Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка средств и методов лабораторной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней

и/

л.

УДК 619:616.988-076:636.4

ОД

'J ü IUP tS98 . ■ u

J"JU На правах рукописи

Аспирант Суханова Ольга Валентиновна

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА

СВИНЕЙ

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Покров - 1997

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН.

Научный руководитель:

член-корреспондент РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор ВИШНЯКОВ И.ф.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор ЛАГУШИН H.A. (ВНИИВВиМ), доктор ветеринарных наук, профессор МИ1ЦЕНК0 В.А. (ВНИИЗЖ).

Ведущее учреждение - Всероссийский НИИ экспериментальной

ветеринарии.

Защита состоится 26 марта 1998 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д-120.61.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН (60II20, г.Покров, Владимирской области, ВНИИВВиМ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан февраля 1998г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Г.ПоФЁДОРОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Одной из основных проблем свиноводства, особенно связанной с селекцией и разведением - нарушение репродуктивных функций у свиноматок и гибель новорожденных поросят. Проблема многофакгорна; связана с нарушением кормления, содержания, зоогигиенических и санитарных условий, нарушением обмена веществ, незаразными, инфекционными и паразитарными болезнями.

В период с 1987 по 1992 г.г. свиноводы в странах Северной Америки и Западной Европы заявили о массовом проявлении у свиноматок заболевания, проявляющегося нарушением, ^воспроизводства и не поддающегося диагностированию. Только в 1991 году вирусологами Центрального ветеринарного Института (Лелистад, Нидерланды) была установлена вирусная природа возбудителя (\Л/епзуоог1 е1 а1., 1991), и после некоторых дискуссий болезнь названа репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС). В 1994 болезнь внесена в список МЭБ.

Болезнь не поддавалась лечению испытанными химиотерапевти-ческими средствами, быстро распространялась среди свиней и без строжайшего соблюдения ветеринарно-санитарных и организационно-технических норм поставила хозяйство перед необходимостью полной смены поголовья. Важно было установить этиологию болезни, разработать методы быстрой и эффективной диагностики, которые позволили бы обнаружить и дифференцировать указанный вирус от возбудителей клинически сходных заболеваний.

В 1991 году в колхозе "Россия" Медвенского района Курской области ветеринарными специалистами установлено заболевание у свиноматок с признаками нарушения воспроизводительных функций (аборты, рождение мертвых, нежизнеспособных поросят). В результате исследо-

вания патологического материала в Центральном ветеринарном институте (Лелистад) был поставлен диагноз - РРСС.

Всвязи с обнаружением новой нозоединицы, вируса репродуктив-но-респираторного синдрома свиней, ввиду высокой контагиозности возбудителя, отсутствия действенных средств специфической профилактики и методов борьбы с репродукгивно-респираторным синдромом , данное заболевание вошло в число первых по размерам нанесенного экономического ущерба свиноводству в тех хозяйствах Российской Федерации, где это заболевание имеет место.

Данная работа является результатом исследований по разработке средств и методов лабораторной диагностики РРСС, выполненных во ВНИИВВиМ.

Цель работы

Целью наших исследований являлась разработка средств и методов лабораторной диагностики болезни репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

Задачи исследования.

1. Изучить репродукцию вируса PPCCinvitron in vivo; в различных куяьтуральных клеточных системах различного происхождения;

2. Разработать способ получения специфической сыворотки к вирусу РРСС 'на чувствительных животных, пригодной для изготовления диагностических препаратов;

3. Разработать технологию изготовления диагностических препара тов;

4. Отработать методы исследования для лабораторной диагностики РРСС;

5. Изучить диагностическую ценность разработанных средств и методов лабораторной диагностики РРСС для обнаружения специфического антигена и выявления антител у больных и переболевших животных;

6. Разработать схему лабораторной диагностики болезни РРСС.

Научная новизна

Научная новизна и практическая ценность работы состоит в том, что в результате проведенных исследований:

- изучены основные морфологические, физико-химические и биологические свойства вируса РРСС;

- обнаружение антигена и выявление антител к вирусу РРСС проводится в культурах клеток MARC-145, AMC реакцией непрямой имму-нофлуоресценции и гистохимическим вариантом иммуноферментного анализа;

Разработана схема диагностики РРСС;

Практическая значимость

На основании экспериментальных исследований разработаны и рекомендованы для включения в схему диагностики РРСС чувствительные и специфичные реакция непрямой иммунофлуоресценции и гистохимический вариант иммуноферментного анализа, предназначенные для обнаружения антигена вируса и выявления специфических антител.

Изготовлены лабораторные образцы "Набора препаратов для лабораторной диагностики репродцетивно-респираторного синдрома свиней", которые успешно прошли межлабораторную комиссионную апробацию.

Разработана нормативно-техническая документация "Набора препаратов для лабораторной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней" (Временная инструкция по изготовлению и контролю;

Технические условия; Методические указания и Наставление по применению набора), утвержденные директором ВНИИВВиМ.

Разработанные средства и методы лабораторной диагностики ре-продуктивно-респираторного синдрома свиней внедрены в ветеринарную практику страны, что позволяет своевременно диагностировать данное заболевание и проводить эффективные мероприятия по предупреждению распространения инфекции.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на научных конференциях и на заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ (г. Покров 1994-1996).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Основные положения диссертационной работы,

выдвигаемые на защиту

1. Результаты экспериментальных исследований по разработке реакции непрямой иммунофлуоресценции и гистохимического варианта иммунрферментного анализа для диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней и ее дифференциальной диагностики от клинически сходных болезней свиней.

2. Результаты апробации методов гистохимического варианта им-муноферментного анализа и реакции непрямой иммунофлуоресценции на практике.

3. Результаты изучения вируса репродуктивно-респираторного синдрома, выделенного из экспертизного материала Самарской области.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 134 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы ( 225 источник, в том числе 29 отечественных). Работа иллюстрирована 15 таблицами и дополнена приложениями.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы.

Вирусы и антигены.

В работе использовали вирус РРСС штамм "S 86", штамм "Мадрид" и штамм "Самара-96". Для контроля специфичности разработанных методов использовали гетерологичные вирусы: вирус КЧС шт "Ши-мынь", вирус болезни Ауески шт "Бук-Тк-900", вирус болезни Тешена шт "Закарпатский", вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней шт "Lindholm", вирус респираторного коронави'русной инфекции свиней шт "Лук", парвовирус свиней.

Сыворотки

Использовали нормальные и специфичные к вирусу РРС сыворотки крови свиней, а также сыворотки крови, специфичные к гетерологичным вирусам болезней свиней: вирусу КЧС, болезни Ауески, вирусу болезни Тешена, трансмиссивного гастроэнтерита свиней, респираторной корона-вирусной инфекции свиней, парвовирусу свиней.

Сыворотки получены из лаборатории "Диагностика" ВНИИВВиМ.

Животные.

Для клинического воспроизведения репродуктивно-респираторного синдрома свиней и получения в и руссод е ржа ще го материала в экспериментах были использованы клинически здоровые поросята в возрасте 1-5 суток, подсвинки в возрасте 4-5 месяцев, супоросные свиноматки на 80-87 сутки супоросности.

Для получения специфических и нормальных сывороток крови использовали клинически здоровых свиней в возрасте 2-9 месяцев, и свиноматок в возрасле 2-5 лет.

В качестве доноров альвеолярных макрофагов, для накопления вируссодержащего материала использовали клинически здоровых свиней в возрасте 5-15 суток.

Животных получали из научно-экспериментальной базы лабораторных животных, питомников "Светлые горы" и "Столбовая" АМН РФ, а также из хозяйств Владимирской области. До начала эксперимента животных выдерживали под наблюдением в течение 10-14 дней. Кормление осуществляли в соответствии с рационом.

Культуры клеток

Для выделения, культивирования, титрования и накопления антигенов вируса репродуктивно - респираторного синдрома свиней использовали одно-двухсуточные перевиваемые культуры клеток:

- клоновый вариант почки зеленой мартышки МА 101 - МАИС-145;

- почки зеленой мартышки (СУ-1);

- почки сибирского горного козерога, линия ПСГК минус 60,

- почки поросенка (РК-15);

- тестикул поросенка;

- почки эмбриона свиньи.

- почки теленка (МДВК).

Первичную культуру клеток альвеолярных макрофагов свиней.

Культуры клеток получали в лаборатории "Биологии и культивирования вирусов" и в лаборатории "Культуры клеток с музеем клеточных штаммов" ВНИИВВиМ.

Методы.

Серологические методы исследования.

Для проверки активности и специфичности сывороток крови, специфичности антигена вируса РРСС, а также для сравнения диагностической ценности разработанных методов использовали РНИФ, ГХ ИФА, РН.

Получение антигенов.

Специфические культуральные антигены вируса получали с использованием шт "S 86" и культур клеток AMC и MARC-145. При определении инфекционной активности, культуральный вирус титровали в культуре клеток AMC, титр вируса рассчитывали по методу Рида и Мен-ча, выражая в цитопатических дозах в миллилитре (ЦПД50/мл. Нормальные культуральные антигены получали из интакгных культур клеток аналогично специфическим антигенам.

Получение специфических сывороток крови.

Для получения специфических к вирусу РРСС диагностических сывороток крови использовали свиней, проводя иммунизацию культураль-ным антигеном штамма "S 86" вируса РРСС. Активность полученных антигенов определяли в РНИФ и ГХ ИФА, а кроме того, титрованием в чувствительной культуре клеток.

Активность специфичных к вирусу РРСС сывороток крови определяли в РНИФ, ГХ ИФА и РН.

Хроматографические методы исследования. Выделение IgG из сывороток крови проводили путем высаливания сернокислым аммонием, с последующей гельпроникающей хроматографией на Ультрагеле АсА-34. Очистку полученных коньюгатов проводили: ФИТЦ - на сефадексе G-50.

Коньюгиоование laG.

Коньюгирование антивидовых IgG с пероксидазой хрена проводили по методу периодатного окисления (Wilson & Nakane 1978), а с ФИТЦ -на основе ряда методов, предложенных ранее (П.Фогт, 1972; Л.Форни, 1981; Б.Эрнст, 1979).

Результаты собственных исследований Изучение репродукции различных штаммов (изолятов) вируса репродуктивно-оеспираторного синдрома свиней в культуральных клеточных системах различного происхождения

В результате проведенных исследований по определению чувствительности перевиваемых культур клеток и первичной культуры альвеолярных макрофагов свиней установлено, что чувствительными к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней являются первичная культура клеток альвеолярных макрофагов свиней и перевиваемая культура клеток MARC-145 (клоновый вариант почки зеленой мартышки МА-101). Титр вируса РРСС в AMC составил 5,5+0,24 Lg ТЦД 50/мл, в культуре клеток MARC-145 - 3,5±0,18 Lg ТЦД 50/мл. Принимая это во внимание, для дальнейшей работы по получению культурального спе-

цифического антигена и отработке методов диагностики нами были выбраны культуры клеток AMC и MARC-145.

Изучение свойств культуры альвеолярных макрофагов свиней

Исследовали зависимость накопления вируса от множественности заражения, сроков культивирования, процентного содержания феталь-ной сыворотки КРС в культуральной среде. Оптимальной множественностью заражения оказалась доза 0,01 ТЦД 50/мл.

Проведена работа по изучению свойств AMC, полученных от животных разного возраста для использования их в диагностических исследованиях. Наиболее чувствительными к вирусу РРСС являются AMC, полученные от 5-10 дневных поросят. Однако, в 35-40% случаев альвеолярные макрофаги не чувствительны к вирусу РРСС, не зависимо от возраста животных.

Цитологические исследования

При исследовании зависимости накопления вируса, от содержания сыворотки" крови в питательной среде оказалось, что содержание сыворотки влияет на накопление вируса в обоих видах культур клеток. Содержание фетальной сыворотки крови КРС для культуры AMC составило 10%, а для культуры клеток MARC-145 5%. Оптимальными сроками культивирования для культуры AMC 1-2 сутки, а для MARC-145 - 3-4 сутки. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Данные таблицы говорят о том, что культура клеток AMC более чувствительна и накопление вируса в данной культуре выше, чем в культуре клеток MARC-145. В дальнейшей работе для получения вирус-содержащего материала и культуральных антигенсодержащих препаратов для иммунизации животных использовали культуру клеток AMC.

Таблица 1.

Оптимальные условия накопления и активность вируса РРСС, шт "Б 86"

в культурах клеток

п=3

исследуемые параметры культур клеток

АМС АМС АМС MARC-145 MARC-145 MARC -145

множественность заражения (ТЦД 50, V 'мл/ 000,10,001 0,10,001 0,10,001 0,10,001 0,10,001 0,10,001

содержание сыворотки (%) 2 5 10 2 5 10

сроки накопления (сут) - 1-2 1-2 3-4 3-4 5-6

титр инфекционного вируса ([д ТЦД 50/мл) - 4,56,0 5,0-6,0 3,5-4,0 3,5-4,0 2,0-2,5

Получение специфической к вирусу РРС сыворотки крови на свиньях

Для этого использовали свиней иммунизируя их культуральным антигеном вируса РРСС шт "S 86". Животных иммунизировали интроназально по 1 мл антигена на животное. Испытали три схемы иммунизации, с интервалом в 2 недели. Первую группу иммунизировали 1-кратно, интроназально, по 1 мл антигена. Вторую - 2-кратно, интрона-зально, по 1 мл антигена с интервалом в 2 недели. Третья схема предусматривала 3 введения антигена интроназально, с интервалом в 2 недели. Более активную сыворотку получили от животных, гипериммуни-зированных по второй схеме иммунизации. Активность полученных сывороток крови представлена в таблице 2.

Таблица 2.

Активность сывороток крови свиней,полученных в зависимости от схемы иммунизации

п=3

разведения сывороток п1 активность сывороток в НМФА

при I схеме иммунизации: 1:40 10 ++

1:80 -

1:160 -

1:320 -

1:640 -

три ГI схеме иммунизации: 1:40 10 ++++

1:80 ++++

1:160 ++

1:320 ++

1:640 +

1ри III схеме иммунизации: 1:40 6 ++++

1:80 ++++

1:160 ++

1:320 ++

1:640 +

Активность коньюгатов, полученных из сыворотки крови свиней составила : - пероксидазного 1:20 -1:80, а ФИТЦ 1:4 -1:32.

Серологически методы исследования

Цитопатическое действие на культуре клеток, специфичное для ируса РРСС, можно наблюдать на вторые сутки после заражения куль-уры AMC и на 5-7 сутки на - MARC-145. Выявление вируса болезни РСС в культурах клеток по ЦПД обладает рядом недостатоков: замед-яет получение результатов исследований на 2-3 суток по сравнению с эрологическмми реакциями непрямой иммунофлуоресценции и гисто-имическим вариантом иммуноферментного анализа, значительным асходом питатательной среды. К тому же ЦПД не может служить неоп-эвержимым доказательством наличия вируса в культуре клеток. В свя-

зи с выше сказанным для обнаружения вируса РРСС в культуре клеток были предложены реакция непрямой иммунофлуоресценции и гистохимический вариант иммуноферментного анализа.

Разработка реакции непрямой иммунофлуоресценции для обнаружения антигена вируса РРСС

При разработке реакции непрямой иммунофлуоресценции, мы исследовали пригодность полученного ФИТЦ-коньюгата для обнаружения вируса РРСС в зараженных культурах клеток. Для этого культуру клеток MARC-145 (AMC) заражали вирусом РРСС в дозе 0,001 ТЦД 50/мл. Пластины инкубировали в С02 инкубаторе в течение 2-3 суток. Монослой клеток фиксировали 80 %-ным охлажденным ацетоном в течение 10 мин. В лунках пластины инкубировали специфическую к вирусу РРСС сыворотку и инкубировали при 37° С в течение 30-45 мин. После отмывки наносили ФИТЦ-коньюгат в рабочем разведении при 37° С в течение 30-45 мин. После отмывки несвязавшегося коньюгата, проводили учет результатов под инвертированным флюоресцентным микроскопом.

Результаты определения чувствительности и специфичности РНИФ свидетельствуют, что метод специфичен и чувствителен, позволяет обнаруживать в цитоплазме зараженных клеток антигены вируса РРСС и дифференцировать их от антигенов гетерологичных возбудителей болезней свиней. Метод позволяет выявлять антигены вирулентного вируса РРСС шт "S 86"и "Самара 96" в культуре MARC-145 (AM) павших или вынужденно убитых свиней.

Разработка ГХ ИФА для обнаружения антигена вируса РРСС При разработке гистохимического иммуноферментного анализа (ГХ ИФА) мы исследовали пригодность полученного ПХ коньюгата для обнаружения вируса РРСС в цитоплазме зараженных клеток методм ГХ ИФА.

Зля этого культуру клеток MARC-145 заражали вирусом РРСС в доз» 5,001 ТЦД 50/мл. Пластины инкубировали в С02 инкубаторе в течение 2$ суток. Монослой клеток фиксировали 80 %-ным охлажденным ацетоном в течение 10 мин. В лунках пластины инкубировали специфическую с вирусу РРСС сыворотку в рабочем разведении при 37° С в течение 50-Ю. После отмывки инкубировали пероксидазный коньюгат в рабочем зазведении при 37° С в течение 50-60 мин. После отмывки несвя-¡авшегося коньюгата в лунки пластины вносили раствор хромогенного субстрата. Учет результатов проводили через 30-60 мин инкубирования ipn комнатной температуре под световым микроскопом. Зезультаты определения чувствительности и специфичности метода свидетельствуют, что непрямой вариант ГХ ИФА чувствителен и специфичен, юзволяет обнаруживать в цитоплазме зараженных клеток антигены вируса РРСС и дифференцировать их от антигенов возбудителей гетерологич-ных болезней свиней.

Разработка реакции непрямой иммунофлуоресиениии и ГХ ИФА для обнаружения антител к вирусу РРСС

В ходе постановки реакций выяснили, что оба метода специфичны и «увствителены. Позволяют выявлять антитела к вирусу РРСС начиная с новорожденных поросят и дифференцировать их от антител к гетероло-ичным возбудителям болезней свиней в титрах 1:40-1:640. Методы позво-пяют выявлять антитела к вирулентным шт "S 86"и "Самара 96" вируса ЭРСС.

Изучение диагностической ценности РНИФ и ГХ ИФА для обнаружения антител и антигена к вирусу болезни РРСС

Разработанные РНИФ и ГХ ИФА применили при исследовании ipo6 сывороток и проб патматериала от свиней, а также от эксперимен-гально зараженных свиней. От экспериментально зараженных животных

получали пробы до заражения и после заражения в определенной последовательности (Таблица 3). От павших животных исследовали пробы внутренних органов: печени, легких, почек, лимфатических узлов, альвеолярные макрофаги. Результаты исследований проб экспериментально зараженных свиней представлены в таблице 4.

Данные таблиц свидетельствуют, что разработанные нами РНИФ и ГХ ИФА позволяют обнаруживать антиген вируса РРСС и антитела к нему в пробах плеврального эксудата, а также в сыворотках крови больных животных и дифференцировать их от гетерологичных возбудителей болезней свиней.

Эти данные говорят о возможности применения этих методов для диагностики РРСС.

Сыворотки крови свиней (более 500 проб), исследовали в РНИФ и ГХ ИФА. При сравнении полученных данных установили совпадение результатов двух реакций.

Таким образом, в результате проведенных исследований решены поставленные задачи и достигнута цель - разработаны средства и методы лабораторной диагностики позволяющие проводить диагностику репродую-ивно-респираторного синдрома свиней. На основе разработанных РНИФ и ГХ ИФА сконструирован "Набор препаратов для лабораторной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней", который успешно прошел внутриинститутские комиссионные испытания.

Таблица 3.

Обнаружение антител к вирусу РРСС на культуре клеток AMC

мгм Сыворотки крови Титр сыворотки

вРНИФ ГХИФА в РН

1 свиноматки до заражения 0 0 H.H.

2 свиноматки на 28 день после опороса 1:160 1:160 1:16

3 мертворожденного поросенка 1:160 , ... 1:160 1:16

4 поросенка с признаками пореза (до принятия молозива) 1:160 1:160 1:16

5 поросенка с признаками пореза в возрасте трех суток 1:160 1:160 1:16

6 поросенка в возрасте семь дней 1:160 1:160 1:16

7 поросенка в возрасте 1,5 месяца 1:160 1:160 1:16

8 поросенка в возрасте 4 месяца 1:80 1:80 н.и.

9 поросенка в возрасте 5 месяцев 1:80 1:80 н.и.

10 поросенка в возрасте 9 месяцев 1:80 1:80 н.и.

Примечание: • н.и. - не исследовали

Таблица 4.

Результаты исследования экспертизного материала на первичной культуре клеток альвеолярных макрафагах свиней

п=3

исследуемый материал Наличие или отсутствие ЦПД Титр вируса в кк AMC (Lg ТЦД 50/мл)

РНИФ ГХ ИФА

эксудат от мертворожденных поросят! пассаж 0 0

2 пассаж - 0 0

3 пассаж - 0 0

4 пассаж - 34 34

5 пассаж + 4-5 4-5

6 пассаж + 4-5 4-5

печень 10% сусп. (бпас.) - 0 0

легкие 10% сусп. (бпас.) - 0 0

почки 10% сусп. (бпас.) - 0 0

лимфатические узлы 10% сусп. (бпас.) 0 0

патологический материал со свиноводческого комплекса им "50 летия ВЛКСМ", Чамзинского района республики Мордовия

AMC 1 пассаж + 3-4 3-4

2.пассаж + 4,5-5,0 4,5-5,0

3 пассаж + 4,5-5,0 4,5-5,0

печень 10% сусп. (6 пас.) - 0 0

легкие 10% сусп. (6 пас.) - 0 0

почки 10% сусп. (6 пас.) - 0 0

лимфатические узлы 10% сусп. (6 пас.) 0 0

Примечание: - (-) - отрицательный результат;

- (+) - положительный результат.

На основании результатов вирусологических и серологических исследований изолят вируса РРСС депонирован во ВНИИВВиМ как вирус РРСС шт. "Самара 96".

С целью воспроизведения болезни РРСС с выделенным изолятом вируса поставили биопробу на супоросной свиноматке, 88 дней супо-росности. В результатае биопробы на 7 день после инфицирования супоросной свиноматки фиксировали повышение температуры тела до 40,7С.

Опорос наступил на 116 сутки супоросности. Родилось 17 поросят, из них 10 здоровых, 4 мертворожденных, 3 с нервным^ признаками (порез).

В мазках-отпечатках альвеолярных "макрофагах мертворожденных и больных поросят РНИФ обнаружен антиген вируса РРСС . Наблюдали диффузное и гранулярное свечение в цитоплазме клеток.

В сыворотке крови свиноматки на 28 день после опороса обнаружены антитела к вирусу РРСС в РНИФ 1:160, и в РН титр сыворотки, полученной к вирусу РРСС шт "Б 86" со 100 единицами вируса составил 1:32.

В результате проведенной биопробы и постановки РН выделенный изолят вируса был идентифицирован, как изолят вируса РРСС шт. "Самара 96".

Схема лаборатоных исследований по диагностике РРСС

В результате изучения иммунобиологических свойств вируса ре-продуктивно-респираторного синдрома свиней и испытания серологических методов диагностики разработана схема лабораторных исследований по диагностике этой болезни (рисунок 1), в которой предложено при первичном возникновении заболевания проводить, выделение вируса из патматериала(легкие, плевральный эксудат) больных животных на

культуре альвеолярных макрофагов свиней ( РНИФ или ГХ ИФА) с по следующей идентификацией его и, при необходимости, с последующей оценкой патогенности на восприимчивых животных.

В неблагополучных зонах предложено исследовать патологические материал больных и вынужденно убитых животных. Проводить выделе ние вируса на культуре альвеолярных макрофагов свиней, с последую щей его идентификацией.

Ретроспективная диагностика проводится путем выявление анти тел к вирусу РРСС при исследовании сывороток крови животных РНИЗ или ГХ ИФА.

Таким образом, в результате проведенных исследований быт разрешены поставленные перед нами задачи и достигнута цель иссле дований: разработаны средства и методы лабораторной диагностик репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

Рис. 1 Схема лабораторных исследований по диагностикерепродуктивно-респираторного синдрома свиней

Постановка диагноза при Постановка диагноза в не-

первичном возникновении благополучных зонах

заболевания

Ретроспективная диагностика

Исследуемый материал (сыворотки крови животных)

Обнаружение антител РНИФ или ГХ ИФА *

ВЫВОДЫ

1. Изучена репродукция вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на восприимчивых животных и культурах клеток. К вирусу чувствительны клоновый вариант почки зеленой мартышки МА 101 - МАКС-145 и первичная культура клеток альвеолярных макрофагов звиней. Титр вируса в этих культурах клеток достигал 3,5+0,18 и 5,5+0,24 !д ТЦД 50/м„, соответственно.

2. Разработана схема иммунизации свиней. Животных иммуниэ руют инранозально, культуральным вирусом, двукратно, с интервале в две недели. Что обеспечивает получение специфических диагностич ских сывороток к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома, с а тивностью в непрямом МФА и ГХ ИФА 1:80 -1:640.

3. Отработана технология изготовления диагностических антив довых ФИТЦ- и лероксидазных конъюгатов с активностью в РНИФ и Г ИФА 1:32 и 1:80, соответственно.

4. Реакция непрямой иммунофлуоресценции и гистохимичесм вариант иммуноферментного анализа позволяют обнаруживать спец фический антиген вируса в альвеолярных макрофагах поросят, зар женных плевральным экссудатом и альвеолярных макрофагах мертв рожденных или вынужденно убитых поросят, а также антитела, спец фические к вирусу PPC у новорожденных поросят и свиноматок в титрг 1:80-1:320.

5. Определена чувствительность и диагностическая ценность л; боратоных методов исследований - РН, РНИФ, ГХ ИФА для выявлена специфических антигенов и антител к вирусу болезни репродуктивн! респираторного синдрома свиней. Чувствительность РНИФ и ГХ ИФА 10 раз выше, чем РН.

6.' На основании полученных результатов предложена схема лаб< раторной диагностики болезни РРСС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДПОЛОЖЕНИЯ

Разработан и предложен для применения в диагностических и следованиях:

- "Набор диагностических препаратов для лабораторной диагностики р< продуктивно-респираторного синдрома свиней методом флуоресц! рующих антител и гистохимическим вариантом иммуноферментно!

анализа" , на который составлена нормативно-техническая документация {Временная инструкция по изготовлению и контрлю, Технические условия и Наставление по применению, утвержденные директором ВНИИВВиМ).

- "Временные методические указания по лабораторной диагностике респираторно-репродуктивного синдрома свиней", утвержденные директором ВНИИВиМ.

- Разработанные нами средства и методы внедрены в лабораторную диагностику экспертизных материалов в институте.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Балашова Е.А.,Куриннов В.В.,Вишняков И.Ф.,Зуев В.В.,Юрков С.Г. Шевченко Л. В "Чувствительность некоторых перевиваемых куль тур клеток к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней".//Вирусные болезни сельскохозяйственных животных. Те зисы докладов Всероссийской научно-практической конфе ренции, 17-21 апреля, Владимир, 1995, с. 96

2. О.В. Суханова, И.Ф. Вишняков, В.В. Куриннов, Е.А. Балашова, В.М. Лыска "Выявление антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом иммунолероксидазного монослоя'.// Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Тезисы докладов V Всероссийской конференции 14-17 мая, Щелково 1996, с.45

3. Суханова О.В., Балашова Е.А., Куриннов В.В., Вишняков И.Ф. "Выделение и идентификация полевого изолята вируса репродукутивно-респираторного синдрома свиней".// Международ ная научно- практическая конференция молодых ученых, Харьков 1997г.,с.94

4. Суханова О.В., Балашова Е.А., Куриннов В.В., Вишняков И.Ф. "Воспроизведение заболевания репродукгивно-респираторного синдрома свиней на супоросной свиноматке".// Международная научно- практическая конференция молодых ученых, Харько 1997г., с.64

5. Суханова О.В., Балашова Е.А., Куриннов В.В., Вишняков И.Ф. "Изучение персистенции вируса репродукгивно-респираторного синдрома свиней".//Развитие ветеринарной науки на Украине. Сборник материалов международной научно-практической конференции, Харьков 1997г., с.127

6. Вишняков И.Ф., Балашова Е.А., Суханова О.В., Куриннов В.В., Лыска В.М., Хухоров И.Ю., Коростылева Т.С. "Выделение и идентификация вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) в Самарской области"//Ветеринария, N11, с. 16-19