Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Реакция коагглютинации для серологической типизации культур HAEMOPHILUS PLEUROPNEU-MONIAE и индикации возбудителя в патологическом материале

РГ6 од

1 ?м!$&сшк:тво сельского хозяйства

российской федерации

всеюссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

На правах рукописи

БЛЕМУ Жорж

реакция ко агглютинации для серологической типизации культур haemophilus pleuropneumonie и индикации возбудителя в патологическом материале

3.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва 1993

Работа выполнена на кафедре микробиологии и биотехнологии Московской Государственной академии прикладной биотехнологии

Научные руководители — доктор ветеринарных наук,

профессор СИДОРОВ М.А.

- кандидат ветеринарных наук, доцент СКОРОДУМОВ Д.И.

Официальные

оппоненты — доктор ветеринарных наук

ТАТАРИНЦЕВ Н.Т. (ВГНКИ)

— кандидат ветеринарных наук ЮДИН А.И. (ВИЭВ)

Ведущая

организация — Московская ветеринарная ака-

демия им. К.И.Скрябина

Защита состоится "22" 'апреля 1993 г. в 16 час. на заседании специализированного совета Д.120.85.01 при Всероссийском Государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов по адресу: 123022. г.Москва, Звенигородское шоссе дом 5 ВГНКИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ.

Автореферат разослан " " 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

Ю.А.КОЗЫРЕВ

1. общая характеристика работы

Актуальность темы. Гемофилезная плевропневмония —

инфекционная болезнь свиней, получившая широкое рас-________________

пространение во многих странах в связи с изменением технологии ведения свиноводства. Болезнь наносит значительный экономический ущерб, являясь серьезной угрозой промышленному свиноводству.

Отход среди заболевших поросят после отъема иногда достигает 100% В хозяйствах России возбудитель гемофи-лезной плевропневмонии впервые выделен от больных пневмонией свиней в 1980 году М.А.Сидоровым и Д.И.Скоро-думовым.

В последние годы предприняты интенсивные исследования биологии, экологии возбудителя, разработки методов диагностики и мер борьбы с болезнью ( Nakai et а1., 1983, Ro-sendal S. et a 1.,1988, Сидоров, Д.И.СкородумовД.И.Лаврен-тьев, 1984).

Возбудитель гемофилезной плевропневмонии, по данным серологических реакций, имеет 12 серологических вариантов (типов) по капсульному антигену. Точная серологическая идентификация выделенных культур гемофильных бактерий одно из условий достоверной диагностики и эффективной специфической профилактики гемофилезов. Поэтому эффективность лабораторных исследований зависит прежде всего от качества применяемых диагностических препаратов. В этой связи очевидно, что совершенствование методики их приготовления и выбор оптимальной схемы использования представляют интерес для практики борьбы с гемофилезной плевропневмонией свиней.

В последнее время было уделено внимание при диаго-стике многих бактериальных инфекций реакции коагглюти-нации. Принцип реакции коагглютинации основан на способности белка А, компонента наружного слоя клеточной стенки Staphylococcus aureus избирательно взаимодействовать с Fc-фрагментами IgG человека и ряда млекопитающих, что обеспечивает однотипную ориентацию Fab-фрагментов и способствует оптимальному соединению антигена с антителом.

Реакция коагглютинации предложена в 1973 г. Кгоп-va11 для постановки диагноза пневмококковой инфекцга и в настоящее время успешно используется для: типиро-вания гонококков (Lernis et al, 1980), менингококко] Н.Н.Костюкова и др. 1981), стрептококков ( Lei and D., Lach аре 11 R., 1978, А.Н.Панин, 1990), серогруппировки эн теробактерий: эшерихий (Л.Б.Хазенсон, Т.Я.Геннадьева и др., 1969; Л.Б Хазенсон и соавт. 1980; Gorzynaki et a1., 1980), шигелл (E.Edwards et al, 1976 ), сальмонелл (Edwards et a1 1976), идентификация холерных вибронов (Andrade Maceda, 1979 ) j а также для обнаружения некоторых токсинов (К.В. Бунин и соавт., 1982). Оказалось, что реакция коагглютинации специфична и более чувствительна, чем РДП. Кроме того, ее преимуществами является возможность исследования культур, проявляющих в РА склонность к самоагглютинации.

Цели и задачи исследований. В связи с изложенным и учитывая актуальность этих вопросов, перед нами были поставлены следующие задачи:

определить условия получения активной по белку А и стабильной взвеси тест-штамма стафилококка;

выяснить оптимальные параметры приготовления коагглютинирующих реагентов для постановки реакции коагглютинации для серологической идентификации Н. pleuropneumonias.

получить кроличьи гипериммунные сыворотки к референтным штаммам Н. pleuropneumoniae,

приготовить антительные диагностикумы для разных сероваров Н. pleuropneumoniae, определить их активность, специфичность, изучить возможность их применения для серологической идентификации штаммов Н. pleuropneumoniae и для индикации возбудителя в патологическом материале.

Научная новизна. Отработаны оптимальные параметры культивирования стафилококка в лабораторном ферментере позволяющие получить богатые белком А бактериальные клетки, а также схема изготовления специфических гипериммунных сывороток против 10 сероваров Н. pleuropneumoniae, на основании чего научно обоснована методика полу-

гения коагглютинирующих антительных диагностикумов 1 их использования для идентификации серовариантов и шдикации возбудителя в патологическом материале.

Впервые определена чувствительность реакции коаг-________

"лютйнации относительно выявления антигенов Н. р1еигор-1еитот'эе.

Практическая ценность работы. На основании резуль-атов исследований предложены антительные диагностикумы ухя практического применения в ветеринарной практике как 1КСпресс-метода обнаружения и идентификации в реакции <оагглютинации Н. р1еигорпеитотае.

Апробация работы. Результаты исследований доложены 1а заседаниях Ученого совета ветеринарно-санитарного факу-1ьтета МГАПБ в 1990,1991 и 1992 г.г.

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые для защиты. Экспериментальное обоснование мето-даки приготовления антительного коагглютинирующего диаг-тостикума и его применение для серотипирования Н. р1еи-•орпеитошае и обнаружения возбудителя непосредственно з патологическом материале.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.

Работа иллюстрирована 33 таблицами и 2 рисунками. Список литературы включает 206 наименований работ, из них 151 иностранных

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проводилась по плановой исследовательской тематике на кафедре микробиологии и биотехнологии Московской Государственной академии прикладной биотехнологии в период с 1989 по 1992 г.г.

2.1. Материалы и методы

В работе были использованы следующие виды бактерий: НаеторИ! 1иэ р1еигорпеитотае шт. ССМ 5869 (серовар 1), шт.

ССМ 5870 (серовар 2), шт. ССМ 5871 (серовар 3), шт. М62 (серовар 4), шт. К17 (серовар 5), шт. Femo (серовар 6) — получены от Dr. Haagsma, Central Veterinary Institute Departa-ment of Bacteriology, Rotterdam, H. pleuropneumoniae шт. H4( (серовар 7), шт. H405 (серовар 8), шт. Н407 (серовар 1.0) шт. Н408 (серовар 12); Н. parasuis шт. Н230 (серова{ D ), шт. Н183 (серовар А), шт. Н184 (серовар С), шт. H18J (серовар В)получены от Dr.P. Kielstein, DDR, Jena- Actinob-acillus suis шт. ССМ 5586 получен от Dr. М. Savadina Veterinary Research Institute, Collection of animal pathogeny microorganisms, 4CCP-,Pasteure11a multocida шт. P20 (серовар A) шт № 473 (серовар В), шт. Р19 (серовар D) — получень в МВА, кафедра микробиологии; Staphylococcus epidermidis АТСС1 4990,S.aureus шт.209Р, S. saprophyticus шт.АТСС153( Streptococcus pneumoniae iiit.T3N 2428,1310041, Streptococcus pyogenes шт. № 284 ИГ, Pseudomonas aeruginosa шт. 615, Escherichia coli шт. 846, Bacillus anthracoides шт. 96, Bacillus megatherium шт. 654 - получены из Государственного научно-исследовательского института, стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.Та-расевича; Staphylococcus aureus шт. Cowan-1 NCTC 8530 — получен из MBA; Salmonella cholerae suis шт№ 370, Sa1mone11a ty— phimurium шт.№ 415 - получены из ВГНКИ вет.препаратов.

Питательные среды. Для работы использовали мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар (рН 7,2-7,4), среДы Гисса, кровяной МПА, сывороточно-дрожжевой МПБ и МПА, сывороточный МПА с бактерией кормилкой, сывороточно-дрожжевой бульон и агар Хоттингера.

Животные. В опытах были использованы 36 кроликов породы шиншилла массой 2,0-2,5 кг, 45 беспородных белых мышей массой 16-22 г, 50 морских свинок массой 200-300 г.

Культуры сальмонелл проверяли с групповыми (поливалентными) сальмонеллезными агглютинирующими О-сыво-ротками в РА и с отдельными монорецепторными О- и Н-сы-воротками. Изучали культуральные и биохимические свойства культур стафилококкус ауреус штамма Кован 1. При проверке свойства данного штамма оказались типичными для вида.

Приготовление антительных диагностикумов из Staphy-оcoccus aureus шг. Cowan 1 осуществляли по модифици-ованной нами методике Kronvall (1973). Процесс включал :ультивирование стафилококка на МПА и в бульоне Хот-ингера, формалинизацию нативной взвеси, термическую бработку (прогревание при 80°С). Оптимальные условия роведения всех стадий приготовления стафилококкового «агента и диагностикумов установлены в ходе исследований. Сультурально-морфологические и тинкториальные свойства I. pleuropneumoniae изучали общепринятыми методами, при-1еняемыми в микробиологии (М.А.Сидоров, Д.И.Скоро ду-юв, 1986). Капсулу выявляли окрашиванием по методу 'инса. Морфологию колоний изучали с использованием стетоскопического микроскопа МБС-1. Чашку с выросшими солониями помещали вверх дном на предметный столик микроскопа. Между осветителем и микроскопом помещали югнутое зеркало. Пучок света от осветителя направляли так, пгобы отражаясь от зеркала,он падал снизу в чашку под углом 15°. Правильно направленный пучок света вызывал цветное ¡вечение колоний. Колонии просматривали под увеличением

l6X.

Зависимость роста изучаемых культур от ростовых факторов определяли с помощью бумажных дисков, пропи-~анных растворами ростовых факторов и путем культивирова-гая на простых питательных средах с бактерией кормилкой.

Сахаролитические свойства изучали на полужидкой сре-хе Гисса. Способность изучаемых культур редуцировать штраты в нитриты устанавливали посевом на МПБ с 2% 1зотнокислого калия исследуемой культуры и через 4812 ч культивирования в термостате при 37°С добавляли 3,1 мл реактива Грисса.

Уреазную активность изучали в среде Заксе — окрашивание среды в малиновый цвет указывает на присутствие фермента уреазы. Каталазную активность выявляли методом Гопли.

Гемолитическую активность культуры установили путем посева на МПА и в МПБ с добавлением 10% дрожжевого экстракта и 5% дефибринированной крови барана.

Для обнаружения индола исследуемую культуру засевали в МПБ и в пробирку помещали индикаторную бумажку, пропитанную 12%-ным раствором щавелевой кислоты. Розовое окрашивание индикаторной бумажки указывает на присутствие индола.

Образование бактериями сероводорода определяли при помощи полосок фильтровальной бумаги, пропитанных раствором уксуснокислого свинца.Появление темно-бурого окрашивания бумажки в среде оценивали как свидетельство присутствия сероводорода.

Протеолитическую активность изучали посевом на питательный желатин. При изучении биохимических свойств во все питательные среды добавляли ДПН из расчета 10 мг/мл.

Патогенные свойства культур изучали путем внутри-брюшинного заражения белых мышей суспензией бактерий концентрацией 1 млрд.микробных клеток в 1 см^в дозе 0,5 см**. Вирулентные культуры вызывали гибель мышей в течение 24-72 ч.

Использованные гипериммунные сыворотки для приготовления антительных диагностикумов получены по трем схемам гипериммунизации. Оптимальная схема иммунизации установлена в ходе исследований.

Капсульные растворимые антигены Н. р1еигорпеигти>-т'ае получали по методу Картера. С указанной целью в водяной бане при 56°С в течение 30 мин прогревали 50-млрдную взвесь бактериальных клеток 18-часовой агаровой культуры. Прогретую взвесь бактерий центрифугировали при 5000 об/мин 20 мин. В качестве антигена использовали над-осадочную жидкость.

Пробирочную реакцию агглютинации в объеме 1 см ставили согласно биппагввоп А. ег а1. (1977); пластинчатую РА I соответствии с рекомендациями М1Па1 К.егаЧ., (1982). Результаты пробирочной и пластинчатой РА оценивали по общепринятой для этих реакций критериям по чегырехбалль-ной системе.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по методике Урбаха (1963).

2.2. Результаты исследований

Культурально-морфологические. тинкториальные и био-дмические свойства H.pleuropneumoniae.H.pleuropneumoniaa —

елкие ((^2-0,4x0,4-0,5—мкм) грамотрицательные кокковид----------------------

ые палочки.расположенные единично или парами или в виде оротких цепочек по 3-4 элементаЛри окраске по методу инса у клеток находили капсулу.На сывороточно-дрожжевом ТТА через 18-24 ч культивирования формировались колонии ескольких типов: М, S и R-форм в разных соотношениях

Проведенные исследования показали, что использован-ые в нашей работе штаммы по своим основным биологичес-им свойствам соответствовали роду Haemophilus виду . pleuropneumoniae.

Все изучаемые штаммы нуждаются в V-факторе роста не нуждаются в гемине(Х-факторе роста) .редуцируют нит-аты,выделяют уреазу,обладают бета-гемолитической активно-гью(лизируют эритроциты барана) .Все культуры обладали ка-шазной активностью,они расщепляли глюкозу »сахарозу,манит,мальтозу,не образовывали индол^сероводород и не разжи-али желатин. Сорбит, дульцит, рамнозу, арабинозу и глице-ян не ферментировали. Все типовые штаммы были вирулент-ыми для белых мышей при внутрибрюшинном заражении, араженные мыши погибали в течение 24-72 ч.

Получение бактериальной массы Staphylococcus aureus !тамма Cowan-1. Культуру стафилококка выращивали в ста-ионарных условиях в бульоне Хоттингера с 1% глюкозы (рН 2-7,4 аминный азот 120 мг%; в ферментере в таком же буль-не и на агаре Хоттингера (рН 7,2-7,4,аминный азот 120 мг%); культивирование проводилось при температуре 37-38°С.

Результаты исследований показали, что в условиях гационарного культивирования в бульоне Хоттингера с глю-озой концентрация бактериальных клеток через 18 ч до-гигала 2 млрд. микробных клеток в 1 см^. В ферментере аналогичной питательной среде логарифмическая фаза оста завершалась к 9 ч культивирования при концентрации 4 млрд. микробных клеток в 1 см^. При более длительном ультивировании (12 ч) отмечали признаки диссоциации проба термоагглютинации). Бактериальные клетки отмы-

вали путем центрифугирования в фосфатно-солевом буфе, ном растворе (рН 7,2-7,4), подвергали обработке формалино] и прогреванию согласно Кгопуа11 (1973). Инактивирован-ную микробную массу четырехкратно отмывали фосфатнс солевым буфером, готовили взвесь стафилококков в фосфап но-солевом буферном растворе 70 млрд. в 1 см . Количеств А-протеина в клетках стафилококка определяли в реакци непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроцитами баран: сенсибилизированными гемолитической сывороткой по м< тодике Каральника Б.В. и соавт (1977). Учет реакции провс дили через 1,5-2 ч. Несколько большее содержание протеин А отмечено в клетках агаровых культур (5,7+0,34) и пракп чески равнозначное в клетках бульонных культур (4,6, 0,34 5,0+0).

Получение гипериммунных сывороток проти Н. рЧеигорпеитотае . Приготовление антигенов для иммуни; ции кроликов. Антигенами для гипериммунизации служил инактивированные формальдегидом целые микробные кле-ки Н. р1еигорпеитотае сероваров 1-12, а также штамм 202 "малой группы".

Культуру каждого штамма высевали на сывороточнс дрожжевой МПА (рН ^2-7,4), инкубировали 18-20 ч пр: 37-38°С. Культуры селекционировали, отбирая колони М или Б -формы, в зависимости от схемы гипериммунизацш Моновалентные антигены получали путем выращивания с< лекционированных культур бактерий определенного серовар! антаЛэ актериальную массу смывали ф осфатно-солевым буфе] ным раствором (рН 7,2) .трехкратно отмывали путем центр] фугирования, устанавливали концентрации 10 ЕД по оптиче« кому стандарту мутности, добавляли 0,1% формальдегид и выдерживали 48 ч при 37-38°С.

Поливалентные антигены готовили путем объединение в равных пропорциях моноантигенов. Поливалентный антиге: № 1 включал серовары 1,2,3,4,5,6; антиген № 2 — серовар! 7,8,10,12, "малая группа".

Для иммунизации по схеме № 3 готовили антигены адъювантом Фрейнда. Моновалентные антигены с масляныг адыовантом получали путем смешивания поровну бактерн

гсьной суспензии концентрацией 200 БД по оптическому стан-арту мутности с адъювантом.

Схемы иммунизации кроликов. Для изготовления гафилококковых антительных диагностикумов использовали ипериммунные кроличьи сыворотки, полученные по трем хемам иммунизации, которые различались длительностью, ислом инъекций и количеством вводимого антигена.

Перваях' схема иммунизации включала пять внутривен-ъгх инъекций корпускулярного антигена с интервалом 3 дня ; дозе 1 млрд. микробных клеток. 6 и 7 инъекции в до-ах 5 и 1 млрд. микробных клеток с интервалом 10 дней. Че->ез 8-10 дней после заключительной инъекции кроликов »бескровливали.

Вторая схема иммунизации была аналогична первой, но (ключала дополнительно 8 и 9 внутривенные инъекции в дозе . млрд. микробных клеток с интервалом 10 дней.

Третья схема иммунизации состояла из инъекции 1,25 см полного адьюванта Фрейнда без антигена в поду-иечки задних лап кроликов. Через 8 суток в увеличенные юдколенные лимфатические узлъг вводили 0,25 см эмулированной вакцины на полном адъюванте Фрейнда. На 22 и 54 сутки кроликам вводили внутривенно соответственно ),5 и 1 млрд. микробных клеток без адьюванта. Сыворотки срови брали через 8 дней после заключительной инъекции.

Активность полученных сывороток определяли в реак-дга агглютинации (РА) в пробирках с гомологичными антигенами, а специфичность — в перекрестной реакции с гете-эологичными антигенами.

При использовании всех трех схем гипериммунизации толучили активные сыворотки. Однако более активные сы-зоротки (титр 1.320 — 1:5120) были получены при гипер-шмунизации по схемам 2 и 3. По схеме 1 получены сыворот-¡си с титром агглютининов 1:160—1:1280.

Приготовление антительных диагностикумов для реакции коагглютинации. Приготовление моновалентных диаг-достикумов. Антительные диагностикумы готовили из ги-

Антисьгаоротки получены в лиофилизированном виде от канд. вет.наук Скородумова Д.И.

периммунных сывороток, полученных по схемам № 1, 2 3 по модифицированной методике Кгот/а11 (1973), с испо зованием бактериальной массы стафилококка, выращенног в ферментере.

Моновалентные антительные диагностику мы готовил путем взаимодействия стафилококкового сорбента концент рацией 70 млрд м.к. в 1 см и гипериммунных сыворото] к отдельным штаммам Н. р1еигорпеитогиае. Сыворотки для обработки стафилококкового реагента использовал! в разведениях 1:10, 1:20 1:40 и 1:80. Готовые диагностику мы консервировали раствором азида натрия, устанавливал! концентрацию 3,5 млрд. м.к. в 1 см^.

На основе сывороток, полученных по трем различны», схемам гипериммунизации, удалось получить во всех слу чаях активные антительные диагностикумы, однако ош отличались по серовариантной специфичности. Наиболе* специфичными были реагенты из гипериммунных сыворо ток полученных по схеме № 1, и в меньшей степени и: сывороток, полученных по схемам № 2 и 3.

Приготовление и испытание поливалентного диагно стикума. Одной из основных задач работы являлось получе ние поливалентного диагностикума, позволяющего в РК^ идентифицировать Н. рЧеигорпеитотае на уровне вида.

Готовили поливалентные диагностикумы двух видов В первом случае (вариант № 1) смешивали в равной пропор ции моновалентные сыворотки сероваров 1—12 и из такой комплексной сыворотки готовили единый диагностикум. Во втором случае (вариант № 2) гипериммунизацией кроликов комплексными антигенами, получали поливалентную антисыворотку, которую и использовали для приготовления диагностикума.

Из поливалентной сыворотки, полученной путем объединения моновалентных, не во всех случаях удалось получить достаточно активные коагглютинирующие реагенты. Судя по полученным результатам, для изготовления поливалентного видового диагностикума, следует использовать гипериммунные сыворотки, полученные иммунизацией кроликов поливалентными антигенами.

Исследования показали, что для оценки активности антительных диагностикумов предпочтительнее использовать пробирочную реакцию коагглютинации, что позволяет давать количественную оценку активности реагента.---------------------

Определение серовариантной принадлежности культур Н. рЧеигорпеитотае при помощи реакции коагглютинации. Мы сравнивали РКА, РА на стекле и приборочный вариант РА. Антигенами служили 16-18 часовые агаровые культуры в виде суспензии в фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,2) концентрацией 1 млрд микробных клеток в 1 см^ и растворимые капсульные антигены, полученные по методу Картера. Использовали стафилококковые моновалентные антительные диагностикумы из гипериммунных сывороток, полученных по различным схемам.

Результаты исследований показали, что в РКА на стекле не проявляются многие перекрестные реакции, имеющие место в пластинчатой и пробирочной РА. Кроме того, используя уменьшенные количества иммунной сьюоротки для нагрузки А-протеина стафилококка, можно получить более специфические реагенты. Наиболее четкие серовари-антные различия штаммов устанавливаются в РКА с капсуль-ными антигенами, которые недоступны для исследования в реакции агглютинации.

Наибольшую серовариантную специфичность показали диагностикумы. изготовленные на основе гипериммунных сывороток, полученных по схеме № 1, в которой для иммунизации кроликов использовали антигены из культур в М-фор-ме

Идентификация Н. рТеигорпеитотае в первичных культурах при помощи реакции коагглютинации. В РКА на стекле исследовали суспензии бактерий из колоний различного типа (М-, Э-, И-). Культуры бактерий выращивали- на сывороточно-дрожжевом МПА и МПБ при 37-38°С и исследовали в РКА через 6, 12, 24*36, 48 и 72 ч культивирования. Результаты опытов показали что бактериальные клетки культур Н. р1еигорпеитошае в Б -форме, несмотря на отсутствие признаков диссоциации по культуральным критериям и данным пробы термоагглютинации, несут больше видо-

вых антигенов чем культуры в М-форме. Антигены бактерий в И-форме обладают низкой серологической активностью и одновременно меньшей серовариантной специфичностью.

Было установлено, что 6-часовые культуры пяти исследованных сероваров (1,2,3,4,5) обладают агглютинобильностью. У ряда сероваров (1,2,3 и 12) по мере старения культуры активность поверхностных антигенов в РКА также снижается. -

Учитывая, что в первичных посевах возможно наличие гегерологичных видов бактерий, мы изучали специфичность моновалентных и "видового" диагностикумов по отношению к различным видам стрептококков, стафилококков, известным сероварам пастерелл, гемофюпос парасуис, сальмонеллам, эшерихиям, некоторым бациллам и актинобациллюс суис. Ни один вид перечисленных бактерий не давал положительной РКА. Антигенные связи обнаружены только с таксономически и экологически близким видом АЛтоЬа-аПиззшэ.

Чувствительность реакции коагглютинации. Проведены опыты по определению чувствительности РКА. В качестве антигенов использовали суспензии бактерий 18-24-часовых агаровых культур Н. р1вигорпеитоп1ае различной концентрации (20, 2, 1 млрд., 200,20,2 млн. и 200 тыс. м.к. в 1 см? по стандарту мутности) .Порог чувствительности РКА,в зависимости от активности диагностакума> составил 20-200 млн. м к. в 1 см® суспензии

Изменение активности и специфичности диагностикумов в процессе хранения. С целью установления возможных сроков использования жидких диагностикумов, по одной серии моновалентных реагентов хранили при 4-5°с и исследовали в течение 12 мес. в пробирочной РКА и в РКА на стекле.

Пробирочная РКА позволяет достаточно полно проследить динамику снижения активности реагентов. Через 6 мес. хранения все диагностикумы в РКА на стекле были активны. Существенное снижение активности препаратов отмечали к 9-10 мес. хранения. Многие диагностикумы оставались пригодными для исследования через 12 мес. хранения.

Результаты исследований показали, что при снижении титра диагностикума в пробирочной РКА до 1:20 и менее,

исчезает его активность и в реакции на стекле. Скорость снижения активности реагента не всегда в полной мере коррелировала с активностью исходной сыворотки и диагностику ма.

В процессе хранения изменялась специфичность диагностику мов. У диагностикумов, сохранивших активность в течение 6-12 мес., серовариантная специфичность была выше, чем у исходных.

Отработка методики исследования в реакции коагглю-тинации тканевого материала. Исследовали 20 материалов легочной ткани клинически здоровых свиней и 5 материалов от морских свинок. Легкие всех животных не имели макроскопически видимых изменений. Все образцы тканей подвергали бактериологическому исследованию и ни в одном случае возбудителей специфических бактериальных инфекций выделено не было

Исследования показали, что все моновалентные и поливалентные диагностикумы в течение 1-3 мин контакта с испытуемым материалом давали неспецифические положительные реакции. Блокирование рецепторов А-протеина стафилококка глобулином нормальной сыворотки крови кролика и увеличение концентрации альбумина в диагностикуме влияют на результаты РКА, но только прогревание тканевого гомогената позволило полностью избежать неспецифической агглютинации. Таким образом, тканевой материал перед исследованием в РКА, необходимо подвергать термической обработке.

Известно, что термическая обработка антигенов бактерий вообще и Н. р1еигорпеитогнае в частности, может сказаться на их активности и специфичности^ серологических реакциях ( М|«а1 К.Й., Жддтв Я., |.агМеге Б. et а1., 1987).

Исходя из вышеизложенного мы исследовали влияние прогревания суспензий Н. р1еигорпеитошае и гетерологичных видов бактерий на результаты РКА и РА. Термической обработке подвергали бактериальные суспензии 18-часовых агаровых культур

Результаты свидетельствуют, что прогревание корпускулярных антигенов при 100°С в течение 10 мин. практически

не влияло на их активность и специфичность в РКА. Более жесткие температурные режимы, особенно автоклавирование, приводили к снижению серологической активности антигенов в РКА у ряда штаммов гемофилюс плевропневмоние. По этому критерию штаммы Н. р1еигорпеитошае можно подразделить на группу термолабильных и термостабильных. Все виды температурной обработки не влияли на антигены штаммов Фемо, 405, К17. ССМ5870 и ССМ5871. При длительном кипячении и автоклавировании уменьшалась активность антигенов штаммов 404, 407, 202, ССМ5869.

Прогретые при всех режимах антигены из культур стафилококков, стрептококков, эшерихий, бацилл, пастерелл,' сальмонелл и гемофилюс парасуис не агглютинировали диа-гностикумы всех серовалов.

Обнаружение антигенов Н. рТеигорпеитотае в тканях экспериментально зараженных лабораторных животных. Морских свинок заражали интраназально суспензией 8-часовой агаровой культуры Н. р1еигорпеитошае в дозе 1 млрд. микробных клеток, по два животных на штамм (шт. ССМ5869, ССМ5870, ССМ5871, М62, К17). За животными вели наблюдение в течение пяти дней. По истечении заданного срока оставшихся в живых морских свинок убивали. Всех животных подвергали бактериологическому исследованию, легочную ткань изучали в РКА с видовыми и моновалентными диагнос-тикумами. Выделенные культуры Н. р1еигорпеитотае идентифицировали в РКА.

От павших животных во всех случаях были выделены исходные культуры Н. р1еигорпеитотае. Результаты бактериологического исследования совпали с показаниями РКА. Серо вариантная специфичность РКА с моновалентными диагностикумами была вполне сопоставима с таковой при идентификации в РКА культур Н. р1еигорпеитошае различных сероваров.

Обнаружение при помощи РКА антигенов гемофильных бактерий в легких свиней, больных пневмонией. Исследовали образцы легких 28 свиней различного происхождения. Все материалы были подвергнуты бактериологическому исследованию, а также изучению в РКА с поливалентным и

Таблица

Результаты исследования легких свиней, больных пневмонией в РКА

Происхождение: Выделены исследуемого : культуры материала : бактерий

:Кол-во:

риалов:™*1

: :ный ДИ.-5869

;агнос-: __'тикум :

Результаты РКА.

ссы: ссм:

5870:5871 :М62

К17

фемо

404

405

407

408

202

Московский мя- Микоплазмы сокомбинат

9

+

Вологодская Гемофильные

область, сов- ¡Й0ТгИруп- 3 хоз "Коммунист"пы"_

МурШНСкая Р. гтшИосИа

область сов- + гемофиль- 2 ооласть, сов- ше (^дрии

хозы "Печен- "малой пзуппы"

га" , "Пригород- Р. тиПоС1(1а НЫЙ"

Белгородская область, совхоз "Губкик-ский"_

в. сЬо1егае 5Ш$

Примечание: в крестах выражена интенсивность реакции

сп

4

моновалентными стафилококковыми диагностикумами. Посевы производили из пораженных участков легких на МПА (рН 7,2-7.4) с 5% крови барана, с последующим засевом культуры-кормилки(Staphylococcus saprophytics ) ,сывороточно дрожжевой МПБ.

С целью выделения микоплазм посевы производили на жидкую и плотную среды Эдварда (бак.исследования проведены доцентом кафедры Д.И.Скородумовым).

Исследования показали, что с пневмониями у исследованных групп свиней ассоциировались различные патогенные бактерии: сальмонеллы, пастереллы, гемофильные бактерии "малой группы", микоплазмы. При помощи поливалентного диагностикума в РКА были определены 5 исследуемых материалов, как содержащие гомологичные антигены бактерий. В РКА с моновалентными диагностику-мами антигены были идентифицированы как относящиеся к гемофильным бактериям "малой группы". Результаты РКА совпали с данными бактериологического исследования. Свойства выделенных негемолитических, ДПН-зависи-мых бактерий соответствовали описанию представителей так называемой "малой группы". Результаты свидетельствуют, что при помощи РКА можно обнаружить антигены гемо-фильных бактерий, вызывающих пневмонии свиней.

3. ВЫ ВОДЫ

1. Усовершенствован^ методика приготовления и контроля активности антительного диагностикума для серо-типирования культур Haemophilus pleuropneumonias и индикации возбудителя в патологическом материале от больных животных в реакции коагглютинации на стекле

2 Отработана методика получения гипериммунных сывороток против разных сероваров Н. pleuropneumoniae, состоящая из селекции колоний в М-форме, культивирования клонов, приготовления суспензии, инактивации формальдегидом и гипериммунизации полученным формолантигеном кроликов. По указанной схеме удается получать и поливалентные сыворотки путем гипериммунизации смесью антигенов из нескольких серовариантов.

3. Для сенсибилизации клеток стафилококка с целью получения высокоактивных и специфических антительных диагностикумов пригодны гипериммунные сыворотки с

титром агглютининов не ниже 1:160. Для контроля актив-----------------

ности антительных диагностикумов наиболее пригодна пробирочная реакция коагглютинации, позволяющая дать количественную оценку активности реагента.

4. Жидкие серо вариантные и видовые антительные диагностикумы сохраняют активность в течение 10 мес. хранения при температуре 4-6°С. Более длительное хранение приводит к снижению их активности.

5 Приготовленными антительными диагностикумами с использованием цельноклеточных и капсульных экстрагированных антигенов разных сероваров удается определить серологические варианты Н. pleuropneumoniae в капельной реакции коагглютинации. Более четкие результаты типиро-вания получены при использовании в качестве антигенов капсульных экстрактов. Эти данные свидетельствуют о возможности использования реакции коагглютинации для индикации не только корпускулярных, но и растворимых термостабильных капсульных антигенов Н. pleuropneumo. niae

6. По данным реакции коагглютинации антигены H.pleuropneumoniae разных серовариантов не имеют родства с антигенами стрептококков, стафилококков, эшери-хий, сальмонелл, пастерелла, мультоцида А. В и Д. Некоторые сероварианты имеют общие антигены с Actinobaci 11us suis. Поэтому поливалентный и моновалентные антительные диагностикумы могут быть использованы для экспресс-индикации H.pleuropneumoniae в смешанных культурах.

7 Реакция коагглютинации может быть использована как экспресс-метод обнаружения и идентификации антигенов Н. pleuropneumoniae в' патологическом материале (пораженные легкие и легочные лимфатические узлы).

Для исследования в РКА тканевые гомогенаты предварительно необходимо прогревать в водяной бане при 100°С в течение 5-10 мин

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предлагается использовать видовые и моновалентньн антительные диагностикумы в ветеринарных лаборатория: для индикации и серотипизации Н. р1еигорпеитошае в кул] турах и в патологическом материале.

Материалы диссертации использованы при составле нии методических указаний по изготовлению и применении коагглютинирующего антительного диагностикума для эк спресс-идентификации Гемофилюс плевропневмоние и ин дикации возбудителя в патологическом материале, утверж денных Отделением ветеринарной медицины РАСХН 19 фев раля 1993 г.