задачи исследования

Целью нашей работы являлось изучение морфо-функциональных особенностей гемолимфы шмелей на разных стадиях онтогенеза и сравнительное исследование состава гемолимфы разных видов шмелей на стадии имаго.

В связи с этим перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать клетки гемолимфы двух видов шмелей Bom-bus terrestris (L.) и Bombus hypnorum (L.) на всех стадиях индиви-

дуального развития, а также четырех видов шмелей ВошЬиэ 1ар1-ёагшБ (Т.), ВошЬиБ ЬогЧогит (Ь.), ВотЬиБ з1тепоу1е1и8 (8каг.), ВотЬиБ сопБоЬппиз (Ва1гЬЬ.) на стадии имаго.

2. Выявить морфологию гемоцитов данных видов шмелей на основе использования различных методов морфологического и цитохимического анализа.

3. Изучить качественные и количественные изменения в составе клеток гемолимфы шмелей в зависимости от возраста и стадии онтогенеза.

4. Выявить черты сходства и различия состава и морфологии гемоцитов у разных видов шмелей рода ВотЬиБ (Ьа1;г.).

Решение данных вопросов позволит использовать результаты анализа гемолимфы шмелей в научных и практических целях.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые изучены клетки гемолимфы шмелей на всех стадиях индивидуального развития, дана их морфо-функциональная характеристика и классификация соответственно принятой номенклатуре клеток гемолимфы по классификации Сиротиной М.И. и Черной Г.С. (1965).

У обоих видов определена изменчивость клеточного состава гемолимфы в зависимости от стадии развития.

Впервые изучен клеточный состав гемолимфы имаго шмелей. Дана их морфо-функциональная классификация и подробное описание морфологии гемоцитов. Выяснена таксономическая значимость клеточного состава гемолимфы имаго шмелей: выделены типы гемоцитов общие для данного рода и для отдельных видов.

Представлены данные о качественном и количественном изменении соотношения классов гемоцитов на разных стадиях онтогенеза и в разных возрастных группах шмелей.

Результаты настоящего исследования имеют значение в энтомологии, так как позволяют расширить круг перепончатокрылых насекомых, гемоциты которых изучены и дают возможность провести сравнительный анализ клеточного состава гемолимфы.

Практическая значимость работы определяется возможностью использования результатов исследования функциональной морфологии гемоцитов шмелей в норме, как эталона для определения физиологического состояния насекомых при искусственном разведении и на территориях, подвергающихся антропогенному воздействию, особенно в местах интенсивного клевероводства. Это позволит выявить срытые заболевания и определить степень воздействия на насекомых различных химических веществ, применяемых в сельском хозяйстве, так как гемолимфа наиболее быстро реагирует на изменение физиологического состояния под действием факторов внешней среды.

Соответственно, результаты исследования гемолимфы шмелей разных стадий развития позволят выявить тот период онтогенеза, когда организм наиболее подвержен влиянию внешних факторов и, в связи с этим, определить оптимальные сроки использования химических веществ, применяемых в земледелии.

Выделенные нами видовые особенности гемолимфы шмелей могут быть использованы в идентификации вида, в совокупности с другими признаками, в тех случаях, когда определение по внешним критериям затруднено.

Положения выносимые на защиту

1. Морфология и функциональная активность клеток гемолимфы всех стадий онтогенеза земляного шмеля ВотЬиБ 1еггез1:п8

(Ь).

2. Динамика гемоцитов в онтогенезе земляного шмеля в качестве стандарта для сравнения с другими видами шмелей.

3. Онтогенетическое развитие гемолимфы городского шмеля ВотЬиБ Ьурпогит (X.) в сравнении с земляным шмелем.

4. Морфологические особенности гемоцитов четырех видов шмелей на стадии имаго.

Апробация работы

Основные положения диссертации были обсуждены и одобрены на 28-ой, 31-ой, 32-ой научных конференциях Бирского государственного педагогического института (Бирск, 1991, 1994, 1995гг.), на научных семинарах зоологов ФПК при РГПУ им. А.И.Герцена (1989, 1993. Санкт-Петербург), на Всероссийской научно-практической конференции «Биологические науки в высшей школе» (1998, Бирск).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объём работы

Диссертация изложена на 191 страницах машинописного текста, содержит 41 рисунок, среди которых микрофотографии и 10 графиков. Цифровой материал представлен в виде 9 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и практических предложений. Список литературы включает 210 источников из них 114 зарубежных авторов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Интерес к изучению клеточных элементов гемолимфы обусловливается ее чрезвычайно многообразными морфо-функциональными особенностями и возможностью практического применения результатов исследования.

Уже на ранних этапах исследования гемолимфы отмечается гетерогенность клеточных элементов. Первыми были выделены в крови насекомых веретеновидные и амебоидные гемоциты. (Newport, 1845; Graber, 1871; Cattaneo, 1889).

В последующих работах при изучении гемолимфы прямокрылых выделены четыре типа гемоцитов, которые были названы лейкоцитами различных стадий развития. Лейкоциты первой стадии, более мелкие, способные к митотическому делению, являлись исходной формой для развития других типов гемоцитов. (Cuenot, 1895, 1896). Эти клетки в дальнейшем стали называть пролейкоци-тами. Исследование гемолимфы других видов насекомых привело к открытию новых типов гемоцитов, различающихся по форме и функциональным особенностям. Так в крови насекомых были обнаружены крупные клетки с ядром, содержащим характерные глыбки хроматина, а также клетки, имеющие в цитоплазме округлые включения. Эти клетки соответственно стали называть эноци-тоидами и сфероцитами. (Поярков, 1909, 1910; Hollande, 1911).

Обнаруженные в крови прямокрылых насекомых лейкоциты второй стадии или фагоциты (Hollande, 1909) были разделены на микронуклеоциты и макронуклеоциты (Paillot, 1919, 1923). Разнообразие объектов, а также использование боле совершенных методов исследования привело к выделению новых типов гемоцитов. Только отсутствие единой классификации гемоцитов создавало пу-

таницу в обозначениях гемоцитов, у разных авторов одни и те же клетки гемолимфы имели разные названия.

В гемолимфе прямокрылых насекомых на ранних этапах изучения выделялись гемоцитобласты, соответствующие пролейкоци-там, веретеновидные гемоциты и зернистые лейкоциты. Пролейко-циты описывались как округлые клетки с большим ядром, наблюдалась дальнейшая их дифференциация, приводящая к образованию веретеновидных и зернистых клеток, это подтверждалось наличием в гемолимфе переходных форм клеток.

Зернистые и веретеновидные клетки имели вытянутую форму. Зернистые клетки отличались отсутствием способности к передвижению и содержали в цитоплазме большое количество ней-трофильных гранул (Богоявленский, 1932).

Позднее, в гемолимфе Lokusta migratoria на разных стадиях онтотогенеза, было выделено пять типов гемоцитов: гранулоциты, плазматоциты, эноцитоиды, коагулоциты и сферулоциты (Hoffmann, 1969,1970; Hoffmann, Stoeckel, 1968; Hoffmann, Porte, Joly, 1968; Hoffmann, Brechelin, Hoffmann, 1974). Прогемоциты отмечаются как редко встречающиеся родоначальные клетки гемолимфы, в гранулоцитах и коагулоцитах обнаружен лизоцим, участвующий в свертывании гемолимфы (Brechelin, Zachary, Hoffmann, 1978; Zachary, Hoffmann, 1984).

В гемолимфе кузнечика, кроме названных пяти типов гемоцитов некоторые авторы выделяют адипогемоциты, содержащие ли-пидные включения. (Zachary, Hofmann.1984; Sharma, Tikku, Sax-ena, 1986). Наибольшее число типов гемоцитов описано в гемолимфе Chrotogonus trachypterus, Acrida exaltata: прогемоциты, полиморфные плазмоциты, имеющие веретенообразную форму; гранулоциты; цистоциты (коагулоциты); сферулоциты, адипогемоци-

ты; эноцитоиды; подоциты, крупные клетки с 3-8 цитоплазматиче-скими отростками; червеобразные клетки. (Sharma, Dutta, 1976).

Такие же довольно противоречивые сведения имеются в литературе о составе гемолимфы тараканов. В основном представлены данные о гемоцитах имаго. Все авторы, изучающие гемолимфу тараканов, выделяют три типа клеток: прогемоциты, плазматоциты и гранулоциты. (Yearger, Munson, 1950; Sarcaria, Bettini, Patton 1951; Wheeler, 1963; Arnold, Salkeld, 1967; Кочетова, 1978). По другим типам гемоцитов сведения весьма разнообразны. Так, в гемолимфе Blatta orientalis, методами флюоресцентной микроскопии выделены только два типа клеток (Belden, Cowden 1971). В гемолимфе Blaberus giganteus были обнаружены два типа гемоцитов: прогемоциты и плазматоциты (Arnold, 1960). Позднее эти же автором у данного вида определено было 4 типа клеток: прогемоциты, плазматоциты, гранулоциты и сферулоциты (Arnold, Salkeld, 1967). Гистохимическое исследование гемоцитов позволило определить наличие в гемолимфе Periplaneta orientalis уже семи типов клеток. Из них наиболее многочисленны плазматоциты, прогемоциты и цистоциты, тогда как гранулярные клетки, эноцитоиды, адипогемоциты относительно немногочисленны (Sharma, Агуа, 1974). Некоторые авторы не выделяют в гемолимфе тараканов эноцитоиды (Patton, Flint, 1959; Arnold, Salkeld, 1967; Arnold, 1960, 1972; Price, Ratcliffe, 1975), хотя выделенные в гемолимфе Gromphadorhina portentosa - так называемые серповидные клетки, являются в действительности эноцитоидами (Gupta, 1985). Исследование гемолимфы таракана Blattella germanica позволило выделить 10 типов гемоцитов, среди них названы подоциты и вермици-ты, впервые выявленные у тараканов. У этого же вида обнаружен новый тип гемоцитов, который обозначен как спиноциты (Pathak,

Kulshreshtha, 1995). Электронномикроскопическое исследование гемоцитов тараканов показало наличие семи типов клеток: проге-моциты, гранулоциты, плазматоциты, сферулоциты, эноцитоиды, адипогемоциты и коагулоциты. Коагулоциты с помощью светового микроскопа идентифицировать не удается (Han, Gupta, 1988).

Работ по изучению состава гемолимфы в процессе онтогенеза тараканов почти нет, имеющиеся данные указывают на то, что состав гемолимфы меняется в ходе развития личинки, меняется также соотношение гемоцитов не только у личинок, но и в гемолимфе самок и самцов одного вида. В гемолимфе таракана Nauphoeta cinerea выявлены прогемоциты, плазматоциты, гранулоциты, адипогемоциты и эноцитоиды. В ходе индивидуального развития качественные изменения гемоцитов незначительны и состав гемоцитов не изменяется. Количественное соотношение подвергается значительным изменениям. В ходе личиночного развития сферулоциты и гранулоциты малочисленны у только что отродившихс