Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Создание рекомбинантного аденовируса птиц CELO, экспрессирующего ген фибера вируса ССЯ-76

На правахрукописи

Капитонов Андрей Владимирович

СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АДЕНОВИРУСА ПТИЦ CELO, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕГО ГЕН ФИБЕРА ВИРУСА ССЯ-76

специальность 16. 00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре биологии, вирусологии и генной инженерии Московского Государственного Университета Прикладной Биотехнологиив и в лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Народицкий Б.С. (МГУПБ),

доктор ветеринарных наук, Субботин В.В. (МГУПБ),

доктор ветеринарных наук, Кузнецов Д.ЩВНИИГЩ г. Щелково)

Ведущая организация - ФГУ ВПО Московская академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. КЛ Скрябина

Защита диссертации состоится

¿¿¿Л 2004 г. в /И*

часов на заседании Диссертационного Совета Д.212.14903 при Московском государственном университете прикладной биотехнологии (109316 г.Москва, ул. Талалихина, д. 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарьДиссертационного

доктор ветеринарных наук, профессор [ лу^Л Смирнова И.Р.

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Серьезной проблемой современного промышленного птицеводства являются заболевания, протекающие без ярко выраженных клинических признаков. К такой группе относится заболевание, возбудителем которого является утиный аденовирус, поражающий кур-несушек мясных и мясояичных пород в возрасте 24-32 недели. Данный вирус вызывает широко распространенное латентное заболевание кур-несушек, сопровождающееся снижением яйценоскости на 15-40 % и размягчением скорлупы яиц, что наносит огромный экономический урон птицеводческим хозяйствам. Со времени подробного описания болезни синдрома снижения яйценоскости - ССЯ (EDS - Egg drop syndrome-76), сделанного Eck и др., и открытия самого вируса появились многочисленные сообщения о вспышках этой болезни во многих странах мира: Нидерландах, Северной Ирландии, Японии, Англии, Франции, Бельгии, Италии, США, Ираке и нашей стране. В настоящее время профилактика против данного вида заболевания осуществляется за счет применения комплекса санитарно-гигиенических мер, а также использования профилактических препаратов отечественного и зарубежного производства.

В настоящее время широко распространены вакцины, полученные традиционными методами (живые вакцины, инактивированные вакцины, субъединичные антигены и др.). Однако наиболее привлекательной для ученых всего мира является возможность получения живой генно-инженерной вакцины. Рекомбинантный вирусный либо бактериальный вектор, содержащий смысловой ген при введении в организм обеспечивает экспрессию необходимого количества антигена.

В качестве векторов для экспрессии генов в клетках млекопитающих in vivo и in vitro широко применяются- аденовирусы (Ад). Исследуется применение векторов на основе Ад человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин для ветеринарии. В последние годы были осуществлены попытки создания векторов на основе Ад животных, в частности, на базе генома аденовируса птиц 1 серотипа CELO. Данная векторная система представляется перспективной,

обеспечивает эффективную доставку генов в клетки птиц, которые являются для него пермиссивной системой, вирус не является патогенным для кур и не вызывает заболеваний при экспериментальном заражении. Важным достоинством CELO является его способность к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах, что позволяет осуществлять наращивание аденовируса в препаративных количествах.

Для практического применения вектора большое значение имеет высокая пакующая емкость генома CELO, а также возможность направленной модификации элементов капсида вируса для повышения тропности CELO по отношению к различным типам клеток.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание рекомбинантного вируса CELO, содержащего ген фибера вируса ССЯ-76 под контролем промотора цитомегаловируса человека и сигналом полиаденирования бычьего гормона роста, анализ экспрессии и антигенных свойств рекомбинантного белка, изучение гуморального иммунного ответа в организме лабораторных животных после введения им рекомбинантного вируса.

В процессе работы были поставлены следующие задачи:

1. Конструирование экспрессирующей плазмидной кассеты, несущей ген фибера ССЯ-76

2. Создание челночной плазмидной конструкции для получения вектора на основе аденовируса птиц CELO

3. Получение рекомбинантного аденовируса CELO-Фибер

4. Получение и характеристика очищенного белка фибера ССЯ-76

5. Разработка иммуноферментной системы детекции антигена фибера вируса ССЯ-76.

6. Анализ экспрессии рекомбинантного антигена вируса ССЯ-76 в аллантоисе куриных эмбрионов, зараженных вирусом CELO-Фибер

7. Определение уровня специфических антител к фиберу ССЯ-76 в

организме лабораторных животных при введении им рекомбинантного

вируса CELO-Фибер.

Научная новизна. В результате проведенной работы впервые получен рекомбинантный вирус CELO- Fiber.

Создан банк плазмид, содержащих ген фибера в различных прокариотических и эукариотических плазмидных векторах.

Впервые получен препарат белка фибера ССЯ-76, очищенный методом двухстадийной гидрофобной хроматографии, определена его молекулярная масса и локализация в полипептидном спектре вируса ССЯ-76.

Разработана иммуноферментная система детекции антигена фибера вируса ССЯ-76.

В ходе работы была показана эффективная экспрессия и функциональная активность гена фибера, встроенного в геном CELO.

Показана индукция синтеза специфических, антител в организме лабораторных животных при инъекции рекомбинантного аденовируса CELO-Фибер.

Практическая значимость. Работа представляет не только научный интерес, но и предполагает возможность использования полученного рекомбинантного аденовируса СЕШ-Фибер для профилактики синдрома снижения яйценоскости у кур. Кроме того, векторы на основе CELO могут быть использованы для создания живых- генно-инженерных вакцин для профилактики других инфекционных заболеваний птиц.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, глав: «Обзор литературы» (55 стр.), «Материалы и методы» (20

стр.), «Результаты» (31 стр.), «Обсуждение результатов» (15 стр.), выводов и списка литературы, включающего 121 библиографическую ссылку. Работа изложена на 119 машинописных страницах, включая 2 таблицы и 15 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Работа была проведена в лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Выражаю благодарность в.н.с, к.б.н. Верховской Л.В.за консультацию и помощь в проведении исследований. 1. Материалы и методы исследования.

В экспериментальной части работы использованы аденовирус птиц ССЯ-76, CELO штамм FELPS (полученный от д-ра А. Ван Дер Эба, лаборатория физиологической химии Лейденского университета), вирус CELO-IL2 (любезно предоставленный к.б.н. Череновой Л.В.).

Для наращивания рекомбинантных плазмид использован лабораторный штамм Escherichia coli DH5a

В работе использовалась клеточная линия: LMH (leghorn male hepatoma) предоставленная доктором М. Коттен (Австрия).

Для биологических экспериментов использованы мыши линий Balb/C, самки, возрастом 4-6 недель.

В работе' использовались стандартные плазмидные векторы pBssK+ ("Fermentas"); pcDNA3.1("Invitrogen"); вектор для клонирования ГЩР-фрагментов pGEM-T("Promega"). Плазмида pCBEARV любезно предоставлена Логуновым Д.Ю., плазмида рЕАХ любезно предоставлена Шмаровым М.М.

Синтез дезоксиолигонуклеотидов проведен ЗАО «СИНТОЛ».

Трансфекцию клеточных линий проводили методом-, кальций-фосфатной преципитации (Graham & van der Eb, 1973). Все манипуляции, связанные с получением рекомбинантных аденовирусов проводили согласно Graham & Prevec (1991): Все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методикам, изложенным в Maniatis et al. (1982)..

Аденовирусы птиц CELO накапливали в куриных эмбрионах (Laver et al. 1971).

Детекцию экспрессируемого белка проводили методом электрофореза в ПААГ-ДСН в буферной системе Laemmli (1970) с последующим иммуноблотингом.

2. Результаты и их обсуждение.

2.1. Конструирование рекомбинантного аденовируса на основе

генома CELO

Конструирование рекомбинантного аденовируса CELO-Фибер проводилось методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток LMH.

Для создания рекомбинантного вируса необходимо было выделить ген фибера из генома вируса ССЯ-76 . Ген фибера был получен методом полимеразной цепной реакции с праймеров F1 и F4 (F1: 5' — TGT-TAC-AGA-TGA-AGC-GAC-TAC-GG, F4: 5' — CAA-AGT-CTA-CTG-TGC-TCC-ААС), в качестве матрицы использована геномная ДНК ССЯ-76 . Полученный ген был клонирован в прокариотическую плазмидную векторную систему pGEM-T.

Для получения гена фибера в составе экспрессирующей кассеты нами была сконструирована плазмида, несущая ген фибера под контролем эукариотического промотора цитомегаловируса и сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста. В качестве вектора была использована плазмида pCDNA3.1Zeo+. Фрагмент, содержащий полноразмерный ген фибера, был вырезан из плазмиды pGEM/Fib и лигирован в вектор pCDNA3.1Zeo+.

Полученная экспрессирующая кассета, состоящая из промотора, целевого гена и сигнала полиаденилирования, была переклонирована из эукариотического вектора в плазмиду, содержащую правый фрагмент генома

CELO от 88,8 до 100 ед. карты (кассета была вставлена в область делеции генома CELO от 95,3 до 99,7 ед карты). Таким образом, получена плазмидная конструкция pCBEARV/Fib, несущая ген фибера вируса ССЯ-76 в составе фрагмента генома аденовируса птиц CELO.

Полученной плазмидной конструкцией pCBEdlRV/Fib, совместно с ДНК вируса CELO, гидролизованной по эндонуклеазе рестрикции Swal, котрансфецировали клетки LMH методом кальций - фосфатной преципитации. Инфекционность. вирусного генома- восстанавливалась в результате гомологичной рекомбинации между комплементарными последовательностями плазмидной и вирусной ДНК. Результатом рекомбинации являлось включение экзогенной последовательности в область делеции «несущественного» для репликации участка генома

Рис 1: Схема гомологичной рекомбинации для получения рекомбинантного вируса CELO-Фибер

Рекомбинантныи аденовирус CELO-Fiber

В полученном нами вирусе CELO-Фибер делегирован EcoRV фрагмент размером 1954 пар оснований (41738 - 43684 п.о.) [Д.Ю. Логунов и dp. In vitro и in vivo доставка гена секретируемой плацентарной щелочной фосфатазы (SEAP) в составе рекомбинантного аденовируса птиц CELO.// Мол. Ген. Микробиол. Виру сол. 2002, v.- 4, рр.34-9.][М.М. Шмаров и др. Эукариотические векторы на основе генома аденовируса птиц CELO, несущие гены GFPи 1L-2 человека. //Молекулярная генетика микробиология и вирусология, 2002, v.~2, рр.30-35.] и в сайт делеции встроена экспрессирующая кассета (CMV-промотор, целевой ген Fiber и сигнал полиаденилирования).

Рис2:Структура генома рекомбинантного аденовируса CELO-Фибер.

CMV- промотор ранней области цитомегаловируса человека; рА — сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота;

Fiber-ген фибера вируса ССЯ-76; ex.— единицы карты.

Fibl-сайт посадки праймераFibl(S'-GGAGGCATTGGGATCGTCTCG); СВЕ5- сайт посадки праймера СВЕ5(5-AAGTGCTACTACTTTTCGGAGTC);

СВЕ1 - сайт посадки праймера СВЕ1 (5'- TGTGCTGATAACAGATGCCG); СВЕЗ - сайт возможной посадки праймера СВЕЗ (5'-GGATGACATTTCGGCTATC) на геноме "дикого типа" CELO

Для устранения возможной контаминации препаратов CELO-Фибер

вирусом CELO "дикого типа" проведена очистка методом повторного

получения индивидуальных аденовирусных бляшек на культуре клеток LMH.

Чистоту препарата вируса CELO-Фибер анализировали, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для детекции ДНК рекомбинантного вируса использовали праймеры: Fibl, специфичный к гену фибера и СВЕР5, специфичный к последовательности CELO (98,5 ед. карты). Для анализа на наличие ДНК вируса CELO "дикого типа" использовали праймер СВЕР1 (95,0 ед. карты) и праймер СВЕРЗ (96,2 ед. карты), с сайтом посадки внутри делегированной области. Детекцию результатов ПЦР проводили методом электрофореза в 0,8% агарозном геле/ На рис.3 очевиден положительный результат в пробах, проанализированных на наличие ДНК рекомбинантного вируса CELO-Фибер и отрицательный результат на присутствие ДНК вируса дикого типа в этих же пробах: (Амплификация фрагмента ДНК размером 759 п.о. в присутствии праймеров Fibl и СВЕР5 происходит при наличии в пробе ДНК рекомбинантного аденовируса CELO-Фибер, а фрагмент 520 - п.о. синтезируется в присутствии праймеров СВЕР1 и СВЕРЗ при наличии в пробе ДНК вируса CELO дикого типа.)

РисЗ: Электрофореграмма ПЦР анализа очищенных препаратов генома рекомбинантных вирусов

Рекомбинант "Дикий тип" CELO

I I I I

К-К- 1 2 3 4 К+К- К- 1 2 3 4 К+М

К~ отрицательный контроль системы и незараженные клетки 1,2,3,4- пробы ДНК, выделенной из зараженных вирусом CELO-Фибер клеток

АН- положительный контролъ(плазмидаpCBEdlRV/Fib в случае -рекомбинанта и ДНК CELO "дикого типа ") М-маркер молекулярного веса

Аденовирус птиц CELO способен размножаться в куриных эмбрионах. При этом количество вируса, которое можно выделить из аллантоиса эмбрионов составляет до 1012 физических частиц вируса из одного эмбриона [М.М. Шмаров и др. Эукариотические векторы на основе генома аденовируса птиц CELO, несущие гены GFP и IL-2 человека. //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2002, v.-2, pp.30-35.].

Доза заражения аденовирусом CELO-Фибер составляла 107 БОЕ/эмбрион. Были использованы 9-ти дневные куриные эмбрионы. Инкубацию проводили в течение 2-х суток после заражения, затем эмбрионы охлаждали на +4 ОС в течение 10 часов. Отобранный аллантоис очищали и концентрировали- по методу Green [Green K.Y., Wold W.S.M. Human adenoviruses: growth, purification andtransfection assay.//Methods Enzymology 1980v.-80,pp.425-431].

Титр вируса определяли методом бляшкообразования в культуре клеток

LMH.

Оптическая плотность полученного препарата составила 11,6 ОЕ/мл, а титр 1-5-1010 БОЕ/мл.

2.2. Разработка иммуноферментной системы детекции фибера ССЯ-76

Следующей задачей нашей работы являлось определение рекомбинантного белкового продукта, гена, фибера, встроенного в полученный вектор, однако коммерческой тест-ситемы для определения данного антигена не существует. Поэтому перед нами встала задача разработки иммуноферментной системы детекции фибера ССЯ-76. Для этого, прежде всего, необходимо было выделить и очистить белок фибера. Для очистки капсидных белков ССЯ-76 были использованы условия селективности аденовирусных белков из более кислых растворов (рН 4—5) в -условиях гидрофобной хроматографии. [Иванов А.Е., Верховская Л.В., Хилько С.Н., Зубов В.П.: "Твердокаркасные широкопористые сорбенты для

гидрофобной хроматографии белков"; биоорганическая химия, т 16, №8, 1990]

В качестве материала мы использовали фракцию- растворимых вирусных белков аллантоисной жидкости утиных эмбрионов, зараженных ССЯ-76. Вирионы ССЯ-16, содержащиеся в используемой аллантоисной жидкости предварительно были осаждены методом

ультрацентрифугирования на подушку CsCl. Для получения очищенного вирусного антигена применяли метод хроматографической очистки на гидрофобном сорбенте Phenyl Toyopearl - 650 М в ступенчатом градиенте рН.

Для препаративной очистки фибера ССЯ-76 на Phenyl Toyopearl -650М использована вышеописанная схема хроматографии со следующими модификациями: исходную алантоисную жидкость наносили в 50 мМ ацетатом калия при рН 4,0; несвязанные белки элюировали буфером рН 5,5; а для элюции антигенов использовали карбонатный буфер (рН 8,0); содержащий 20% изопропанола (Таб. 1). Фибер ССЯ-76 полностью сорбировался при нанесении аллантоисной жидкости на Phenyl Toyopearl -650 М и полностью элюировался во фракции Е-1.

Таб.1:

Очистка фибера ССЯ-76 на колонке с гидрофобным сорбентом Phenyl Toyopearl - 650 М

Фракция Состав буфера Количество белка (mg)

Аллантоис исходный 40мМ К-Ас рН 4,0 1900

Е - 0 (несорбированные примеси) 40мМ К-Ае рН 4,0 1350

Е-01 (сорбированные примеси) 10тМК-АсрН 5,5 100

Е-1 (элюат - очищенный белок фибера) 10mM K-Carb рН 8,0 + 20% изопропанол 420

В результате проведенной хроматографии были получены три фракции: Е-0, Е-01, Е-1. Наличие белков во фракциях детектировано спектрофотометрически по поглощению при 280 нм (рис. 4):

Рис. 4: Денситограмма этапов гидрофобной хроматографической очистки фибера ССЯ- 76 из аллантоисной жидкости.

А — нанесение подкисленной аллантоисной жидкостирН4,0;

В - десорбция примесей буферомрН5,5;

С-элюция очищенного белка буфером рН 8,0 с 20% изопропанола.

Е-0, Е-01, Е-1 - белковые фракции; заштрихованный пик очищенного фибера.

Анализ белкового состава полученных фракций проводилась методом электрофореза в 10% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по методике Laemmli. [Laemmli U.K.// Nature.-1970-Vol. 227-P. 680-685.] Для анализа конформационной (олигомерной) структуры полученного белка и определения его мономерного полипептида препарат обрабатывали в денатурирующих (+) и неденатурирующих (-) условиях.

Рис 5: Анализ фракций хроматографической очистки фибера ССЯ-76методом электрофореза в ПААГ-ДСН.

ССЯ-76 vi ал л. исх. Е-0 Е-01 Е-1

+ . + ♦ . + . ♦

Электрофореграмма,окраска серебром:

+ - денатурирующие условия;

- - неденатурирующие условия;

EDS vi- вирионы ССЯ-76;

Алл. исх. - исходный аллантоис;

Е-0, Е-01, Е'1 - белковые фракции;

F1 - зона мономера фибера;

F3 - зона тримера фибера.

По данным электрофореза видно, что большая часть примесных белков аллантоиса, зараженного ССЯ-76, не сорбируется а остается во фракции Е-0 несорбированных белков. Фракция белков элюируемая буфером 10mМ К-Ас рН 5,5 (Е-01) представлена низкомолекулярными белками. Очищенный белок фибера элюируется во фракции Е-1.

После данной хроматографической очистки фибер сохраняет нативную (олигомерную) структуру (Е-1 минус), соответственно он должен обладать биологическими свойствами, которыми обладает белок фибера, находящийся в составе вириона. Одним из таких свойств является способность фибера гемагтлютинировать эритроциты птиц. Данное свойство было использовано

для идентификации очищенного белка как фибера ССЯ при анализе стабильности его нативной структуры в процессе очистки.

Гемагглютинирующие свойства белка фибера в очищенной фракции Е-1 были исследованы в реакции гемагглютинации с эритроцитами перепелов. Постановка реакции была проведена на микропланшетах ("NUNC"). Для работы с очищенным белком фракцию Е-1 предварительно подвергли диализу против PBS рН 8,0 в течение 24 часов для удаления изопропанола.

Гемагглютинирующая активность полученного очищенного белка была детектирована в разведении 1:128, что аналогично гемагглютинирующей активности препарата очищенного вируса.

Поскольку очищенный фибер вируса ССЯ-76 был получен впервые, необходимо было исследовать его физико-химические свойства. По электрофоретической подвижности мономерной формы полученного белка определена его молекулярная масса и положение в составе белков вириона (Рис. 6) Молекулярная масса по электрофоретической подвижности белка составила 66 кДа.

Рис 6: Определение локализации мономера белка фибера среди полипептидного спектра белков вир иона ССЯ- 76

12 3 4

1 - фракция белка фибера в денатурирующихусловиях

2 - фракция белка фибера в недеиатурируюшихусловиях

3 - очищенный препарат вируса ССЯ- 76 в денатурируюшихусловиях 4- очищенный препарат вируса ССЯ- 76 в денатурируюшихусловиях Ф1 - мономерная форма белка фибера

ФЗ - тримерная форма белка фибера

Для иммуноферментной системы детекции антигена были получены антитела специфичные к фиберу ССЯ-76. Полученная гипериммунная сыворотка к очищенному белку фибера ССЯ-76 была получена в результате трехкратной иммунизации группы мышей линии БЛЬБ/е по стандартной схеме с использованием полного и неполного адъюванта Фрейда. Параллельно группу мышей иммунизировали очищенным вирусом. Кровь отбирали на 10-й день после последней иммунизации.

Уровень специфических антител в полученных препаратах гипериммунной сыворотки определяли в реакциях: ИФА, РН и РТГА. Специфичность полученной сыворотки анализировали методом иммуноблотинга.

Для определения специфических антител в сыворотке крови мышей был разработан вариант непрямого твердофазного гетерогенного иммуноферментного анализа на полистирольных микропланшетах (НИИМП, Москва). В качестве - антигена для сорбции микропланшета использовали препарат очищенных вирионов ССЯ-76 с оптической плотностью 22 ОЕ/мл в разведении 1:500. Сыворотки титровали методом двукратных разведений начиная с 1:100 на PBS-буфере с 0,05% TWIN20. Антивидовой коньюгат (RabJ-IgG mouse меченые пероксидазой) добавляли по 100 мкл в рабочем разведении. В качестве субстрат-индикаторной смеси использовали'0,05% ортофенилендиамин и 0,02% Н2О2 на 0,05 М ацетатном буфере рН 5,0. После остановки реакции оптическое поглощение (ОП) окрашенного продукта пероксидазной реакции определяли на 8-канальном фотометре - Multiscan MCC ("Flow", Англия) при 492 нм. За титр антител считали последнее разведение, в котором образца в 4 раза превышало в

отрицательном контроле (предиммуная сыворотка мышей).

Титр антител в ИФА составлял 1:6400 в группе иммунизированной очищенным вирусом и 1:3200 в группе иммунизированной - полученным белком. Титр свидетельствует о высокой иммуногенной' активности очищенного белка.

Как известно фибер индуцирует синтез вируснейтрализуюших антител. Для определения титра вируснейтрализуюших антител была поставлена реакция нейтрализации на первичнотрипсинизированой культуре, клеток почки 5-дневного цыпленка методом двукратных разведений сыворотки с постоянным рабочим разведением вируса ССЯ-76.

Титры вируснейтрализующих антител в реакции вируснейтрализации, были детектированы в следующих разведениях: 1:128 - при иммунизации

вирусом и 1:64 - при иммунизации очищенным фибером..Эти данные коррелируют с данными, полученными, на - других аденовирусах - ответ вируснейтрализующих антител на очищенный фибер несколько ниже, чем на инъекцию цельного вириона [Jason Call "Ad5/7 capsid. chimera: Fiber replacement alters receptor tropism without affective chimeri VN epitopes", journal Virorogy 1996, p. 2116-2123].

Способность полученной сыворотки ингибировать агглютинацию эритроцитов вирусом продемонстрирована, в реакции торможения гемагглютинации на эритроцитах петуха. В качестве гемагглютинина использовался препарат очищеный фибер в рабочем разведении (1/128).

По данным РТГА способность к торможению гемагпотинации больше выражена у сыворотки, полученной от иммунизации очищенным фибером, и детектируется в разведении 1/128. Сыворотка от иммунизации вирионом ингибирует гемагглютинацию в разведении 1/64, что определяется более низким содержанием фибера в составе вириона, чем в очищенной фракции антигена.

Специфичность полученной сыворотки анализировали методом иммуноблоттинга(рис. 7). -

Рис.7: Анализ специфичности. IgG — антител в сыворотке, полученной к фиберу ССЯ- 76.

CCSvi - полипептидный состав вириона ССЯ-76 (окраска на общий белок);

Anti~F3 - взаимодействие антител сыворотки против очищенного фибера с белками вириона;

Anti-CCЯvi — взаимодействие антител сыворотки против очищенного вируса с белками вириона;

+ — денатурирующиеусловия; — неденатурирующиеусловия;

F1 - зона мономера фибера;

F3—зона тримера фибера;

Hex 1 - зона мономера гексона;

Hex 3 - зона тримера гексона.

По иммунореплике видно, что антитела против белка фибера

детектируют тримерную и мономерную форму фибера ССЯ-76 в составе вирусных белков, а антитела, полученные против очищенных вирионов ССЯ-76 способны реагировать с тримерными формами белков фибера и гексона вируса ССЯ-76 и незначительно с мономерной формой фибера. Это свидетельствует о наличии в составе- фибера ССЯ-76 не только конформационных антигенных детерминант но и линейных, что делает возможным детекцию экспрессии рекомбинантного мономерного полипептида.

2.3. Экспрессия фибера ССЯ-76 рекомбинантным аденовирусом CELO-Фибер.

Используя разработанную иммуноферментную систему детекции, мы анализировали экспрессию рекомбинантного белка фибера ССЯ-76 в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженных рекомбинантным аденовирусом CELO-Фибер, методом Western blotting.

На рисунке 8 представлена иммунореплика детекции экспрессии рекомбинантного антигена.

Рис 8. Анализ экспрессии фибера ССЯ- 76 в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженныхрекомбинантным вирусом CELO-ФиберИммунореплика Western blotting, окраска спомощьюECL.

Фибер ССЯ-76 - положительный контроль (очищенный препарат фибераССЯ- 76)

СЕЬ0-1Ь-2 - отрицательный контроль (аллантоис куриных эмбрионов, зараженных рекомбинантным вирусом, несущим ген интерлекина 2)

СБЬО-ПЬвг - исследуемый образец (аллантоис куриных эмбрионов, зараженныхрекомбинантным вирусом, несущим ген фибера ССЯ- 76)

Очевидно, что специфическая сыворотка к нативному очищенному фиберу вируса ССЯ-76 взаимодействует с рекомбинантным белком. Рекомбинантный белок по своим антигенным свойствам и молекулярному весу соответствует белку фибера вируса ССЯ-76. Полученные данные свидетельствуют об антигенной активности рекомбинантного белка фибера находящимся в составе рекомбинантного вируса СЕЬО-Фибер.

2.4. Исследование гуморального иммунного ответа в организме лабораторных животных после инъекции рекомбинантного вируса CELO-Фибер

Уровень специфических антител при введение рекомбинантного вируса лабораторным животным был определен в реакции непрямого иммуно-ферментного анализа спустя 10(светлые столбцы) и 20(темные столбцы) дней после инъекции (Рис.9).

Рис 9. Индукция гуморального иммунного ответа на введение рекомбинантного аденовируса СЕLO-Фибер

CELO-SEAP ССЯ-76 CELO-Flber

Таким образом, представленные на диаграмме титр антител, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности вируса CELO-Фибер и его способности стимулировать выработку антител против фибера ССЯ-76 при 1-кратной инъекции. Антитела, образующиеся в результате инъекции вируса CELO-SEAP связываются с антигеном в данной реакции на уровне неспецифического взаимодействия.

Таким образом, можно предположить, что созданный нами рекомбинантный аденовирус CELO-Фибер, после проведения дополнительных исследований найдет применение в ветеринарии в качестве вакцины против ССЯ-76.

Современная вакцинация против ССЯ-76 способна обеспечивает

защиту птиц от болезни, предотвратить фазу виремии, связанную с ней экскрецию вируса, улучшить яйценоскость и качество скорлупы. Однако, существующие инактивированные вакцины имеют ряд недостатков. В случае недостаточной инактивации вируссодержащего материала возможно сохранение остаточной вирулентности. В случае чрезмерной инактивации возможно изменение антигенных эпитопов и, как следствие, снижение иммуногенности вакцины. Кроме того, существующие инактиванты обладают пирогенной активностью и способны вызывать аллергические реакции.

Таким образом, существует необходимость создания вакцины, обеспечивающей надежную защиту от ССЯ-76 и являющейся безопасной для птицы. Одно из направлений современной науки - разработка ДНК вакцин. Наиболее привлекательной для ученых является возможность получения живой генно-инженерной вакцины. Рекомбинантный вирусный вектор, содержащий смысловой ген, при введении в организм, обеспечивает экспрессию требуемого количества антигена. Именно это направление разрабатывается в наших исследованиях.

Безусловно, в перспективе, является необходимым проведение исследований по изучению гуморального иммунного ответа в организме кур на введение рекомбинантного аденовируса СЕЬО-Фибер. Результаты исследования помогут точно оценить перспективы использования данного вируса в качестве вакцины против ССЯ-76 в ветеринарии.

выводы.

1. Впервые сконструирован рекомбинантный аденовирус птиц CELO, экспрессирующий ген белка фибера вируса ССЯ-76. Показана экспрессия белка фибера ССЯ-76 в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженных рекомбинантнтным вирусом CELO-Фибер.

2. Отработаны условия получения рекомбинантного вируса CELO-Фибер в куриных эмбрионах в препаративных количествах и технология очистки вирусной суспензии (титр очищенного препарата рекомбинантного вируса CELO-Фибер- 1-5-101СШЕ/мл)

3. Впервые выделен в препаративных количествах и очищен белок фибера вируса ССЯ-76. Определена молекулярная масса белка и идентифицировано его положение в электрофоретическом спектре белков вируса ССЯ-76

4. Разработана иммуноферментная система детекции антигена фибера вируса ССЯ-76

5. Показано наличие специфических антител к белку фибера ССЯ-76 в сыворотке крови лабораторных животных (мыши линии Balb/c) иммунизированных рекомбинантным вирусом CELO-Фибер. Титр антител при однократной инъекции составил 1:1600 -1:3200

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Шмаров М. М., Л. В. Черенова, Е. В. Шашкова, Д. Ю. Логунов, Л. В. Верховская, А. В. Капитонов, Г.Л. Неугодова, К.К. Доронин, Б. С. Народицкий. "Эукариотические векторы на основе генома аденовируса птиц CELO, несущие гены GFP и IL-2 человека". Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. 2002;(2):30-5

2. Уласов И. В., Верховская Л. В., А. В. Капитонов, Б. С. Народицкий "Исследование индукции иммунного ответа у лабораторных животных наведение им рекомбинантных ДНК, содержащих ген фибера вируса ССЯ-76 (генетическая иммунизация)". Вторая международная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», ВНИИСБ, 2000

3. Капитонов А. В. , Л. В. Верховская, И. В. Уласов, Б. С. Народицкий "Получение идентификация и иммунохимические свойства отростка пентона аденовируса птиц ССЯ-76" Вторая * международная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», ВНИИСБ, 2000

4. Капитонов А. В., И. В. Уласов, Л. В. Верховская, М. М. Шмаров, Б. С. Народицкий:"Получение исследование иммуногенных свойств ДНК - вакцины против синдрома снижения яйценоскости кур (ССЯ-76)" Материалы четвертой научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек» М.:МГУПБ, 2001, с. 348

5. Капитонов А. В. , Л. В. Верховская, Б. С. Народицкий:"Создание рекомбинантных плазмид, несущих гены гексона ифибера вируса ССЯ-76, и вирусных векторов для генетической вакцинации" Материалы пятой научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек» М.:МГУПБ, 2003, с. 254-255

Формат 60x90/16

Бум. тип. Тираж 100 экз. Зак. № 95

ООО «Полиграфсервис» 109316 Москва, ул. Талалихина, 26

V 12 7 5 О

Актуальность проблемы.

Серьезной проблемой современного промышленного птицеводства являются заболевания, протекающие без ярко выраженных клинических признаков. К такой группе относится заболевание, возбудителем которого является утиный аденовирус, поражающий кур-несушек мясных и мясояичных пород в возрасте 24-32 недели. Данный вирус вызывает широко распространенное латентное заболевание кур-несушек, сопровождающееся снижением яйценоскости на 15-40 % и размягчением скорлупы яиц, что наносит огромный экономический урон птицеводческим хозяйствам. Со времени подробного описания болезни синдрома снижения яйценоскости - ССЯ (EDS - Egg drop syndrome-76), сделанного Eck и др., и открытия самого вируса появились многочисленные сообщения о вспышках этой болезни во многих странах мира: Нидерландах, Северной Ирландии, Японии, Англии, Франции, Бельгии, Италии, США, Ираке и нашей стране. В настоящее время профилактика против данного вида заболевания осуществляется за счет применения комплекса санитарно-гигиенических мер, а также использования специфических препаратов отечественного и зарубежного производства.

Для профилактики различных инфекционных заболеваний в ветеринарии используется вакцинация. В настоящее время широко распространены вакцины, полученные традиционными методами (живые вакцины, инактивированные вакцины, субъединичные антигены и др.). Однако наиболее привлекательной для ученых всего мира является возможность получения живой генно-инженерной вакцины. Рекомбинантный вирусный либо бактериальный вектор, содержащий смысловой ген, который при введении в организм обеспечивает экспрессию большого количества протективного антигена.

В настоящее время в качестве векторов для экспрессии генов в клетках млекопитающих in vivo и in vitro широко применяются аденовирусы (Ад) . Исследуется применение векторов на основе Ад человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин против для ветеринарии. В последние годы были осуществлены попытки создания векторов на основе Ад животных, в частности, на базе генома аденовируса птиц 1 серотипа CELO. Данная векторная система представляется перспективной, поскольку вирус CELO обеспечивает эффективную доставку генов в клетки птиц, которые являются для него пермиссивной системой, не является патогенным для кур и не вызывает заболеваний при экспериментальном заражении. Важным достоинством CELO является его способность к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах, что позволяет осуществлять технологичное наращивание аденовируса в препаративных количествах.

Для практического применения вектора большое значение имеет высокая пакующая емкость генома CELO, а также возможность направленной модификации элементов капсида вируса для повышения тропности CELO по отношению к различным типам клеток.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось создание рекомбинантного вируса CELO, содержащего ген фибера вируса ССЯ-7 6 под контролем CMV-промотора, анализ экспрессии и антигенных свойств рекомбинантного белка, изучение гуморального иммунного ответа в организме лабораторных животных после введения им рекомбинантного вируса.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Конструирование экспрессирующей плазмидной кассеты, несущей ген фибера ССЯ-7 6

2. Создание челночной плазмидной конструкции для получения вектора на основе аденовируса птиц CELO

3. Получение рекомбинантного аденовируса CELO-Фибер

4. Получение и характеристика очищенного белка фибера ССЯ-7 6

5. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антигена фибера вируса ССЯ-7 6.

6. Детекция рекомбинантного антигена вируса ССЯ-7 6 в аллантоисе куриных эмбрионов, зараженных вирусом CELO-Фибер

7. Определение уровня специфических антител к фиберу ССЯ-7 6 в организме лабораторных животных при введении им рекомбинантного вируса CELO-Фибер.

Научная новизна и практическая значимость.

В результате проведенной работы впервые получен рекомбинантный вирус CELO-Фибер.

Создан банк плазмид, содержащих ген фибера в различных прокариотических и эукариотических плазмидных векторах.

Впервые получен препарат белка фибера ССЯ-7 6, очищенный методом двухстадийной гидрофобной хроматографии, определена его молекулярная масса и локализация в полипептидном спектре вируса ССЯ-7 6.

Впервые разработана иммуноферментная тест-система для определения антигена фибера вируса ССЯ-7 6.

В ходе работы была показана эффективная экспрессия и функциональная активность гена фибера, встроенного в геном CELO.

Показана способность рекомбинантного аденовируса CELO-Фибер индуцировать гуморальный иммунный ответ на экспрессируемый ген белка фибера

Работа представляет не только научный интерес, но и предполагает использование полученного рекомбинантного аденовируса CELO-Фибер для профилактики синдрома снижения яйценоскости у кур. Кроме того, векторы на основе CELO могут быть использованы для создания живых генно-инженерных вакцин для профилактики других инфекционных заболеваний птиц.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

7.7. Синдром снижения яйценоскости кур (ССЯ-76)

выводы

1.Впервые сконструирован рекомбинантный аденовирус птиц CELO, экспрессирующий ген белка фибера вируса ССЯ-7 6. Показана экспрессия белка фибера ССЯ-76 в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженных рекомбинантнтным вирусом CELO-Фибер.

2.Отработаны условия получения рекомбинантного вируса CELO-Фибер в куриных эмбрионах в препаративных количествах и технология очистки вирусной суспензии (титр очищенного препарата рекомбинантного вируса CELO-Фибер - 1-5-Ю10БОЕ/мл)

3. Впервые выделен в препаративных количествах и очищен белок фибера вируса ССЯ-7 6. Определена молекулярная масса белка и идентифицировано его положение в электрофоретическом спектре белков вируса ССЯ-76

4. Разработана иммуноферментная система детекции антигена фибера вируса ССЯ-7 6

5. Показано наличие специфических антител к белку фибера ССЯ-76 в сыворотке крови лабораторных животных (мыши линии Balb/c) иммунизированных рекомбинантным вирусом CELO-Фибер. Титр антител при однократной инъекции составил 1:1600 - 1:3200