Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Факторы естественной резистентности при инфекционной патологии медоноснойпчелы (Apis mellifera L. )

Актуальность темы. Проблема естественной резистентности медоносных пчел имеет большую научную и практическую значимость, обусловленную ведущей ролью её в защите пчел от болезнетворных агентов, а также их продуктивности. Изменения в состоянии резистентности являются объективными показателями многообразных полезных и вредных воздействий на пчел. Появились новые болезни пчел-варроатоз, спироплазмоз, получили распространение аскосфероз, вирозы и стрессы от кочевок, обработок акарицидами, антибиотиками, интенсивной подкормки сахарным сиропом. Сложившиеся обстоятельства настоятельно требуют повышения уровня знаний о резистентности пчел к патогенам и использования их в практическом пчеловодстве.

Устойчивость медоносных пчел к болезнетворным агентам освещена в литературе лишь отдельными разработками. Изучены некоторые факторы естественной резистентности, среди которых наиболее интенсивной оценке подвергался фагоцитоз (Шишкин Б. А., 1958; Gilliam м. and Shimanuki Н.Д967; Запольских 0.В.,1983); лизоцим и ингибиторы (Malke H.t 1964;Messner В., 1966; А.И.Егорова, 1979; Glinski Z., Rzedzicki J., 1979; Скрипник Е.И., Артеменко JI.П.,1980; Руденко Е.И., 1987), В последние годы значительное внимание уделено выявлению и расшифровке природы антибактериальных субстанций гемолимфы пчел (Casteels P. and oth., 1989,1990).

В специальной литературе по пчеловодству получили достаточно широкое освещение данные по генетической способности пчел к очистке гнезд (Rothenbuhier w.c. and Tompson v.с.,1956), антибактериальным свойствам меда, прополиса, маточного молочка (Иойриш И.П., 1956; Grout R.A., 1963; Темнов В.А., 1967; Таранов Г.Ф., 1968, 1986; Dustmann J.н.,1971,1982; Поправко С.А., 1982,1985), защите гнезд от проникновения в них всевозможных паразитов (Комаров 1.М.,

Губин А.Ф., 1937; Peng y.S.C. and oth., 1987) и некоторым другим особенностям. Однако представление о защитных факторах у отдельных особей и семьи в целом остаётся неясным; имеющиеся сведения далеко уступают современным данным о резистентности позвоночных животных (Штейнхауз Э., 1952; Зильбер АД., 1958; Woodset K.R. et al, 1958; Барнет Ф.М., 1971) и отдельных видов беспозвоночных (Купер ЭД., 1980).

В то же время создание ясного представления о системе устойчивости и механизме её функционирования позволяет более полно представить патогенез, разработать новые способы диагностики, терапии и профилактики болезней G позиций защитной реакции организма насекомого. Возможность оценки степени защищенности способствовала бы целенаправленному отбору при выведении устойчивых к заболеваниям линий и пород пчел.

Цель .и задачи исследований. Целью работы явилось определение систем и механизмов естественной резистентности у медоносных пчел.

Исходя из этого были поставлены следующие задачи:

1. Выявить факторы естественной резистентности у семьи медоносных пчел.

2. Определить факторы и механизмы резистентности медоносной пчелы в онтогенезе.

3. Установить природу антимикробных субстанций в нектаре, меде и маточном молочке,

4. Выявить изменения достояния резистентности пчел под действием отдельных внешних факторов и патогенов.

Научная новизна. Впервые исследованы системы и механизмы резистентности медоносных пчел в онтогенезе. Определено, что резистентность организма насекомого неспецифическая, представлена системой из нескольких типов клеток: секреторных - кишечника и кишечных желез, гемоцитами и ретикуло-эндотелиальными; механизмами агглютинации, агломерации, лизиса, фагоцитоза,' инкапсулирования и меланизации. Резистентность семьи обусловлена защитными факторами отдельных составляющих её индивидуумов, наличием этих факторов в кормах, поведенческими инстинктами взрослых пчел и, по существу, является адаптационной.

Установлено наличие комплемента в гемолимфе; лектинов в гемолимфе и экстракте из яиц; антибактериальных пептидов в секретах желез, гемолимфе, содержимом зобика, меде, маточном молочке; лизо-цима в секретах грудной и ректальной желез, содержимом яиц, клетках средней кишки; кишечных протеаз, оказывающих вирусингибирующее действие, тирозиназы в гемоцитах.

Установлено, что антимикробные субстанции меда и маточного молочка являются продуктами секреции желез переднего отдела кишечника и представлены пептидами и лизоцимом.

Дана количественная и качественная характеристика некоторых факторов, ответственных за невосприимчивость пчел к отдельным возбудителям. Разработаны способы'определения лектинов и антибактериальных пептидов в гемолимфе пчел. Показана возможность оценки состояния резистентности организма этих насекомых по ряду показателей в различные периоды года, в норме и изменения этих показателей при патологии.

Стимуляция антигеннеспецифических механизмов вызывает в организме пчел состояние параиммунитета при котором активность антибактериальных пептидов, лизоцима и лектинов повышается в 2-10 раз с продолжительностью 3-5 суток, увеличивается также количественное содержание ДОС, аминокислот, общего белка в организме. Развитие инфекции с летальным исходом снижает активность факторов резистентности вплоть до её полной утраты.

Разработан состав отполирующей белковой подкормки для пчел используемой как неспецифическое лечебное средство при мешотчатом расплоде, нозематозе и варроатозе пчел (а.с. Ш 8290088). Разработан способ лечения пчел основанный на интеграции действия лечебных средств и естественной устойчивости пчелосемей (а.с. № 820759).

Результаты выполненных работ позволяют вынести на защиту сле--дующие основные положения:

1. Характеристика факторов и механизмов естественной резистентности медоносных пчел.

2. Оценка состояния резиетентности организма пчел в онтогенезе, в различные периоды года, в норме и при патологии.

3. Природа антимикробных субстанций в нектаре, меде и маточном молочке.

Практическая ценность работы. По результатам исследований разработаны и внедрены: Временное наставление по постановке реакции нейтрализации для диагностики вирусного паралича пчел (утверждены ГУВ МОХ СССР 19.02.1975 г.) в соавторстве с профессором Гробовым О.Ф.; методические рекомендации по определению факторов неспецифического иммунитета медоносной пчелы (утверждены ДВО ВАС-ХНЙД I5.0I.I99I г.), рекомендации по диагностике и терапии смешанных заболеваний пчел (утверждены ДВО ВАСХНЖ I5.0I.IS9I г.), пособие для фермерских и крестьянских хозяйств по борьбе с болезнями пчел, 1993 г. (раздел "резистентность пчел").

Выражаю глубокую благодарность сотрудникам Всесоюзного ордена Ленина научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) - заведующему лабораторией профилактики болезней и экологической охраны пчел проф.Гробову О.Ф., зав.лабораторией иммунитета проф. Федорову Ю.Н., ст.науч.сотруднику лаборатории биохимии, канд.биол.наук Устиновой Г.И. за помощь, оказанную при выполнении диссертационной работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Первыми исследованиями по иммунитету беспозвоночных были опыты И.И.Мечникова над медузами и морскими звездами, выполненные им в Мессине в 1882 г. Именно эти работы привели к созданию фагоцитарной теории, нашедшей'широкое подтверждение в последующем.

В дальнейшем изучение иммунитета насекомых ( insecta ) складывалось в направлении изыскания способов защиты полезных для человека членистоногих: медоносной пчелы (Apis mellifera L. ), тутового шелкопряда ( Bombyx mori )t муравьев (Iridomyrmex humilis

Maur. ) и разработки мер борьбы с насекомыми-вредителями: вощинной МОЛЬЮ (Galleria mellonella ), мухами (Lucillia sericata И др.), комарами ( Culex pipiens И Др.), блохами ( Xenopsylla gerbilli mina^, капустной белянкой ( Pieris brassicae L. ) И целым рядом других видов.

Вопросам изучения иммунитета медоносной пчелы посвящены исследования ряда авторов: Сербинов И.Л. (1913), Туманов К. (1927, 1930, 1951), Штейнхауз Э. (1952), Полтев В.И. (1956), Шишкин Б.А. (1957), White G. (1905), Bailey L. (1956); Rothenbuhler W.C. , Tompson V.C. (1956),, Rousseau M.t Barbier E. , Valin I. (1957), Lavie P. (1957, 1959), Heimpell A.M. , Harshbarger G. (1965). Из более позних авторов следует отаетить работы Гробова О.Ф. (1971, 1972, 1973, 1980), Гузевой Л.Н. (1971), Жеребкина М.В. (1974), Егоровой А.И. (1979), Скрипник Е.И., Артеменко Л.П. (1980), Руден-KO Е.В. (1986, 1987), Mohrig W. , Messner Б. (1968), Glinski Z. , Rredzicki J. (1979), Gilliam M. et al (1970, I97E, 1972), Tomas-zewska Bj(I971, 1976), Taber S. (1982, 1986, 1988), Verbeke M. , Jacobs F.S., Kicke P.H. (1984), Hellmich R.L. (1985), Karp R.D. et RheinsL.(I980)I982), Jacobs F. et al (1990).

Однако эти исследования касались изучения отдельных факторов резистентности пчел: инстинктов, защитных веществ гнезда, лизо-цима и механизмов защиты: фагоцитоза и антителообразования.

ВЫВОДЫ

1. Естественная резистентность семей медоносных пчел обусловлена защитными факторами отдельных составляющих её индивидуумов; их поведенческими инстинктами (трофолаксис, очистка гнёзд, развитие семей до оптимального уровня и др.); наличием антимикробных веществ в гнезде, в кормах и является адаптационной.

2. Резистентность отдельных особей медоносных пчел связана со структурными и функциональными приспособлениями, обеспечивается системой из нескольких типов клеток: секреторных - кишечника и кишечных желез, гемоцитов и ретикуло-эндотелиальных, изменяется в онтогенезе и имеет различия в зависимости от пола насекомого.

3. Факторами резистентности, кроме морфологических, являются защитные вещества: антибактериальные пептиды, лизоцим (ряд других ферментов), лектины, комплемент, кишечные протеазы и защитные механизмы: фагоцитоз, инкапсулирование, меланизация, агглютинация, агломерация и лизис.

4. Пептиды, действующие бактерицидно, найдены в организме пчел и продуктах пчеловодства (меде, маточном молочке) в последние они попадают в составе секретов подглоточной и грудной желез. Антибактериальные пептиды сохраняют активность после 30-минутного кипячения и частично инактивируются после автоклавирования в режиме 1,5 атм. и 125°С в течение 30 мшу т.

5. Лизоцим, лизирующий грамположительные бактерии, обнаружен в экстракте из яиц пчел, во всех стадиях эмбриогенеза и у имаго рабочих пчел, трутней и маток с колебаниями от 6,2+0,8 в яйцах до 16,8+1,3 мкг/мл у 30-дневных пчел, а также в меде и маточном молочке.

6. Лектины (гемагглютинины) выявлены в экстракте из яиц пчел в титре 1:200 и 1:50; гемолимфе 5-дневных личинок - 1:100 и 1:20; гемолимфе имаго - 1:200 и 1:10 к Micrococcus lysodeikticus И Escherichia coli соответственно.

7. Комплемент, функционально подобный компоненту СЗ комплемента позвоночных, установлен в гемолимфе 5-дневных личинок и 20-дневных рабочих пчел соответственно в титрах 1:3200 и 1:800; в экстракте из яиц пчел комплемент не обнаружен.

8. Протеазы, шгибирующие отдельные FHK-содержащие вирусы (вирус острого паралича) в среднем на 3 lg,обнаружены в средней кишке пчел.

9. Мед, содержимое зобиков и маточное молочко из здоровых семей пчел содержат антибактериальные пептиды, а также лизоцим (10, 20 и 100 мкг/мл соответственно). Антибактериальная активность корма для 5-дневных личинок в период медосбора достигает титра 1:200 и снижается до 1:100 в его отсутствие.

10. Защитная реакция организма насекомого на травму или инфицирование проявляется по типу тахифилаксии, характеризуется повышением активности лизоцима в гемолимфе имаго до 12,1 мкг/мл и 20,0+1,2 мкг/мл против 5,4+0,8 мкг/мл, усилением антибактериального действия пептидов в 1,5 и 2 раза соответственно, титра лектинов с 1:10 до 1:100 и тирозиназы с 1:8 до 1:128.

11. Фагоцитоз более активен у куколок и личинок, и менее выражен у имаго (фагоцитарный индекс соответственно 3,6; 1,8; 0,2). Основная масса бактерий в гемоцеле имаго агглютинируется, заключается в меланизирующиеся узелки, часть которых лизируется через 72-96 часов; у личинок агглютинаты бактерий инкапсулируются и отторгаются с кутикулой при очередной линьке.

12. Гемолимфа травмированных пчел меланизируется в три раза быстрее, чем интактных. Экспериментальное инфицирование (инъекция в гемоцель микроорганизмов) предотвращает меланизацию гемолимфы.

- 251

Бактерицидность меланизированной гемолимфы снижается в 1,7 раза. Локальная меланизации происходит по типу антигеннезависимого цито-лизирующего действия лимфоцитов - естественных киллеров (N К-кле-ток) у позвоночных.

13. Активность факторов защиты у пчел изменяется под действием патогэнных для пчел вируса острого паралича или.нозематоза -возрастает в период заражения в 2-10 раз и снижается в 1,5-2 раза при развитии инфекции с летальным исходом.

14. Инфицирование вирусом острого паралича ведет к нарушению обмена веществ в организме пчелы. Так, содержание ЛЦК и РНК в тканях изменяется на +44% и -33% соответственно, сумма аминокислот в тканях увеличивается в 1,8 раза; концентрация белка в гемолимфе повышается в 4,6 раза.

15. Семья пчел дальневосточной породы (Apis macedonica ) проявляющие генетически обусловленную невосприимчивость к европейскому гнильцу, удаляют искусственно травмированный расплод в 1,6 раза интенсивнее, чем привозные семьи карпатской породы (Apis carnica) восприимчивые к гнильпу. Более интенсивно очищает соты помесь пчел 1-го поколения дальневосточной и карпатской пород - в 4,3 и 7,7 раза соответственно.

16. Пчелосемьи, неблагополучные по европейскому гнильцу, сокращают развитие в период главного медосбора, если их сила больше 10 обсиживаемых соторамок, и напротив используют принос нектара для бурного развития, если их сила меньше 10 обсиживаемых соторамок; в первом случае клинические признаки заболевания исчезают, а во втором - кратковременно обостряются.

17. Эндонуклеаза бактериальная, прополис, белковые подкормки не оказывающие выраженного ингибирующего действия на возбудителя болезни стимулируют развитие семей пчел и повышают их сопротивляемость и продуктивность.

18. Факторы естественной резистентности медоносных пчел являются важными показателями их благополучия. В связи с этим анализ и учет факторов резистентности необходим при изучении вопросов патологзш пчел, генетики разведения, ветсанэкспертизе продуктов пчеловодства и оценке состояния внешней среды.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты проведенных исследований были использованы при разработке:

- "Временного наставления по постановке реакции нейтрализации для диагностики вирусного паралича пчел" (в соавторстве). Утверждены ГУВ МСХ СССР 19.02.1975 г.

- "Методических рекомендаций по исследованию вирусов медоносных пчел" (в соавторстве). Утверждены Отделением ветеринарии ВАСХНШ1 4.П.1982 г.

- "Методических рекомендаций по определению факторов неспецифического иммунитета медоносной пчелы". Утверждены ДВО ВАСХНШЕ 15.01.1991 г.

- "Рекомендаций по диагностике и терапии смешанных заболеваний пчел с основами иммунитета". Утверждены ДВО ВАСХНШ1 15.01.1991г.

- "Методических рекомендаций к проведению ветеринарно-профи-лактических мероприятий в животноводстве Амурской области" (в соавторстве). Утверждены НГС Амурской области 10.06.1986 г., а также:

- "Способ лечения пчелиных семей от инфекционных заболеваний" (в соавторстве). Авторское свидетельство № 820759.

- "Белковая подкормка для пчел" (в соавторстве). Авторское свидетельство № 829088.

- "Штамм вируса мешотчатого расплода пчел для изготовления диагностикумов" (в соавторстве). Авторское свидетельство Л 1554374.

Кроме того подготовлены материалы:

- Способ практического использования аддитивного действия лекарственных препаратов и факторов неспецифического иммунитета в терапии пчел.

- Метод количественной оценки антибактериальных пептидов в тканях пчелы на модели H.alvei штамм М-83.

- Способ качественной оценки лектинов в организме пчел при помощи РТГА.

- Метод качественного и количественного определения комплемента в гемолимфе пчел с помощью реакции конглютинации (РК).