Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Факторы и механизмы неспецифической резистентности медоносной пчелы (Apis mellifera L.)

всесоюзный ордена Ленина научно-исследовательский институт жспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко (ВИЭВ) Всесоюзной ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени Академии сельскохозяйственных наук имени В. И. Ленина

(ВАСХНИЛ)

На правах рукописи

ЗЮМАН

Борис Васильевич

ЩК 638.58 + 638.15.092

ФАКТОРЫ И МЕХАНИЗМЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ

(APIS MELLIFERA L.)

Специальность 16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соисканне ученой степени доктора ветеринарных наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории по изучению болезней пчел Дальневосточного зонального научно-исследовательского ветеринарного института, лаборатории по изучению болезней пчел Белорусского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. С. Н. Вышелесского, в хозяйствах Амурской облаете.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РСФСР, профессор ДЬЯКОНОВ Лев Петрович (ВИЭВ)

доктор биологических наук, профессор ФИЛИППОВИЧ Юрий Борисович (МПГУ)

доктор ветеринарных наук, профессор СИДОРОВ Михаил Анисимович (МИГ1Б)

Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт энтомологии и арахнологии

Защита диссертации состоится < »__1991 г.

в_часов на заседании специализированного Совета Д—020.

28.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко.

Адрес института: 109472, г. Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан < »_1991 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат ветеринарных наук Ф. Г. Терешков

5Ei"

иссертаций

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Наряду с такими приоритетными управлениями, как биотехнология и генная инженерия в Основ-ых направлениях экономического и социального развития СССР а период до 2000 года указано на необходимость дальнейшего азгштия иммунологии. Существует сугубо научная проблема волюции иммунитета, которая может быть решена только при зучешш иммунитета у более простых форм жизни, в том числе у насекомых. Помимо научного интереса, механизмы неспеци-шческон защиты у медоносной пчелы имеют практическую зна-имость, связанную с устойчивостью этих полезных насекомых к олезням. В минувшие десятилетия резко сократились природ-ые кормовые угодья пчел, значительно повысилась загрязнен-ость окружающей среды, появились новые болезни пчел — вар-оатоз, спироплазмоз, получили распространение аскосфероз, ви-озы и стрессы организма пчел от кочевок, обработок акарици-ами, антибиотиками и другими лекарственными веществами, нтенсивной подкормки сахарным сиропом.

Иммунология медоносной пчелы представлена отдельными азработками. У пчел изучены некоторые факторы естественной езистентности, среди которых наиболее интенсивной оценке подергался фагоцитоз (Шишкин Б. А., 3958; Gilliam М. and Hiimanuki Н., 1967; Запольских О. В., 1983); лизоцим и ингибн-эры (Malke Н„ 1964; Messner В., 1966; Егорова А. И., 1979; ilinski Z., Rzedzicki J. 1979; Скрипник Е. И., Артеменко Л. П., 980; Руденко Е. И., 1987). В последние годы значительное ннмание уделено выявлению и расшифровке природы антибакте-шальных субстанций гемолимфы пчел (Casteels P. and oth., 1989, 1990).

В специальной литературе по пчеловодству получили доста-эчно широкое освещение данные по генетической способности чел к очистке гнезд (Rothenbuhler W. С. and Tompson V. С., 956), антибактериальным свойствам меда, прополиса, маточно-5 молочка (Иойриш И. П., 1956; Grout R. А., 1963; Темпов В. А., аранов Г. Ф., 1968, 1986; Дустман И. Г., 1971, 1982; По-равко С. А., 1982, 1985), защите гнезд от проникновения в них севозможных паразитов (Комаров Л. М., Губин А. Ф., 1937; eng X. S. С. and oth., 1987) и некоторым другим особенностям.

Однако представление о защитных силах у отдельных особей в гнез де и семьи в целом остается неясным; имеющиеся сведения да леко уступают данным современного представления об иммуни тете позвоночных животных (Штейнхауз Э., 1952, Зильбер А. Л. 1958;\Voodset К. И. а1, 1958;Бернег Ф. М., 1971) и отдельны; видов беспозвоночных (Купер Э. Л., 1980).

В то же время создание ясного представления о системе им мунитета и механизме ее функционирования позволяет более пол но представить патогенез болезней, разработать новые приемь диагностики, иммунотерапии и профилактики с позиции защит ной реакции организма насекомого. Возможность опенки степе ни иммунной защищенности способствовала бы целенаправленно му отбору при выведении устойчивых к заболеваниям линий I пород пчел.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось опреде ление систем и механизмов неспецифической резистентности ; медоносных пчел.

Исходя из этого были определены следующие задачи исследо ваний:

1. Определить факторы и раскрыть механизмы, ответственны! за неспецифическую резистентность организма медоносной пче лы в онтогенезе и семьи пчел в целом.

2. Выявить антимикробные субстанции в нектаре, меде и ма точном молочке.

3. Установить изменения состояния резистентности пчел по; действием отдельных внешних факторов и патогенов.

Научная новизна. Впервые исследованы системы и механизмь резистентности медоносной пчелы в онтогенезе. Установлено на лпчие комплемента в гемолимфе; лектинов в гемолимфе и экст ракте из яиц; антибактериальных пептидов в секретах желез, ге молимфе, содержимом зобика, меде; лизоцима в секретах груд ной и ректальной желез, содержимом яиц, клетках средней киш ки; кишечных протеаз, оказывающих вирусингибирующее дейст вие.

Подтверждено присутствие лизоцима в гемолимфе, секретах подглоточной и ядовитой желез, меде и кишечном содержнмои^ пчел.

Дана количественная и качественная характеристика некото рых факторов, ответственных за естественную невосприимчивое пчел к отдельным возбудителям. Разработаны способы определе ния лектинов и антибактериальных пептидов в гемолимфе пчел Показана возможность оценки состояния резистентности организ ма этих насекомых по ряду показателей в различные периоды года, в норме и изменения этих показателей при "патологии.

Практическая ценность работы. По результатам проведенных хледонаний разработаны и внедрены: Временное наставление о постановке реакции нейтрализации для диагностики вирус-ого паралича пчел (утверждены ГУВ МСХ СССР 19.02.1975 г.)

соавторстве с проф. Гробовым О. Ф., методические рекоменда-пи по исследованию вирусов медоносных пчел (утверждены От-елением ветеринарии ВАСХНИЛ 4.11.1982 г.) совместно с про-»ессором Гробовым О. Ф., ст. науч. сотр. Надточием Г. А., Обу-овым Л. Н., Батуевым Ю. М. (ВИЭВ), Керимбаевым А. К. (Каз-ШВИ), Юровой В. П. (МВА), Талпалацким П. Л. (ВНИИЗРн->П), методические рекомендации по определению факторов не-иецифического иммунитета медоносной пчелы (утверждены ДВО 'АСХНИЛ, 15.01 .1991 г.), рекомендации по диагностике и терапии мешанных заболеваний' пчел с основами иммунитета (утверж-ены ДВО ВАСХНИЛ 15.01.1991 г.).

Получены авторские свидетельства Госкомнзобретеннй Ге 820759, 1980 г. «Способ лечения пчелиных семей от инфекци-нных заболеваний», № 829088, 1981 г. «Белковая подкормка для чел»; № 1554374, 1989 г. «Штамм вируса мешотчатого расплода чел для изготовления диагностикумов».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и об-уждены на международном симпозиуме по патологии беспозво-очпых (XI ежегодное собрание общества по патологии беспозво-очных, Прага, 1978), Амурской областной научно-практической онференции «Ученые и специалисты — научно-техническому по-енциалу Приамурья» (Благовещенск, 1983), областной научной онференции «Ветеринарная наука на службе производства» (Бла-овещенск, 1987), зональной научной конференции «Профилакти-а и ликвидация основных болезней сельскохозяйственных жи-отных» (Благовещенск, 1989), заседании Ученого совета Даль-1НИВИ в 1985—1990 гг., заседании секции «Патология й про-знлактика болезней пчел и других беспозвоночных животных» Москва, ВИЭВ, 1988), зональной научно-практической конфе-енции «Проблемы ветеринарии Приморского края» (Владиво-ток, 1990), научной сессии общего годичного собрания Дальне-осточного отделения ВАСХНИЛ (Хабаровск, 1990).

По материалам диссертация опубликовано тридцать пять пе-атных работ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Система неспецифической резистентности пчел иредстгвле-:а поведенческими гнетинктами и несколькими типами клеток ор-анизма: секреторными — кишечника и кишечных желез, гемоцн-ами и ретнкуло-эндотелиальнымн.

2. Факторами защиты организма насекомого, продуцируемы-

ми системой резистентности, являются лизоцим, антнбактериаль ные пептиды, лектины и комплемент, принимающие участие в не специфической ответной реакции организма, а также кишечны пептидазы.

3. Неспецифическая резистентность пчел включает механизлп интерференции, фагоцитоза, меланизации, инкапсулирования, аг глютинации и реакции агломерации и лизиса.

4. Защитное действие факторов и механизмов иеспецифиче ской резистентности распространяется на отдельных особей i семью пчел в целом.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена и; 297 страницах машинописного текста и включает введение, обзо) литературы, материалы и методы, результаты собственных нссле дований, обсуждение, выводы, практические предложения, спи сок литературы. Работа иллюстрирована 60 таблицами, 72 рисун ками. Список литературы включает 473 наименования, в том чис ле 195 отечественных и 278 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в период с 1972 по 1990 г. в лабораторш по изучению болезней пчел Белорусского научно-исследователь ского института экспериментальной ветеринарии им. С. Н. Вы шелесского и в лаборатории по изучению болезней пчел Дальне' восточного зонального научно-исследовательского ветеринарного института. В выполнении отдельных работ принимали участие доктор биол. наук, профессор Гробов О. Ф., научные сотрудники: Ермолаев Г. Ф., Литвяк В. С., Гордненко Л. Н., Лобаченко Н. И., Устинова Г. И. Более 2/3 объема совместных работ выполнены диссертантом.

При изучении неспецифической резистентности медоносной пчелы использовали яйца 1-го и 2-го дня развития, личинок 1, 2, 3, 5 и 7-дневного возраста, предкуколок и куколок на стадии белых и темных глаз, нарождающихся пчел, 7—10-дневных пчел-кормилиц, 20- и 30-дневных пчел-фуражиров, а также зимующих пчел. Непосредственно для лабораторных опытов взято около 200000 доимагинальных форм и зрелых особей медоносной пчелы. Материалы отбирали как от здоровых пчелосемей, так и неблагополучных по нозематозу, вирусному параличу, мешотчатому расплоду, европейскому гнильцу или предварительно зараженных, в период острого проявления указанных болезней. В исследованиях были использованы пчелы местной дальневосточной (macedónica), карпатской (carnica) пород, а также их помеси 1—2 н 3-го поколений. В опытах находились 12 пчелосемей пасеки ДальЗНИВИ, 476 семей пчелосовхоза «Кундурский» и 512 семей пчелосовхоза

Майский» Амурской области; 30 кроликов, -! барана, 2 теленка, ! петухоп, 6 гусей, 120 белых мышеи, 24 морские спинки н рыбы: фась (С. аипИи.ч рлЬеПо) и головешка-ротан (РегссоИи.ч £|еЬш). бъектамн исследования служили также продукты пчеловодства: фм для личинок старшего возраста, маточное молочко, яд, мед, жтар. Отдельные опыты были поставлены с использованием фвпчно трнпсинпзировашюй культуры эмбрионов пчел (КЭП).

качестве патогенов были взяты вирусы и бактерии, выделенные : пчел, а также штаммы, полученные из различных учреждений ■рапы.

Возможность самовыздоровления семей пчел от европейского шльца (возбудитель М. р1и1оп) в период взятка изучали в поле->!х опытах. В ходе опытов сопоставляли инстинкты запасания фмов впрок н развития семей до оптимального уровня, влияю-,ие на течение заболевания.

Корреляцию между выраженностью инстинкта очистки гнезда телами и резистентностью пчелосемей к европейскому гнильцу зучали на местной дальневосточной и карпатской породах пчел, также на помесях этих пород в нервом поколении. Исслсдокалй злноту и скорость удаления искусственно травмированных пнъ-щпопной иглой личинок и куколок из этих пчелосемей.

Учет проводили через 24 и 72 часа. Числовые расчеты относн-зльно удаленного пчелами расплода п соответствующие графики ^поднялись на компьютере.

Протектнвпые вещества — лизоцим, лектииы, комплемент и итлбактернальные пептиды в водных экстрактах из яиц опреде-яли турбндиметрически, методом диффузии в агаре и с помощью зрологическнх реакции: агглютинации (РА), конглютинации РЮ, торможения агглютинации (РТГА). Для опыта отбирали 30—1000 яиц, гомогенизировали, гомогенат суспендировали в /15 М фосфатном буфере 2—10 раз и осветляли центрпфугиро-анием при 800 § в течение 20 минут.

Бактерицидное действие экстракта яиц изучали на культурах \icrccKcus КзоскчкИсиэ, НйсЬсгИпа соП, На1ша а 1 \е1 с псполь-эванием метода диффузии в агаре против растущей культуры пкроорганпзма (Лабинская А. С., 1978). Результаты учитывали о задержке микробного роста вокруг лунок после 24 и 48-часо-ого инкубирования й термостате при +32°С. Согласно рекомен-ациям по «Унификации методов определения чувствительности нкроорганнзмов к хнмиотерапевтпческнм препаратам», утверж-енным Минздравом СССР 13 марта 1975 г., полную задержку оста вокруг луны: с препаратом рассматривали как бактери-идное действие, а угнетение микробного роста в виде отдель-ых видоизмененных колоний принимали за бактериостатичесгос. Достоверность разности зон задержки роста бактерий устанавлн-

вали константным методом Садовского Н. Б. (1975). Контроле служил белок куриных яиц в соответствующих разведениях физиологический раствор.

Содержание лизоцима в исследуемых образцах экстракта у танавливали с использованием калибровочной кривой, постр енной по показателям активности лизоцима в рабочих раствор; стандартного препарата.

Литическое действие экстракта яиц исследовали методом дис фузии в 1% бифталатном агаре против ацетонового породи М. lysodeikticus или турбидиметрически (Лабинская А. С 1978). В качестве контроля использовали стандартный лизоци: белок куриных яиц и физиологический раствор.

Лектины в экстрактах из яиц выявляли посредством класс: ческой реакции агглютинации, используя макроскопическую об-емную реакцию в серологических пробирках с эритроцитами пти н бактерий. Последнее разведение экстракта, где наблюдаете агглютинация, считали их титром. Учитывая, что взаимодействг лектинов с углеводными лигандами эритроцитов или микробе ингибируется специфическими для лектинов углеводами, допо. нительно ставили реакцию торможения агглютинации. Контр! леи служили лектины (фитогемагглютинины) из семян фасол При постановке РА ставили конгроли экстракта и сорбентов.

Наличие комплемента в экстракте из яиц устанавливали в pi акции конглютинации в прямом варианте. В реакции использ* вали экстракт в разведении до 3:128, инактивированную при 56° в течение 30 минут сыворотку крупного рогатого скота и эритр< циты барана (0,5% взвесь). Реакцию учитывали через 1 час 18 часов. Контролем реакции служила система из свежей сыв< ротки крови лошади, инактивированной сыворотки крупного р< гатого скота, экстракта яиц и взвеси эритроцитов а тех же обт емах. Кроме того, в Р1< ставили контроли эритроцитов, и систел экстракт-эритроциты и сыворотка крови крупного рогатого скот; эритроциты.

Антибактериальные пептиды обнаруживали методом высоке вольтпого электрофореза на бумаге (Габел К., Салзмап Н. П 1972). С целью уточнения природы пептидов, разделенных на б) маге, исследовали каждую фракцию на бактерицидные и литиче ские свойства, для этого использовали метод диффузии aKCTpat тов фракций в агаре. Антибактериальную активность иептидо определяли по задержке ростаН. a'.vei штамм М-83.

Для выявления факторов, определяющих резистентность имг го и личинок медоносной пчелы, исследовали кутикулу, жнрово тело, гемолимфу, мышцы, железы кишечника, кишечник, кишечно содержимое, кшиечпую микрофлору и яд. Опыты выполнены в ве сеннее, осеннее, летнее время и в период зимовки пчел.

Лизоцнм, лектиньг, комплемент и антибактериальные пептиды ределяли вышеописанными способами, при этом изучали их ецнфичность, сродство лектинов гемолимфы к олиго- и моно-карндам. Исследовали возможность индукции лизоцима, антп-ктерцальных пептидов и лектина антигенной стимуляцией пчел средством инъекции в гемоцель бактериальной взвеси Е. соН и травмирования (нарушали целостность кутикулы).

Чтобы установить, в какой белковой части гемолимфы иа-дится лизоцнм, белки осаждали сульфатом аммония (ЫН4)2804 зной концентрации. Определяли заряд и скорость движения зоцима в геле агарозы. Контролем служили: стандартный ли-цим, яичный белок и буферный раствор.

Для обнаружения в гемолимфе пчел комплемента использова-

РСК и реакцию конглютинацип. Комплементом служила гемо-мфа, контролем — сыворотка морских свинок. Поскольку ком-емент гемолимфы пчел не обладает гемолитическим свойством РСК остается не видимой, эту реакцию дополняли реакцией нглютннацин. Положительная РК характеризуется наличием адка в виде пленки, обволакивающей нижнюю часть пробирки. ?и встряхивании осадок разбивается на комочки, вновь выпа-ющие в осадок. В случае отрицательной Р1\ эритроциты обра-ют плотный осадок в виде пуговицы на дне пробирки.

В гемолимфе личинок из пчелосемей, пораженных европеп-им гнильцом, определяли интерферон исходя из гипотезы, что ганнзм пчел-кормилиц, возможно, отвечает наработкой Интерпола, который в последующем передается с маточным молочком чинкам пчел, и индуцирует образование защитных средств в ; организме (так называемый праймингэффекг). Для обнару-ения интерферон-подобных субстанций проводили разделение лков гемолимфы на колонках с 15% полиакриламидным гелем, ¿являя, таким образом, дополнительные белковые фракции.

Количественные изменения в содержании лизоцима, лектинов, [тнбактериальных пептидов, а также аминокислот, нуклеиновых 1слот и белка устанавливали в организме пчел под влиянием авмы, инфекции или голодания. Динамику аминокислот, пукле-ювых кислот и белков изучали в организме пчел, пораженных [русным параличом, возбудителем европейского гнильца, нозема->зом. Пользовались методами Цанева Р. Г. и Маркова Г. И. 960), Лоури О. (1951). Аминокислотный состав интактных пчел отдельных частей их тела определяли на аминоанализаторе Д-1200Е. Уровень белковых фракций в гемолимфе здоровых и )двергнутых антигенной стимуляции пчел определяли электрофоном в геле агарозы по методике Чекишева В. И. (1977).

Действие водного экстракта из средней кишки пчел на вирус ггрого паралича определяли в реакции нейтрализации. Реакцию

ставили с постоянным разведением экстракта и разными дозал вируса. Титр вируса устанавливали по методу Кербера в мод фикации Ашмарина И. П. и Воробьева А. А. (1962), заражая нч< инъекцией в гемоцель.

Для исследования механизмов фагоцитоза, агломерации, м ланизации, лизиса и инкапсулирования в полость тела имаго, к; колке или личинке инъецировали живые или инактированнь вирус паралича пчел, микрококк или кишечную палочку, угол тушь, пчелиный яд, физиологический раствор. В полость тела н; секомому вводили живые бактерии в объеме 2 мкл, содержащим и 5 млн. микробных тел. При этом наблюдали взанмодейстш между микроорганизмами, введенными в сублетальных и летал: пых дозах, и гемоцнтами, клетками целома. Определяли морф( логические и функциональные изменения в гемоцитах, устанавл! вали фагоцитарный индекс. Обращали внимание па процессы о£ разования агломератов из погибших гемоцитов, бактериальны агглютинатов, инкапсулирования и меланизации. Реакцию агл( мерации гемоцитов считали положительной, если число клеток агломератах после антигенной стимуляции личинок, ут личивается примерно вдвое но сравнению с агломератами в гем< лимфе интактных личинок. Подсчет агломератов, агглютниато гемоцитов и бактериальных тел выполняли в камере Горяева п общепринятой методике.

Чтобы установить возможное участие гемоцитов в реакции м* ланизации, их отделяли от плазмы центрифугированием при 800 : в течение 30 минут. Гомогенат гемоцитов вносили в лунки МП/ приготовленного на рыбном или мясном бульоне. Чашки поме щали в термостат с температурой 32°С и ежедневно, в течени семи дней учитывали зоны меланизации вокруг лунок в МПА. Кон тролем служили цельная гемолимфа и плазма. В опытах исследс вали гемоциты интактных н травмированных прижиганием бак териологической петлей или проколом кутикулы инъекциоино иглой личинок и куколок.

Длительность персистирования бактерий, инъецированных гемолимфу, устанавливали высевом из гемолимфы на МПА МПБ в асептических условиях через каждые 24 часа после инъ екции в течение 10 дней.

Возможность проявления гуморальной иммунореактивности иммунизированных насекомых контролировали реакциями нейт рализации, связывания комплемента, прямой и перекрестной а г глютинации и диффузионной преципитации, лизиса и нейтрализа ции. Контролем служила гемолимфа интактных пчел.

Устойчивость клеток медоносной пчелы к инфекциям изучал) на первично трипсинизированной культуре эмбриональных кле ток пчел, заражая ее вирусом острого паралича. Контролем елу

силн пробирки с иитактиымн культурами клеток. Оценку инто-атнческого (¡?ектл ¡зг>;рпжалп условно в крестах со второго по едьмон лень инкубации. За титр вируса принимали наибольшее го разведение, которое вызывало гибель 50% зараженных этой озон культур. Титр вируса выражали в lg Т11Д->0 н определяли о Риду и А1епчу (1938). Вируссодержащий материал титровали акже на пчелах. Пчел заражали инъекцией в гемоцель тех же азведеннй вируса, что и культуры тканей. Каждое разведение спытывали на 50 пчелах. Учет результатов проводили но гибели 0% (ЛДг,0) насекомых с 4-го но 11-й день инкубации с момента аражения. Специфичность действия вируса оценивали в сравне-пп с данными контроля.

Наличие антимикробных веществ в нектаре из цветов леспе-ецы (Lc-spedeza Rich.) .донника (Melilotus L.), подсолнечника Heiiaiithus L.) и бальзамина (Impatiens L.),b содержимом зо-нков, меде, маточном молочке и личиночном корме исследовали етодами, использованными при изучении бактерицидиостн тка-ей организма пчел. Природу бактерицидной активности содер-:и.\юго зобика, меда и маточного молочка выясняли, воздействуя а них температурой, высушиванием, длительностью хранения, а жже химическими веществами: хлористоводородной кислотой, [дроокпсью натрия и перекисью водорода. В качестве контроля шользовалн сахарный сироп различной концентрации, а также гстые химические вещества.

Аддитивное действие лекарственных веществ и факторов ре-icieiniiocTi! организма изучали на семьях пчел, неблагополуч->ix по аскосферозу, мешотчатому расплоду, европейскому гнпль-/ и нозематозу. Пчелосемьям с острой формой аскосфероза зашали нистатин и одновременно создавали искусственный взяток, рн мешотчатом расплоде лечебные препараты задавали за 2 ча-: или спустя 4 часа после заражения. Исследовали действие ле-фственных веществ и факторов резистентности на семьях пчел

смешанным течением нозематоза и европейского гнильца. Сте-:пь пораженности поземон контролировали микроскопией гомо-1ата из средней кишки пчел. Контролем служили здоровые пчелы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Механическая очистка гнезда взрослыми пчелами, запасание рма впрок, развитие семей до оптимального уровня.

Одним из факторов защиты семей пчел от патогенных агентов ляется филогенетически возникшая способность этих насекомых удалению погибших особей из гнезда. При этом поведение взрос-IX пчел по очистке сотов наиболее наглядно проявляется в кс-од медосбора и зависит от состояния семей, их силы и характе-

ра нектаровыделения. Статистическая обработка материала, пол; ченного за три года, позволила выявить определенные закономе; ности в поведении неблагополучных семей. Пчелы прекраща; развитие в период медосбора, если их сила была больше 10 обе; живаемых соторамок и площадь, занятая расплодом, вследств1 заполнения ячеек сотов нектаром, сокращалась с 58427, 2±6240 см2 до 12639,8±3384,2 и 2318,1 ±619,5 см2 к середине и окончапн основного медосбора соответственно; наоборот, слабые семьи и пользовали принос нектара для бурного развития и yвeлнчивa^ количество расплода с 14236,4±3638,2 до 22649,2±3743,8 см2 к с редине основного медосбора. Этим частично объясняется обрь заболевания европейским гнильцом, снижение интенсивности п раження личинок с 1,8 до 0,1 % и самооздоровление одних семей вспышка заболевания у других с 11,1 до 28,4%, где на фоне рез1 увеличивающегося количества расплода становились заметно признаки заболевания. Возбудитель присутствовал в гнездах и первом, и во втором случае. Для устранения клинических лрпзн ков европейского гнильца в период медосбора, как правило, бьи достаточно однократной обработки стрептомицином, в то вре:\ как в безвзяточное время требовалась трехкратная обработка интервалом 5—7 дней. К окончанию медосбора число больных л чинок в неблагополучных семьях составляло 0,8%. Поздней осень весь расплод неблагополучных семей был практически свобод« от европейского гнильца, что позволяло им выжить в зимний п рпод. На интенсивность очистки сотов влияют породные и нндив дуальные особенности семей пчел. Очистка соторамок от травм рованного расплода у карпатской пчелы была на 6,3% менее и тенсивной по сравнению с дальневосточной пчелой, и на 15,05' по сравнению с помесью этнх пород 1-го поколения. Более сущ ствепнымп оказались различия в активности очистки гнезд пчел семьями внутри одной породы. Максимальное различие колпч ственных показателей выброшенных за 24 часа травмированнь личинок семьями карпатской породы равнялось 51,2%, семьял дальневосточной породы — 12,5%, помесными семьями 1-го п колення карпатской и дальневосточной — 7,2%- Эти различия в к личестве выброшенных личинок пчелосемьями одной породы 72 часам снижались до 2%. Карпатская порода пчел, более во приимчивая к заболеванию расплода европейским гнильцом, м псе активна в чистке гнезда по сравнению с дальневосточной п родой пчел (разница 6,3% )• Более высокой очистительной акти ноетыо обладают помеси 1-го поколения по сравнению с карпа ской и дальневосточной породами пчел (на 15,05% и 8,7% соо ветственно).

Таким образом, опыты подтвердили наблюдения пчеловодо практиков о возможности самовыздоровления семей пчел от евр

шского гнильца в период медосбора, что связано с интенсивной теткой ячеек сотов для поступающего нектара и зависит от корыстна пчел в семье, ее породных и индивидуальных особенно-ей.

2. Антимикробная активность некоторых кормов взрослых пчел личинок. Поскольку мед является продуктом переработки нек-1ра цветков пчелами, проведены раздельные исследования нек-Iра, содержимого зобиков рабочих пчел и зрелого меда.

Экстракты из цветов донника и леспедецы, водные разведе-1я 1:2, 1:10, 1:100 нектаров из леспедецы, подсолнечника и баль-1мнна, а также неразведенный нектар этих растений бактерицид-)стн в отношении микрококка и кишечной палочки не проявили, злее того, экстракт из цветков и водные разведения нектаров 2 и выше стимулировали рост этих микробов. В то же время, »держимое зобика как летных, так и ульевых пчел дало выра-енпую зону задержки М. ¡уБСскчкНсия н Н. ак'еь

Электрофорез в 1% геле агарозы показал наличие .3 фракций ■лка о пптактном содержимом зобиков, 2 фракций в содержимом ¡биков, прогретом при 65°С в течение 30 мин., и следов белка >еле 30-минутного кипячения. Электрофорез содержимого зобн-)в па бумаге выявил пять фракции пептидов, которые окрашивать 1% нинг'идрииом. Три фракции (а, б, в) двигались в направ-:нпи катода, одна фракция (г) проявила нейтральные свойства одна (д) имела отрицательный заряд.

Лизирующая активность содержимого зобиков значительно фьпрует в зависимости от сезона и физиологических функций ратей пчелы. У летных и молодых пчел, выполняющих ульепые 1боты, активность лизоцима равняется 26,2 н 19,6 мкг/мл соот-ггетнешю. Большей бактерпцидностыо обладает содержимое зо-1ков у летних пчел по сравнению с таковым зимующих (Р<0,05). 1тр бактерицидной активности содержимого зобиков в огноше-ш к М. 1ухо<:1е1кПешч равен 1:100.

В зависимости от активности действия па М. 1\ 50(!е!к11сия даль-мюсточные зрелые меды расположились в следующем порядке: ¡еточный мед, мед леспедецы, гречишный мед. Различия в их тьмикробном действии оказались несущественными (Р>0,05). 1тр бактерицидного действия меда равен в среднем 1:10. Неразменный мед леспедецы дает зону задержки ростаМ. 1уйойе1кИсиз 1аметром 22,6^0,2 мм, а сахарный сироп аналогичной плотности ■ 9,1±0,8 мм (Р<0,001). Неразведенные пли-в разведении 1:2 и 4 меды задерживают рост патогенного для пчел возбудителя фимоза Н. акек Кишечная палочка более устойчива к пиги-гторам меда. При снижении концентрации высеваемой микробной веси с 2 млрд. до 100 млн. микробных тел п 1 мл кишечная па-

лочка проявила чувствительность к антибактериальным вещесч вам мела, но зоны задержки исчезали через 24—48 часов с мс мента их появления. По выраженности действия ¡¡а кишечную ш: лочку, меды расположились в следующем порядке: гречишньп л есп едец ы, п одсолнечни ко вы н.

Электрофорез в геле агарозы выявил наличие одной фракцн белка в меде, обладающей большей подвижностью по сравненш с белковой фракцией содержимого зобика. Непродолжительно (до 2 мин.) кипячение не изменило количественного содерл<ани белков, по замедлило скорость их продвижения в геле. Кипяче ние меда в течение 30 мин. разрушило абсолютное большпнств белков меда, сохранились следы белка, обладающего небольшо подвижностью и ¡еле. Автоклавирование при 125°С и 1,5 атм. течение 30 минут уменьшило следы белка.

Белки, осажденные из цветочного меда (NH^SO^ в значь тельной мере утрачивали бактерицидность по отношению к М. lysodeikticus по сравнению с исходным материалом и совершен но не задерживали рост Е. coli п Н. alvei. Белки меда лнзирс вали ацетоновый порошок М. lysodeikticus в разведении 1:100, чг согласно калибровочной кривой, составляет 10 мкг в 1 мл ннтакт ного меда.

Электрофорез на бумаге меда, разведенного 1:2 медпналовы; буфером, показал, что количество пептидных фракций не злвпеи от источника меда. В гречишном и цветочном меде проявлялос по четыре фракции, окрашенных шшгидрином. Прогревание цве точного меда при 100° в течение 30 мин. снизило количество пей тидных фракций до 3, причем 3-я фракция сохранилась в вид следов. Бактерицидность к М. lysodeikticus проявили 2-я и 3-: фракции гречишного меда, а к Е coji. — первая и третья.

Титр бактерицидного действия корма личинок старше 2-днеп ного возраста десятикратно превышает титр меда. Во время взят ка титр бакгерицидности корма для личинок повышается с 1:10 до 1:200 (Р<0,05).

Маточное молочко оказывает выраженное бактерицидное дег ствне на грамположительный М. lysodeikticus и менее существен ное на граыотрицательные Е. coli и Н. alvei. Маточное молоч ко лизирует ацетоновый порошок М. lysodeikticus . Экстраполированием на калибровочную кривую выявлено: содержани лнзоцима в молочке составило 98,6=^6,1 мгк/мл.

Наиболее характерной чертой антибактериальных факторо! находящихся в маточном молочке, является стабильность их ден ствия при разведении. Они термостабильны и полностью разр\ шаются только после автоклавирования в сухом виде. Высушен ное при +4°С и прогретое при температуре 60° в течение 30 ми нут маточное молочко сохраняет способность к задержке рост

4 lysodeikticus на МПА, но утрачивает бактерицндчость к 1. coli,

Электрофорезом в геле агарозы в маточном молочке обнару-кено четыре белковых фракции. Прогревание при 100'С в течете 30 мин. оставило следы белка, примыкающие к краю лунки, ^месь маточного молочка и меда (1:1), прогретая при JOO'C в -ечеиие 30 мин., сохраняет электрофоретнческую подвижность юлынего количества белка по сравнению с каждым препаратом в сдельности, подвергнутым аналогичной тепловой обработке.

Электрофорез маточного' молочка на бумаге выявил наличие ■рех пептидных фракций, окрашивающихся шшгидрнном. Больней бактерицндностыо в отношении к М. lysodeikticus обладает нейтральная фракция, а на Г£. coli более выраженное дей--твпе оказывают подвижные катодная и анодная фракции. Про--ревание маточного молочка при 100°С в течение 30 минут не изменило количество пептидных фракций.

Следовательно, бактерицидная активность содержимого зоби-<ов, меда н маточного молочка связана с содержанием лизоцима (20, 10 и 100 м г к/мл соответственно) и антибактериальными пептидами. Повышенная устойчивость и активность лизоцима отмелется в кислой среде (pH 4,5—6,5), что соответствует pH кор-лов; таким образом, кислотность кормов пчел играет существен-то роль в их антибактериальной активности.

3. Факторы резистентности яиц пчел. Яйца пчел содержат лн-юшт, антибактериальные пептиды и лектнны.

Лпзоцим яиц пчел растворяет ацетоновый порошок М. lysodeikticus , суспендированный в 1% бифталатном агаре, к щдерлшвает рост этого микрококка на МПА, оптимум лизирующей активности наблюдается при pH 5, 8—6, 4. Эквивалентно стан-гартному ферменту, количество лизоцима в яйцах нчел составляет 6,2±0,8 мкг/г. В буферном растворе с pH 6,2 фермент не разрушается полностью при 100СС в течение 30 минут.

Электрофорезом на бумаге экстракта из яиц пчел выявлены -рн фракции пептидов. Катодные фракции оказывали бактерицидное действие на М. lysodeikticus и бактериостатическое на Т. alvei н Е. coli. Анодная фракция антимикробным действием ie обладала. Пептиды яиц исключительно термостабильны и вы-герживают 30-мииутное кипячение.

Водный экстракт яиц агглютинирует эритроциты кур в разве-ценпи до 1:25, а также бактерии М. lysodeikticus и Е. coli : титром 1:200 и 1:50 соответственно. Реакция агглютинации прояв-шлась через 2 часа после инкубирования смеси в водяной бане. Характер агглютинации крупиохлопчатый, что указывает на полн-)алентность лектинов. Агглютинат имеет форму опрокинутого вниз юнтика. Через 18 часов при заключительной читке реакции жид-

кость в контрольных пробирках была мутной, а в опытных — про зрачной. Выдерживание экстракта в течение 72-х часов при +4°С снижало титр лекгннов на порядок. Прогретый в водяной бане npi + 56°С в течение 30 мин. экстракт из яиц утрачивал слособност! агглютинировать M. lysodeikticus.

Реакцией конглюгинации, поставленной в прямом варианте комплемент в экстракте из яиц выявить не удалось. В яйцах пче; отсутствует также тирозиназа, вследствие чего эсктракты из яш не меланизируются.

Несмотря на отсутствие комплемента и системы тирознн-тиро зиназа, яйца медоносной пчелы являются хорошо защищсшю! стадией развития насекомого за счет лизоцима, антнбактериаль пых пептидов и лектинов.

4. Факторы и мехализмы резистентности в организме личинок предкуколок п куколок пчел. Методом диффузии в агаре протш растущей культуры и ацетонового порошка M. lysodeikticus ус тановлено наличие лизоцима в гемолимфе всех стадий развнтш расплода пчел. Количество фермента изменяется в онтогенезе: i гемолимфе 2-дневных личинок рабочих особей — 5,2±0,8 мкг/мл: 6-дневных личинок — 12,3^1,4 мкг/мл; выпрямившихся личинок — 18,6±1,8 мкг/мл; предкуколок — 4,1±0,5 мкг/мл; 1-дневных куколок — 6,2±0,8 мкг/мл; 5-дневных лнчинок трутней—8,4± 1,3 мкг/мл Литическую активность проявляли как плазма гемолимфы, так и гемоциты, причем активность плазмы была выше (Р<0,05). Прогревание при 80°С в течённе 30 мин. устраняло задержку роста M. lysodeikticus гемолимфой личинок и снижало диаметр зон с 16,2 мм до 12,1 мм гемолимфой куколок. Прогревание при 100°С в течение 30 мин. не лишало гемолимфу куколок литических свойств, Кроме субстратной специфичности, фермент проявил устойчивость к CCI«; эфиру и хлороформу, что характерно для лизоцима.

Пептиды в гемолимфе личинок, предкуколок и куколок обнаружены с помощью метода диффузии в агаре против растущей культуры H. alvei . Гемолимфа расплода не задерживает рост грамотрицательных Е. coli и H. alvei на чашках с обычными (2 млрд/мл) посевными дозами. Зоны задержки роста появлялись, когда посевную дозу снижали до 100 тыс. микробных тел в 1 мл. Стандартный лизоцим не задерживал рост Е. сой' и H. aïvej в концентрации 1000 мкг/мл. Содержание лизоцима и антибактериальных пептидов повышается после травмирования личинок прижиганием бактериологической петлей, а куколок — проколом кутикулы инъекционной иглой (Р<0,05).

Гемолимфа расплода обладает гемагглютинирующимн свойствами. Гемолимфа личинок агглютинирует эритроциты кур в разведении до 1:10 и M. lysodeikticus — 1:80. Травмирование ку-

икулы 10-кратно повышало титр лектинов в гемолимфе 5-днев-ых личинок пчел. Пик активности лектинов находился в литерале 24—72 часов после нанесения травмы. Исследование снеци-шчпости лектинов гемолимфы пчел к углеводам показало, что ед содержит углеводы, связывающиеся с лектннамп. Лектнны роявнлн специфичность к олнгосахарпду (трисахариду) Д( + ) аффипозе п моносахариду Ь (+) арабпиозе.

Прямой реакцией конглютинации, в которой свел<ую сыворот-у крови лошади заменили гемолимфой, установлено, что в гемо-нмфе постоянно присутствует комплемент — полимолекулярная истема белков плазмы, обладающая ферментативными свонст-ами, связывающаяся на комплексе антиген-антитело. Так же, ак и комплемент свежей сыворотки лошади, комплемент гемо-нмфы адсорбировался эритроцитами и вступал в связь с конглю-шншом (так называемым антнкомплементом) — термостабиль-ой субстанцией коллоидного типа сыворотки крови крупного ро-агого скота.

При замене сыворотки лошади гемолимфой, чувствительность еакции не изменилась. Реакция хорошо происходит с цельной ывороткой или гемолимфой, при разведении 1:40 реакция была мнительной. Конглютннацля эритроцитов барана, сенсибилнзн-ованпых комплементом гемолимфы, была быстротечной: через часа пленка отставала от стенок пробирки и сворачивалась. Ре-кцпя происходила только при концентрации эритроцитов — 0,5%. хлп в реагирующую систему вносили гемолизин (сыворотку крови ролика, содержащую антитела к эритроцитам), то реакция свя-ывания комплемента оказалась возможной с разведением гемо-имфы 1:3200.

Гемоциты личинок активно фагоцитируют чужеродные веще-гва. Основная масса введенного материала захватывается плаз-юцитамп п экскреторными клетками, которые затем примыкают внутренней поверхности кутикулы и отторгаются с ней при оче-едной линьке. Через час после инъекции туши в полость тела ли-инке частички туши концентрируются под кутикулой, окрашн-ая ее в черный цвет. Через 5 мин. после инъекции в полость те-а 4-дневной личинки 2 млн. тел живой культуры Е. соП бакте-ни были диффузно рассеяны в организме; через 30 мин. обнаруживали в два раза больше бактерий в мазках-отпечатках внут-енней поверхности кутикулы, чем в аналогичных мазках с наруж-ой стенки кишечного канала; через час разница в количестве актерий удваивалась. Через 5 минут после инъекции кишечной алочки активность фагоцитоза составляла 9%, через 30 мин. — 2% и через 60 мин. — 18V Фагоцитарный индекс через 1 час осле инъекции равнялся 0,2. При увеличении инъецируемой до-ы бактерий до 10 млн. на личинку фагоцитарная активность ге-

моцитов через час после инъекции составляла 69%, а фагоцитарный индекс равнялся 1,8- Как правило, наблюдался незавершенный фагоцитоз кишечной палочки. Около 90% погибших лнчнпоь содержали смешанную микрофлору и имели гнилостный запах микрофлора остальных 10% была представлена кишечной палочкой и онн имели кислый запах.

Более выраженная фагоцитарная активность отмечена у куколок. Фагоцитарный индекс через час после инъекции в полость тела куколке 10 млн. тел Е. coli равнялся 3,6. Часть куколок (40±5%) погибала после инъекции 2 млн. телЕ. coli , а выжившие трансформировались во взрослых пчел мелких размеров с укороченным брюшком. Организм куколки оставался нестерильным вплоть до сформирования имаго.

Как правило, МПА вокруг лунки с гемолимфой темнел от ме-ланизирующейся гемолимфы, что свидетельствовало о наличии фермента тирозиназы в гемолимфе всех стадий развития личинок и куколок. Травмирование покровных тканей расплода повышало диаметр зоны меланизащш вокруг лунок с гемолимфой с 8 до 12 мм. Степень меланизащш гемолимфы зависела от силы раздражителя (при сильном прижигании меланизация гемолимфы происходила при разведении 1:160; слабом —.1:80, у интактных личинок — 1:10).

Спустя два часа после инъекции бактерий куколке или личинке в полости тела обнаруживали меланизнрующиеея агломераты из погибших клеток и массы. Отмечали более быстрое (3±1 день) потемнение кутикулы у куколок после инъекции живой культуры Е. coli. Быстрота и интенсивность потемнения зависела от дозы. При инъекции в полость тела куколкам убитой культуры Е. coli меланизация кутикулы незначительно превышала норму. После гибели от европейского гнильца или мешотчатого расплода личинки меланизировались и превращались в темные корочки. Гемолимфа с признаками меланизации в значительной мере утрачивала бактерицидностьт vitro , что отражалось на величине зон задержки роста бактерий (Р<0,05).

Следовательно, личиночная стадия развития медоносной пчелы защищена более надежно по сравнению с яйцом насекомого, что выражается в появлении комплемента в гемолимфе и таких механизмов защиты, как фагоцитоз, агломерация, инкапсулирование и меланизация. Появление белков «взрослого» типа на стадии куколки повышает устойчивость лизоцима к нагреванию.

5. Защитные системы и механизмы в организме взрослых особей медоносной пчелы. Лизоцнм обнаружен в гемолимфе, секретах подглоточной, грудной, ректальной и ядовитой желез, секреторных клетках средней кишки взрослых пчел. Осажденные сернокислым аммонием глобулины гемолимфы в разведении 1:100

Задерживали, рост М. lysodeiktieus- а зоне- 16,4 мм, лизировали Зномассу М. lysodeiktieus с диаметром зоны 15;1 ми; ио в то же лрсмя не оказывали ни бактерицидного; ни бактериостатического хенствня im Е. coli . Эквивалентно лизирующей активности стандарта, лнлоцимл яичного белка в гемолимфе Ю-дпевиых пчел-кормилиц содержится 5,4±0,8 мкг/мл н 30-дневных пчел-фуражп->ов — 16,8± 1,3-мкг/мл; 30-дневных маток и трутней — 8,2±1,1 и кг/мл и 4,8^0,6 мкг/мл соответственно. Антигенное стимулирование 10-дневиых пчел живой культурой Е. coli в-, количестве-I млн. микробных тел/пчелу повышало количество лизоцима в гемолимфе до 20,0±1,2 мкг/мл, а травмирование —до 12,1. мкг/мл (Р<0,001).

Электрофорез гемолимфы взрослых рабочих, особей пчел на 5умаге выявил четыре пептидные фракции, окрашиваемые 1% нпн-идрином в сиреневый и фиолетовый цвета. Две- фракции, первая 13 которых была наиболее массивной, имели катодную направленность; из двух оставшихся одна имела нейтральный заряд, а зторая — отрицательный со сравнительно небольшой подвнж-юстыо в ватмане. Антигенное стимулирование пчел живой культурой Е. coli в дозе 2 млн. бактерий на пчелу не вносило пзме-1енин в количество пептидных фракций гемолимфы и их объем:

Гемолимфа взрослых особен пчел содержит вещества, агглю--иннрующне эритроциты кур в титре 1:10 и микроорганизмы А. lysodeiktieus и Е. coli, в тнтре 1:200' п 1:10 соответственно, Антигенное стимулирование пчел живой: культурой Е. coli,повыпало титр гемагглюгинации до 1:100, титры агглютинации микроюкка и кишечной палочки достигали 1:800 и 1:200 соответствен-¡о. Лучшие результаты агглютинации гемолимфой отмечены че->ез 24 часа после антигенного стимулирования, но и спустя 72 ча-:а отмечалась разница в титре лектннов в опыте и контроле. Трав-шрованне кутикулы также повышало титр лектинов гемолимфы с :200 до 1:400 к М. lysodeiktieus. В реакции конглютннацшг ком-¡лекса комплемент-сорбент (в качестве сорбента использовали 1—-15,% взвесь эритроцитов барпна) титр комплемента гемолимфы [маго равнялся 1:16, что ниже титра-комплемента гемолимфы ли-ннок в два раза. Конглютннация бычьей сывороткой комплекса-щтиген-антнтело-.комплемент показала положительный- результат-| разведении гемолимфы 1:800.

Через час после инъекции в гемоцель имаго 2 млн. тел кишеч-юй палочки фагоцитирование бактерий имело место в. незначи-ельном числе случаев. Фагоцитарная активность гемоцитов сос-авляла 9,8%, а фагоцитарный индекс был равен 0J5 (и 0,2 че-ез час после инъекции 10 млн. микробных тел/пчелу)..

Экстракт, приготовленный из всего насекомого, меланпзпрует-я в течение 30 мин., в то же время экстракты, приготовленные

йз Отдельных частей тела (головок, грудок и брюшек) меланизгё-руются незначительно. По интенсивности меланизации на первом месте находились экстракты из головок, па втором — из брюшек и на последнем — из грудок имаго рабочих пчел. Наиболее быстро, в течение 15 минут, и интенсивно мслапи-зировалась гемолимфа рабочей особи пчел, гемолимфа матки ме-ланизировалась за 20 мин. и трутня спустя 30 мин.

Экстракт из головок трутня практически не меланизнровался, незначительно меланизнровался экстракт из головок маток и более интенсивно меланизнровался экстракт из головок рабочих особей пчелы. Гемолимфа, имеющая признаки меланизации, после инъекции ее в околосердечную полость сокращала срок жизни пчел в 1,5 раза по сравнению с интактными контрольными пчелами. Пчелы погибали с клиническими признаками токсикоза. Признаки токсикоза проявлялись на 10—15-й день инкубации в зависимости от разведения. В то же время бактерицидность ме-ланизированной гемолимфы in vitro снижалась в 1,7 раза. Гемолимфа, не имеющая признаков меланизации, безвредна для пчел.

Как правило, экстракт, приготовленный из пчел, больных вирусом паралича, меланизнровался быстрее и интенсивнее, чем экстракт из контрольных пчел. В то же время, инфицирование нчел апатогенным М. lysodeikticus или условно патогенной Е. coii предотвращало генерализованную меланизацшо гемолимфы, но локальная меланизация имела место. Меланизировалнсь агглю-тинаты бактерий и агломераты гемоцитов. Разрушение инфицирующего агента в организме имаго происходит в основном за счет агглютинации и лизиса. Ежесуточным высевом на МПА гемолимфы из пчел, инфицированных Е. соП, установлено, что кишечная палочка сохраняет жизнеспособность в организме пчел на протяжении пяти суток, причем чистую культуру Е. cofi получили в течение трех суток, после чего отмечали рост на МПА смешанной культуры, состоящей из кишечной палочки, грубой грамотрицательной палочки и грамиоложительно-го стрептококка (по всей видимости, проникших в гемолимфу через раневое отверстие). Стрептококк и крупная палочка перспсгн-ровали в гемолимфе в течение десяти суток (срок наблюдения).

Водный экстракт из подглоточной железы содержит термостабильные антибактериальные вещества, антимикробные вещества экстрактов грудной и ректальной желез относительно термостабильны. Бактерицидные вещества подглоточной железы выдерлш-вают кипячение в течение 30 мин., а бактериостатические вещества грудной и ректальной желез разрушаются при воздействии температур выше 80°С. Экстракты грудной и ректальной желез лизируют ацетоновый порошок М. lysodeikticus , экстракт подгло-

точной железы обладает этим свойством в гораздо меньшей степени (табл. 1).

Таблица !

Антибактериальное действие экстрактов желез пчелы

Препарат Разведе- Ре жил г1 зон задержки роста в мм с! зон лизиса 13 мм

ние эк стр акта обработки М. 1 vsod ei kiicus E. coli М. ¡у5;к!е1й.

Подглоточная железа 1:10 — 19,3 ±2,1 10,1 ±1,4 10,2 ±0,9

• 65°30 млн. 20,4 ±1,9 (20,1 ±,2,4) —

ЮО'ЗО мнн 11,2 ± 1 ,G (18,G±2,1) —

"рудная железа 1:10 — 14,1 ±1,2 — —

G5°30 мин. 12,6 rt 1,2 — 22,4 ±3,2

ЮО'ЗО мин сл. 18,6 ±2,8

Ректальная кслеза 1:10 — 10,3 ±2,2 — 16,8 ± 1,3

[довитая железа 1:10 65°30 мнн. 100°30 мни. 8,5 16,4 ±0,3 (17,9 ±0,6) сл. 17,5 ±0,8

"Цифры в скобка;; обозначают бактериостатиче-ское действие экстрактов.

Экстракт средней кишки зимующих пчел после прогревания 1рн 65°С в течение 30 мин. дает просматривающую с трудом зо-1у лизиса диаметром 10,0 мм. Зона лизиса появляется через 48 'асов и становится четче спустя 3—4 суток. Экстракт из головок, ! которых размещена подглоточная железа, содержит четыре гептндные фракции, две из которых проявляют антибактериально активность. В экстракте из грудок, содержащих слюнную же-:езу, присутствует три фракции в т. ч. две оказывают антнмикроб-;ое действие, а одна, кроме того, активно лпзнрует микрококк. Экстракт ядовитой железы содержит три пептидные фракции, роявляющнх антибактериальную активность.

Таким образом, защитные функции в организме пчел выявляет система клеток, тканей и органов. Система защиты организ-(а взрослой особи медоносной пчелы состоит из секреторных кле-ок кишечника и кишечных желез, а также клеток гемолимфы и елома. Протеиновые вещества (преимущественно глобулины) ге-

молимфы взаимодействуют с поверхностью как отдельных струю тур, например, эритроцитов, так и с комплексами антиген-анти тело. Присоединение комплемента гемолимфы к комплексу анти ген-антитело имеет выраженную устойчивость, а адсорбирование комплемента :на отдельных антигенных структурах менее выраже но и быстротечно. Тем не менее, этот факт важен, так как свидетельствует о том, что антиген может связывать комплемент гемо лимфы и без участия специфических антител. Гемолимфа пче./ содержит .в своем составе лизоцим, антибактериальные пептиды лектины, активность которых повышается при антигенном стимулировании -пчел, и комплемент, которые обусловливают реакцш конглютинации, агломерации, неспецифических агглютинации лизиса и способствуют действию механизмов интерференции, фагоцитоза, инкапсулирования и меланизации.

6. Неспецифнческие факторы и механизмы резистентности I ответной реакции организма пчелы на заражение. Полученные данные по сравнительному титрованию вирусов выявили более вы сокую степень чувствительности первично трипсинизированно1 культуры ткани к вирусу острого паралича по сравнению с пче лами. Между величинами логарифмов цитопатических доз и ле тальных доз вируса острого паралича пчел наблюдается частичная прямая корреляция г±тг =0,99 ±0,11.

Заражение вирусами как острого, так и хронического паралича, вызывает резкие изменения количества нуклеиновых кислот в организме пчел. Количество РНК в организме пчелы, зараженной ост рым параличом, снижалось в течение первых 4-х часов на 33% в последующие 24 часа скорость снижения РНК замедлялась и ь 48 часам превышала исходный показатель на 9%. Напротив, ко личество ДНК в организме зараженной вирусом острого паралича пчелы возрастало в течение первых 4-х часов на 44%, в нос ледующие 24 часа оно снижалось и к 48 часам — началу заболевания — превышало норму на 11%. При заражении пчел виру сом хронического паралича первые признаки заболевания появ лились через 72 часа, поэтому нарастание количества РНК про исходило несколько -медленнее, но в целом происходящие коли чесгвенные изменения нуклеиновых кислот в организме зараженных пчел идентичны -как в случае острого, так и хронического паралича пчел.

Заражение вирусом острого паралича вызывало глубокие изменения в белковом обмене пчел. Общее количество аминокислот резко увеличивалось, сумма г минокислот в тканях зараженные пчел, в период проявления клинических признаков заболевают равнялась 74,74%, у здоровых составляла 46,92%. Содержание общего протеина у пчел в начале заболевания вирусным параличо\ увеличивалось -и составляло 53,55% против 50,4% в контроле. Е

брюшках общая сумма аминокислот увеличивалась до 63,14% прогни 26,05% в контроле, уровень протеина составлял 32,73%• В грудках больных пчел получено статистически достоверное снижение концентрации всех аминокислот за исключением пролина, лейцина, тирозина. Общая сумма аминокислот п грудках больных параличом пчел составляла 77,47% против 99,23% в контроле. Содержание протеина в грудках зараженных пчел незначительно повышалось и составляло 66,15% против 62,52% у контрольных насекомых.

У пчел с клиническими признаками заболевания общий белок в гемолимфе в 4,6 раза превышал исходный показатель. Напротив, уровень общего белка в гемолимфе пчел, которым инъецировали инактивированиый вирус, шел на спад и выравнивался с контролем примерно к 72 часам. Непосредственно после заражения пчел вирусом, количество гемолимфы изменялось незначительно; к 4 часам — существенно превышало норму; с появлением клинических признаков заболевания и до момента гибели от вироза снижалось более чем в 2 раза, содержание общего белка в ней, в пересчете на объемные показатели, повышалось.

Через час после заражения имаго пчел вирусом острого паралича инъекцией в гемоцель 200 вирусных частичек/пчелу количество гемоцитов в 1 мм3 гемолимфы снижалось с 10900 до 3000, а через 4 часа достигало 11250 в 1 мм3. Прн инокуляции 20 вирусных частичек/пчелу количество гемоцитов увеличивалось через 1 час до ¡5800. Через 72 часа к моменту гибели зараженных пчел в 1 мм3 насчитывалось 5700 гемоцитов. Часть разрушающихся гемоцитов образовывала агломераты, которые, спустя несколько часов, ме-лавизировались.

Внроз оказывает существенное влияние на факторы неспецифической резистентности пчел. У пчел, пораженных хроническим параличом, снижается активность пищеварительных ферментов средней кишки в 1,5 раза, отсутствует лизирующее действие экстрактов грудной железы. В то же время активность лизоцима и антибактериальных пептидов незначительно повышается, увеличиваются в 1,3 раза зоны мелинизацни гемолимфы ив 1,5 зоны ме-ланнзацни экстракта из подглоточной железы но сравнению с контролем.

Соединенный в равных частях с суспензией вируса острого паралича с титром 12^Ь Д50 пищеварительный сок проявил выраженное ингибирующее действие, равное З.П^Ь Д50 , после инкубирования смеси при 37° в течение 30 мин. Вирусингибирующая активность пищеварительного сока повышалась на 1Ы после инкубирования смеси при 39°С в течение 30 минут и снижалась на 2 после предварительного прогревания экстракта со средней кишки при 60°С в течение 30 мин.

V личинок, больных европейским гнильцом, количество ДНК в организме увеличивается в 2,2 раза, в то время как содержание РНК снижается в 2,9 раза. Количество РНК и ДНК снижается у пчед-кормилиц из пчелосемей, пораженных европейским гнильцом, в период острых проявлений клинических признаков заболевания в 2,3 и 1,3 раза соответственно.

Гемолимфа 4-дневных личинок с признаками поражения европейским гнильцом беднее белком, нежели гемолимфа здоровых личинок. Количественное соотношение белка в них 2,0:2,8. Вес сравниваемых личинок был одинаков. Белковый состав гемолимфы больных личинок беднее, выпадает средняя фракция (№ 4).

В период острого проявления европейского гнильца объем синтеза белка у пчел-кормилиц снижается с 2,8 до 1,6, а у зараженных личинок с 2,4 до 0,4. Снижение синтеза белка в организме больных личинок происходит за счет наиболее подвижных фракций, количество и удельный вес которых уменьшаются.

В организме личинок, страдающих европейским гнильцом, снижаются бактерицидные свойства гемолимфы. Исследование пораженных европейским гнильцом 4-дневных личинок выявило уменьшение содержания лизоцима с 8,7 м/кг до 5,9 мкг/мл в гемолимфе, с 4,1 мкг/мл до 2,6 мкг/мл в гомогенате тела и снижение активности антибактериальных пептидов в 4 раза. В то же время содержание лизоцима в кишечнике в 1,1 раза превышало показатель контроля. Маточное молочко из ячеек с 2-дневнымн личинками из здоровых пчелосемей богаче белком по сравнению с маточным молочком неблагополучных семей и определяется соотношением 3,1:2,6. Бактернцидность маточного молочка из неблагополучных семей пчел снижена (Р>0,05).

Возбудитель нозематоза Nosema apis Z. нарушает белковый обмен зараженных пчел. Содержание протеина в погибших от нозематоза пчелах в 1,2 раза превышает показатель контроля. Процентное содержание аспарагиновой кислоты в 1,2, пролина в 1,4 и валяна в 1,3 раза выше у пчел, погибших от заражения.

В организме пчел, страдающих нозематозом, со степенью поражения кишечника 4- + + +- в период острого проявления заболевания снижена в два раза активность лизоцима и антибактериальных пептидов в гемолимфе и экстракте из подглоточной железы, полностью отсутствует активность лектинов, интенсивность меланизации экстракта из головок снижена в два раза: экстракты из грудок не меланизируются в отличие от контроля. Снижена на 1/3 активность пищеварительных ферментов; в то же время активность лизоцима и антибактериальных пептидов грудной железы у пчел, болеющих нозематозом, в 1,8 превышает показатели контроля (Р<0,05).

Под действием патогенов в организме насекомых происходят

существенные изменения, ведущие к снижению резистентности. Нарушение формирования факторов устойчивости у взрослых пчел, участвующих в переработке нектара в мед и производстве маточного молочка, влияет на качество этих продуктов, приводит к снижению жизнеспособности семей пчел.

Большие дозы микроорганизмов, попадающие в гемоцель, вызывают элиминацию гемоцитов из гемолимфы, что типично для действия регулирующих агентов типа лимфокинов. Резкое, в 3,6 раза, снижение числа гемоцитов в гемолимфе после заражения пчел летальной дозой вируса ОППВ и одновременное повышение ДНК в организме зараженных насекомых свидетельствуют о том, что исчезнувшие из гемолимфы гемоцнты интенсивно размножаются. В течение суток количество циркулирующих клеток достигает, а затем и превышает показатели контроля, изменяется также структура гемоцитов. Одновременно увеличивается содержание общего протеина в организме пчел. Увеличение в 2,4 раза, по сравнению с контролем, общей суммы аминокислот в брюшках зараженных вирусом острого паралича насекомых, с одновременным ее снижением в грудках в 1,3 раза, указывает на то, что процессы белкового синтеза и гемоцигопоэза происходят в брюшной полости пчел.

Изучаемые факторы резистентности медоносных пчел могут быть широко использованы для прогноза болезней, исследования их патогенеза, разработки средств терапии и мер борьбы с болезнями этих насекомых, а также ветсанэкспертизы продуктов пчеловодства (мед, маточное молочко), генетики, разведения пчел и сцепки состояния окружающей среды.

7. Выявление антител у пчел после антигенного стимулирования.

Антигенная стимуляция не оказывала выраженной защиты от внро-за; 20% выживших пчел в группе, предварительно нм.муиизнроваи-ных инактнрованным ОППВ, можно отнести на счет интерференции. Не защищали пчел от паралича инъекция (за 14 дней до заражения) сублетальных разведений вируса или введение в гемолимфу сильных раздражителей, таких, как тушь. При работе с бактериальными культурами на 3—4-й день погибало 60±7% иммунизированных личинок, зараженных смесыо вирулентных культур М. phiton и Bact. eurydiee, и 12±4% личинок, зараженных Entero coccus faecal is. Личинки, инфицированные инактивиро-вапными формалином бактериальными культурами, как правило, окукливались. Количество выброшенных не превышало 10±2%. РСК, РА п РДП, поставленные с гемолимфой подопытных личинок и взрослых пчел, в каждом отдельном случае дали отрицательные результаты. Титры РСК и РА не превышали 1:25, что свидетельствовало о неспецифичности реакций. Таким образом, полученные данные указывают, что в гемолимфе иммунизирован-

ных личинок и взрослых пчел антитела в количестве, доступном для обнаружения использованными методами, не установлены.

8. Аддитивное действие факторов естественной резистентности и лекарственных препаратов. Терапевтическая эффективность нистатина при оздоровлении пасеки с острой формой аскосфероза повышалась в 2,8 раза, если сочетали дачу нистатина с искусственным взятком. Определенный эффект на развитие семей пчел оказывали белковые подкормки. Скармливание фумагиллина не излечивало от нозематоза пчелосемьи неблагополучные по европейскому гнильцу. Напротив, после купирования европейского гнильца антибиотиками, фумагиллин проявлял высокие лечебные свойства. Поступившие в кишечник с кормом левомицетин, уксусная кислота и рибонуклеаза ускоряли процесс выздоровления семей пчел от мешотчатого расплода. Интерферон человека, заданный через 4 часа после заражения личинок этим возбудителем, предупреждал развитие заболевания 20 ±2,4% особей.

ВЫВОДЫ

1. Естественная резистентность семей медоносных пчел обусловлена защитными факторами отдельных составляющих ее индивидуумов, наличием этих факторов в кормах, особенностями поведения взрослых пчел (трофолаксис, очистка гнезда и др.).

2. Факторами неспецифической защиты всех стаз и стадий развития медоносной пчелы являются: лизоцим, антибактериальные пептиды и лектины; к набору этих средств у личинок добавляется комплемент, а у взрослых пчел — пищеварительные протеазы. В защите организма пчелы от патогенов принимают участие механизмы фагоцитоза, интерференцпн, меланизации, инкапсулирования, агломерации и реакции агглютинации н лизиса.

3. Лизоцим, который секретируют клетки желез кишечника, средней кишки, гемоциты личинок, куколок и взрослых пчел, проявляет различие в активности, характере действия на бактерии, устойчивости к температуре в зависимости от среды нахождения: повышенная активность лизоцнма отмечается в кислой среде (рН 4,5—6,5). В гемолимфе, экстрактах грудной н ректальной желез фермент проявляет более выраженное лидирующее действие, а в меде и маточном молочке — бактерицидное (задерживает рост бактерий). В гемолимфе личинок он разрушается при температуре выше Ч-80°С в течение 30 мин.; у взрослых пчел — выдерживает прогревание при ЮО'С в течение 30 минут.

4. Лизоцим содержится в гемолимфе личинок рабочих пчел 2-дневного возраста в концентрации 5,2±0,8 мкг/мл; 6-дневных — 12,3± 1,4 мкг/мл; 7-дневных — 18,6±1,8 мкг/мл; у однодневных

предкуколок и куколок — 4,1±0,5 и 6,2±0,8 мкг/мл соответственно; 5-дневных личинок трутней — 8,4±1,8 мкг/мл; имаго трутней — 4,8±0,6 мкг/мл; взрослых особей рабочих пчел: 10-дневных — 5,4±0,8 мкг/мл; 30-дневных 16,8^1,3 мкг/мл; 30-дневных маток 8,2±1,1 мкг/мл. В яйцах пчел лизоцим содержится в количестве G,2±0,8 мкг/мл. В гемолимфе взрослых особен пчел в зимний период находят 5,2±0,7 мкг/мл лизоцима.

5. Антибактериальные пептиды присутствуют как в организме пчел, так и в продуктах пчеловодства (меде, маточном молочке) и действуют бактерицидно на грамположительные и грамотрица-тельные микроорганизмы. Пептиды сохраняют активность после кипячения в течение 30 минут и частично инзктивируются после автоклавирования в режиме 1,5 атм. и 125°С в течение 30 минут.

6. Лектины и комплемент присутствуют в гемолимфе 5-дневных личинок рабочих пчел соответственно в титрах 1:10 и 1:3200; у взрослых рабочих пчел 20-дневного возраста — 1:10 и 1:800; в яйцах лектин содержится в титре 1:25.

7. Лизоцим медоносной пчелы обладает бактерицидным и лидирующим действием на грамположительные бактерии; лектины агглютинируют различные микроорганизмы и эритроциты теплокровных; антибактериальные пептиды действуют бактерицидно и бактериостатически на грамположительные и грамотрицатель-пле бактерии; комплемент связывается на поступающих в организм антигенах; ферменты средней кишки ингибируют отдельные вирусы (вирус острого паралича в среднем на 3'g).

8. Травмирование кутикулы и антигенное стимулирование инъекцией живых культур микроорганизмов у 10-дневных пчел вызывают увеличение концентрации лизоцима в гемолимфе до 12,1 икг/мл и 20,0±1,2 мкг/мл против 5,4 + 0,8 мкг/мл, титра лектинов / иммунизированных пчел до 1:100, усиливают антибактериальное действие пептидов в 1,5 и 2 раза соответственно. Повышенная активность факторов резистентности сохраняется в организме пчел соответственно 3 и 5 дней. Интерференция, вызываемая инакти-рованным нагреванием вирусом острого паралича, защищает >0% пчел, зараженных тем же типом вируса.

9. Фагоцитоз микроорганизмов в гемоцеле насекомых осуществляют гемоциты личинок, куколок и взрослых пчел, наиболее жтивна реакция у куколок и личинок, наименее выражена у има-'о (фагоцитарный индекс соответственно 3,6; 1,8 и 0,2). Бактери-1льные клетки в организме имаго лизируются; у личинок инкапсулируются и отторгаются с кутикулой при очередной линьке.

10. Меланизация in vitro, гемолимфы и экстрактов тканей всех •таднй развития пчелы (кроме яиц) в зависимости от темпера.ту-)ы внешней среды происходит в течение 15—30 мин. Гемолимфа рутией меланизируется вдвое медленнее, чем у рабочих пчел.

Травмирование кутикулы повышает титр тирозиназы с 1:8 до 1:128 и ускоряет меланизацию до 5—10 мин.; инъекция в гемоцель микроорганизмов предотвращает этот процесс.

11. Антибактериальная активность меда обусловлена добавлением в него секретов слюнных и подглоточной желез взрослых пчел в процессе переработки нектара. Мед, содержимое зобиков имаго и маточное молочко из здоровых семей пчел содержат лп-зоцим (10, 20 и 100 мкг/мл соответственно), антибактериальные пептиды. Антибактериальная активность корма 3—6-дневных личинок в период медосбора достигает титра 1:200 и снижается до 1:100 в период его отсутствия.

12. Факторы неспецифической защиты пчел изменяются под действием патогенов (возбудителей острого, хронического паралича, европейского гнильца и нозематоза), приводящих к нарушениям количеств ДНК и РНК, аминокислот и белка в организме хозяев.

13. При хроническом параличе пчел лизоцим отсутствует в грудной железе, в 1,5 раза снижается активность протеаз в средней кишке; незначительно увеличивается содержание лизоцима и антибактериальных пептидов в гемолимфе и экстракте подглоточной железы; в 1,5 раза возрастает меланизация экстракта подглоточной железы и в 1,3 раза — гемолимфы.

При европейском гнильце в 1,3 раза снижается активность лизоцима и в 1,4 — антибактериальных пептидов в гемолимфе пораженных личинок; в то же время содержание лизоцима в кишечнике в 1,1 раза превышает соответствующий показатель у здоровых личинок.

При нозематозе пчел из гемолимфы исчезают лектины, в 2 раза снижается активность лизоцима и антибактериальных пептидов в гемолимфе и подглоточной железе; вдвое падает интенсивность меланизацни гемолимфы и экстракта из головок; уменьшается в 1,3 раза активность кишечных протеаз. Одновременно усиливается меланизация экстрактов грудок и в 1,8 раза повышается активность лизоцима и антибактериальных пептидов в экстракте из грудной железы.

14. Интенсивность поражения расплода в семьях пчел с европейским гнильцом неодинакова у различных подвидов (пород) пчел и зависит от выраженности инстинктов очистки ячеек сотов от погибших личинок, запасания кормов впрок и развития семей до оптимального уровня. Македонская (местная дальневосточная) пчела, устойчивая к гнильцу, удаляет погибший расплод в 1,6 раза интенсивнее, чем карника (карпатская пчела), восприимчивая к гнильцу. Пчелы прекращают развитие в период главного медосбора, если их мушность больше 10 обсиживаемых соторамок и, наоборот, используют принос нектара для бурного развития, если

их мутность меньше 10 соторамок; в первом случае площадь, занятая расплодом, сокращается с тенденцией самовыздоропленпя к середине основного медосбора и во втором случае — увеличивается с одновременным повышением интенсивности заболевания.

15. Учет факторов резистентности организма пчел и антибактериальных субстанций в медах и маточном молочке целесообразен при изучении различных вопросов патологии пчел, генетики разведения и содержания пчел, при ветсанэкспертизе продуктов пчеловодства, оценке состояния внешней среды.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты проведенных исследований были использованы при разработке:

— «Временного наставления по постановке реакции нейтрализации для диагностики вирусного паралича пчел» (в соавторстве). Утверждены ГУ В МСХ СССР 19.02.1975 г.;

— «Методических рекомендаций по исследованию вирусов медоносных пчел» (в соавторстве). Утверждены отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 4.11.1982 г.;

— «Методических рекомендаций по определению факторов неспецифического иммунитета медоносной пчелы». Утверждены ДВО ВАСХНИЛ 15.01.1991 г.;

— «Рекомендаций по диагностике и терапии смешанных заболеваний пчел с основами иммунитета». Утверждены ДВО ВАСХНИЛ 15.01.1991 г.;

— «Методических рекомендаций к проведению ветеринарно-профилактических мероприятий в животноводстве Амурской области» (в соавторстве). Утверждены НТС Амурской области 10.06.1986 г., а также:

— «Способ лечения пчелиных семей от инфекционных забо-аеваиий» (в соавторстве). Авторское свидетельство № 820759;

— «Белковая подкормка для пчел» (в соавторстве). Автор-:кое свидетельство № 829088;

— «Штамм вируса мешотчатого расплода пчел для изготовле-шя диагпостикумов» (в соавторстве). Авторское свидетельство

1554374.

Кроме того, подготовлены материалы:

— «Способ практического использования аддитивного дейст-шя лекарственных препаратов и факторов неспсцифического иммунитета в терапии пчел»;

— «Метод количественной оценки антибактериальных пептидов в тканях пчелы па модели П. а1\ге! шт. М-83»;

— «Способ качественной оценки лектинов в организме пчел [ри помощи РТГА»;

— «Метод качественного и количественного определения комплемента в гемолимфе пчел с помощью реакции конглготинацип (РК)».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зюман Б. В. Тропизм вирусов хронического паралича и «неявной инфекции» к первичным культурам клеток // 'Гсз. Всесоюзного семинара «Современные методы изучения болезней пчел и меры их профилактики».—Москва, 1972.

2. Гробов О. Ф., Зюман Б. В., Кумков В. Т. Ассоциированное действие Nosema apis Z., 1909 и вирусов хронического паралича и мешотчатого расплода на медоносную пчелу// Bulletin Apicole

XV-2.

3. Гробов О. Ф., Зюман Б. В. Роль Nosema apis Z., 1909 при вирусном параличе//Мат. XXIV Международного' конгресса по пчеловодству. 1973.

4. Зюман Б. В. К диагностике хронического паралича//Ветери-нария, 1974. № 6. С. 113—114.

5. Зюман Б. В. Заражение пчел вирусом хронического паралича//]! человодство, 1974. № 10. С. 101 —196.

6. Зюман Б. В. Дифференциальная диагностика хронического паралича пчел//Труды БелНИВИ. 1975. T. XIII.

7. Зюман Б. В. Способ культивирования эксплантатов тканей насекомых//Межвед. сб. «Достижения ветеринарной науки и передового опыта животноводству». —■ Минск, 1976.

- 8. Зюман Б. В. Обнаружение вируса в гемолимфе больных вирусным параличом пчел//Ветеринария, 1977. № 4. С. 55.

9. Зюман Б. В. Экологическая пластичность медоносной пче-лы//Родная природа, 1977. № 4.

10. Зюман Б. В., Ермолаев Г. Ф., Лучко В. П. Очистка и идентификация вируса мешотчатого расплода//Пчеловодство, 1977. № 12.

11. Зюман Б. В. Вирусоносительство при параличе пчел//Тр БелНИВИ. 1978. T. XVI. С. 79—81.

12. Зюман Б. В., Литвяк В. С. Изменение амннокислотногс состава тканей пчел при заболевании параличом//Международ коллоквиум но .патологии беспозвоночных XI ежегод. совещ. общества по патол. беспозвоночных. — Прага, 1978. С. 136.

13. Зюман Б. В., Гукосян А. X.' Реакция сывороточной нейтрали зацпн для диагностики хронического паралича пчел// Тр. БелНИВИ, 1979. T. XVII. С. 83—85.

14. Зюман Б. В., Литвяк В. С. Нарушение белкового обмепг

тканях пчел при остром параличе//Науч. труды ВАСХНИЛ. ■-;олос, 1980. С. 143—147.

15. Гробов О. Ф., Зюман Б. В., Керимбаев А. К. Культивирова-не вирусов медоносной пчелы//Науч. тр. ВАСХНИЛ.—Колос, Э80. С. 138—143.

16. Зюман Б. В. Поведение пчел в садках//Пчеловодство, 1980. » 11. С. 19.

17. Зюман Б. В. О европейском гнильце//Пчеловодство, 1983. Ь 10. С. 19.

18. Зюман Б. В. Профилактика и терапия европейского гниль-а пчел//В кн.: Борьба с болезнями с/х ж-х на ДВ Сиб. отд. АСХНИЛ,—Новосибирск, 1984. С. 57—61.

19. Зюман Б. В., Гордиенко Л. Н. Выявление комплемента в :молимфе ичел//Ветеринария, 1986. № 11 С. 29—31.

20. Зюман Б. В. Комплекс мероприятий по борьбе с варроато-)м пчел//Ветеринария, 1987. № 6. С. 40—43.

21. Зюман Б. В., Шариков А. П., Лобаченко Н. И. Устойчи-)сть пчел к заболеваниям//Пчеловодство, 1987. № 5. С. 12—13.

22. Зюман Б. В., Кадочников А. Ю. Гельминтозы. Варроатоз юл. — Хабаровск, 1988.

23. Зюман Б. В., Лобаченко Н. И. К изучению лектинов медо-)сной пчелы//НТБ. Незаразные болезни с.-х. животных. — Ново-[бнрск: СО ВАСХНИЛ, 1988. С. 14—17.

24. Зюман Б. В. Факторы естественного иммунитета у пчел// человодство, 1988. № 11. С. 21—23.

25. Зюман Б. В., Гордиенко Л. Н. Комплемент в системе им-уннтета у пчел//Инфекционная патология с.-х. животных и пчел 1 Дальнем Востоке//Сб. научи, тр. ДальЗНИВИ. — Новосибирск, )88. С. 61—67.

26. Зюман Б. В., Лобаченко Н. И. Иммунная реакция у медо->сной пчелы//Инфекционная патология с.-х. животных и пчел I ДВ//С6. научн. тр. ДальЗНИВИ, 1988. С. 67—72.

27. Зюман Б. В. Защитные приспособления и общефизиологи-ские факторы иммунитета пчел//Тезисы докладов обл. научно-1актической конференции «Ветеринарная наука на службе АПК» Благовещенск, 1988. С. 25—29.

28. Зюман Б. В. Аддитивное действие факторов естественного шуннтета и химпопрепаратов при мешотчатом расплоде пчел// :з. докл. региональной научно-произв. конф. «Профилактика и [квндация основных болезней с.-х. животных на ДВ», 1989.

55—57.

29. Зюман Б. В., Устинова Г. И. Содержание общего белка в молимфе и тканях медоносной пчелы в норме и патологии// жлады ВАСХНИЛ, 1989. № 3. С. 32—34.

30: Зюман Б. В., Лобаченког Н-. И'. Мечение пчел//Пчеловодст во, 1990. № 7. С. 8.

31. Зюман. Б. В., Будилова. И;. В. Диагностика и терапия гаф шюза//НТБ* Вопр. эпизоот. диаг. и мероприятия- по ликв. инфек бол. с.-х. живот. Новосибирск: СО ВАСХНИЛ, 1990: С. 34—37.

32. Зюман Б. В». Терапия аскосфероза//НТБ. Вопр-. эпизоот. дшн и меропр. по ликв. инфек. бол. с.-х. животных. — Новосибирск СО- ВАСХНИЛ, 1990. С. 37—40; '

33. Зюман Б. В. О бактерицидности меда//Пчеловодство, 199С № 3. С. 43—44:

34. Зюман. Б1 В. Динамика нуклеиновых кислот в организ ме медоносной пчелы при вироэах//Доклады ВАСХНИЛ.—М 1990, № 10; С. 56.

35. Зюман Б. В., Лобаченко Н. И. Выявление и классификации лектинов медоносной пчелы//Снбирский вестник с.-х. науки, 1990 № 6. С. 59—61.