Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Совершенствование и оценка средств и методов лабораторной диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней

УДК 619 616-076 616 98

На правах рукописи

Бунькова Наталия Ивановна

Совершенствование и оценка средств и методов лабораторной диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней

16 00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1Ь"ЗБ 1 1

Покров - 2008

003169611

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ)

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор

Куриннов Виктор Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

кандидат ветеринарных наук

Балышева Вера Ивановна Кукушкин Сергей Анатольевич

Ведущее учреждение: Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИТИБП)

Защита состоится 20 июня 2008 г. в II30 часов на заседании диссертационного совета Д 006 003 01 при Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу 601120, Владимирская область, г Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Тел/факс (49243)62125

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Автореферат разослан « /3 » мая 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук - р. ОКЮп&ь*-^)/

В Я Савукова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы

Репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС) -контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся абортами в конце срока супоросности, рождением мертвых и/или слабых поросят, погибающих в первые 2-3 недели жизни, и поражением органов дыхания у поросят в постотъемный период (Мищенко В А, 1994, А1шпа Е., 1997, Уооп К1, 2003) Вирус чаще циркулирует в изолированных фермах с полным циклом и промышленных свинокомплексах, наносит значительный экономический ущерб из-за репродуктивных потерь и низкой сохранности новорожденных и поросят на доращивании (Кукушкин С А., 2000)

В настоящее время, на основании имеющихся сведений о вирусе и патогенезе болезни рутинные диагностические исследования базируются на использовании серологических методов для обнаружения специфических антител и обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для обнаружения генома (Уооп К.1, 2003) Так, при типичных случаях (т е наличии эпизоотологических данных, клинических признаков) в хозяйстве с полным циклом при отсутствии вакцинации, первичного обнаружения генома вируса РРСС и специфических антител, особенно у поросят группы доращивания, достаточно для подтверждения диагноза, а обследуемая ферма (хозяйство) считается неблагополучной то РРСС (Суханова О В, 1997, ВоШег А, 1997) Однако, результаты исследований, выполняемых на основе использования коммерческих диагностических наборов «РРСС-Серотест», производства НПО НАРВАК, широко используемого в РФ, «НегсЮЬек РМ^Б 2ХЯ» фирмы ЮЕХХ (США) и др, не позволяют идентифицировать группы недавно зараженных животных в неблагополучной ферме, потому что реакции предназначены для обнаружения только специфических антител к вирусу РРСС класса ^О Недостаточная информативность существующих серологических методов не позволяет использовать их для совершенствования стратегии и тактики борьбы с болезнью Учитывая энзоотичность РРСС в

свиноводческих хозяйствах, особенно с полным циклом, перспективным направлением для совершенствования мер борьбы с болезнью является разработка серологического метода для выявления животных на ранних стадиях заражения, являющихся источником вируса, а именно, обнаружение специфических вирусу РРСС ранних антител класса IgM Несмотря на широкое использование методов обнаружения ранних антител в медицинской вирусологии, сведения о диагностическом значении специфических антител класса IgM в ветеринарии, в том числе и при РРСС ограничены лишь несколькими работами (Joo Н S , 1997, Park В К 1995)

До последнего времени считалось, что в странах Европы (за исключением Дании) циркулируют изоляты вируса РРСС европейского генотипа, а в Северной Америке и странах Азии - американского По данным литературы, в свиноводческих хозяйствах РФ циркулируют изоляты, относящиеся только к европейскому генотипу вируса РРСС (Кукушкин С А , 2006) Однако, с учетом значительных закупок племенных свиней из стран Европы и Северной Америки, а также применения в течение нескольких лет живой вакцины из штамма «БД» американского варианта (Stadejek Т, Pejsak Z, 2003), ситуация может измениться, и поэтому с целью контроля заноса вируса РРСС американского варианта актуальным является серологический мониторинг свиней как неблагополучных, так и благополучных хозяйств на присутствие антител к американскому варианту вируса

Таким образом, несмотря на существенные достижения в изучении вируса и вызываемой им болезни, применение существующих средств специфической профилактики и мер борьбы не всегда дает успех, так как эффективные вакцины отсутствуют, а длительная персистенция, различные формы проявления болезни и циркуляция генетически различных европейского и американского вариантов вируса РРСС приводят к необходимости повысить эффективность серологических исследований и улучшить схему лабораторных диагностических исследований

1.2. Цель и задачи исследования

Целью данных исследований являлось совершенствование и оценка средств и методов лабораторной диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней

В соответствие с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи

- изучить репликацию вируса РРСС европейского и американского вариантов в клеточных культурах различного происхождения,

- разработать модифицированные методы иммуногистохимического анализа (РНИФ, ИФА) для обнаружения специфических вирусу иммуноглобулинов класса М в сыворотках крови инфицированных свиней,

- разработать метод для серологической дифференциации европейского и американского вариантов вируса РРСС,

- изучить диагностические характеристики лабораторных методов диагностики РРСС в эксперименте и при исследовании полевого патологического материала,

- разработать схему проведения лабораторных диагностических исследований при подозрении на РРСС

1.3. Научная новизна работы

Усовершенствованы методики получения диагностических препаратов и постановки реакции непрямой иммунофлуоресценции для обнаружения ранних специфических антител класса 1§М к вирусу РРСС в сыворотках крови зараженных свиней и животных — вирусоносителей

Усовершенствован метод идентификации в сыворотках крови инфицированных свиней специфических антител к вирусу РРСС американского и европейского вариантов

Разработана схема лабораторных диагностических исследований при подозрении РРСС

1.4. Практическая значимость результатов исследований

Разработанная реакция непрямой иммунофлуоресценции пригодна для

обнаружения инфицированных свиней на ранней стадии заражения вирусом

РРСС и вирусоносителей и может быть включена в схему лабораторных исследований и проведения мероприятий при совершенствовании мер борьбы с РРСС в хозяйствах с полным циклом и свинокомплексах промышленного типа

Разработанные Методические указания по идентификации антител к европейскому и американскому вариантам вируса респираторного и репродуктивного синдрома свиней могут использоваться при проведении диагностических исследований в случае подозрения заноса вируса РРСС американского варианта

На основании результатов оценки диагностических методов (изоляции вируса, обнаружения генома, а также специфических антител) усовершенствована схема лабораторных исследований на РРСС как при подозрении заноса вируса, так и в неблагополучных хозяйствах

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

- метод обнаружения ранних специфических антител к вирусу РРСС класса ^М на основе непрямых вариантов иммуно-гистохимического анализа и диагностическое значение обнаружения специфических антител класса 1§М,

- серологический метод идентификации антител европейского и американского вариантов вируса РРСС в крови инфицированных свиней и его практическое значение,

- диагностическая характеристика методов обнаружения вируса, генома и специфических антител при исследовании экспериментальных и полевых материалов от зараженных вирусом РРСС разной патогенности животных и усовершенствованная схема лабораторной диагностики болезни

1.6. Апробация работы и публикация результатов

Материалы исследований были доложены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария»

1.7. Личный вклад соискателя

Представленные в диссертационной работе материалы получены, проанализированы и обработаны автором самостоятельно Практическую и

консультативную помощь при изготовлении конъюгатов анти-IgM свиньи оказал дбн Новиков Б В (ГНУ ВНИИВВиМ) 1.8. Структура п объем диссертации

Диссертация изложена на 134 страницах и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы, приложения Список литературы включает 209 источников, в том числе 39 отечественных и 170 зарубежных авторов Работа иллюстрирована 19 рисунками и 15 таблицами

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Вирусы В работе использовали референс-штаммы вируса РРСС «Lelystad» европейского варианта и «NADC-8» американского варианта, вакцинный штамм «БД-ДЕП» американского варианта, полученные из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ, НПО НАРВАК, ФГУ ВНИИЗЖ, Центрального Ветеринарного Исследовательского Института (г Лелистад, Нидерланды), а также полевые изоляты «Самара-96», «Владимирский», «Кострома»

Полевые пробы В работе использовали пробы органов абортированных плодов, павших поросят и сыворотки от свиней разных производственных групп промышленных свинокомплексов «Гибридный» (Самарская область), «Шувалово» (Костромская область), «Юбилейный» (Тюменская область), «Владимирский» (Владимирская область)

Животные Для экспериментального заражения использовали поросят в возрасте 2-4 мес, живой массой 15-30 кг. Для получения диагностических антисывороток использовали кроликов в возрасте от б месяцев до 1 года, живой массой не менее 2-2,5 кг

Культуры клеток Для культивирования вируса РРСС использовали первичную культуру клеток альвеолярных макрофагов свиньи (AMC) и перевиваемые культуры клеток MARC-145, CV-1, РК-15, ПСГК, ВНК-21,

полученные из лаборатории «Культуры клеток с музеем клеточных штаммов» ГНУ ВНИИВВиМ

Монокпональные антитела к ц-цепи иммуноглобулина М свиньи, продуцируемые гибридомой SS3, были любезно предоставлены доктором биологических наук Новиковым Б В , ГНУ ВНИИВВиМ

Диагностические препараты Набор диагностических препаратов для лабораторной диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней методом флуоресцирующих антител и гистохимическим вариантом иммуноферментного анализа (производства ГНУ ВНИИВВиМ), диагностический набор реагентов для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней иммуноферментным методом («РРСС-Серотест» производства НПО НАРВАК), диагностический набор реагентов для выявления РНК вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (производства НПО НАРВАК), антисвиные ФИТЦ-иммуноглобулины (из «Набора препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической чумы свиней» производства ГНУ ВНИИВВиМ)

Выделение, культивирование и титрование вируса РРСС Для изоляции вируса и определения инфекционной активности экстракты суспензий проб органов или сыворотки крови от инфицированных или подозреваемых в заражении вирусом РРСС животных, после обработки антибиотиками, инокулировали на культуры AMC или MARC-145, инкубировали при 37°С не менее 6 сут Размножение вируса подтверждали реакцией непрямой иммунофлуоресценции

Инфекционный титр вируса вычисляли по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦЦ 50/мл

Постановку серологических реакций (реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), гистохимический вариант

иммуноферментного анализа (ГХ-ИФА), твердофазный вариант иммуноферментного анализа (ТФ-ИФА, ELISA)), а также ОТ-ПЦР выполняли

согласно наставлений (инструкций) по применению соответствующих Наборов, Тест-систем в соответствии с рекомендациями изготовителя

Статистическая обработка результатов исследований проводилась согласно рекомендованным методикам (Лакин ГФ, 1990, Лярски 3, 1980, Сосов Р Ф, Глушков А А , 1974) с использованием персонального компьютера и пакета прикладных программ Statgraphics (Version 2 1) 2.2. Результаты исследований

2.2.1. Репродукция вируса РРСС европейского и американского вариантов в различных культуральных системах in vitro

Для оптимизации условий изоляции вируса РРСС из патологического материала при проведении диагностических исследований, а также приготовления культуральных тест-препаратов для реакций непрямой иммунофлуоресценции или гистохимического варианта ИФА определяли уровень репродукции вируса референс-штаммов и полевых изолятов европейского и американского вариантов в клетках различного происхождения

Перевиваемые культуры клеток CV-1, РК-15, ПСГК, ВНК-21 в исследованиях оказались не чувствительны и не поддерживали репликацию как референтных штаммов, так и полевых изолятов вируса РРСС

Полевые изоляты «Владимирский», «Кострома» были выделены с использованием культуры клеток АМС, и не размножались в культуре клеток MARC-145 Размножение изолята «Самара-96» в MARC-145 было установлено только после адаптации в течение 8 пассажей (накопление вируса 3,0-4,0 lg ТЦД5о/мл) Референтный штамм «Lelystad» размножался лучше в культуре клеток АМС (5,0-5,5 lg ТЦД50/мл), чем в культуре MARC-145 (1,0-2,0 lg ТЦД5о/мл), а штамм «NADC-8» размножался лучше в культуре MARC-145 (7,2 lg ТЦД5о/мл), чем в культуре АМС (6,0 lg ТЦД50/мл) Адаптированный вакцинный штамм «Lelystad» в культуре MARC-145 накапливался в титре 4-4,5 lg ТЦД5о/мл, а адаптированный вакцинный штамм «БД-ДЕП» - 7,2-7,4 lg ТЦД50/мл Эти штаммы были выбраны для приготовления тест-препаратов для дальнейших серологических исследований

Для подтверждения избирательной чувствительности AMC репродукцию вируса РРСС определяли в первичной культуре клеток из легких 6-недельных поросят, полученных от 14 свиноматок, содержащихся в виварии ГНУ ВНИИВВиМ. Было установлено, что альвеолярные макрофаги поросят, полученных только от 7 свиноматок, стабильно поддерживали репродукцию вируса РРСС европейского варианта.

С целью оптимизации условий приготовления тест-препаратов для обнаружения специфических антител к вирусу РРСС иммуно-гистохимическими реакциями определяли оптимальную дозу заражения и время культивирования вируса в культуре клеток MARC-145 . При множественности заражения 0,1-1,0 ТЦД50/клетка через 48-72 часа после инокуляции вируса наблюдали поражение более 20-30% клеток монослоя, а после иммунофлуоресцентного окрашивания люминесцентной микроскопией обнаруживали чётко выраженные флуоресцирующие фокусы, состоящие из 1525 антигенсодержащих клеток, что можно считать приемлемым для учёта результата реакции (рис. 1.).

Зараженная культура клеток MARC-145 Незараженная культура клеток MARC-145

Рис. 1. Люминесцентная микроскопия зараженной и незараженной вирусом РРСС (шт. «Lelystad») культуры клеток MARC-145 (Olympus IMT2-RFL, 10-20x10PL).

В культуре клеток AMC разрушение монослоя (около 30-50%) наблюдали через 48 часов после инокуляции вируса. Зараженные клетки отделялись от стекла. Через 120 часов после заражения на стекле оставались единичные

клетки макрофагов, а основная масса зараженных клеток находилась во взвешенном состоянии в виде конгломератов в культуральной среде

Для приготовления тест-препаратов для РНИФ в последующих исследованиях использовали культуру клеток MARC-145, инфицированную адаптированным вирусом «Lelystad», «Самара-96» или «БД», при множественности заражения не менее 0,1 ТЦД50/клетка

2.2.2. Экспериментальное воспронзведеиие РРСС с использованием вируса европейского и американского вариантов

С целью диагностической оценки лабораторных методов проведено экспериментальное воспроизведение инфекции РРСС на поросятах от 25 дневного до 8 недельного возраста с использованием штаммов и полевых изолятов европейского и американского вариантов

После интраназального введения клинические проявления болезни у поросят оценивали по схеме, разработанной С Mittelholzer и др (2000) После заражения разными штаммами вируса степень выраженности клинических признаков была различной Так, у поросят, зараженных атгенуированными штаммам (используемыми для производства живой или инактивированной вакцин), отмечали учащенное дыхание, температура тела была в пределах физиологической нормы для данной группы животных или повышалась незначительно (40,2 - 40,5°С) Поросята, зараженные референтным штаммом «Lelystad», показали более полную клиническую картину болезни, включающую повышение температуры тела (до 41°С), увеличение частоты дыхания с различимыми движениями грудной клетки, локальные покраснения кожи, конъюнктивиты Аппетит сохранялся, но был несколько снижен У поросят, зараженных изолятом «Самара-96», клинические признаки были выражены слабее К 21 суткам после заражения проявления клинических признаков исчезали, за исключением конъюнктивитов, принимавших хроническую форму

Штамм «Lelystad», полевые изоляты «Владимирский», «Самара-96» по вызываемому ими респираторному синдрому были отнесены к умеренно вирулентным, а атгенуированные вакцинные штаммы «Lelystad» и «БД» -

слабо вирулентным Гибели поросят после экспериментального заражения указанными штаммами не установлено ни в одном случае

Таким образом, для определения диагностических характеристик лабораторных методов получены пробы от поросят, зараженных вирусом РРСС разной патогенности в динамике инфекционного процесса

2.2.3. Разработка непрямых вариантов иммуно-гистохимического анализа для обнаружения ранних антител (IgM) к вирусу РРСС

Основные исследования по данному этапу работы включали отработку технологических условий и изготовление диагностических препаратов для постановки реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) и непрямого гисто-химического варианта ИФА (ГХ-ИФА) для обнаружения в сыворотках крови инфицированных вирусом РРСС свиней специфических иммуноглобулинов класса М

Из иммуноглобулинов сыворотки крови интактной свиньи была выделена фракция IgM Для получения антисвиных IgM раствор свиных IgM с содержанием белка 5,8 мг/мл вводили кроликам по схеме внутрикожно, внутривенно и подкожно 100-130 мкг/кг жм) с интервалом 5-14 сут Сыворотки крови кроликов, имевшие титр антител в РДП 1 32 и выше против исходных свиных IgM были использованы для выделения иммуноглобулинов анти-IgM свиньи высаливанием сульфатом аммония с последующей гельфильтрацией с использованием Ultrogel АсА34 Полученные препараты очищенных иммуноглобулинов кролика анти IgM свиньи, содержащие не менее 20 мг/мл белка использовали для метки ФИТЦ и изготовления конъюгата ФИТЦ-анти-IgM свиньи Изготовленные ФИТЦ-анти-IgM имели соотношение Ф/Б 3 и активность 1 32-1 64 (рабочее разведение 1 8-1 16)

Активность конъюгата ПХ-анти-IgM свиньи, изготовленного на основе моноклональных антител к ц-цепи IgM свиньи гибридомы SS3, составила 1 2000 (рабочее разведение 1 500)

Специфичность обнаружения антител (IgM) к вирусу РРСС РНИФ и ГХ-ИФА с использованием полученных антисвиных конъюгатов была проверена исследованием сывороток крови от поросят, отобранных на 10 и 50 сутки после

Таблица 1

Специфичность обнаружения антител класса IцN1 в сыворотках крови поросят, зараженных вирусом РРСС (изолят «Самара-96») РНИФ с _использованием коныогата ФИТЦ-анти-^М свиньи _

Тест-препарагы (вирусный изоот) Промежуточные сыворотки Разведения ФИТЦ- анти-IgM свиньи ФИТЦ анти IgG свиньи

Разведения 1 8 1 16 1 32 1 64 116

Самара-96 Специфическая 10 сутки п/з 1 8 ++++ +++ ++ + +

1 16 ++++ +++ ++ + ±

1 32 ++++ +++ ++ + ±

1 64 ++++ +++ ++ - -

Специфическая 50 сутки п/з 1 8 ± - - - ++++

1 16 ± - - - ++++

1 32 ± - - - +-Н-+

1 64 ± - - - 1111

Отрицательная 1 16 ± - - - -

Обозначения

(++++, +++,++,+) - зеленая флуоресценция цитоплазмы и включений разной интенсивности, (±) - неспецифическое серо-зелёное свечение цитоплазмы клеток (фон), (-) - отсутствие флуоресценции, п/з - после заражения

Таблица 2

Специфичность обнаружения антител класса IgM в сыворотках крови поросят, зараженных вирусом РРСС (изолят «Самара-96») ГХ-ИФА с _использованием коньюгата ПХ- анти-IgM свиньи _

Тест- ПХ-анти

препараты Промежуточные сыворотки Разведения ПХ- анти-IgM IgG

(вирусный свиньи свиньи

изолят) Разведения 1 500 1 1000 1 2000 1 1000

Самара -96 Специфическая 10 сутки п/з 1 8 ++++ +++ ++ ++

1 16 i i i i +++ ++ ++

1 32 ++++ +++ ++ +

1 64 i i i i +++ ++ -

Специфическая 50 сутки п/з 1 8 ± - - i i i 1

1 16 ± - - -н-н-

1 32 ± - - ++++

1 64 ± - - ++++

Отрицательная 1 16 ± - - -

Обозначения

(++++, +++) - темно-коричневое окрашивание цитоплазмы, (++, +) - светло-коричневое окрашивание цитоплазмы, (±) - неспецифическое розово-коричневое окрашивание клеток, п/з - после заражения

интраназального заражения вирусом РРСС (изолят «Самара-96») В таблицах 1 и 2 показано, что РНИФ и ГХ-ИФА с использованием конъюгатов ФИТЦ-анти-

IgM и ПХ-анти-IgM позволяют обнаруживать специфические антитела к вирусу РРСС класса IgM (положительное окрашивание имело место при использовании сывороток, полученных только на 10 сутки после заражения)

2.2.4. Разработка метода серологической дифференциации европейского и американского вариантов вируса РРСС и специфических антител

В данном исследовании были использованы референс-штаммы «Lelystad», «NADC-8» и пробы сывороток, полученные от свиней в динамике инфекции после экспериментального воспроизведения РРСС Специфические сыворотки исследовали перекрестной РНИФ с использованием культуральных тест-препаратов европейского и американского вариантов вируса РРСС Специфические гипериммунные сыворотки использовали в рабочем разведении 1 32-1 64, антисвиные ФИТЦ-иммуноглобулины - 1 16

В результате использования в РНИФ промежуточных специфических сывороток к штамму «Lelystad» и гомологичных тест-препаратов европейского варианта, наблюдали специфическую флуоресценцию (диффузное свечение цитоплазмы изумрудно-зеленого цвета с гранулярными включениями в одиночных клетках, или группах клеток на темном фоне незараженных клеток) с интенсивностью на 4 условных креста (табл 3) В гетерогенных тест-препаратах американского варианта (штаммы «NADC-8», «БД»), с использованием тех же сывороток наблюдали слабую специфическую флуоресценцию (диффузное желто-зеленое свечение цитоплазмы) Так же, при использовании референтных специфических сывороток к штамму «NADC-8», наблюдали четкую специфическую флуоресценцию в тест-препаратах американского варианта («NADC-8», «БД») и слабую специфическую флуоресценцию в тест-препаратах европейского варианта («Lelystad», «Самара-96»)

Было сделано предположение, что, используя в РНИФ гомологичные тест-препараты, можно дифференцировать антитела в сыворотках поросят, заражённых европейским или американским вариантом вируса В результате исследования было установлено, что сыворотки, полученные на штаммы,

Таблица 3

Дифференциация вариантов вируса РРСС РНИФ с использованием вариант______ специфических сывороток_

Специфические сыворотки Вариант вируса тсст-препаратов

Европейский Американский

Lelystad Самара-96 NADC-8 БД

Европейский вариант Ье1у$Ы (1 64) ++++ ++-Н- ± ±

Американский вариант КАБС-8(1 32) ± ± ми ++++

относящиеся к европейскому варианту вируса РРСС, при использовании гомологичных тест-препаратов имели титр антител до 1 1024, в то же время титр антител в тех же сыворотках, исследованных при использовании гетерогенных тест-препаратов, не превышал 1 64

Аналогичные данные получены при исследовании сывороток от поросят, инфицированных американским вариантом вируса (табл 4)

Таблица 4

Результаты исследования специфических к вирусу РРСС сывороток

Тест-препарат Специфические сыворотки к вариантам вируса

европейский (Lelystad) Американский (NADC-8)

1 16 1 164 | 1256 1 16 | 1 64 1 256

Европейский вариант

Ье1узЫ ++++ ++++ +++ ++ j + -

Самара-96 ++++ lili +++ ++ + -

Американский вариант

КАЭС-8 ++ + - ++++ ++ +

БД ++ + - ++++ ++ +

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что, используя специфические сыворотки к европейскому и американскому вариантам вируса, гомологичные и гетерогенные тест-препараты, РНИФ возможно идентифицировать как вариант выделенного из патологического материала вируса, так и специфические антитела, обнаруженные в сыворотках крови зараженных животных

2.2.5. Оценка методов обнаружения вируса, генома и специфических антител после экспериментальной РРСС-инфекции

2.2.5.1. Обнаружение специфических РРСС IgM и IgG в сыворотках крови экспериментально зараженных свиней

Для сравнительной оценки методов обнаружения специфических антител класса IgM и IgG были исследованы сыворотки проб крови, полученные от свиней в динамике инфекции после экспериментального заражения вирусом РРСС (изолят «Самара-96») Одновременно исследуемые сыворотки инокулировали на монослой культуры AMC для обнаружения вируса

Согласно полученным данным у 4 из 12 животных специфические антитела класса IgM в сыворотках обнаруживали на 4 сутки после заражения в титре 1 8 - 1*16 (средний геометрический титр составил 1,08±1,62) На 7 сутки специфические IgM определяли у 11 из 12 (средний геометрический титр 4,08±1,62), а на 11 сутки - у всех 12 животных (6,16±0,83) На 14 и 21 сутки после заражения средний геометрический титр специфических IgM составлял 6,42±0,79 и 5,83±0,67, соответственно К 28 суткам IgM определяли у 10 из 12 животных, средний геометрический титр был 3,75±2,0 На 45 сутки после заражения IgM в сыворотках не обнаруживали

Специфические антитела класса IgG обнаруживали начиная с 11 суток (8 из 12 животных, средний геометрический титр 3,83±2,55) Далее, специфические IgG определяли у всех животных, средний геометрический титр составил на 14 сутки 7,08±1,31, на 21 сутки 8,08±1,08, на 28 сутки 8,67±0,98, на 45 сутки 8,5±1,09 Инфекционный вирус был изолирован из крови животных в основном с 7 по 28 сутки после заражения

Сравнительное обнаружение уровня специфических антител класса IgM, IgG РНИФ и вируса в крови заражённых животных в динамике инфекции, представлено на рис 2

В результате проведения корреляционного анализа между количеством животных с выявленной виремией и изменением титров специфических антител класса IgM, установлено, что коэффициент корреляции составил 0,58,

С) ген после заражения

IgM 1од2 IgG |0д2

—А—виреыичных животных

Рис 2 Уровни средних геометрических титров специфических антител класса IgM, IgG и виремия в динамике инфекции вирусом РРСС, изолят «Самара-96», р<0,05

что отражает среднюю положительную связь между сравниваемыми величинами При оценке достоверности значение t-критерия Стьюдента составило 2,28, при уровне значимости р<0,05 Таким образом, установлена достоверная средняя корреляционная связь между виремией и выявлением специфических антител класса IgM в сыворотках крови свиней, зараженных вирусом РРСС

2.2.5.2 Сравнительные результаты оценки методов изоляции вируса (AMC), обнаружения генома (ОТ-ПЦР) и специфических антител (РНИФ, ГХ-ИФА, ТФ-ИФА)

В результате исследования проб от экспериментально зараженных поросят были определены интервалы времени после заражения, в которых тот или иной диагностический метод позволяет выявить положительных животных (табл 5) Оказалось, что чувствительность методов изоляции вируса и ОТ-ПЦР варьирует в зависимости от времени отбора проб крови 100% чувствительность была только на 11-14 сутки после заражения, а в более поздние сроки существенно ниже (16,7%)

Специфические антитела класса IgM были впервые обнаружены на 4 -7 сут (33,3%-91,7%) и во всех пробах на 11- 21 сут после заражения (100%)

Специфические антитела класса IgG обнаруживали, начиная с 11 суток после заражения в 25% (ELISA) и 66,7% (РНИФ/ГХ-ИФА) и во всех пробах с 14 -21 суток до 45 (срок наблюдения) Таким образом, диагностическая чувствительность сравниваемых методов в условиях контролируемого эксперимента значительно варьирует и зависит не только от диагностических характеристик методов, но и от стадии инфекционного процесса у отдельно взятых животных Так как при исследовании полевого патологического материала данные анамнеза часто не позволяют установить стадию инфекционного процесса у отдельного животного, следует использовать комплекс методов, позволяющих обнаружить вирус или его маркеры (специфические антитела) на всех стадиях патогенеза

Таблица 5

Результаты сравнения методов изоляции вируса (AMC), обнаружения генома (ОТ-ПЦР) и специфических антител (РНИФ, ГХ-ИФА, ELISA) в пробах крови поросят, экспериментально зараженных европейским вариантом вируса РРСС (изолят «Самара-96») в динамике инфекции

Метод Сутки после заражения

4 7 II 14 21 28 45

Изоляция вируса

Изоляция '■3/12, 11/12 12/12 "'10/12 9/12 ! 2/12

вируса ' 191,7°^ 100% ' 100%, 83,3% ' w75%,J 16,7% .

ОТ-ПЦР

ОТ-ПЦР ^ "2/124- 11/12 12/12 ' 12/12,- * W12S-- \ 9/1-27 -2/12 ,

16,7% 91,7% 100% 100% « 75%.. -.75%' 16,7%'

Специфические антитела

РНИФ/ % 4/12" 41/12 •12/12,- . -12/12' '«.10/12 0/12

ГХ-ИФА (IgM) 33,3% Ж ■ i '''" ft 100%; 83,3% 0%

РНИФ/ 0/12 0/12 : 8'12 • 12/12 >- 12/12» ,ч12/12? - ,12/12",

ГХ-ИФА 0% 0% 66,7% ' 100% -- 100% 100% 100%

(IgG) t •.'Д ЛЩ ,•,¿6,} а, W Ä

ELISA 0/12 0/12 ,3/12 5/12 • 12/12 Г* . -12/12 12/12

(РРСС- 0% 0% ■ 100% 100% -

Серотест) '-Ti s :

2.2.6. Оценка лабораторных методов диагностики РРСС в свинокомплесах с различным эпизоотологическим статусом

2.2 61. Серологический скрининг популяций домашннх свиней благополучного и неблагополучного свинокомплексов по РРСС

С целью диагностической оценки разработанных серологических реакций для обнаружения специфических антител РРСС класса IgM и IgG, дифференциации европейского и американского вариантов вируса были исследованы пробы сывороток крови свиней 2-х свинокомплексов, по эпизоотологическими данным благополучного (свинокомплекс №1) и неблагополучного (свинокомплекс №2) по РРСС, в которых вакцинация не проводилась

Для исследования по 20 проб сывороток крови получали от ремонтных свинок, основных свиноматок, а также поросят групп подсоса и доращивания

В результате исследования у животных были обнаружены специфические антитела класса IgM и IgG к вирусу РРСС европейского варианта Антител к вирусу РРСС американского варианта выявлено не было

В свинокомплексе №1 в группе основных свиноматок 100% исследованных сывороток имели специфические РРСС IgG, при этом в 60% сывороток выявлены титры 1 512 и выше В тех же сыворотках в 5% проб были обнаружены специфические РРСС IgM В группе ремонтных свинок специфические IgM обнаружены в сыворотках 80% проб, специфические IgG -в 100% В группах подсосных поросят и доращивания специфических IgM обнаружено не было, а титр специфических РРСС IgG, выявленных в 100% сывороток, в группе доращивания снижался по сравнению с группой подсоса от 1 128 - 1 256 до 1 32 - 1 64 Эти данные позволяют предположить, что инфицируются не имеющие специфического иммунитета ремонтные свинки, и, в меньшей степени, свиноматки основного стада, не сталкивавшиеся ранее с возбудителем или уже утратившие специфический иммунитет У подсосных поросят обнаружение специфических IgG свидетельствует об их материнском происхождении Таким образом, интерпретируя результаты серологического обследования, можно сделать вывод о циркуляции у ремонтных свинок

активного вируса РРСС К моменту осеменения, они переболевают, циркуляция вируса ограничивается (в том числе вирус-нейтрализующими антителами), происходит адаптация к резиденскому вирусу и в период осеменения и далее они защищены от заражения (абортов не установлено)

Свинокомплекс №2 имел статус положительного по РРСС В хозяйстве к моменту исследования около 8 месяцев не проводилась вакцинация против РРСС У свиноматок во второй половине супоросности периодически происходили аборты, у поросят наблюдались клинические признаки респираторных нарушений, анорексия В результате серологических исследований специфические антитела классов 1§М и выявлены в сыворотках свиней всех исследуемых производственных групп В группе основных свиноматок ^М обнаружены в 50% сывороток в титрах до 1 256, - в 100% сывороток В группе ремонтных свинок только 30% были сероположительными по специфическим ^М, и 60% - по специфическим В 25% проб от подсосных поросят и в 20% проб группы доращивания в сыворотках были обнаружены специфические антитела ^М, в 90% и 100% проб сывороток - специфические антитела соответственно

Обнаружение специфических антител ^М у свиноматок, поросят групп подсоса и доращивания свидетельствует о передаче инфекционного вируса РРСС от инфицированных свиноматок подсосным поросятам и ремонтным свинкам, которые, в свою очередь, инфицируют основных свиноматок Таким образом поддерживается постоянная активная циркуляция вируса, обуславливающая неблагополучие поголовья по РРСС

Таким образом, результаты серологического обследования с использованием дополнительного метода обнаружения ранних антител к вирусу РРСС значительно облегчают анализ получаемых результатов и позволяют определить половозрастную группу(ы), имеющую решающее значение в распространении вируса в популяции свиней.

2.2.6 2. Оценка методов лабораторной диагностики РРСС при острой вспышке болезни

В свинокомплексе с объемом производства 108 тыс свиней в год в 2-х производственных комбинатах (№1 и №2) содержалось 7300 свиноматок и 3760 свиноматок на племферме Для профилактики РРСС и ПВИС с 2000 года применяли вакцину эмульсионную инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома, изготовленную на основе американского варианта, штамм «БД» и парвовирусной инфекции свиней производства ФГУ ВНИИЗЖ за 30 дней до осеменения, по схеме, согласно наставлению производителя

В августе-сентябре 2001 г после карантина в основное стадо свиноматок комбината №2 были введены около 80 ремонтных свинок "Нуриг", завезенных из Польши Животные не имели антител к вирусу РРСС

С января 2002 г у свиноматок 1-й и 2-й половины супоросности комбината №2 начали регулярно проявляться аборты среди «своих» и вновь введенных осемененных свиноматок, с постепенным спорадическим увеличением их инцидентности (рис 3) В течение 2002 г зарегистрировали 3 пика увеличения количества абортов (январь-май-октябрь) После короткого периода снижения инцидентности повторное увеличение числа абортов отмечали в феврале-марте 2003 г Некоторое уменьшение инцидентности регистрировали в весенне-летние месяцы, а в ноябре был новый пик

■В КЪмбинат№1 Комбинат №>

Количество абортов

мес, год

Рис 3 Инцидентность абортов в свинокомплексе в 2001-2004 г г

В июне-июле 2004 года значительное увеличение количества абортов регистрировали одновременно в обоих комбинатах Более 50% случаев абортов было в конце третьего триместра супоросности

Таблица 6

Сводные данные серологических и вирусологических исследований

Год, мес № комбината Кол-во проб Антитела Вирус

РНИФ ELISA (Е + А) ПЦР АМС

Е А

2002 ноябрь №2 свиноматки аборт 9 9/9 1 40-80 Ни Ни Ни Ни

№2 свиноматки через 21 день после аборта 13 13/13 1 320-640 Ни Ни Ни Ни

2003 март ноябрь ноябрь Хряки 110 10/110 1 16-32 70/110 1 64-256 60/110 (54,5%) 3/110 Ни

№1 свиноматки* 20 2/20 1 16-64 11/20 1 64-256 9/20 (45%) - -

№2 свиноматки** 23 17/23 1 64-256 10/23 1 128-256 7/23 (30%) - -

2004 март март май июль №1 свиноматки* 20 18/20 1 64-256 5/20 1 64-256 5/20 (25%) - -

№2 свиноматки** 23 20/23 1 128-512 12/23 1 64-256 10/23 (43,5%) - -

№2 свиноматки*** 6 0/6 6/6 1 64-128 6/6 - -

№2 свиноматки*** 6 6/6 1 64-256 6/6 1 64-128 6/6 - -

июнь №2 свиноматки аборт 100-106 дн 4 4/4 1 80 4/4 1 64-128 4/4 4 2

Плодная жидкость (аборт 94-101 дн ) 6 - - - 1/6 3/6

Обозначения *, **,*** - исследование парных сывороток, А - антитела к американскому варианту вируса РРСС, Е — антитела к европейскому варианту вируса РРСС, числитель - количество положительных, знаменатель - количество исследованных проб, н/и - не исследовали

У поросят группы доращивания наблюдали респираторные нарушения, кашель, затрудненное дыхание, при вскрытии павших и вынужденно убитых поросят - картину гнойной пневмонии

В результате дифференциальных лабораторных исследований были исключены классическая чума свиней, болезнь Ауески, парвовирусная инфекция, отравления и кормовые токсикозы

Эпизоотологические данные, клинические и патологоанатомические признаки позволили предположить, что этиологическим агентом вспышек абортов в свинокомплексе является вирус РРСС Сложность диагностирования РРСС в данном комплексе была обусловлена тем, что применялась вакцинация свиней против РРСС

Сводные данные серологических и вирусологических исследований представлены в таблице 6 Так, перекрестной РНИФ и ELISA было установлено, что около половины вакцинированных животных не имели антител к вакцинному варианту вируса, а были обнаружены антитела к европейскому варианту вируса, и определена 8-кратная положительная сероконверсия у свиноматок через 21 день после абортов При проведении серологического обследования всех хряков в 9% обнаружены антитела к вирусу европейского и в 64% - к вирусу американского варианта С помощью ОТ-ПЦР геном вируса РРСС европейского варианта был выявлен в 2-х пробах сывороток и одной пробе спермы из 110 проб от хряков, а также в пробах легких и экссудате абортированных плодов и сыворотке свиноматки после аборта В 2004 г из сывороток крови свиноматок и плодной жидкости плодов был выделен вирус РРСС европейского варианта

2.2.7. Схема лабораторной диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней

На основании разработанных методов РНИФ и ГХ-ИФА с использованием конъюгатов ФИТЦ-анти-IgM свиньи и ПХ-анти-IgM свиньи, рутинных тестов - ОТ-ПЦР, вирусовыделения в культурах клеток AMC и MARC-145 и биопробы на неиммунных поросятах - предложена схема лабораторной диагностики РРСС (рис 4)

В случае обнаружения генома вируса РРСС ОТ-ПЦР предварительный диагноз считается установленным

Положительные результаты вирусовыделения в культуре клеток дают основание для постановки окончательного диагноза

При отрицательных результатах вирусовыделения на первом пассаже проводят дополнительно 2-3 "слепых" пассажа В случае отсутствия репродукции вируса на протяжении трех пассажей для постановки окончательного диагноза руководствуются результатами биопробы

Биопробу ставят на неиммунных поросятах 3-6 недельного возраста За инфицированными животными наблюдают в течение 5 суток с ежедневной термометрией Через 5 дней животных обескровливают, отбирают патологический материал (AMC, кусочки легких, экссудат из грудной полости) и исследуют ОТ-ПЦР и вирусовыделением в культурах клеток AMC и MARC-145 При получении положительного результата в биопробе окончательный диагноз считается установленным

Для серологической диагностики исследуют пробы сывороток крови от невакцинированных животных с клиническими признаками реакцией непрямой иммунофлуоресценции

Обнаружение специфических антител IgM в сыворотках крови невакцинированных животных дает основание для постановки предварительного диагноза

При обнаружении вирусспецифических антител IgG в сыворотках крови невакцинированных животных РНИФ проводят серологическую дифференциацию европейского и американского варианта вируса перекрестной РНИФ Повторно исследуют сыворотки крови от тех же животных, отобранные через 2-3 недели. Увеличение титров антител в 2 и более раз дает основания для постановки окончательного диагноза

Таким образом, разработанные средства и методы лабораторной диагностики позволяют обеспечить постановку диагноза на РРСС

Рис 5 Схема лабораторной диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней

3. выводы

1 Для выделения полевых изолятов вируса РРСС, циркулирующих на территории РФ, необходимо использовать первичную культуру AMC после предварительной проверки чувствительности помётов свиноматок к репродукции референс-вируса, для приготовления тест-препаратов в РНИФ -вирус европейского («Lelystad») и американского («БД») вариантов, адаптированный к культуре клеток MARC-145, при множественности заражения 0,1-1,0 ТЦД50/клетка

2 Усовершенствованные серологические методы (РНИФ, ГХ-ИФА) с использованием коныогатов анти-IgM свиньи позволяют обнаруживать специфические антитела (иммуноглобулины) класса М к вирусу РРСС с 4-х по 28 сутки после заражения

3 На основании установленной достоверной средней корреляционной связи между виремией и обнаружением специфических IgM в сыворотках крови свиней, зараженных вирусом РРСС, РНИФ и ГХ-ИФА могут быть использованы для обнаружения вирусоносителей

4 Разработанная модификация РНИФ позволяет дифференцировать специфические антитела к европейскому и американскому вариантам в сыворотках крови инфицированных и переболевших свиней, а также, используя гомологичные или гетерогенные специфические сыворотки, определять принадлежность вируса к европейскому или американскому варианту

5. Диагностические характеристики лабораторных методов диагностики РРСС зависят от времени отбора проб после заражения- так, метод изоляции вируса и ОТ-ПЦР имеют 75-100% чувствительность с 7 по 28 сутки после заражения и в этот же период РНИФ в 83,3-100% проб обнаруживаются специфические антитела класса IgM Серологические методы определения специфических РРСС IgG имеют наибольшую чувствительность, начиная с 1421 (42-100%) до 45 суток (100%) (срок наблюдения)

6 Наиболее результативными лабораторными методами для обнаружения и скрининга инфицированных вирусом РРСС животных по диагностической чувствительности и специфичности являются РНИФ и ГХ-ИФА,

обеспечивающие как обнаружение специфических антител класса IgM, IgG, так и дифференциацию европейских и американских изолятов вируса

7 Рекомендованная схема лабораторной диагностики РРСС, включающая методы обнаружения ранних специфических IgM и IgG к вирусу РРСС, серологический метод дифференциации европейского и американского вариантов вируса, позволяет идентифицировать как стадию инфекционного процесса (острую или реконвалесценцию) у отдельных животных, так и определять эпизоотологический статус обследуемой популяции/фермы. 4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Данные, полученные в результате проведения экспериментальных исследований, позволяют рекомендовать для применения в лабораторной диагностике РРСС метод определения специфических антител IgM и серологический метод дифференциации европейского и американского вариантов вируса РРСС как чувствительные, специфичные и высоко воспроизводимые методы

2 Подготовлена и утверждена директором ГНУ ВНИИВВиМ нормативная документация «Временные методические указания по идентификации антител к европейскому и американскому вариантам вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней» 5.СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Балашова, Е А Выделение вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в культурах клеток / Е А Балашова, В В Куриннов, Н.И. Бунькова // Проблемы экотоксикологического, радиационного и эпизоотологического мониторинга - Казань- ВНИВИ, 2005 - С 252-255

2 Бунькова, НИ Определение специфических антител класса IgM к вирусу РРСС реакцией непрямой иммунофлуоресценции / Н.И. Бунькова, В В Куриннов // Научные основы профилактики и лечения болезней животных -Екатеринбург. Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт, 2005 -С 218-221.

3 К вопросу о персистенции полевого вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней у животных, вакцинированных инактивированной вакциной

[Инактивированная вакцина на основе американского варианта вируса, штамм "БД"] / В В Куриннов, Н.П. Бунькова, Е А Балашова, Б В Новиков // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов -Щелково ВНИТИБП,2005 -С 173-178

4 Обнаружение РНК вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) с помощью полимеразной цепной реакции / Н.И. Бунькова, В О Копытов, С Ж Цыбанов, В В Куриннов, Е А Балашова, О С Колобова // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов -Щелково ВНИТИБП,2005 -С 183-187

5 Вспышка РРСС на свинокомплексе промышленного типа / В В Куриннов, Н.И. Бунькова, Е А Балашова, С Ж Цыбанов, В А Зеленцов // Ветеринария -2007 -№8 -С 17-21.

Подписано в печать 08 05 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 383 Тираж 75экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ш

1.1. Актуальность темы

Репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС) - контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся абортами в конце срока супоросно-сти, рождением мертвых и/или слабых поросят, погибающих в первые 2-3 недели жизни, и поражением органов дыхания у поросят в постотъёмный период (23, 45, 200). Вирус чаще циркулирует в изолированных фермах с полным циклом и промышленных свинокомплексах, наносит значительный экономический ущерб из-за репродуктивных потерь и низкой сохранности новорожденных и поросят на доращивании (15).

В настоящее время, на основании имеющихся сведений о вирусе и патогенезе болезни рутинные диагностические исследования базируются на использовании серологических методов для обнаружения специфических антител и обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для обнаружения генома (200). Так, при типичных случаях (т.е. наличии эпизоотологи-ческих данных, клинических признаков) в хозяйстве с полным циклом при отсутствии вакцинации, первичного обнаружения генома вируса РРСС и специфических антител, особенно у поросят группы доращивания, достаточно для подтверждения диагноза, а обследуемая ферма (хозяйство) считается неблагополучной по РРСС (36, 61). Однако, результаты исследований, выполняемых на основе использования коммерческих диагностических наборов «РРСС-Серотест» производства НПО НАРВАК, широко используемого в РФ, «HerdChek PRRS 2XR» фирмы IDEXX (США) и др., не позволяют идентифицировать группы недавно зараженных животных в неблагополучной ферме, потому что реакции предназначены для обнаружения только специфических антител к вирусу РРСС класса IgG. Недостаточная информативность существующих серологических методов не позволяет использовать их для совершенствования стратегии и тактики борьбы с болезнью. Учитывая энзоотичность РРСС в свиноводческих хозяйствах, особенно с полным циклом, перспективным направлением для совершенствования мер борьбы с болезнью является разработка серологического метода для выявления животных на ранних стадиях заражения, являющихся источником вируса, а именно, обнаружение специфических вирусу РРСС ранних антител класса IgM. Несмотря на широкое использование методов обнаружения ранних антител в медицинской вирусологии, сведения о диагностическом значении специфических антител класса IgM в ветеринарии, в том числе и при РРСС, ограничены лишь несколькими работами (117, 166).

До последнего времени считалось, что в странах Европы (за исключением Дании) циркулируют изоляты вируса РРСС европейского генотипа, а в Северной Америке и странах Азии - американского. По данным литературы, в свиноводческих хозяйствах РФ циркулируют изоляты, относящиеся только к европейскому генотипу вируса РРСС (16). Однако, с учетом значительных закупок племенных свиней из стран Европы и Северной Америки, а также применения в течение нескольких лет живой вакцины из штамма «БД» американского варианта (181), ситуация может измениться, и поэтому с целью контроля заноса вируса РРСС американского варианта актуальным является серологический мониторинг свиней как неблагополучных, так и благополучных хозяйств на присутствие антител к американскому варианту вируса.

Таким образом, несмотря на существенные достижения в изучении вируса и вызываемой им болезни, применение существующих средств специфической профилактики и мер борьбы не всегда дает успех, так как эффективные вакцины отсутствуют, а длительная персистенция, различные формы проявления болезни и циркуляция генетически различных европейского и американского вариантов вируса РРСС приводят к необходимости повысить эффективность серологических исследований и улучшить схему лабораторных диагностических исследований.

6. выводы

1. Для выделения полевых изолятов вируса РРСС, циркулирующих на территории РФ, необходимо использовать первичную культуру АМС после предварительной проверки чувствительности помётов свиноматок к репродукции референс-вируса; для приготовления тест-препаратов в РНИФ - вирус европейского («Lelystad») и американского («БД») вариантов, адаптированный к культуре клеток MARC-145, при множественности заражения 0,1-1,0 ТЦД 50/клетка;

2. Усовершенствованные серологические методы (РНИФ, ГХ-ИФА) с использованием коньюгатов анти-IgM свиньи позволяют обнаруживать специфические антитела (иммуноглобулины) класса М к вирусу РРСС с 4-х по 28 сутки после заражения;

3. На основании установленной достоверной средней корреляционной связи между виремией и обнаружением специфических IgM в сыворотках крови свиней, зараженных вирусом РРСС, РНИФ и ГХ-ИФА могут быть использованы для обнаружения вирусоносителей;

4. Разработанная модификация РНИФ позволяет дифференцировать специфические антитела к европейскому и американскому вариантам в сыворотках крови инфицированных и переболевших свиней, а также, используя гомологичные или гетерогенные специфические сыворотки, определять принадлежность вируса к европейскому или американскому варианту;

5. Диагностические характеристики лабораторных методов диагностики РРСС зависят от времени отбора проб после заражения: так, метод изоляции вируса и ОТ-ПЦР имеют 75-100% чувствительность с 7 по 28 сутки после заражения и в этот же период РНИФ в 83,3-100% проб обнаруживаются специфические антитела класса IgM. Серологические методы определения специфических РРСС IgG имеют наибольшую чувствительность, начиная с 14-21 (42-100%) до 45 суток (100%>) (срок наблюдения);

6. Наиболее результативными лабораторными методами для обнаружения и скрининга инфицированных вирусом РРСС животных по диагностической

Ill чувствительности и специфичности являются РНИФ и ГХ-ИФА, обеспечивающие как обнаружение специфических антител класса IgM, IgG, так и дифференциацию европейских и американских изолятов вируса;

7. Рекомендованная схема лабораторной диагностики РРСС, включающая методы обнаружения ранних специфических IgM и IgG к вирусу РРСС, серологический метод дифференциации европейского и американского вариантов вируса, позволяет идентифицировать как стадию инфекционного процесса (острую или реконвалесценцию) у отдельных животных, так и определять эпизо-отологический статус обследуемой популяции/фермы.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Данные, полученные в результате проведения экспериментальных исследований, позволяют рекомендовать для применения в лабораторной диагностике РРСС метод выявления специфических антител IgM и серологический метод дифференциации европейского и американского вариантов вируса РРСС как чувствительные, специфичные и высоко воспроизводимые методы.

2. Подготовлена и утверждена директором ГНУ ВНИИВВиМ нормативная документация: «Временные методические указания по идентификации антител к европейскому и американскому вариантам вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате проведенных исследований раскрыты некоторые особенности клинических проявлений РРСС, проведена сравнительная оценка лабораторных методов диагностики РРСС, разработан гистохимический метод определения специфических вирусу антител IgM, позволяющий выявлять животных на ранних стадиях заражения вирусом РРСС, и серологический метод для дифференциации вариантов вируса и вирусспецифических антител. Разработанные методы позволяют полно характеризовать эпизоотологическую ситуацию по РРСС в свинокомплексах, определять группы животных, являющиеся резервуаром возбудителя болезни. Проведена сравнительная оценка характеристик основных методов, используемых для лабораторной диагностики РРСС: ОТ-ПЦР, изоляции вируса, определения специфических антител IgG с помощью РНИФ, ГХ-ИФА и ТФ-ИФА, а также разработанных методов определения специфических антител IgM и серологической дифференциации вариантов вируса и антител.

Диагностическая оценка характеристик методов при экспериментальном заражении животных и при исследовании полевого материала позволяет рекомендовать метод определения специфических вирусу антител IgM и метод серологической дифференциации европейского и американского вариантов вируса для использования при лабораторной диагностике РРСС.