Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Совершенствование методов дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота

На правах рукописи

Латыпов Фарид Рауфович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ТУБЕРКУЛИНОВЫХ РЕАКЦИЙ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

003447667

Нижний Новгород - 2008

003447667

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана»

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор Сафин Марат Абдрахманович

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор кандидат ветеринарных наук

Молев Аркадий Иванович Мякин Николай Александрович

Ведущая организация: ВНИВИ (г. Казань) ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных.

диссертационного совета , , А (Нижегородская

государственная сельскохозяйственная академия» (603107, г. Новгород, проспект Гагарина, д. 97).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НГСХА (603107, г.Н. Новгород, проспект Гагарина, д. 97). Автореферат опубликован на официальном сайте ФГОУ ВПО НГСХА www. agri.sci-nnov.m «/5» Q9 2008

Автореферат разослан « ggWt^A 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Защита состоится

ч. на заседании

кандидат ветеринарных наук, доцент

А В. Пашкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из ближайших и важнейших задач

ветеринарной науки и практики является полное оздоровление крупного рогатого скота от туберкулеза, который наносит огромный экономический ущерб народному хозяйству и представляет серьезную опасность для здоровья людей. Туберкулез животных еще имеет значительное распространение в отдельных зонах страны, поэтому не исключена возможность заноса возбудителя инфекции и в хозяйства благополучных зон, что может привести вслед за этим и к ухудшению эпидемиологической ситуации по туберкулезу человека.

Применяемые в ветеринарной практике аллергический метод диагностики туберкулеза не во всех случаях обеспечивает точную постановку диагноза, особенно у больных животных, в состоянии анергии (A.C. Донченко, 1987; Ю.А. Макаров 1991 и др.). Поэтому своевременная постановка первичного диагноза и выяснение причин сенсибилизации макроорганизма к туберкулину во многом зависят от качества диагностических исследований и идентификации выделенных культур, без проведения которых эпизоотическая ситуация может оставаться неясной на протяжении ряда лет (Н.П. Овдиенко, 1986; А.Х. Найманов 1993; М.А. Бажин, 1995,).

Вместе с тем, не решен вопрос и дифференциации неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота. Неспецифические реакции обуславливают огромные трудности в постановке диагноза на туберкулез и могут повлечь за собой необоснованное проведение противотуберкулезных мероприятий и неоправданный убой большого числа высокопродуктивных животных, свободных от туберкулеза.

Отсутствие достаточно надежных методов диагностики туберкулеза и дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота требуют совершенствования имеющихся и изыскания новых, более доступных прижизненных экспресс методов диагностики.

Все вышеизложенные факты свидетельствуют об актуальности проведения исследований по усовершенствованию прижизненной диагностики туберкулеза и дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований являлось усовершенствование методов прижизненной диагностики туберкулеза и дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить показатели повреждения нейтрофидов (тест - ППН) на лабораторных животных (морских свинках и кроликах), зараженных разными дозами микобактерией туберкулеза бычьего вида.

2. Изучить тест - ППН на морских свинках, инфицированных атипичными микобактериями из штамма М. яте^тайБ.

3. Провести комплексные диагностические исследования крупного рогатого скота в хозяйствах с разной эпизоотической ситуацией по туберкулезу.

4. Провести эпизоотический мониторинг в скотоводческих предприятиях РТ по туберкулезу и эхинококкозу за последних 5- 6 лет.

5. Разработать рациональные методы диагностики туберкулеза и дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота.

6. Определить экономическую эффективность применения разработанных методов диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

Научная новизна работы. Проведен биохимический анализ крови у морских свинок и кроликов, зараженных различными дозами микобактерией туберкулеза бычьего вида.

Изучен тест - ППН на лабораторных животных (морских свинках, кроликах), экспериментально зараженных микобактериями туберкулеза

бычьего вида и на крупном рогатом скоте в хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу.

Испытан тест - ППН на морских свинках до и после заражения атипичными микобактериями из штамма М. 5те£та&.

Проведен мониторинг эпизоотической ситуации по туберкулезу и по эхинококкозу крупного рогатого скота в хозяйствах РТ.

Впервые испытан очищенный и разбавленный эхинококковый аллерген, для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота с помощью модифицированного метода Кацони.

Разработаны методические рекомендации: «Показатели повреждения нейтрофилов (тест - ППН) для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота».

Определена экономическая эффективность применения теста - ППН для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота.

Практическая значимость. Полученные результаты исследований показывают, что с помощью теста - ППН представляется возможность своевременно дифференцировать неспецифические туберкулиновые реакции у крупного рогатого скота. Метод выполним в условиях ветеринарной лаборатории. Использование предложенных методов дифференциальной диагностики туберкулеза позволят значительно повысить эффективность прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и своевременно провести противотуберкулезные мероприятия.

Внедрение результатов исследований. На основании полученных результатов исследований разработаны и внедрены методические рекомендации «Показатели повреждении нейтрофилов (тест - ППН) для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота », утвержденные ГУВ КМ РТ 6 апреля 2007 года. По материалам исследований получено удостоверение на рационализаторское предложение № 444 от 30.06.03 г.

Теоретические и практические аспекты диссертации используются в учебной работе при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий и научных исследований в ФГОУ ВПО КГАВМ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Эпизоотическая ситуации по туберкулезу и эхинококкозу в скотоводческих предприятиях РТ.

2. Модифицированная технология изготовления и применение нового аллергена из эхинококкового пузыря, а также эффективное его применение для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин, обусловленных эхинококкозом.

3. Эффективность теста - ППН на лабораторных животных и крупном рогатом скоте для прижизненной и дифференциальной диагностики туберкулеза.

4. Возможность применения теста - ППН и ПЦР для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота в хозяйствах с различной эпизоотической обстановкой.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции молодых ученых и специалистов Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана (Казань, 2004); на международном симпозиуме по теме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (ФГУ Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных (Казань 2005); на Всероссийской научно - практической конференции молодых ученых, посвященной 450 - летию вхождения Удмуртии в состав России «Молодые ученые в реализации национальных проектов» (Ижевск 2006); на ассоциации практикующих ветеринарных врачей Татарстана «Ветеринарная медицина домашних животных» (Казань, КГАВМ 2006); опубликованы статьи в Ученых записках КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань 2006), в материалах «Всероссийской научно - производственной конференции» (Казань 2007).

Пути реализации. Результаты исследований, рекомендации целесообразно использовать при разработке научно - обоснованных систем эпизоотического надзора и контроля при туберкулезе крупного рогатого скота в различных регионах РФ, особенно в хозяйствах, где выделяются животные с неспецифической реакцией на туберкулин.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе методические рекомендации, утвержденные ГУБ КМ РТ 6 апреля 2007 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов, списка литературы, включающего 195 источников, (из них 42 иностранных автора). Диссертация иллюстрирована 14 таблицами, 15 фотографиями.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2003 - 2007 годах на кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана». Проводили исследования также совместно с сотрудниками республиканской ветеринарной лаборатории по изучениию биоматериалов, привезенных из различных хозяйств Республики Татарстан.

Кровь для гематологических и биохимических исследований брали у морских свинок и кроликов из краевой ушной вены, у крупного рогатого скота из яремной вены, соблюдая правила асептики.

Для изучения гематологических и биохимических показателей крови и постановки теста ППН до и после заражения животных микобактериями туберкулеза проводили опыты на 16 морских свинках и 12 кроликах. Морских свинок разделили на 4 группы, по 4 животного в каждой. Первую группу морских свинок заражали культурой мшсобактерии туберкулеза бычьего вида в дозе 0,10 мг на 1 голову, вторую группу животных инфицировали этой же

культурой в дозе 0,15 мг, а третью группу животных заражали бактериальной массой в дозе 0,20 мг на голову. Всем опытным животным, культуру микобактерии туберкулеза бычьего вида, вводили в физиологическом растворе, подкожно в область паха. Четвертая группа животных из 4-х морских свинок служила контролем.

Кровь у морских свинок для постановки теста - ППН брали через 15 и 30 дней после заражения микобактериями туберкулеза из краевой ушной вены в стерильные мини пробирки с добавлением антикоагулянта. Затем в лунки стерильного планшета добавляли по 40 мкл нитрированной крови и в эти же лунки приливали соответствующие аллергены (из расчета 4:1).

Кроликов (12 голов) разделили также на 4 группы по 3 животного в каждом. Первую группу кроликов, заражали культурой микобактерии туберкулеза бычьего вида в дозе 0,55 мг, вторую группу по 0,60 мг и третью группу по 0,65 мг микробной массы на голову. Всем кроликам опытных групп вводили культуру М. bovis в 1,5 мл физиологическом растворе подкожно в область паха. Четвертая группа животных из трех кроликов служила контролем. Для постановки теста - ППН брали кровь у всех кроликов до и через 15-30-60 суток после заражения микобактериями туберкулеза из краевой ушной вены в стерильные минипробирки с добавлением 5%-ного цитрата натрия из расчета 9:1.

Для изучения специфичности аллергического состояния организма у морских свинок, зараженных атипичными микобактериями из штамма М. smegmatis в тесте ППН был проведен опыт на 12 морских свинках, весом 300320 грамм. Их также разделили на 3 группы по 4 животного, из которых образовали три опытных, и одну группу контроля. Опытных животных заражали культурой атипичных микобактерий из штамма М. smegmatis, Культуру атипичных микобактерии вводили животным подкожно в область паха в 0,5 мл физиологического раствора из расчета по 0,10 мг в первой группе, 0,15 мг во второй и по 0,20 мг в третей группу. Четвертая группа животных служила контролем.

Гематологические исследования проводили общепринятыми методами (A.A. Кудрявцев и др., 1969; В.В. Меньшиков, 1987). Подсчет количества эритроцитов и лейкоцитов производили в камере Гаряева, а содержание гемоглабина определяли гемометром Сали (JT П. Жаворонков, В.М. Зяблицкий, 1980).

Биохимические исследования сывороток крови у животных проводили с помощью аппарата ФП-901 в режиме полуавтомат с использованием реактива «Эколап» (производство Россия).

Динамику аллергического статуса организма изучали на ранних стадиях туберкулеза на лабораторных животных (морских свинках, кроликах) и на крупном рогатом скоте путем подсчета повреждения нейтрофилов (illLH) в присутствии специфического аллергена in vitro по методу В.А. Фрадкина, 1985 год. Животных для опытов подбирали по принципу аналогов, с учётом пола, породы, возраста и живой массы.

Убой морских свинок производили через 30 суток, а кроликов спустя 60 суток после заражения. Туши и внутренние органы лабораторных животных подвергали тщательному патологоанатомическому осмотру, а биоматериал от них исследовали общепринятыми лабораторными методами (бактериоскопической, бактериологической, гистологической и биопробой на морских свинках). Для лабораторных исследований использовали паренхиматозные органы (кусочки печени, легких, почек, селезенки) и лимфатические узлы (предлопаточные, средостенные, бронхиальные, заглоточные, брыжеечные и паховые).

Для уточнения диагноза на туберкулез у морских свинок и кроликов, а также для постановки прижизненного диагноза и дифференциальной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота проводили ПЦР (полимеразную цепную реакцию) в отделе молекулярной генетических исследований ФГУ ВПО ФТЦРБ совместно с профессором Т.Х. Фанзовым.

В качестве материала для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) от коров, реагирующих на внутрикожное введение туберкулина, брали

молоко и кровь, а при контрольном убое животных брали и лимфатические узлы (заглоточные, предлопаточные, средостенные, бронхиальные, брыжеечные). ПЦР проводили с праймером, входящими в состав набора тест -систем, «Амплисенс» (ЦНИИ эпидемиология) для диагностики Mycobacterium tuberculosis, bovis, которые амплифицируют фрагмент ДНК с размером 357 пар нуклеотидов, определяемый фрагмент последовательности гена МПБ 64 Mycobacterium tuberculosis, bovis Амплифицированную ДНК разделяли методом горизонтального электрофореза в 2% - ном агарозном геле.

Патоморфологические исследования проводили по методике описанной А.И. Яковлевой (Т.Н. Першин, 1971),

Аллергические исследования морских свинок, кроликов, а также бактериоскопические и бактериологические исследования патологического материала от зараженных животных проводили в соответствии с «Рекомендациями по лабораторной диагностике туберкулеза» Всесоюзного научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (1988)

Для выяснения эпизоотической ситуации по туберкулезу и эхинококкозу крупного рогатого скота в республике Татарстан нами были изучены и обобщены результаты отчетов ГУВ КМ РТ и 10 мясокомбинатов республики за 2001 - 2006 годы, с ежегодным охватом 43 районов, в том числе более тысячи ферм крупного рогатого скота.

Изучение эпизоотической ситуации по эхинококкозу в РТ, а также изготовление и испытание аллергена из эхинококкового пузыря были проведены совместно с доцентом кафедры паразитологии ФГОУ ВПО КГАВМ им. Баумана Д.Г. Латыповым.

Для постановки теста - ППН, ПЦР от коров в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве «ОАО Клементейкино» Альметьевского района РТ брали кровь и молоко, кусочки лимфатических узлов и паренхиматозные органы для лабораторных исследований. Аналогичные исследования проводили и в 14 благополучных хозяйствах республики: (КП им. Горбунова, им.

Рахимова, « Апас » Апастовского района; Учхоз КГАВМ, «Битаман», «Айбаш», Высокогорского района, им. Вахитова, «Кургузи», им. Ленина, «Овощевод», «Колос-Синтез», «Маевка», «Уразла», «Ключи» Зеленодольского района).

Статистическую обработку цифровых данных проводили по разработанным программам в Microsoft Excel. Достоверность устанавливали по методу Стьюдента - Фишера (И.А. Плохинский, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Показатели повреждения нейтрофилов (тест - Ш1Н) у морских свинок, зараженных микобактериями туберкулеза бычьего вида

В качестве специфического аллергена использовали очищенный ППД туберкулин для млекопитающих. Для контроля специфичности аллергического состояния организма путем повреждения лейкоцитов крови (нейтрофилов), применяли также разные гетерогенные аллергены: бруцеллезный антиген для РА, РСК, РДСК, паратуберкулезный антиген для РСК, эхинококковый аллерген, а также стерильный физиологический раствор.

ППН у всех морских свинок до заражения микобактериями туберкулеза колебался в пределах от 2,6±0,7% до 5,7±0,7%. Через 15 суток после заражения результаты ППН при инкубировании крови с ППД туберкулином составили: в первой группе морских свинок 42,2±1,2%, во второй - 38,4±1,0%, а в третьей группе- 50,7±1,4%.

При инкубации бруцеллезным, паратуберкулезными антигенами, эхинококковым аллергенами и физиологическим раствором показатели повреждения нейтрофилов не превышали 4,5±0,5%.

Через 30 суток после заражения процент поврежденных нейтрофилов с ППД туберкулином составил в первой группе - 63,6±1,3%, во второй -67,2±0,2%, в третьей группе животных 69,8±1,2%. При инкубации с гетерогенными аллергенами показатели теста - ППН также не превышали 5%.

В результате проведенных исследований установили, что у зараженных туберкулезом животных наиболее значительные изменения повреждения нейтрофилов отмечаются при инкубации с ППД туберкулином. При этом

процент поврежденных нейтрофилов в нашем опыте колебался через 15 дней после заражения от 38,4±1,0% до 50,7±1,4%, а через 30 дней от 63,6±1,3% до 69,8±1,2%.

Специфичность аллергического состояния организма у морских свинок, зараженных микобактериями туберкулеза, определяли инкубированием крови с бруцеллезным, паратуберкулезным антигенами, эхинококковым аллергеном, а также стерильным физиологическим раствором. С гетерогенными аллергенами показатели повреждения нейтрофилов теста - ППН у зараженных животных было в пределах - от 2,1±0,3% до 5,1 ±0,5%.

Показатели повреждения нейтрофилов у морских свинок, зараженных атипичными микобактериями из штамма М. зп^таАю

Для постановки теста - ППН кровь у морских свинок брали через 15 и 30 дней после заражения по вышеуказанной методике.

Во всех трех группах у морских свинок показатели повреждения нейтрофилов до заражения колебались в пределах от 2,1±0,1% до 5,4±0,6%.

Спустя 15 суток после заражения в первой опытной группе морских свинок показатели теста - ППН при инкубации с ППД туберкулином в среднем составили 4,2±1,2%, во второй опытной группе 2,8±0,6% а в третей контрольной группе 2,5±0,3%. Показатели повреждении нейтрофилов при инкубировании крови бруцеллезным, паратуберкулезным антигенами, эхинококковым аллергеном, а также при контроле с физиологическим раствором варьировали от 2,7±0,1%. до 5,1±0,1%.

Процент поврежденных нейтрофилов у зараженных атипичными микобактериями животных при инкубировании с ППД туберкулином спустя 30 суток составил: в первой группе - 4,4±0,1%, во второй -5,7±0,3%, в третьей контрольной группе -3,2±0,7%. В свою очередь с другими гетерогенными аллергенами показатели теста - ППН колебались от 1,6±0,2% до 5,5±0,3%.

Проведенные исследования показали, что морские свинки зараженные атипичными микобактериями из штамма М. Бте^аЙБ показывают отрицательные результата теста - ППН, при этом процент поврежденных

нейтрофилов, как со специфичным, так и с гетерогенными аллергенами, а также физиологическим раствором колеблется в пределах от 1,6±0,2% до 5,7±0,3%.

Патоморфологические изменения в органах и тканях морских свинок, инфицированных атипичными микобактерия»;:! из штам".;а М. Етс^та!::

Легкие у морских свинок были не спавшиеся, бледно красного цвета, наполнены воздухом. Легочная ткань не была изменена, обнаруживали фокусы дистеликтаза и ателектазы с утолщением межапьвеолярных перегородок. В местах утолщения отмечается инфильтрация -гистеоцитарных клеток, а также расширение и кровенаполнение капилляров. Макроскопически лимфатические узлы в объеме не увеличены, округлой формы и эластичны.

Проведенные исследования показали, что при инфицировании животных атипичным штаммом микобактерий (М. Бп^тайз) образование специфичных эпителиоидно - клеточных гранулем, характерных для туберкулеза, не происходит.

Показатели повреждения нейтрофилов (ППН - тест) у кроликов, зараженных микобактериями туберкулеза бычьего вида

До заражения у всех опытных и контрольных групп животных, как со специфичным, так и с гетерогенньми аллергенами показатели теста - ППН не превышали 5 %.

Спустя 15 суток после заражения кроликов из опытных групп показатели повреждения полиморфно - ядерных лейкоцитов (нейтрофилов) при инкубировании со специфическим аллергеном (ППД туберкулином) составили в первой группе 39,6±2,8°/о, во второй - 41,2±2,0%, а в третьей 46,7±1,7%. При инкубировании крови с бруцеллезным, паратуберкулезными антигенами, и с эхинококковым аллергеном, а также с физиологическим раствором показатели повреждения нейтрофилов не превышали 5%.

Через 30 суток после заражения в тесте - ГОШ процент повреждения нейтрофилов с ППД туберкулином составил в среднем: первой группе 52,7± 2,0%, во второй -60,2±1,9%, в третьей - 59,4±1,7%, а в контрольной группе

данный показатель не превышал 4,4±0,4%. При инкубации с другими аллергенами максимальный процент повреждения нейтрофилов был 5,2±0,5 %.

Спустя 60 дней после заражения при инкубации с ППД туберкулином процент повреждения нейтрофилов увеличился: в первой группе он вырос до 61,8±2,4%, во второй - 63,3±2,0%, в третьей - до 69,1±2,6%. Показатель повреждения нейтрофилов с гетерогенными аллергенами не превышал 5,3%±0,4%, что свидетельствует о специфичности теста ППН с туберкулином

Высокий процент повреждения нейтрофилов при инкубации крови с ППД туберкулином отмечается у животных, зараженных микобактериями туберкулеза. Тогда как у контрольных животных, исследованных в эти же сроки, показатель повреждения нейтрофилов не превышал 5%.

У опытных и контрольных животных при инкубации крови с бруцеллезным, паратуберкулезными антигенами, а также с эхинококковым аллергеном, при проведении теста - ППН процент повреждения нейтрофилов варьировал от 1 до 5 процентов, что свидетельствует о специфичности теста -ППН.

Патоморфологические изменения в органах кроликов зараженных М. bovis

При патологоанатомическом вскрытии трупов кроликов, зараженных М. bovis, через 60 суток после заражения, отмечали выраженные туберкулезные очаги в области легких, увеличенные в размере. На поверхности разреза ткани легкого видна желтоватая масса плотной консистенции.

У кроликов из контрольной группы в легких характерные для туберкулеза изменения не были обнаружены.

Регионарные к месту заражения (левые паховые лимфатические узлы) были плотной консистенции, приводящие в следствии к увеличению органа в несколько раз. При разрезе лимфатических узлов выделялась зловонная масса творожистой консистенции желтовато - серого цвета.

Результаты комплексных исследований крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах

Нами были проведены исследования 95 голов крупного рогатого скота по изучению этиологии аллергических реакций на туберкулин в 14 благополучных по туберкулезу населенных пунктах 3-х районов республики. Во многих ранее благополучных хозяйствах появляется крупный рогатый скот, реагирующий на туберкулин, а при убое этих животных при лабораторных исследованиях туберкулез у них не подтверждался, поэтому эти реакции были отнесены к неспецифическим. Лабораторные исследования патологического материала проводили в бактериологическом отделе ветеринарной лаборатории РТ.

Проведенные исследования показали, что тест - ППН и ПЦР были отрицательными у всех исследованных животных.

При убое не реагирующих на тест - ППН животных и при патологоанатомическом исследовании их внутренних органов изменения характерные для туберкулеза, не были обнаружены. При посеве биоматериала на искусственные питательные среды и при постановке биопробы на морских свинках, во всех случаях туберкулез был исключен. В результате комплексных исследований показатели аллергических реакций на ППД туберкулина у всех животных оценивались как неспецифические.

Полученные нами данные указывают, что у крупного рогатого скота, не инфицированного микобактериями туберкулеза, нейтрофилы крови при инкубации со специфичным аллергеном не повреждаются и поэтому показатели теста - ППН в этом случае могут служить прижизненным экспресс методом диагностики болезни и дифференциации неспецифических реакций на туберкулин.

Результаты комплексных исследований крупного рогатого скота в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве

Исследования проводилось в неблагополучном по туберкулезу крупного рогатого скота ОАО «Климинтейкино» Альметьевского района РТ.

Для изучения показателей повреждения нейтрофилов теста - ППН, использовали кровь, от всех 40 животных, реагировавших на ПЦД туберкулин. Кровь, взятая от 3-х коров, не реагирующих на туберкулин, служила контролем.

У 36 коров показатели теста - ППН варьировали от 21 до 59% поврежденных нейтрофилов. В контроле со стерильным физиологическим раствором показатели теста колебались в пределах от 1 до 4 %. У животных контрольной группы (Зголовы) результаты теста - ППН варьировали от 2 до 5% поврежденных нейтрофилов.

Из 40 реагировавших на ППД туберкулин животных, положительный результат ПЦР нами был получен в 36 случаях по крови и в 28 случаях по молоку. При контрольном убое 26 животных из отобранного патологического материала были сделаны посевы на питательные среды. В посевах через 45 суток наблюдали обильный рост микобактерий туберкулеза. Результаты биопробы также были положительными у всех животных, у которых была выделена культура микобактсрии туберкулеза.

Из анализа проведенных исследований видно, что из 40 голов крупного рогатого скота, реагировавших на ППД туберкулин, у 36 животных нами был установлен туберкулез. Вероятно, у 4-х животных аллергические реакции были неспецифическими, так как тест - ППН, а также ПЦР показывали отрицательные результаты.

При контрольном убое 26 коров, реагирующих на ППД туберкулин, позитивные результаты теста - ППН совпали с положительными показателями ПЦР и результатами лабораторных исследований на туберкулез.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами было установлено, что тест - ППН при инкубировании крови с ППД туберкулином для млекопитающих может служить дополнительным прижизненным диагностическим тестом при туберкулезе крупного рогатого скота и результаты теста - ППН совпадают с показателями ПЦР.

Применение теста - ППН в ветеринарной практике позволяет также дифференцировать неспецифические реакции на введение ППД туберкулина и избежать неоправданного убоя высокопродуктивных и племенных животных.

Поучение jiitujiui ыи ^специфических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота

Реагировавших на туберкулин животных в 2006 году было зарегистрированы в 336 хозяйствах РТ. По количеству реагирующих животных это был самый высокий показатель по сравнению с остальными годами и составил 4832 головы, из которых 2928 были сданы на убой. Для лабораторных исследований на туберкулез было отобрано 1175 проб биоматериала.

Таким образом, за последние шесть лет из 1116 имеющихся в республике различных форм хозяйств в 346 (31%) выявлено реагирующих на внутрикожное введение туберкулина 24580 животных, или в среднем по 4146 голов ежегодно. Из числа реагирующих на туберкулин 16219 животных (65,9%) было подвергнуто контрольно - диагностическому убою. От убитых 4635 животных (25%) пробы биоматериала подвергались лабораторным исследованиям на туберкулез. При этом в 120 случаях (2,5%) патологоанатомическим, бактериологическим методами и биопробой был выделен возбудитель туберкулеза.

Неоправданный убой животных с неспецифическими реакциями на туберкулин за один год в среднем равен количеству коров целого района республики.

Изучение туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота, пораженного гельминтами

По распространению ларвального эхинококкоза крупного рогатого скота республику можно разделить условно на три зоны. Это зоны слабой, умеренной и сильной инвазированности.

В слабо инвазированную зону входят 11 северных районов республики (Арский, Атнинский, Балтасинский, Кукморский, Мамадышский, Сабинский, Тюлячинский, Высокогорский, Агрызский, Елабужский и Менделеевский), один район Заволжья - Апастовский и один юго-восточный район -

Бугульминский. В этой зоне инвазированность эхинококкозом крупного рогатого скота составляет от 0,1 до 3% от убойного поголовья в течение всего мониторинга.

В умеренно инвазированную зону республики входят пять Заволжских районов (Камско-Устинский, Зеленодольский, Кайбицкий, Верхнеуслонский и Дрожжановский), а также пять восточных районов (Актанышский, Менделеевский, Муслюмовский, Азнакаевский и Бавлинский), три центральных района (Лаишевский, Рыбно-Слободский и Нижнекамский) и один южный район (Спасский), где инвазированность эхинококкозом крупного рогатого скота колебалась от 3 до 10%.

Зона сильной инвазированности включает остальные 16 районов республики. Это 13 районов Закамья (Алькеевский, Алексеевский, Аксубаевский, Нурлатский, Чистопольский, Новошешминский, Черемшанский, Альметьевский, Заинский, Лениногорский, Сармановский, Тукаевский и Ютазинский), два района Заволжья (Буинский и Тетюшский) и один центральный район Пестречинский. Результаты проведенных нами исследований показали, что в зонах слабой инвазированности эхинококкозом в таких районах как Арский, Атнинский, Сабинский, Менделеевский, Бугульминский неспецифических реакций на введение ППД туберкулина крупного рогатого скота за 2005 год не наблюдали.

В зонах сильной инвазированности, таких как Нурлатский район из 846 убитых коров 254 были инвазированы эхинококкозом, из которых 106 реагировали на ППД туберкулин. В Заинском районе из 842 убитых животных, 110 оказались инвазированы эхинококкозом. В этом районе в течение года были выявлены 1175 животных с неспецифическими реакциями на туберкулин.

Проведенные нами исследования свидетельствуют о том, что неспецифические реакции на введения ППД туберкулина у крупного рогатого скота в зонах слабой инвазированностю эхинококкозом почти не регистрируются.

Дифференциация неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота с помощью эхинококкового аллергена

Возможность и эффективность применения эхинококкового аллергена для дифференциации не специфических туберкулиновых реакции у крупного рогатого скота изучали в учебном хозяйстве КГАВМ, где также -регистрировались неспецифические реакции на туберкулин у крупного рогатого скота. С этой целью через один месяц после туберкулинизации всем 345 животным ввели эхинококкозный аллерген внутрикожно в область средней третей шеи в дозе 0,2 мл. Учет и оценку реакции Кацони проводили через 1,5-3 часа и 24 часа после введения аллергена.

При исследовании 345 животных на туберкулез нами были выявлены 3 головы (0,9%), положительно реагирующих на туберкулин, в тоже время выявлены эхинококковым аллергеном в реакции Кацони 23 головы крупного рогато скота. При этом у 4-х животных утолщение кожной складки (УКС) составило 8 мм, у 6-и - 9 мм, у 4-х - 10 мм, у 2-х - 13 мм, у 3- х - 16 мм и у 4-х - 18 мм.

Результаты положительно реагирующих на туберкулин 3-х коров, совпали с позитивными показаниями реакции Кацони. При патологоанатомическом исследовании лимфоузлов и внутренних органов от 3-х коров, реагировавших на ППД туберкулин, а также при микроскопии мазков, посеве патологического материала на искусственные питательные среды и заражении морских свинок ни в одном случае микобактерий туберкулеза не было выявлено.

Эхинококкозный аллерген (1часть эхинококковой жидкости, 1,5 части физиологического раствора и 1,5 части глицерина) в реакции Кацони является специфичным и может быть использован для уточнения пораженности скота эхинококкозом. В благополучных по туберкулезу хозяйствах, где регистрируются поражение скота эхинококкозом, для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций целесообразно использовать модифицированную аллергическую пробу Кацони.

20

ВЫВОДЫ

1. Применение теста - ППН позволяет правильно оценить эпизоотическую ситуацию по туберкулезу и дифференцировать неспецифические туберкулиновые реакции у крупного рогатого скота;

— у морских свинок, кроликов и сельскохозяйственных животных, зараженных микобактериями туберкулеза бычьего вида, тест - ППН при инкубировании крови со специфичным аллергеном (ППД туберкулином) дает положительный результат (процент поврежденных нейтрофилов от 20 до 69,8%);

— у здоровых животных этот показатель не превышает 5%;

— у животных, зараженных микобактериями туберкулеза бычьего вида, тест-ППН при инкубировании крови с бруцеллезным и паратуберкулезными антигенами, эхинококковым аллергеном, а также с физиологическим раствором дает отрицательный результат;

— у морских свинок, зараженных атипичными микобактериями штамма М. зп^шайз, тест - ППН при инкубировании крови со специфичным аллергеном и гетерогенными антигенами и аллергенами дает отрицательный результат.

2. Тест - ППН дает 100%-ную корреляцию результатов исследования зараженного и здорового крупного рогатого скота с таковыми при молекулярно-генетических исследованиях (ПЦР). При этом тест-ППН не требует дорогостоящей аппаратуры и выполним в любой ветеринарной лаборатории.

3. Наибольшее число неспецифических реакций у крупного рогатого скота, инвазированного гельминтами (фасциолами, дикроцелиумами, личинками эхинококков и другими) в РТ регистрируется при ларвальном эхинококкозе (50,6%).

4. Для дифференциации неспецйфических туберкулиновых реакций успешно может быть применена модифицированная реакция Кацони с

эхинококковым аллергеном, приготовленным по модифицированной нами технологии.

5. Экономическая эффективность на один рубль затрат при применении теста - ППН для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций составляет 37,28 руб.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. По результатам исследований разработаны и внедрены методические рекомендации «Показатели повреждении нейтрофилов (тест - ППН) для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота», утвержденные ГУВ КМ РТ от 6 апреля 2007 года.

2. По материалам исследований получено удостоверение на рационализаторское предложение № 444 от 30.06.03 г., которое может быть использовано для выявления животных, пораженных ларвальным эхинококкозом, а также для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота.

3. Теоретические и практические аспекты диссертации используются в учебной работе при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий и научных исследований в ФГОУ ВПО КГАВМ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Латыпов, Ф.Р. Неспецифические туберкулиновые реакции у крупного рогатого скота / Ф.Р. Латыпов, Д.Г Латыпов.// Материалы конференции молодых ученых и специалистов Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. Казань, 2004. -С.35- 36.

2. Латыпов, Ф.Р. Неспецифические позитивные реакции на туберкулин при эхинококкозе крупного рогатого скота / Ф Р. Латыпов, Д.Г. Латыпов, A.M. Идрисов, М.Х. Лутфуллин // Часть 2 материалах международного симпозиума ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний. Казань, 2005.-С. 217-220.

3. Латыпов, Ф.Р. Показатели повреждения нейтрофилов (ППН) при экспериментальном туберкулезе морских свинок / Ф.Р. Латыпов, М.А.Сафин, Д.Г. Латыпов // «Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 450 - летаю вхождения Удмуртии в состав России». Молодые ученые в реализации национальных проектов. 3 том. -Ижевск, 2006. - С.61-64.

4. Латыпов, Ф.Р. Показатель повреждения нейтрофилов (ППН тест) у кроликов, зараженных микобактериями туберкулеза. / Ф.Р. Латыпов // Сборник статей выпуск 3 ассоциации практикующих ветеринарных врачей Татарстана, Казанская государственная академия ветеринарной медицины. Ветеринарная медицина домашних животных. Казань, 2006. - С.65-68.

5. Латыпов, Ф.Р. Изучение теста ППН для диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве / Ф.Р. Латыпов // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана том 188. Казань, 2006. - С.145-150.

6. Латыпов, Ф.Р. Показатели повреждения нейтрофилов у морских свинок, зараженных атипичной штаммом микобактерии туберкулеза М. smegmatis /Ф.Р. Латыпов, М.А.Сафин, ДГ. Латыпов // Материалы Всероссийской научно - практической конференции. - Казань, 2007. - С. 25-27.

7. Латыпов Ф.Р. Показатели повреждения нейтрофилов (тест - ППН) при экспериментальном туберкулезе на морских свинках /Ф.Р. Латыпов, М.А.Сафин, Д.Г. Латыпов // «Материалы Всероссийской научно - практической конференции. Казань, 2007. - С. 27 - 29.

Латыпов Фарид Рауфович

Совершенствование методов дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

Корректор Р. И. Бикбаев Компьютерный набор Л.Ф Нигматуллина

Подписано к печати I5.0&.08. Формат 60x84/16

ЗакачЗ^СГираж 100 экз. Усл.- печ. л. 1,0

Печать RISO

Центр информационных технологий КГАВМ 420074, Казань, Сибирский тракт, 35.