Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Сравнительная характеристика развития инфекции, индуцированной вирусом лейкоза крупного рогатого скота, в первичных и перевиваемых культурах клеток различного происхождения

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Р Г Б ОД

На правах рукописи

2 7 ВНВ 1997

АБЕЛ МИГЕЛ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗВИТИЯ ИНФЕКЦИИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, В ПЕРВИЧНЫХ И ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1У9о

Работа выполнена в Московской государственной академии ветеринарной ыедицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Научные руководители: академик РАСХН, доктор ветеринарных наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН,

профессор Воронин Е.С.

доктор биологических наук Валихов А.Ф.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко.

на заседании диссертационного совета Д 120.36.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Московско государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина /109472, Москва, ул. академика Скрябина, 23.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке академии.

профессор Шишков В.П.

кандидат биологических наук, старший.

научный сотрудник Крикун В.А. '

Защита диссертации состоится

1997 г. в часов

Автореферат разослан

1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Слесаренко Н.А.

OBiMfi ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сред/ онкологических заболеваний сельскохозяйственных животных, лейкоз крупного рогатого скота занимает одно из первых мест как по чистоте, так и по тяжести процесса. Заболевание широко распространено во многих регионах Мира и наносит большой экономический ущерб животноводству, з результате преждевременной выбраковки и убоя животных, недополучения продуктов животноводства, ограничений племлроцаки и реализации молока, затрат связанных с диагностическими и ветерииарно-саштарными ■¿ероприятиями.

В результате интенсивных исследований, проводившихся во многих странах üinpa был выделен и идентифицирован этиологический" агент этого заболевания - вирус лейкоза крупного рогатого скота IВЛКРС), изучены его биохимические,- антигенные, биологические зво^ства. Разработаны эффективные методы серологической диагностики С Van der Maaten. , 1974; Miller J. м. 1976; Van öer iaaterJ980; Залихов А.Ф., 1976), которые являются основой современных методов профилактики заболевания и оздоровления неблагополучных по лейкозу хозяйств (Крикун З.А. и др. 1984; Шишков'В.П. -I др. 1986; Нахмансон В.М., 1980; Гулюкин М.И. 1988).

Для получения препаративных количеств вируса лейкоза и его штигенов вначале использовали переживающие культуры лимфоцитов ;рови больных лейкозом животных ( Milier j. ;■). , 1969). Однако, продукция вируса и вирусных антигенов в переживающих культурах клеток была слабой, а большое .количество обломков разрушение клеток, присутствующих в этих культурах, существенно затруд-шло выделение специфического антигена, получение перевиваемых :иний клеток, хронически инфицированных ВЛКРС, позволило устранить 1ЛД недостатков свойственных для переживающих культур лимфоцитов, 'еревиваемые монсслойные культуры клеток более интенсивно продуцируют вирус и растворимые вирусные антигены, позволяют получать :ольжие количества вирусных препаратов с меньшими затратами Van der Maaten , fliller 0. M. , 1976; Крикун В. А.

др., 1976). Кроме того, перевиваемая линия клеток хронически нфицированная ВЛКРС является субстратом для поддержания штамма ируса в лабораторных условиях.

Однако, получение перевиваемых, хронически инфицированных ЛКРС культур клеток связано с большими трудностями. 3 литературе

описано всего несколько таких линий клеток. Таким образом, в Мире существует несколько штаммов ВЛКРС, поддерживаемых в хронически инфицированных перевиваемых культурах клеток. Вместе с тем геномы ретровирусов подобно другим РНК~содержащим вирусам подвержены высокой вариабильности. Поэтому изучение штаммовых различий ВЛКРС является необходимым условием разработки эффективных средств иммунодиагностики и иммунопрофилактики лейкоза крупного рогатого скота.

В связи с этим работа, направленная на изучение оптимальных условий выделения и поддержания вируса лейкоза крупного рогатого скота в культурах клеток является актуальной.

Цеди и задачи исследования. Целью работы являлся поиск оптимальных условий ввделения и поддержания новых изолятов вируса лейкоза крупного рогатого скота в лабораторных условиях в первичных и перевиваемых культурах клеток.

Для достижения намеченной цели, мы разделили работу на три части, при выполнении каждой из которых предстояло решить следующие задачи:

1. Определить оптимальные условия вделения вируса лейкоза крупного рогатого скота в первичных культурах лейкоцитов.

2. Провести сравнительное изучение чувствительности первичных моносдойных культур клеток различного происхождения и их субкультур к ВЛКРС.

3. Изучить чувствительность перевиваемых линий клеток различного происхождения к ВЛКРС.

4. Разработать условия воспроизведения хронической инфекции ВЛКРС в перевиваемых линиях клеток с целью поддержания новых изолятов вируса в лабораторных условиях.

Научная новизна. Изучена чувствительность первичных и перевиваемых культур клеток различного происхождения к ВЛКРС и условия воспроизведения хронической инфекции в процессе их пассирования.

Дана сравнительная характеристика чувствительности первичных и перевиваемых культур клеток различного происхождения к ВЛКРС.

Установлено, что вирусом лейкоза крупного рогатого скота могут заражаться как эпителиоподобные, так и фибробластоподобные культуры клеток, полученные из различных органов и тканей различных видов животных.

Более стабильно хроническая инфекция ВЖРС! воспроизводится в процессе пассирования первичных культур клеток овечьего и бычьего происхождения.

Определены условия, при которых наиболее стабильно воспроизводится инфекция ВЛКРС в перевиваемых культурах клеток.

Практическая ценность. Результаты сравнительного изучения чувствительности первичных и перевиваемых культур клеток различного происхождения к ВЛКРС позволяют рекомендовать первичные культуры клеток из селезенки и легкого плода коровы и овцы в качестве индикаторных клеток для выявления ВЛКРС в биологических материалах в тесте синцитиеобразования.

Отработана методика воспроизведения ВЖРС инфекции на пер-'вичных культурах клеток, позволяющая поддерживать вновь выделенные изоляты ВЖРС в процессе субкультивирования клеток.

Поддержание вновь выделенных в различных регионах изолятов ВЛКРС в культурах клеток позволяет изучать их антигенные и биологические особенности, что имеет важное значение при разработке иммунологических методов диагностики и борьбы с этой инфекцией.

Разработка метода воспроизведения хронической инфекции ВЛКРС в культурах клеток может быть использована для получения новых перевиваемых линий клеток - продуцентов вируса и вирусных антигенов, в качестве дополнительных источников вируса и вирусных антигенов или для задену используемых в настоящее время линий клеток в случае их утраты или снижения их продуктивности.

По результатам выполненной работы на защиту выносятся следующие основные положения:

1. Сравнительная характеристика чувствительности первичных и перевиваемых культур клеток различного происхождения к ВЛКРС.

2. Выявление первичных и перевиваемых культур клеток, в которых вирус лейкоза индуцирует образование синцитиев для использования их в тесте синцитиеобразования.

3. Условия воспроизведения хронической инфекции ВЖРС в первичных и перевиваемых культурах клеток с целью поддержания вновь выделенных изолятов ВЛКРС в лабораторных условиях.

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на отчетных конференциях МГАВМиБ. (1993, 1994 гг.), на межкафедральном совещании МГАВМиБ С1996 г.) и заседаниях Ученого совета МГАВМиБ.

Публикации. По теме диссертации опубликована одна статья.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Работа выполнена в лаборатории гемобластозов и иммуномоду-ляторов Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина.

В работе использовали первичные культуры лейкоцитов инфицированных ВЖРС и больных лейкозом животных и первичные монослой-ные культуры.клеток почки эмбриона коровы (ПЭК), селезенки эмбриона коровы ССЭК), тимуса эмбриона коровы (ТЭК), легкого эмбриона коровы ДОК), бычьих тестикул (БТ), почки эмбриона овцы (ПЭО), селезенки эмбриона овцы (СЭО), легкого эмбриона овцы (ЛЭО), почки новорожденного кролика. СШК), селезенки новорожденного кролика (СНК), легкого новорожденного кролика (ЛНК) и фибро-бласты эмбрионов мышей (ФЭМ) и перевиваемые линии клеток ЛЭК, ТР, ВI С, М ВК, КСТ, СПЭ-В, полученные из коллекции ВИЭВ.

Лейкоциты выделяли из крови центрифугирование« после лизиса, эритроцитов с использованием метода гипотонического шока и культивировали в стационарных условиях в синтетических средах с добавлением 10 - 20% сыворотки крови животных и антибиотиков.

■Для получения первичных монослойных культур клеток из эмбрионов, коров, овец и кроликов стерильно извлекали органы и измельчали ножницами на кусочки размером I мм3 и засевали в матра^ сы Спо 0,5 мл густой суспензии на 0,5 литровый матрас) в питательной среде Игла с 10% сыворотки змбрионов коров и культивировали при 3?°С, периодически меняя питательную среду, до образования сплошного монослоя.

С поверхности стекла клетки снимали с помощью смеси растворов Версена С0,025%) и трипсина (0,25$) в соотношении 9:1, без-'центрифужным методом.

Жизнеспособность клеток определяли методом исключения красителя - трипанового синего путем подсчета количества живых и мертвых клеток. Для этого к 0,9 мл суспензии клеток добавляли ОД мл 0,4% раствора трипанового синего в фосфатном буфере при рН 7,4 и инкубировали 3-5 минут, после чего подсчитывали в

камере Горяева процент живых, неокрашенных клеток.

Для морфологических исследований первичные и перевиваемые культуры клеток выращивали на покровных стеклах в пеншдиллиновых флаконах, герметично закрытых резиновыми пробками. Через различные промежутки времени покровные стекла с прикрепившимися и про-лиферкрующими клетками промывали в безсывороточной среде, и фиксировали в метиловом спирте в течение 5-ти минут. Фиксированные клетки окрашивали по Романовскому - Гимза и заключали в бальзам на предметном стекле.

Продукцию ВЛКРС в культурах клеток определяли в тесте син- -цитиеобразования (ТСО) согласно "Методическим рекомендациям по определению'инфекционного бычьего лейкозного вируса методом синцитиеобразования" (Крикун В.А.,1980).' В качестве индикаторных клеток использовали монослойные культуры зпителиоподобньос клеток селезенки эмбриона коровы (СЭК) на уровне 1-го - 10-го пассажей или перевиваемую культуру кошачьих клеток СС81, выращенные на покровных стеклах в пенициллиновых флаконах. Через 5 дней культивирования зараженные и незараженные индикаторные клетки фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому - Гимза. Синцитием считали многоядерную клетку, содержащую не менее 5-ти ядер. Специфичность теста определяли с помопдео реакции нейтрализации вируса с использованием специфической сыворотки, содержащей антитела к гликопротеидному антигену ВЛКРС.

Продукцию антигенов ВЛКРС в культурах клеток определяли с помощью реакции иммунодиффузии в геле агара (РИД). Антиген для РЗД готовили путем 70-кратной концентрации культуральной жидкости зараженных культур клеток методом форсированного диализа против полиэтиленгликоля (ПЭГ - 6000). Титром антигена считали его последнее разведение, формирующее линию преципитации или способствующее загибу контрольной линии преципитации к лунке с испда,-туемым разведением антигена.

Статистическую обработку, полученных в экспериментах цифровых данных, проводили по Лакину Г.Ф. (1980).

Результаты исследования

Определение оптимальных условий выделения лейкоцитов и репликации ВЛКРС в лекоцитарных культурах. Интенсивность репликации ВЛКРС и продукции вирусных антигенов в краткосрочных культурах лейкоцитов зависит от многих фактов. Проведено сравнитель-

б

ное изучение влияния двух методов лизиса эритроцитов на жизнеспособность и вируспродуцирующую активность, выделяемых лейкоцитов крови в культурах ин витро. Результаты опытов показали, что разрушение эритроцитов в результате гипотонического шока под действием дистиллированной воды с последующим восстановлением изотоничности среды с помощью 1,7% раствора Nací и гемолиз, проведенный с помощью 0,85%-го раствора хлористого аммония не отличались по воздействию на жизнеспособность и функциональную активность вьщеляемых лейкоцитов. Однако, проведение гемолиза с помощью 0,85^-го раствора хлористого аммония требует меньших затрат труда и 1,5 раза снижает объемы центрифугирования по сравнению с проведением гемолиза с использованием HgO.

Влияние посевной концентрации и длительности культивировали; лейкоцитов на их жизнеспособность и продукцию вируса. Проведены исследования динамики сохранения жизнеспособности.клеток и продукции вируса в культурах лейкоцитов в зависимости от посевной концентрации и длительности культивирования клеток. Результаты исследований представленные в таблице I показывают, что лейкоцитарные культуры являются переживающими.

Таблица I Влияние посевной концентрации клеток на жизнеспособность и продукцию ВЛКРС в процессе культивирования

Ш> ;Посевная п/п:концен-:трация • клеток (в I мл)

В р е м :я 24 ч.

культивирования 48 ч. • 72 ч. I 96 ч.

% живых; ТСО :% живых|ТС0 • • »

t-

живых;ТС0 :% живых:ТСО

I. I хЮ6 82 14 79 16 68 10 32 3

2. 2,5хЮб 84 21 76 18 71 12 ' 44 4

3. 5 хЮ6 81 22 72 25 59 15 32 7

4. 7,5x10® 73 16 68 8 41 6 36 2

5. 10 хЮ6 68 14 54 4 39 2 33 3

- Количество синцитиев в препарате.

Через 96 часов культивирования процент живых клеток снижался примерно на 2/3. Увеличение посевной концентрации лейкоцитов

свыше 5x10 клеток в I мл также сопровождалось заметным снижением и жизнеспособности даже через 24 часа культивирования. В первую очередь разрушаются полиморфноядерные лейкоциты. После четвертых суток культивирования большая часть прикрепившихся к стеклу клеток приобретали веретеновидную и отросчатую формы. В более поздние сроки эти клетки начинали размножаться и к 15 - 20-ым суткам в некоторых культурах формировался монослой из фибробластоподобных клеток.

Продукция вируса в культурах лейкоцитов,ввделенных от инфицированных ВЛКРС животных, зависит как от сроков культивирования, так и от исходной концентрации клеток в культуре. Наиболее высокая продукция вируса наблюдалась в первые 24 - 48 часов культивирования. Оптимальная исходная концентрация лейкоцитов в культуре составляла 5x10^ клеток в I мл.

Влияние различных типов синтетических сред и сывороточного компонента питательной среды на репликацию ВЛКРС и продукцию вирусных антигенов в культурах лейкоцитов. Сыворотка крови является важным компонентом питательных сред, обеспечивающим культурой клеток гормональными и другими факторами, поддерживающими функциональную активность клеток. Проведено сравнительное изучение различных серий коммерческой сыворотки крупного рогатого скота,, сыворотки телят, эмбрионов коров и сыворотки овец. Опыты показали, что в подавляющем большинстве (в б-ти из 7-ми испытанных серий) коммерческие сыворотки крупного рогатого скота содержат антитела к гликопротеидному антигену ВЛКРС. В сыворотках эмбрионов коров и в овечьих сыворотках антитела не были обнаружены.

Приведенные в таблице № 2 данные опытов показывают, что по свойству поддерживать жизнеспособность клеток испытанные сыворотки отличаются незначительно. Наиболее' высокая продукция вируса и вирусных антигенов наблюдалась в культурах, выращенных на средах с использованием сыворотки эмбрионов коров. Вместе с тем сыворотка овец по своим культуральным свойствам практически не уступает эмбриональной сыворотке. Наличие в сыворотке даже следов антител к гликопротеидному антигену ВЛКРС резко угнетает продукцию вируса и вирусных антигенов.

Сравнительное изучение эффективности различных типов сред и их сочетаний при культивировании лейкоцитов больной лейкозом коровы СИгла, РПМИ 1640, ДМЕМ, 199, Игла + 199 (2:1) и Игла +

0,5% ГДА (2:1)) показало, что наиболее высокая продукция вируса и вирусных антигенов наблюдалась в культурах клеток, выращенных на экспериментальной питательной среде ДМЕМ.

Таблица 2

Влияние сывороток различного происхождения на продукцию вируса и вирусных антигенов в культурах лейкоцитов лейкозной коровы

№№ : \% жлвых п/п; Сыворотки :клеток I через : :72 часа Выявлено ВЛКРС в ТСО (количество синцитиев в препарате) Выявление антигенов

Л1 П24

I : 2 : 3 4 5 6

1. Крупного рогатого . скота

2. Крупного рогатого скота, содержащая следы антител к ГП антигену ВЛКРС

3. Телят

52*2,3 15,4±3,5

53*3,1 58*1,7

4. Эмбриональная крупного рогатого скота 61*2,1

5. Овец

62*2,3

3,2*2,1 24,3*4,7

38,5*2,7 37,6*2,3

+ +

+ ц

1:2 Ц

В тесте синцитиеобразования изучалась инфекционность на-тивных лейкоцитов, выделенных из крови животных с различной стадией инфекционного процесса (Таблица 3).

Приведенные в таблице данные показывают, что лимфоциты, выделенные из крови животных с гематологическими признаками заболевания лейкозом, продуцируют вирус более интенсивно, чем лимфоциты, вделенные от животных носителей только антител к ВЛКРС. Отмечалась прямая связь между титрами антител к антигенам ВЛКРС в сыворотках животных доноров и способностью выделенных лейкоцитов продуцировать вирус и вирусные антигены ин витро. Поэтому для повышения надежности выделения новых изолятов ВЛКРС. инфицированные лейкоциты целесообразно выделять из крови животных с клинико - гематологическими признаками заболевания лейкозом . или . из крови животных с высоким уровнем антител к антигенам ВЛКРС.

Таблица 3

Зависимость выделения ВЖРС от стадии инфекционного процесса и от концентрации лейкоцитов в культурах

m : п/п; Количество лейкоцитов ! Среднее количество синцитиев в 1-м препарате, ; индуцированное лимфоцитами, полученными от:

в инокуляте : Б1Д положительных : коров ; Гематологически ; положительных коров

I : 2 i з : 4

I. I х Ю6 16,4 i 4,3 56,3 ± 9,6

2. I х Ю5 4,1 i 3,6 15,7 ï 6,1

3. I х Ю4 0 . 3,4 ± 2,8

4. I х Ю3 0 0

5. I х Ю2 0 0

Для выявления инфицированности лейкоцитов ВЖРС в ТСОнет необходимости предварительного их культивирования. Для надежного выявления синцитиеобразования целесообразно испытуемые лейкоциты инкубировать с индикаторными клетками в течение 96 часов.

Для выделения и поддержания нового штамма вируса важно знать условия, при которых ВЖРС связанный с лиьфэцитами крови сохраняет инфекционные свойства. Исследования показали, что инфекционность ВЛКРС в лимфоцитах зависит от их жизнеспособности. Хранение суспензии лейкоцитов при 20°С сопровождается резким снижением инфекционное™ уже через 24 часа и через 48 часов не выявляется в ТСО. При хранении в условиях бытового холодильника (при 4°С) инфекционность ВЛКРС сохраняется до 72 часов. Замораживание при -14°С и оттаивание лимфоцитов сопровождается-резким снижением их жизнеспособности и утратой инфекционности связанного с ними ВЖРС уже через 24 часа хранения в морозильной камере. Замораживание.в жидком азоте с 20$ диметилсульфоксида обеспечивает сохранение жизнеспособности лейкоцитов и инфекционных свойств ВЛКРС примерно на одном уровне на протяжении 4 суток (срок наблюдений).

Чувствительность гомологичных и гетерологичных первичных культур клеток к ВЛКРС. Проведено изучение возможности использования первичных монослойных культур клеток, нашедших широкое применение в вирусологии, для поддержания и накопления ВЛКРС в лабораторных условиях. С этой целью изучалась чувствительность

первичных монослойных культур клеток тканей гомологичных и гете-рологичных видов животных и их субкультур к ВЛКРС. Культуры клеток готовили из лейкоцитов крови больной лейкозной коровы, из почек, селезенок, тимуса, легких эмбрионов коров, овец и кролика а также из эмбрионов мышей.

В монослойных культурах клеток, полученных из крови лейкоз-ного животного и в их субкультурах нам не удалось с помощью ТОО и РВД выявить инфекционный вирус и вирусные антигены. В процессе длительного культивирования и пассирования инфицированные ВЛКРС лимфоциты вытесняются, по нашему мнению, клетками стромального происхождения, не чувствительными к ВЛКРС.

Установлено, что ВЛКРС вызывает цитопатогенное действие, проявляющееся образованием многоядерных клеток - синцитиев практически во всех испытанных культурах, за исключением фиброблас-тов эмбрионов мышей (Таблица 4).

Таблица 4

Чувствительность монослойных культур клеток различного происхождения к ВЛКРС

Щ . п/п:

Монослойнне культуры клеток

Обозначение!

Источник

Образование синцитиев в одном препарате

I. ПЭК Почка эмбриона коровы +

2. СЭК Селезенка эмбриона коровы +++

3. ТЭК Тицус эмбриона коровы ++

4. лэк Легкое эмбриона коровы ++

5. ВТ Бычьи тестикулы +

6. пэо Почка эмбриона овцы ++

7. сэо Селезенка эмбриона овцы +++

8. лэо Легкое эмбриона овцы +++

9. пнк Почка новорожденного кролика +

10. снк Селезенка новорожденного кролика +

II. лнк Легкое новорожденного кролика ++

12. ФЭМ + ++ +++ Фибробласты эмбрионов мыши - от 1-го до 10-ти синцитиев - от 11-ти до 20-ти синцитиев - больше 20-ти синцитиев

Наибольшее число синцитиев наблюдалось в культурах клеток селезенки и легкого эмбрионов овцы и коровы, а наименьшее количество в культурах клеток органов новорожденного кролика.

При пассировании монослойных культур клеток, зараженных ВЛКРС, до третьего пассажа наблюдали интенсивное синцитиеобразо-вание. В последующих пассажах интенсивность синцитиеобразования резко снижалась. В зараженных культурах клеток наблюдалась слабая продукция антигенов ВЛКРС. При этом .гликопротеидный антиген выявлялся только до третьего пассажа. Полипептидный антиген накапливался культуральной жидкости в более высокой концентрации и обнаруживался с помощью РИД в культурах клеток ЛЭО до 12-го пассажа.

При дальнейшем пассировании клетки постепенно утрачивали способность размножаться, появлялись признаки дегенерации (зернистость, вакуоли в цитоплазме, сползание клеток с поверхности стекла) и между 15 и 25 пассажами все культуры были утрачены.

Изучение факторов, влияющих на чувствительность теста синцитиеобразования с использованием монослойных культур клеток тканей эмбрионов крупного рогатого скота и овец. На первом этапе изучали влияние препаратов способствующих проникновению вируса в клетки (ДЕАЕ - декстрана и полибрена) на синцитиеобразование, индуцированное инфицированными ВЛКРС лимфоцитами (Таблица 5).

Таблица 5

Влияние ДЕАЕ-Д и полибрена на синцитиеобразование

И*

п/п

Клетки ; Среднее количество синцитиев в одном препарате

мшени : с' обработкой ДЕАЕ-Д | без обработки _:_и полибреном_:_

1. СЭО 46,4 ± 5,3 18,2 ± 3,4

2. ЛЭО 58,7 ±4,1 26,8 ±5,1

Результаты опытов показали, что предварительная обработка клеток мишеней ДЕАЕ-декстраном в концентрации 40 мкг на I мл среды в течение 30 минут и внесение в питательную среду полибрена в концентрации 4 мкг на I мл среды повышает чувствительность ТСО примерно в 2 раза.

Субкультивирование чувствительных к ВЛКРС первичных культур клеток селезенки и легкого эмбриона овцы в первые 3-6 пассажей

сопровождается повышением чувствительности клеток к ВЛКРС, а затем ('после 10-го пассажа) чувствительность субкультур резко снижается.

Монослойные культуры клеток селезенки и легкого эмбрионов коров и овец являются наиболее чувствительными к ВЛКРС и могут быть использованы для поддержания ВЛКРС, выделенного с лейкоцитами из крови зараженных животных на протяжении нескольких пас-сажей(на клетках легкого эмбриона овцы до 10-ти пассажей). Эти же монослойные культуры можно использовать в качестве тест культур в ТСО для индикации инфекционного вируса лейкоза крупного рогатого скота. При этом следует отметить, что наибольшей чувствительностью к ВЛКРС обладают.,субкультуры клеток легкого эмбриона овцы до 5 - 7-го пассажей.

Изучение чувствительности перевиваемых линий клеток различного происхождения к ВЛКРС. В результате сокультивирования с инфицированными ВЛКРС лейкоцитами нам удалось воспроизвести инфекцию в перевиваемых линиях клеток ЛЭК, ТР, BI С, ЩЕК и КСТ. Перевиваемые клетки СПЭВ оказались устойчивыми к ВЛКРС. Наиболее активно вирус размножался в культурах клеток ЛЭК и МДВК. Однако, в процессе пассирования в зараженных культурах отмечалась четкая тенденция к снижению продукции вируса и вирусных антигенов.

Обработка перевиваемых культур клеток ДЕАЕ-декстраном в момент заражения ВЛКРС и последующее культивирование клеток в среде, содержащей подибрен повышало, уровень репликации ВЛКРС в этих культурах и обеспечивало поддержание хронической инфекции. ВЛКРС. В контрольных, необработанных препаратами культурах ре-^ пликация вируса прекращается на уровне 6 - Ю-го пассажей.

. : Наибольшая продукция вируса и более устойчивая инфекция наблюдалась в перевиваемых культурах клеток легкого эмбриона коровы.

Таким образом, использование, препаратов, способствующих проникновению вируса в клетки (ДЕАЕ-декстран и полибрен) позволило воспроизвести стойкую инфекцию ВЛКРС в перевиваемых линиях ЛЭК, МДВК и BI С, которая наблюдалась на протяжении 16-ти пассажей (срок наблюдения).

выводы

1. Для выделения больших объемов лейкоцитов инфицированных ВЛКРС с целью получения новых штаммов вируса целесообразно использовать метод лизиса эритроцитов в 0,35% растворе хлористого аммония.

2. Инфекционные свойства ВЛКРС, связанного с лимфоцитами находятся в прямой зависимости от жизнеспособности лимфоцитов и сохраняются в условиях благоприятных для сохранения живых лимфоцитов (заморозка в видком азоте в присутствии 10% диметидсульфоксида).

3. Наиболее высокий уровень инфекционного вируса накапливается в культурах лейкоцитов, выращиваемых на среде ДМЕМ с 20% сыворотки эмбрионов коров, через 48 часов после начала культивирования при юссеансй концентрации 5x10® клеток в 1 мл.

4. Сыворотка овец может быть использована для накопления ВЛКРС лейкоцитарных культурах вместо сыворотки эмбрионов коров.

5. Наличие следов антител в сыворотках, добавляемых в питатель-(ые среды резко снижает репликацию вируса в лейкоцитарных культурах.

6. Интенсивность репликации вируса лейкоза в культурах лейкоци-■03 зависит от стадии инфекционного процесса у донора лейкоцитов.

7. Монослойные культуры клеток селезенки и легкого эмбрионов :орсв и овец чувствительны к ВЛКРС, могут быть использованы для под-;еряания ВЛКРС инфекции на протяжении нескольких пассажей и в тесте инцитиеобразования в качестве тест культур для индикации этого ируса.

8 .'■ Наибоьшей чувствительностью к ВЛКРС обладают субкультуры леток легкого эмбриона овцы до 7-го пассама.

9. Препараты, способствующие проникновении вируса в клетки ДЕАЕ-декстран и полибрен) позволяют воспроизвести стойкую инфекцию новь выделенного штамма ВЛКРС в перевиваемых линиях клеток ЛЗК, ЦВК и.В1 С.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Изложенные в диссертационной работе результаты исследований >гут быть использованы в научно-исследовательских лабораториях для ¡деления, накопления и поддержания в лабораторных условиях новых 'аммов вируса лейкоза крупного рогатого скота с целью разработки лее эффективных методов иммунологической диагностики и специфичес-й профилактики лейкоза крупного рогатого скста.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Абел Мигел. Чувствительность гомологичных и гетерологичных перевиваемых культур клеток к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. // Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней животных: Сборник научных трудов /Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии, им. К.И. Скрябина, 1995. -С. 150-151

Размножено Юи экз. в Типографии "РОТЭКС", зак.284. к1ясницкая, 35.