Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Серологическая идентификация P. multocida при помощи реакции коагглютинации

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ. #

^ На правах рукописи

Брежнева Алина Николаевна

Серологическая идентификация Р.тиИос!ёа при помощи реакции коагглютинации.

Специальность 16.00.03. — Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук.

Москва, 1998

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московского государственного университета прикладной биотехнологии

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ

доктор ветеринарных наук, профессор СИДОРОВ М.А.

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук ТАТАРИНЦЕВ Н.Т. кандидат ветеринарных наук, доцент МАСИМОВ Н.А.

Ведущая организация: Всероссийский научно-

исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко

Защита состоится « _1998 г. на заседании

диссертационного совета Д.063.46.03. при Московском государственным университете прикладной биотехнологии (109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке МГУПБ. Автореферат разослан « » _ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета канд.вет.наук

"ЙяТсЕРЕГИН

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Одной из инфекционных болезней животных, имеющих широкое распространение и наносящих большой экономический ущерб, является пастереллез. Пастереллезом болеют многие виды сельскохозяйственных и диких животных и птиц.

Несмотря на значительные успехи в изучении биологии возбудителя и совершенствовании методов лабораторной- диагностики, изыскание новых, достоверных способов индикации и идентификации возбудителя остается актуальной задачей. (Шегидевич Э.А., Федотов В.Б., 1985; Тауба-ев У., Бурлаков В.А.,1991; Rimler R_B.e.a., 1994).

В лабораторной диагностике инфекционных болезней большое значение имеют технически простые, ускоренные методы, доступные в практических условиях. Одним из перспективных способов серологической идентификации микроорганизмов является реакция коагглютинации (РКА), щироко применяемая как экспресс-метод. Впервые РКА. предложена Rronvall G. в 1973 году для диагностики A. pleuropneumoniae, а в дальнейшем успешно примененная отечественными и зарубежными авторами для идентификации стрептококков (Lind С et al., 1979; Астафьева В.К., 1990), энтеробактерий (эшерихий, шнгелл, сальмонелл) (Хазенсон Л.Б., 1980; Sanforn W. et al., 1980; Белая Ю.А. с соавт., 1982; Бритова C.B. с со-авт., 1997); кампилобактерий (Patton С.М., 1986); иерсиний (Femander-Lag L. et аЦ 1988) A.pleuropneumonia (Сидоров М.А.,-Скородумов Д.И., 1985; Hunter D., 1986), а также других микроорганизмов, их токсинов (в том числе и вирусов).

Преимущество РКА в сравнении с существующими серологическими методами заключается в простоте ее постановки, не требующей специального оборудования, в быстроте и надежности учета результатов. По своей специфичности она не только не уступает другим серологическим

реакциям, но зачастую превосходит их. Важным достоинством реакции ко-агглютинацин является возможность исследования культур, склонных к самоагглютинации, а также возможность индикации растворимых антигенов микроорганизмов, включая их токсины.

Применительно к пастереллам РКА изучали Шт1ег Я. (1978); Са-зонкнн В.Н., Гатаринцев Н.Т. (1991). Ими получен антителышй серовари-антный диагностикум для РКА. Других данных в литературе мы не обнаружили. Имеющиеся сведения относительно использования РКА для обнаружения возбудителя пастереллеза и его типизации недостаточны и поэтому необходимы исследования по лому вопросу.

Цели и задачи исследований. Исходя из вышеизложенного и учитывая актуальность проблемы, мы поставили перед собой следующие задачи:

• исследовать возможность использования для изготовления антительных диагностикумов иммунных сывороток на цельноклеточные и кап-сульные антигены Р.тикоаск;

• изучить активность, видовую и серовариантную специфичность антительных диагностикумов на основе нативных и адсорбированных иммунных сывороток, полученных от продуцентов различных видов;

• исследовать в модельных опытах возможность индикации и идентификации на видовом и серовариантном уровне Р.ти1ихас1а в первичных чистых и смешанных культурах и в тканевом материале. Сопоставить результативность идентификации сероваров Р.ти1и>ас1а в РКА и при помощи несерологических методов.

Научная новизна. Отработана методика приготовления антнтель-ных диагностикумов для РКА и установлено, что для их изготовления целесообразно применение антккалсульных кроличьих сывороток; определе-

на зависимость результатов РКА от качественных свойств антигенов P.multocida. Доказано, что РКА - специфичный метод идентификации на видовом и серовариантном уровне культур P.multocida и обнаружения их антигенов в органах животных.

Практическая ценность работы. На основании результатов проведенных исследований предложены антительные диагностикумы для практического применения их в РКА в условиях ветеринарных лабораторий и исследовательских учреждений с целью ускоренной видовой идентификации и серовариантного типирования P.multocida.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на заседаниях Ученого совета ветеринарно-санитарного факультета МГУПБ в 1994, 1996, 1997гг., на 2-ой Международной научно-практической конференции в июне 1997г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано три научных статьи.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов.

Список использованной литературы включает источников, из гак 159 иностранных. Работа иллюстрирована таблицами.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа проводилась в соответствии с планами научных исследований кафедры микробиологии Московского Государственного университета прикладной биотехнологии в период с 1993 по 1997г.

2.1.Материалы и методы.

В опытах были использованы типовые штаммы Pasteurella multocida: штамм 1231 (серовар А), штамм 681 (серовар В), штамм Т-80 (серовар Д), штамм 8504 (серовар Е); 15 эпизоотических штаммов Pasteurella multocida, выделенных от разных видов животных в разных зонах РФ: 6 штаммов, выделены от свиней при пастереллезе в Липецкой области; 5 культур, выделены от крупного рогатого скота при остром пастереллезе в Тверской области; 4 штамма - от нутрий, выделены Агаевой Э.М. в Азербайджане. Кроме того, использовали штаммы следующих видой бактерий: A.pleuropneumoniae штамм Н 404; Escherichia coli шт l&28; Bacillus cereus шт 370; Bacillus mycoides шт 537; Bacillus mesentericus шт 1228; Salmonella typhimurium шт 415; Proteus vulgaris nrr 14; Streptococcus pyogenes шт гр. A 284; Staphylococcus epidermidis nrr 4990 ( получены из музея культур кафедры микробиологии МГУ! Lb). Staphylococcus aureus шт Cowan 1 получен из ВГНКИ вет.препаратов; культуру S.aureus urr Cowan 1 использовали для приготовления активной по белку А стафилококковой суспензии, применяемой в качестве иммуносорбента.

Опытные животные: 12 кроликов породы шиншилла живой массой 2-3 кг, 50 беспородных белых мышей живой массой 15-20 г.

Перед использованием культуры типовых штаммов P. multocida подвергали исследованию на диссоциацию. С этой целью лиофильно высушенные культуры четырех серологических вариантов P.multocida после ре-

гидратации.высевали на питательную среду для выращивания Р.тиксюёа, предложенную М.А. Сидоровым с соавторами (1984). После 18-24-часового культивирования при 37°С культуры рассевали на чашки Петри с этой средой, через 24 часа выращивания колонии изучали при помощи стереоскопического микроскопа МБС-1 в косопроходящем пучке света ( Акатова Н.С., 1966) и отбирали для последующей работы Б- клоны.

Культуральные свойства пастерелл исследовали на агаре и бульоне Хоттингера ( содержание аминного азота 250 - 300 мг%, рН 7,2 -7,4 ), гемолитическую активность - на агаре Хоттингера с 5% дефибринированной крови барана. Учет проводили после 12-, 24- и 48-часового выдерживания посевов при 37°С в термостате.

Подвижность микроорганизмов исследовали методом "висячей" капли.

Капсулообраэование выявляли по методу Гинса.

Сахаролитические свойства пастерелл изучали на питательных средах Гисс^ с 1% лактозы, ксилозы, маннозы, галактозы, сорбита, маннита, дульцита.

Индолообразование определяли по методу Эрлиха-Боме; образование сероводорода при помощи фильтровальной бумаги, пропитанной 10%-ным раствором уксуснокислого свинца. Почернение индикаторной бумаги в МПБ оценивали как присутствие сероводорода.

Редукцию нитратов изучали путем выращивания культуры в МПБ с 1% КЫОз в течение 1-2 суток, затем добавляли реактив Грисса. Появление фиолетово-красного окрашивания среды оценивали как присутствие нитратов.

Для выявления протеолитической активности культуры бактерий засевали уколом в 10% -ную МПЖ. Культивирование посевов проводили в течение 10 суток.

Патогенность изучаемых культур испытывали путем заражения беспородных белых мышей суспензией бактерий, концентрацией 1 млрд.м.к. в см3 по оптическому стандарту мутности . Суспензию вводили внутрибрю-шинно в дозе 0,5 см3.

В реакции коагглютинации испытывали различные антигены из пас-терелл: а) капсульный растворимый антиген по Картеру; 24-часовую бульонную культуру Р.тиЬоыск в Б- форме засевали на агаровую среду, культивировали 18 часов при температуре 37°С. Выросшую культуру смывали 0,85%- ным раствором натрия хлорида (рН 7,0), доводили концентрацию бактерий до 10 млрд. микробных клеток в см3 по оптическому стандарту мутности, суспензию прогревали в течение 30 минут при 56°С в водяной бане, и центрифугировали 20 минут при 5000 об/мин. В качестве антигена использовали прозрачную над осадочную жидкость, б) Формолантиген: в суспензию бактерий 16-18-часового возраста определенного серо варианта пастерелл концентрацией 10 ЕМ по оптическому стандарту мутности, добавляли 0,3% формальдегида и выдерживали 48 часов при 37°С. в) Кипяченый антиген: суспензию бактерий, концентрацией 10 ЕМпо оптическому стандарту мутности, кипятили в течение 20 минут, г) Надосадочная жидкость бульонной культуры: 18-20-часовую бульонную культуру центрифугировали при 5000 об/мин в течение 30 минут, над осадочную жидкость использовали в качестве антигена, д) Бактерии без капсулы: осадок бактерий после приготовления капсульного антигена.

Гипериммунные бараньи сыворотки серологических вариантов А, В, Д пастерелл на цельную бактериальную клетку получены из лаборатории бактериологии ВНПИЭВ им. Я.Р.Коваленко от профессора Э.А. Шегиде-вича.

Гипериммунные кроличьи сыворотки получали иммунизацией кроликов капсульными антигенами Р.тикос1с1а (по два кролика на каждый се-

ровар) по схеме, разработанной М.А.Сидоровым с соавторами и описанной в «Методических рекомендациях по изготовлению типоспецифических сывороток и их применению для серологической типизации P.multocida» (1984).

Серотиповую принадлежность изучаемых штаммов пастерелл, используемых в качестве антигенов для реакции коагглютинации и типоспе-цнфические свойства гипериммунных сывороток определяли в реакции диффузной преципитации по Оухтерлони (195.1); типирование пастерелл также проводили в тесте задержки роста пастерелл культурой S. aureus, продуцирующей гиалуронидазу и в пробе с трипафлавином (Сидоров М.А. и др., 1995).

Пробирочную реакцию коагглютинации в объеме 1 см3 ставили согласно Gunnarsson A. et al. (1977); пластинчатую РА в соответствии с рекомендациями Mittal К. et al. (1982). Результаты пробирочной и пластинчатой РА оценивали по общепринятым для этих реакций критериям по четырех бальной системе.

Статистическую обработку результатов исследований проводили по методике Урбах (1963).

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Изучение биологических свойств типовых и эпизоотических щтаимов P.multocida. Были исследованы свойства 19 типовых и эпизоотических штаммов P.multocida. При микроскопии мазков из 18-24-часовых бульонных и агаровых культур P.multocida окрашенных по Граму, бактериальные клетки представляли собой мелкие короткие грамотрица-тельные палочковидные бактерии (0,3 х 1,5 мкм), расположенные одиночно, попарно, иногда в виде коротких цепочек.

Все штаммы Р.ти1Юас1а давали характерный рост на жидких питательных средах (МПБ и бульоне Хотгингера); на плотной питательной среде (агаре Хотгингера) к 18-24 часам формировали три типа колоний: гладкие, мелкие, прозрачные, слегка выпуклые с голубоватым оттенком ( Б-форма); крупные непрозрачные с гладкими краями слизистые (М-формы); непрозрачные, шероховатые с неровными краями (К- форма).

По данным изучения типовых штаммов количественное соотношение колоний различных типов в популяции Р.тиИошёа разных сероваров отличалось. Так, процентное содержание 8- форм колоний у серовара А составляло 57+0,58%, у серовара.В - 67±0,34%, у серовара Д - 50+ 0,0%, у серовара Е - 60+0,34%. Процентное содержание М-форм колоний у серовара А составляло 12+0,34%, у серовара В - 10+0,58%, у серовара Д -16+0,0% и серовара Е - 14+0,58%. Л-форм колоний у серовара А было, 31+0,58%, у серовара В - 23±0,0%, у серовара Д - 34+0,34%, у серовара Е - 26+0,58%. Сравнительно больший процент Я-форм колоний образовывала культура серовара А и наименьший - серовара В.

С целью получения культур с полноценной антигенной структурой мы провели селекцию, в результате которой до 80-90% выросших колоний на плотной питательной среде находились в Б-форме.

Наиболее пригодна для поддержания селекционированных культур Р.тикос1с1а в Б-форме оказалась среда Хотгингера (аминный азот 200-210 мгУо; рН 7,2-7,4), содержащая 0,1% маннозы, глюкозы и рамнозы, предложенная М.А.Сидоровым с соавторами (1984).

Ферментативная активность штаммов Р.ти1юа<1а имела незначительные отличия. Культуры серовара А, в отличие от других сероваров, не ферментировали декстрозу и галактозу, а культуры серовара Д не ферментировали ксилозу и галактозу. Культуры всех четырех сероваров ферментировали сорбит, маннит, сахарозу, глюкозу, мальтозу и маннозу, а также

образовывали индол и сероводород. Культуры эпизоотических штаммов Р.тиНоаёа (согласно с делением Р.ти11ос1(1а на три биовара) различались по ферментации сорбита и дульцита: ни одна из них не ферментировала дульцит и 33,3% ферментировали сорбит. Маннозу с образованием кислоты без газа разлагали 21+0,0% штаммов, галактозу - 40+0,34%; 53+0,34% штаммов не образовывали сероводород. Культуры как типовых, так и эпизоотических штаммов не ферментировали глицерин, инулин, арабинозу, лактозу, рафинозу, не свертывали молоко, не. разжижали желатин, были уреаза отрицательные.

Патогенные свойства пастерелл определяли биопробой на белых мышах, заражая их внутрибрюшинно суспензией бактерий 24-часовой культуры в дозе 0,5 млрд. м.к. Наблюдение за животными проводили в течение 5 дней. В качестве критерия вирулентности брали сроки гибели зараженных животных. Наибольшей вирулентностью обладали культуры се-ровара В: срок гибели 22,6+ 0,6 часов. Мыши, зараженные сероваром А погибли через 46+1.15 часов; менее вирулентным оказался серовар Д - гибель животных через 70,3+1,1 часа.

Проведенные исследования показали, что по совокупности биологических свойств штаммы Р.тикоас1а, использованные в работе, соответствовали виду Р.тикос1(1а.

2.2.2. Получение кроличьих гипериммунвых сывороток против капсулыюго аптигепа Р.тиНосМа. Антигены • для гипериммунизации кроликов готовили из предварительно селекционированных штаммов Р.тикос1с1а серологических вариантов А, В, Д и Е.

Для восстановления капсулы все штаммы пассировали на среде для выращивания Р.тикоа<1а (М.А.Сидоров с соавт., 1984). Как правило, требовалось провести 2-3 пассажа, чтобы капсульные формы составляли 8090% в популяции. Селекционированные культуры выращивали 18-24 часа

при 37°С на этой среде, бактериальную массу смывали 0,85%-ным раствором натрга хлорида (рН 7,0), доводили концентрацию клеток до 40 млрд.м.к. в 1 см3 по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасеви-ча. Суспензию бактерий прогревали 30 минут при 56°С в водяной бане, центрифугировали 30 минут при 5000об/мин. Надосадочную жидкость -капсульный антиген по Картеру - использовали для иммунизации кроликов.

Продуцентами сывороток служили кролики породы шиншилла живой массой 2-3 кг.

Капсульные антигены сначала вводили кроликам двукратно подкожно, с промежутками пять дней в дозах 1 и-2 см3. Через семь дней три дня подряд вводили антиген внутривенно в объеме 0,1; 0,5 и 0,5 см3..После трехдневного перерыва антигены три дня подряд вводили одновременно внутривенно (1, 2 и 2 см3) и внугрибрюшинно (0,5; 1 и 1 см3). Через три дня делали две инъекции антигенов: первый раз внутривенно 5 см3 и внут-рибрюшинно 1 см3 и через три дня - только внутривенно по 5 см3. Через 710 дней после заключительной инъекции кроликов обескровливали.

Гипериммунные сыворотки консервировали добавлением к ним борной кислоты (0,1%) и хранили при температуре +4°С.

Серологическую активность сывороток исследовали в пробирочной реакции агглютинации (РА) с гомологичными корпускулярными антигенами, которыми служили селекционированные культуры четырех серова-ров Р.тикоиск 18-20-часового возраста, выращенные на агаровой питательной среде для выращивания пастерелл. Бактериальную массу смывали с поверхности питательной среды 0,85%-ным раствором натрия хлорида, однократно отмывали центрифугированием, устанавливали концентрацию 10 ЕМ по оптическому стандарту мутности, добавляли 0,1% формальдегида и выдерживали при +37-38°С 48 часов.

К ром? кроличьих гипериммуниых сывороток в работе использовали пшериммунные бараньи сыворотки, полученные на корпускулярный антиген P.multocida сероваров Л, В, Д. Бараньи гипериммунные сыворотки любезно предоставлены профессором Э.А.Шегидевичем.

Как кроличьи, так и бараньи иммунные сыворотки обладали достаточно высокой серологической активностью. В пробирочной РА кроличьи сыворотки серовара А имели титр агглютининов 8,67+ 0,58 log; серовара В - 9,33+ 0,58 log; серовара Д - 9,00±0,01 log; серовара Е - 8,67±0,58 log. Активность бараньих сывороток серовара А составила 7,00+0,0 log; серовара В - 7,67+0,58 log; серовара Д - 6,67 ± 0,58 log.

2.2.3. Получение нммуносорбента S.aureus. Для приготовления иммуиосорбента культуру стафилококка штамма Cowan 1 выращивали на агаре Хоттингера в чашках Петри (рН 7,2 - 7,4; аминный азот 120 мг%) в течение 18 часов и в жидкой питательной среде в ферментере. Культивирование в ферментере осуществляли в бульоне Хоттингера с 1% глюкозы ( аминный азот 120 мг %; скорость вращения мешалки 250 об/мин; подача стерильного воздуха из расчета 0,7 л/мин; рН 1,2-1,А) в течение 9 часов.

Полученную тем или иным способом бактериальную массу стафилококка двукратно отмывали центрифугированием В фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,4), ресуспендировали в 0,5%-ном растворе формальдегида. Готовили суспензию концентрацией 70 млрд.м.к. в см3 по оптическому стандарту мутности. Обработанные формальдегидом клетки четырехкратно отмывали буферным раствором. Суспензию клеток прогревали в водяной бане при +80°С пять минут и использовали в качестве иммуиосорбента (Kronvall G., 1973).

Определение активности протеина A S.aureus осуществляли по методу Каральник Б.В. с соавторами (1977), используя эритроциты барана, сен-

сибилизированные гемолитической сывороткой (антиэритроцитарная кроличья сыворотка).

Содержание белка А в клетках стафилококков, выращенных на агаре Хоттингера составило 5,7 +0,34 log (титр РИГА), в бульоне Хоттингера в ферментере - 4,6 ± 0,34 log. Учитывая практически одинаковое содержание А- протеина в клетках агаровых и бульонных культур, в дальнейшей работе стафилококковую бакмассу получали культивированием в ферментере в бульоне Хоттингера. Полученная таким способом биомасса пригодна для использования в качестве полноценного сорбента иммуноглобулина.

2.2.4. Приготовление и испытание в РКА антнтельных диагностик-умов P.multocida на основе неадсорбнрованных иммунных сывороток. Для изготовления антительного диагностикума кроличьи антикап-сульные й бараньи антикорпускулярные сыворотки P.multocida разводили фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2) 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80. К каждому из разведений сыворотки добавляли равный объем стафилококковой суспензии и далее по методу Kronvall G. (1973) готовили моновалентные антительные диагностикумы к каждому серовару P.multocida.

Активность полученных антительных диагностикумов испытывали в капельной и пробирочной РКА с гомологичными антигенами.

В таблице 1 показана зависимость активности антительных диагностикумов от титра исходных иммунных сывороток.

Как видно из представленных в таблице 1 данных, в целом на основе иммунных сывороток с высокой серологической активностью были получены более активные диагностикумы.

Исследование серо вариантной специфичности нативных иммунных сывороток и диагностикумов на их основе выявило большую специфичность ангикапсульных кроличьих сывороток и диагностикумов из них. Ба-

раньи антикорпускулярные сыворотки и диагностикумы нгц их основе вступали в перекрестные реакции с гетерологичными антигенами в титрах 3,00 ± 0,00 - 5,67+0,58 log и 2,33±0,58 - 6,00±0,00 log соответственно.

Таблица 1.

Результаты оценки активности аптптельных диагноспгкумов на

основе нативиых кроличьих и бараньих антнсывороток.

Диагностикум (серовар) Титр исходной сыворотки в пробирочной РА с гомологичным антигеном Тигр диагности-кума в пробирочной РКА с гомологичным антигеном Активность ди-агностикума в РКА с гомологичным антигеном на стекле

X 5 X 5

На основе кроличьих сывороток

А 8,67 0,58 9,00 0,00 ' мм

В 9,33 0,58 9,67 0,58 -н-н-

Д 9,00 0,00 8,33 0,58 i 1 и

Б 8,67 0,58 9,00 0,00 1 1 1 +

На основе бараньих сызороток

А 7,00 0,00 6,67 0,58

В 7,67 0,58 7,33 0,58 -н-н-

д 6,67 0,5* 7,00 0,00 1 i 1 1

Результаты капельной и пробирочной PICA показали, что активность и серо вариантная специфичность ди&гностикумов зависит от дозы иммунной сыворотки, взятой для сенсибилизации носителя. При дозе сыворотки 0,1 и 0,05 см3 (разведение сывороток для сорбции на стафилококки 1:10 и 1:20) получали диагностикумы, проявляющие перекрестные реакции меж-

ду сероварами А, В и Д; уменьшение дозы кроличьих антикапсульных сывороток до 0,025 см3 и 0,0125 см3 (разведение сывороток 1:40 и 1:80) позволило дифференцировать указанные ссровары, не прибегая к адсорбции сывороток.

При использовании бараньих иммунных сывороток на цельнокле-точный антиген Р.тикос1(1а такой методический прием, включающий разведение сыворотки, не позволил избежать перекрестных реакций. Видимо, в этих сыворотках и диагностикумах на их основе в достаточно большом количестве присутствуют антитела против видовых антигенов.

2.2.5. Результаты испытания аитительных днагностнкумов на основе адсорбированных иммунных сывороток. С целью повышения серовариантной специфичности диагностикумов на основе бараньих иммунных сывороток перекрестнореагируюнцие антитела из сывороток элиминировали путем многоступенчатой адсорбции. Для проведения адсорбции на 1 см3 гипериммунной сыворотки брали 50 млрд. микробных клеток штамма - сорбента. Микробный сорбент - штаммы четырех сероваров Р.тиИоЫ(1а раздельно высевали на агаровую питательную среду для выращивания пастерелл и культивировали 18 часов при +37°С. Селекционированные культуры смывали 0,85% -ным раствором натрия хлорида с содержанием 0,1% формальдегида, установив концентрацию 10 ЕМ по оптическому стандарту мутности.

Затем необходимое количество бактериальной суспензии центрифугировали при 5000 об/мин 15 минут, после удаления надосадочной жидкости к седименту добавляли иммунную сыворотку, осадок ресуспендирова-ли, взвесь выдерживали два часа при +37°С и 16-18 часов при +4-6°С. После чего сыворотку центрифугировали при 5000 об/мин 15 минут. Адсорбированную сыворотку проверяли в пробирочной РА с гомологичным ан-

тнгеном на активность и с гетерологичными антигенами на специфичность.

Доза адсорбента зависела от титра антител сыворотки и серовара антигена. Для получения типоспецифических бараньих сывороток серовара А потребовалось 200 млрд.м.к. антигена В, 50 млрд.м.к. антигена Д и 50 млрд.м.к. антигена Е; сыворотки серовара В - 250 млрд.м.к. антигена А, 100 млрд.м.к. антигена Д; сыворотки Д - 150 млрд.м.к. антигена В, 50 млрд.м.к. антигена А и 50 млрд.м.к. антигена Е.

Серологическая активность адсорбированных бараньих сывороток и диагностикумов на их основе снизилась в сравнении с таковыми у натив-ных сывороток и диагностикумов из них и составила 5,33 +0,58 log, 6,00+0,00 log, 6,67+0,58 log у сывороток сероваров А, В, Д соответственно; 5,67+0,581og,7,00+0,00 log, 5,67+0,58 log у диагностикумов соответствующих сероваров. Тем не менее, типовая специфичность диагностикумов, изготовленных на адсорбированных бараньих сыворотках, повысилась. В PICA не отмечали перекрестных реакций. Следовательно эти диагностику-мы обладают типовой специфичность«?, но более низкой активностью.

2.2.6. Влияние вида антигена P.multocida на типовую специфичность результатов реакции коагглготннащш. Как показали наши исследования возможность серовариантной дифференциации P.multocida также зависит от варианта используемого антигена. В качестве антигенов для PICA применяли: капсульный растворимый антиген по Картеру; живую 1820- часовую агаровую культуру; формолаятиген (убитые формалином 1618-часовые агаровые культуры); надосадочную жидкость 18-20-часовой бульонной культуры; бактерии без капсулы (осадок бактерий после приготовления капсульного антигена); кипяченый антиген (суспензия бактерий, концентрацией 10 ЕМ по оптическому стандарту мутности, прогревание 20 минут при 100°).

Проведенные исследования показали, что для РКА с целью типизации пастерелл целесообразно использовать капсульный антиген по Картеру или живые бактерии (18-20-часовые колонии с агара).

2.2.7. Изготовление в испытание диагиостикума для видовой идентификации P.multocida в РКА. Для ускоренной идентификации пастерелл на уровне вида мы приготовили поливалентный антительный диаг-ностикум. Для этого объединяли в равных объемах кроличьи антикапсуль-ные моносыворотки четырех сероваров P.multocida и из такой комплексной сыворотки готовили видовой диагностикум. Аналогичным способом получили полидиагностикумы на основе нативных и адсорбированных бараньих сывороток.

Диагностикумы на основе кроличьей и бараньей нативных сывороток обладали достаточно высокой активностью, а видовой диагностикум на основе адсорбированной бараньей сыворотки был менее активен.

С целью оценки специфичности видовые антительные диагностикумы испытывали в РКА с гетерологичными видами бактерий: A.pleuropheumoniae, Escherichia coli, Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Salmonella dublin, Proteus vulgaris, Streptococcus pyogenes. Результаты исследований показали высокую специфичность диагностикумов, ни с одним из указанных видов бактерий перекрестных реакций не отмечали.

Таким образом, для первичной идентификации P.multocida на видовом уровне целесообразно применение йоливалентных диагностикумов в РКА!

2-2.8. Определение чувствительности РКА. В качестве антигена использовали суспензию бактерий 18- часовых агаровых культур P.multocida четырех сероваров различной концентрации (20, 2, 1 млрд., 200, 20, 2 млн. м.к. в см3 по оптическому стандарту мутности), а также

капсульные антигены, полученные из бактериальных суспензий аналогичных концентраций.

Результаты исследований показали, что чувствительность реакции коагглютинации зависит от активности диагностикума и от количества микробных клеток в исследуемой суспензии. Приготовленные нами диаг-ностикумы агглютинировались при добавлении к ним не менее 200 млн. M.K.//U/*

2.2.9. Изменение активности н специфичности диагностикумов в процессе хранения. Мы наблюдали за изменением активности и специфичности антительных диагностикумов в процессе хранения в жидком виде при + 4-6°С.

Активность диагностикумов оставалась практически неизменной в течение 5-6 месяцев хранения, после чего она постепенно снижалась. Ди-агностикумы, имевшие изначально более высокие титры, длительнее сохраняли активность, например, их титры через 10-12 месяцев составили в пробирочной РКА 5,00+0,0 - 5.67+0,58 log.

Серовариантная специфичность антительных диагностикумов в процессе хранения несколько повышалась в сравнении с исходной.

2.2.10. Серологическая идентификация P.raultocida в первичных

культурах при помощи РКА. Полученные антительные диагностикумы

испытывали для серологической идентификации P.multocida в первичных

сгт^ё&у

культурах, выращенных на различных питательных средах, с учетом длительности культивирования, присутствия гетерологичных видов бактерий, состояния культуры.

Пастереллы культивировали на агаре Хоттингера при + 37°С в течение 72 часов и суспензии бактерий из колоний различного типа (S-, R-, М-

формы) исследовали в РКА через 6,12, 24, 36,48 и 72 часа с видовыми и типовыми диагностикумами.

Посредством антительных пастерелезных диагностикумов наряду с типичными формами были выявлены и измененные формы пастерелл, причем агглютинация с бактериями в М-форме была выражена значительно слабее, чем с S-колониями. R-формы P.multocida обнаружили в РКА более низкую серологическую активность и серовйриантную специфичность.

Наибольшей серологической активностью обладали культуры 12-24-часового возраста, интенсивность РКА с ними - на 4 креста; с 6-часовыми культурами — на' 3-2 креста. По мере старения культур их активность как антигенов в РКА снижалась.

Видовые и моновалентные антительные диагноста кумы не реагировали в РКА ни с одной из культур гетерологичных видов бактерий (стафилококков, стрептококков, сальмонелл, эшерихий, бацилл). Исследовали следующие сочетания P.multocida с другими видами бактерий в МПБ: A.pleuropneumoniae + P.multocida A; S.pyogenes + P.multicida В; E.coli + P.multocida D; B.cereus + P.multocida E; P.vulgaris + E.coli; B.mycoides + S.pyogenes й другие. В смешанных культурах положительные показания РКА отмечали во всех сочетаниях, где присутствовали культуры P.multocida, но при условии их концентрации не менее 200 млн.м. к7см3.

С помощью видовых и моновалентных антительных диагности кумов в РКА были исследованы в смешанных и чистых культурах 15 зашифрованных штаммов P.multocida различных сероваров, выделенных при пастерелл езе от разных видов животных в разных зонах РФ, а также типовые штаммы P.multocida. Параллельно серовариантную принадлежность культуры устанавливали несерологическими методами (трипафлавиновый и стафилококковый тесты).

Исследование проводили в два этапа: первоначально при помощи видовых диагностикумов устанавливали наличие P.multocida, затем в РКА

с моновалентными адсорбированными диапюстикумами определяли серо-вар возбудителя. Показания РКА совпали с данными типйрования штаммов несерологическими методами и с ранее проведенной типизацией их в РДП. Все штаммы при помощи поливалетного диагноста кума в агаровых и бульонных культурах удалось идентифицировать на уровне вида и при помощи типовых адсорбированных диагноста кумов на уровне серовара. В частности, к серовару А отнесли 13,34% штаммов, серовару В — 66,0% штаммов, к серовару Д - 26,66% штаммов.

2.2.11. Обнаружение антигенов Р.тиИос1(1а при помощи РКА в тканевом материале. Для исследований отбирали от клинически здоровых животных (туши крупного рогатого скота и свиней после убоя) образцы легочной ткани, селезенку, печень, лимфоузлы. Все образцы подвергали бактериологическому исследованию и ни в одном случае возбудителей специфических бактериальных инфекций, в т.ч. Р. тииос1<1а выделено не было.

При помощи миксера готовили тканевый фарш, затем соединяли 50 г измельченной ткани с равным объемом фосфатно-солевого буфера (рН 7,27,4), гомогенат центрифугировали при.2000 об/мин 15 минут, надосадоч-ную жидкость декфггировали и подвергали исследованию в РКА.

Первоночально апробировали видовой, а затем моновалентные диаг-ностикумы. В ходе опытов отмечали положительные реакции с испытуемым материалом как с поли-, так и с монодиагностикумами. Видимо неспецифическая агглютинация связана с наличием в образцах ^О тканей. Чтобы избежать неспецифических реакций, испытуемый материал подвергли термической обработке: кипячение 10 минут, 60 минут, автоклави-рование при 120 градусах 15 минут. Результаты указанных опытов показали, что прогревание тканевых образцов позволило устранить неспецифическую агглютинацию. Исследование влияния прогревания суспензий

Р.тикос1(1а и гетерологичных ввдов бактерий на результаты РКА свидетельствовали, что кипячение в течение 10 минут практически не влияло на их активность и специфичность в РКА. Длительное кипячение и автокла-вирование снижает активность антигенов штаммов Р.тиИос1с1а. Антигены из культур стафилококков, эшерихий, бацилл, сальмонелл, прогретые при всех режимах, не агглютинировали диагноста кумы всех сероваров.

2.2.12. Выявление антигенов Р.тиНоасЫ в органах лабораторных животных при помощи РКА. Культурой каждого серовара Р.тиЬоаёа заразили по 10 мышей живой массой 16-18 г в дозе 500 млн-.м.к. внутри-брюшинно. Органы павших животных (печень, селезенку, легкие, почки) подвергли бактериологическому исследованию с целью выявления культур Р.тиИоыск. Из паренхиматозных органов готовили 10%-ные суспензии в 0,85% -ном растворе натрия хлорида, кипятили в течение 10 минут, центрифугировали, после чего надосадочную жидкость применяли как антиген в РКА с видовыми и моновалентными диагноста кумами.

По результатам РКА чаще пастереллы выявляли в селезенке - 7080% из 100%; почках, печени и легких - 50- 70%. Показания РКА в ряде случаев совпадали с данными бактериологическими. Как следует из полученных результатов чувствительность РКА уступает классическому методу выявления Р.шикос1(1а путем высева на питательные среды. В тоже время РКА как экспресс-метод, позволяющий ставить диагноз на видовом и серовариантном уровне представляет практический интерес, однако, необходимо для исследования отбирать органы с максимальной концентрацией возбудителя: селезенку, легкие, почки.

3. выводы.

1. Экспериментально обоснована методика приготовления антительного диагностикума для серологической идентификации Pasteurella multocida в реакции коагглютинации, включающая выращивание штамма стафилококка (иммуносорбента) в жидкой питательной среде, изготовление инактивированной суспензии и .адсорбцию на клетки стафилококка типоспецифических иммуноглобулинов против капсульных антигенов пас-терелл различных серологических типов.

2. При культивировании штамма стафилококка Cowan 1 в бульоне Хоттингера (аминный азот 120 мг%, рН 7,2-7,4) с 1% глюкозы в лабораторном ферментере при постоянном перемешивании и аэрации в течение 8-9 часов удается получать биомассу с содержанием протеина А (основной компонент, сорбирующий иммуноглобулины) в пределах 4,6±0,34 log. Полученная таким способом биомасса пригодна для использования в качестве полноценного сорбента иммуноглобулинов.

3. Для изготовления антитеЛьного диагностикума in биомассы штамма Cowan 1 можно использовать антикапсульные кроличьи сыворотки, а также противопастереллезные сыворотки овец, полученные на цельные микробные клетки. Однако, из сывороток на цельные микробные клетки необходимо удалять гетерогенные антикапсульные антитела путем 2-3-х кратной адсорбции суспензией пастерелл гетерологичнных вариантов.

4. С целью повышения типовой специфичности диагностикумов сорбцию антакапсулышх иммуноглобулинов на клетках стафилококка необходимо проводить из сывороток, разведенных в 40-80 раз (в зависимости от ее исходной активности). При таком методе сорбции достигается уменьшение в сыворотке гетеролопгчньгх антител и оптимизируется про-

цесс сорбции типоспецифических иммуноглобулинов на молекулах протеина А стафилококка.

5. По разработанной методике приготовлены антительные диаг-ностикумы четырех серотипов P.multocida (А, В, Д и Е) активностью от 8,33±0,58 log до 9,67±0,58 log (на основе кроличьих антикапсульных сывороток) и 5,67±0,58 - 7,00±0,00 log (на основе бараньих адсорбированных сывороток). Серии диагностикумов в РКА давали положительные реакции только с гомологичными капсульными антигенами пастерелл, что указывает на их типовую специфичность.

6. В качестве антигена при постановке РКА с приготовленными антительными диагностикумами необходимо использовать или живую 1820-часовую агаровую культуру в S-форме, или капсульный антиген по Картеру из суспензии указанных культур. Формолантигены и убитые нагреванием культуры пастерелл не обладают типоспецифичностью.

7. При типизации культур P. multocida реакцией коагглютинации в качестве антигена целесообразно использовать суспензию агаровой культуры, содержащую не менее 200 млн.микробных клеток.

8. Первичная идентификация P.multocida на видовом уровне может быть проведена в РКА с помощью поливалентного диагносгикума и при помощи типовых адсорбированных диагностикумов на уровне серова-ра.Полученные антительные пастереллезные диагноста кумы позволяют выявлять пастереллы как в чистых, так и в смешанных культурах с гетеро-логичными видами бактерий (стрептококки, сальмонеллы, эшерихии, бациллы).

9. Используя приготовленные антигельные диагноста кумы, проведена серологическая типизация зашифрованных 15 эпизоотических культур пастерелл различного зоологического происхождения.Из них к се-ровару А отнесено 13,34%; к серовару В - 60,0%; серовару Д - 26,66%. Результаты типирования в РКА совпадали с ранее проведенной типизацией

этих культур в реакции преципитации и данными несерологических тестов (трипафлавинового и акрифлавинового).

10. При помощи антительных диагностикумов представляется возможным проводить индикацию и идентификацию сероваров пастерелл в органах и тканях экспериментально инфицнрованных мышей. При исследовании тканевого материала в РКА необходимо подвергать его термической обработке, что позволяет устранить неспецифическую агглютинацию.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Для практического применения в ветеринарных и научных лабораториях с целью идентификации и серотипизации Р.ти1оас1а предложена реакция коагглютинации. Постановка РКА включает приготовление видовых и моновалентных диагностикумов, для получения которых необходимо использовать иммунные сыворотки на капсульный антиген Р.тииоасЬ, разведение сыворотки для сорбции на протеин А стафилококка должно быть не менее 1:40; агглютинация наблюдается при условии концентрации возбудителя не менее 200 млн. м.кл.

На основании проведенных исследований разработаны " Методические рекомендации по изготовлению и применению коагглютинирующих антительных диагностикумов для экспресс-идентификации Раз(еиге11а тиНоас1а",утвержденные РАСХН 23 апреля 1998 года.

5.СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1. Применение антительных диагностикумов на основе бараньих сывороток для серотипировании Р.ти1{ос1<1а в реакции коагглютинации. / Тезисы докладов 2-й Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы вет-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции"гМосква,1997./

2. Типизация Р.шиИас1ёа в реакции коагглютинации. / Тезисы докладов 2-й Международной научно-практической конференции" Актуальные проблемы вет-сантарного контроля сельскохозяйственной продукции",Москва, 1997/.

3. Реакция коагглютинации для серотипизации Р.тииоайа. /"Ветеринария", Москва, № 9,1997/.

ГПП «Печатник» Зак. 252 - 80