Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Этиологическая структура стрепкоккокозов свиней

На правах рукописи

ггг» ОД

2 9 ЛЯГ 7Ж!

МАЛИК ЕВГЕНИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА СТРЕР/ОКОККОЗОВ СВИНЕЙ

16.00.03. -ветеринарная микробиология, вируса. -изоотология, микология

и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва-2000

Работа выполнена в отделе пробиотиков и биологически активных препарат Всероссийского государственного научно-исследовательского инстит) контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ)

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профеш член-корреспондент РАСХН Панин А.Н.

Официальные оппоненты

доктор ветеринарных наук, професа Душук Р.В.

кандидат биологических наук, доце; Логинов И.А.

Ведущая организация - Московская государственная академия ветеринар! медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина.

Зашита состоится « 22 » июня в 15 часов на заседании диссертационного сов Д-120.85.01. во Всероссийском государственном научно-исследовательском статуте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препара (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ. Автореферат разослан « 1 $ » ___2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук Козырев Ю./

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. За последние 15 лет удельный вес болезней свиней, вызываемых стрептококками, существенно и резко возрос. В ряде свиноводческих созяйствах стрептококковые инфекции являются одной из основных причин от-сода молодняка свиней.

Стрептококкозы свиней регистрируют в крупных и мелких свиноводческих «озяйствах Германии, Франции, США, Англии, Дании, России и многих других лранах. Они наносят огромный прямой и косвенный ущерб отрасли вследствие падежа и вынужденного убоя пораженных поросят, проведения санитарно-аетеринарных профилактических и диагностических мероприятий. Хозяйство по-;ле заноса патогенных стрептококков длительное время остается неблагополучном.

Стрептококки в зависимости от серогрупповой принадлежности вызывают у свиней маститы, артрозо-артриты, менингиты, менингоэнцефалиты, эндокардиты и др. Взрослые животные могут переболевать стрептококкозами бессимптомно и долгое время оставаться носителями возбудителя инфекции.

Форма проявления инфекции зависит от серогрупповой принадлежности возбудителя, степени его пагогенности, а также возраста и состояния иммунной системы животных. В настоящее время известно 36 серологических групп стрептококков, из которых по данным Панина А.Н. (1987, 1988,1992), наибольшую эпизоотическую значимость для поросят и свиней имеют серогруппы C,D,L,G,R (1992). Зарегистрированы случаи заболевания свиней и поросят стрептококками Str. suis серотипов 3,4,5,7,8 и 10 (Chow J.W., 1992, London I., 1994) а также стрептококками серогрупп Е, Р и W (Andrew P.W. and Mitchell Т.J., 1997).

Снижение потерь от стрептококкозов продолжает оставаться одной из актуальных проблем ветеринарной науки и практики. По мнению Walsh B;Williams А.Е. and Satsangi J.(1992), Панина A.H. (1992), Dee S.A., et.al. (1993), Alexander

T.J.L. (1995), Hampscm D.J.; Trott D.J. (1999) и др. в свиноводческих хозяйствах необходим постоянный мониторинг за эпизоотической ситуацией по стрептококкозам.

Несмотря на совершенствование методов диагностики стрептококкозов, эта проблема продолжает оставаться остро актуальной для клиницистов и лабораторных ветеринарных работников, поскольку клиника и патогенез стрептококковой инфекции у свиней остается недостаточно изученными, а метод серологической идентификации стрептококков не нашел широкого практического применения в Российской Федерации ввиду отсутствия коммерческих диагностикумов.

Широкое внедрение в ветеринарную практику современных экспресс методов диагностики стрептококкозов на основе ИФА, молекулярной гибридизации, а также проведение массовых серологических исследований с использованием РА, РКОА, несомненно, позволит повысить качество и эффективность всего комплекса профилактических мероприятий, однако до настоящего времени метод серологической идентификации стрептококков, предложенный Lancefield R.C. (1933), остается одним из немногих методов, позволяющих при минимальной затрате времени и средств определить серологическую принадлежность возбудителя инфекции, оценить его эпизоотическую значимость и дать анализ этиологической структуры болезни как в одном хозяйстве, так и по региону в целом.

Дефицит данных о серогрупповой принадлежности стрептококков, выделенных в неблагополучных по стрептококкозам хозяйствах Российской Федерации, сдерживает развитие мер эффективной специфической профилактики стрептококкозов свиней. Панин А.П (1988-1992), Мешев Э.М. (1993), считают необходимым проведение бактериологических исследований с обязательной серологической идентификацией выделенных штаммов стрептококков.

В этой связи особое практическое значение приобретает разработка серологического метода идентификации стрептококков, который позволит ускорить определение серогрупповой принадлежности возбудителей инфекции, правильно

уценить их эпизоотическую значимость, изучить этиологическую структуру лрептококковых заболеваний свиней.

В соответствии с вышеизложенным, перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Отработать методику получения антигенов для производства групповых лрептококковых диагностических сывороток.

2. Разработать схему получения и контроля групповых гипериммунных лрептококковых преципитарующих сывороток.

3. Провести идентификацию изолятов стрептококков, выделенных от свиней в свиноводческих хозяйствах различных регионов страны и изучить их культу-ралыше, морфологические, ферментативные и антигенные свойства.

4. Изучить частоту выделения стрептококков различных серологических групп от живых, павших и вынужденно убитых животных в хозяйствах, неблагополучных по стрептококковой инфекции.

5. Определить этиологическую структуру стрептококкозов свиней в хозяйствах промышленного типа.

6. Изучить клинические и патологоанатомические признаки стрептококкозов свиней, вызываемых стрептококками эпизоотически значимых серогрупп.

8. Провести селекцию штаммов стрептококков наиболее распространенных серогрупп, изучить их вирулентные, антигенные и иммуногенные свойства, отобрать штаммы с высокими протективными свойствами с целью дальнейшего использования в качестве производственных при изготовлении биопрепаратов, применяемых для лечения, профилактики и диагностики стрептококкозов свиней.

Научная новизна. Впервые разработана технология изготовления отечественных диагностикумов для идентификации стрептококков в реакции преципитации в капилляре.

Установлены особенности инфекционного и эпизоотического процессов при стрептококкозах у свиней и определены эпизоотически значимые серогруппы

стрептококков, вызывающие заболевания животных в хозяйства>

Российской Федерации.

Селекционирован иггамм стрептококка Streptococcus suis type 2 серогруппы В для изготовления диагностикума и вакцины против стрептококкоза свиней серогруппы R.

Научная новизна работы подтверждена авторскими свидетельствами:

Штамм бактерий Streptococcus suis, тип 2 серогруппы R, используемый дш изготовления диагностикума, № 1554361,1988 г.

- Способ изготовления вакцины для профилактики стрептококкозов свиней № 1564789,1988 г.

Практическая значимость работы. Разработан и предложен для применения в ветеринарной и научной практике набор групповых диагностических стрептококковых преципитирующих сывороток.

Разработаны и утверждены ГУВ Госагропрома СССР: - Методические указания по лабораторной диагностике стрептококкоза животных;

- нормативно-техническая документация на «Вакцину депонированную против стрептококкозов свиней (серогруппы С и R)» (технические условия, наставление по применению, инструкция по изготовлению);

- наставление по применению стрептококковых групповых диагностические сывороток.

Апробация результатов Основные положения диссертационной работы доложены:

- на Международном симпозиуме XII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal diseases, Russia, St.-Petersburg, September 6-10,1993.

- на Международном симпозиуме XIII Lancefield International Symposium or Streptococci and Streptococcal diseases, France, Paris, 1996

на научно-проблемных методических комиссиях - ВГБКИ (Москва, 19861994 гг.).

- на межлабораторном совещании научных сотрудников ВГНКИ (г. Москва, 1998 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, предложений для практики, списка использованной литературы. Материалы включают 15 таблиц, 7 графиков. Список использованной литературы содержит 247 наименований отечественных и зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Экспериментальная часть работы выполнена в период с 1985 по 2000 г во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Минсельхозпрода РФ, в неблагополучных по стрептококкозу свиноводческих хозяйствах Омской, Владимирской, Челябинской, Белгородской, Курской, Псковской, Ростовской, Кемеровской, Нижегородской областей и Хабаровского края.

Бактериологические исследования проводили согласно общепринятым в бактериологии методикам. Проведено бактериологическое исследование 245 проб крови, 123 пунктатов синовиальной жидкости пораженных суставов, 385 проб слизи миндалин, содержимого 61 абсцессов, 400 проб влагалищного секрета и выделений из матки свиноматок, 223 проб молока и молозива от больных маститами и 150 проб спермы полученных от 1698 больных и клинически здоровых животных. Бактериологически исследованы образцы органов и тканей от 88 абор-

тированных плодов, и 5565 павших и вынужденно убитых животных различных возрастных групп.

Для выделения и культивирования стрептококков использовали МПА и МПБ с 1% глюкозы, агар и бульон Хотгингера (БХ) с 1% глюкозы, кровяной агар (5-7% дефибринированной крови барана), 0,3% полужидком агаре (ПЖА). Ферментативные свойства стрептококков определяли на средах Гисса с индикатором Анд-редэ.

У изолятов стрептококков изучали культуральные, морфологические, ферментативные свойства и определяли их серогрупповую принадлежность. Видовую принадлежность стрептококков устанавливали согласно «Определителю бактерий» (Bergey, 1986).

Серогрупповую принадлежность культур стрептококков определяли классическим методом по Lancefield R.C. (1933) в реакции преципитации в капилляре со стрептококковыми преципитирующими сыворотками серогрупп А, В, С, D, Е, G, L, N, R (Str.suis type 2) и S (Str.suis type 1).

Для постановки РП были получены специфические преципитирующие сыворотки путем иммунизации кроликов эталонными штаммами стрептококков 10 серологических групп. Для получения антигенов бульонную культуру штаммов стрептококков 16-18 ч роста осаждали центрифугированием при 5000 об./мин в течение 20 минут. Осадок дважды отмывали в физиологическом растворе и ресус-пендировали в физрастворе, добавляя к нему 0,25%-ный раствор трипсина до конечной концентрации 0,1%. Суспензию выдерживали в течение 24 ч при комнатной температуре, после чего прогревали в водяной бане при 56 °С в течение 30 мин, и вновь центрифугировали в указанном режиме. Осадок дважды отмывали в физиологическом растворе и ресуспендировали в фосфатном буфере с 0,2% формалина при рН равном 7,2-7,4. Рост стрептококков серогрупп D, R и S (Str.suis type 2 и Str.suis type I) после 8-10 ч культивирования в бульоне Хотгингера останавливали формалином, добавляя его до конечной концентрации 0,6 %. Инактивацию вели в течение 48 ч при 37 °С. Культуры вновь осаждали центрифугированием и,

1е обрабатывая трипсином, подвергали тепловому воздействию. Надосадочную кидкость сливали, осадок дважды отмывали в физиологическом растворе, ресус-тендировали в фосфатном буфере при рН 7,2-7,4, с 0,2% содержанием формалина. \нтигены стрептококков всех серогрупп с конечной концентрацией 30-50 млрд. дикробных клеток в 1,0 см3проверяли на стерильность и хранили при 4-6 °€.

Для постановки реакции преципитации в капилляре бульонные культуры лрептококков осаждали центрифугированием, добавляли к осадку 0,3-0,4 см3 0,2 Я раствора соляной кислоты, прогревали на кипящей водяной бане. Суспензию тейтрализовали 0,2 N раствором едкого натра, центрифугировали при 3,5-4,0 гыс.об./мин. в течение 25-30 минут. Надосадочную жидкость использовали в ка-1естве антигена. Для постановки РП использовали стеклянные капилляры, диаметром 0,5-1,0 мм. В капилляр набирали небольшое количество сыворотки (около 1,0-1.5 см длины капилляра) и равное количество антигена, следя за тем, чтобы ;месь сыворотки с антигеном оказалась в середине капилляра, вставляли его в мастилиновую пластину и визуально просматривали его на темном фоне при ярком освещении. Учет реакции проводили через 5 минут после смешивания сыворотки и антигена, оценку проводили в крестах по трех бальной системе.

Патологоанатомические исследования проводили согласно руководствам по патологической анатомии сельскохозяйственных животных и «Правилам ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов».

Антигенные, вирулентные (ДЦМ) и иммуногенные (ИД50) свойства штаммов стрептококков изучали на белых нелинейных мышах массой 16-18 г.

Полученные результаты обрабатывали статистически по методу Кербера-Ашмарина (1976).

Критерием отбора служила способность штаммов обеспечивать накопление в крови лабораторных животных (кроликов) наиболее высокого титра агглютинирующих и преципитирующих антител за максимально короткий период иммунизации.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Разработка средств диагностики для установления серогрупповой принадлежности стрептококков 2Х1Л. Изготовление стрептококковых групповых преиипитируюмш сывороток

2.2.1.1.1. Разработка схемы гипериммунизации кроликов При разработке схемы получения гипериммунных преципитирующих диаг ностических стрептококковых сывороток в качестве базовой использовали схем; ВОЗ (1980), по которой кроликам вводили антиген в нарастающих дозах 15 раз ] течение 5 недель. В случае получения недостаточно активных сывороток допол нительно проводили 2-3-недельный цикл иммунизации.

По разработанной нами схеме в течение первой недели иммунизации антиге! вводили в нарастающих дозах. Первая инъекция предусматривала введение млрд. микробных клеток антигена; вторая - 8 и третья -16. Затем антиген вводит так же, как и по схеме ВОЗ - три раза в неделю по 4 млрд. стрептококков. Всего з; весь цикл инъекций каждому кролику было введено по 64 млрд. микробных кле ток стрептококков. Увеличение количества вводимого антигена во время второй I третьей иммунизации позволило нам уменьшить количество внутривенных инъ екций антигена с 15 до 12 и при этом сократить срок иммунизации до 4-х недель.

Установлено, что схема иммунизации кроликов, рекомендованная ВОЗ, по зволяет получить активные гипериммунные сыворотки серологических групп А В, В, II и 8 С, Ь только после 13-16 инъекций антигена, а для получения акгавньп стрептококковых сывороток серологических групп Е О, N во всех трех опыта: потребовалась дополнительная гипериммунизации животных.

Изготовлено и проверено 638 серий диагностических сывороток к стрепто коккам серогрупп А, В, С, Б, Е, О, Ь, Ы, Э и Л. Активность и специфичность сы вороток изучали в перекрестной РП с гомологичными и гетерологичными антиге нами.

Независимо от. примененной схемы гипериммунизации все полученные сыворотки реагировали только с гомологичными антигенами стрептококков и не вступали в реакцию с антигенами стрептококков других серогрупп, что свидетельствовало о высокой их специфичности. Сыворотки не теряли своей активности и специфичности за период хранения до 36 мес. в нативном состоянии при температуре 4-6 °С.

2.2.2. Результаты серологической идентификации культур стрептококков, выделенных от свиней в неблагополучных по стрептококковой инфекции

хозяйствах.

По частоте выделения стрептококки занимали первое место (41,7%) среди общего количества микрофлоры, выделенной из патматериала и образцов от больных и клинически здоровых животных. В подавляющем большинстве случаев изоляты стрептококков выделяли в чистой культуре. Наряду со стрептокококками выделены культуры сальмонелл (4,1%); стафилококков (3,4%); пастерелл (4,7%); Е.коли (1,9%) и актинобациллюс плевропневмония и парасуис (2,5%)

2.2.2.1. Частота выделения стрептококков различных серогрупп от больных и клинически здоровых свиней и поросят

Частота выделения стрептококков из синовиальной жидкости пораженных суставов, содержимого абсцессов, слизи миндалин, составила соответственно 33,3%, 57,4% и 39,5%. Присутствие стрептококков в крови было установлено у 128 из 245 (52,2%), обследованных животных, в вагинальном секрете у 206 из 400 больных эндометритами (51,5%), в молоке и молозиве - 115 из 223 (51,6%), больных маститами свиноматок. Из спермы хряков-производителей стрептококки были выделены в 16,1% случаев и из абортированных плодов - в 15,9% случаев.

Результаты изучения этиологической структуры стрептококкозов свиней

(прижизненные исследования)

Источники выделения Исследовано проб Количество выделенных культур

Всего В т. числе серогрупп:

В С Б Е в Ь И Не идентифицировано

Кровь 245 128 4 21 7 2 - 25 11 58

Слизь миндалин 385 152 - 20 10 8 - 22 18 74

Вагинальный секрет и выделения из матки 400 206 14 57 19 3 61 15 37

Синовиальная жидкость 123 41 - 15 2 - - 3 6 15

Содержимое абсцессов 61 35 - 3 3 11 3 - - 15

Молоко и молозиво 223 115 14 27 6 - 20 31 - 17

Сперма 261 42 3 6 9 - - - - 24

Абортированные плоды 88 14 1 3 1 - - 3 6

Итого Количество 1786 733 36 152 57 24 23 145 50 246

о/ /о 4,9 20,7 7,77 3,3 3,2 19,78 6,8 33,56

По частоте изоляции из вагинального секрета, выделений из матки, молока и :лизи миндалин, больных и клинически здоровых свиноматок, абортированных плодов, первое место занимали стрептококки серогруппы С (20,70%) и Ь (19,7%).

Стрептококки серогруппы Б присутствовали в вагинальном секрете, слизистых секретах, сперме, крови, молоке, молозиве, абсцессах.

Не менее значимой являлась частота выделения стрептококков серогруппы К (14,6%). Широта распространения стрептококков серогруппы И среди клинически здоровых и больных животных была не столь значительна, как стрептококков серогруппы О. Они не были выделены из синовиальной жидкости суставов, содержимого абсцессов, молока, и спермы.

Из проб молока и молозива кроме серогруппы С и Ь с незначительной частотой выделяли стрептококки серогрупп й, В и Р. Из крови животных были изолированы стрептококки серогрупп В,С,Б,Е,ЬД.В сперме хряков установлено присутствие стрептококков серогрупп В, С и О (2,3%).

У 33,6% изолятов стрептококков, полученных от больных и клинически здоровых животных, серогрупповую принадлежность установить не удалось.

2.2.2.2. Частота выделения стрептококков различных серогрупп из патологического материала

При бактериологическом исследовании образцов патматериала от 5565 павших и/или вынужденно убитых поросят, стрептококки выделены в 41,95% случаев.

Наибольшее число стрептококков выделено из крови, синовиальной жидкости суставов, головного мозга и селезенки в 12,1%, 10,1%, 9,5% и 8,9% случаев соответственно. Из ткани легких и миндалин стрептококки выделяли в 7,4% и 5,2%- случаев.

Среди культур стрептококков, выделенных от павших и вынужденно убитых поросят, так же как от больных и клинически здоровых животных, преобладали стрептококки серогрупп С, 11,0 и Ь. Стрептококки серогруппы С составили 24,8%

от всей выделенной стрептококковой микрофлоры, серогруплы И -23,6%, серо группы О 19,8%, серогруплы Ь -12,8%.

Стрептококки группы С обнаруживали во всех органах и тканях павших по росят, но наиболее часто в сердце (30,2%), легких (16,2%) и суставах (26,7%). I пробах мозга превалировали стрептококки серогруплы И (43,2%).Основным ме стом локализации стрептококков серогруплы Р являлись сердце и селезенка Стрептококки группы Ь выделяли преимущественно из сердца и суставов. Мик роорганизмы серогруплы Е выделялись только из сердца и селезенки. Стретто кокки этой серогруплы, также как и серогруппы В не была выделены из мозга. И: миндалин павших поросят выделены стрептококки всех серологических групп однако, количество выделенных изолятов было незначительным. Из пораженные суставов были выделены стрептококки пяти серорупп - В, С, Б, Ь и К, сред! которых серологическая группа С была преобладающей (51,5%).

2.2.3. Результаты изучения этиологической структуры стрептококкозов

поросят и свиней.

Основными клиническими проявлениями стрептококковой инфекции у поро' сят являются септицемия, пневмония, менингиты, артриты, эндокардиты, полисерозита, энтериты. При септицемии и эндокардитах выделялись стрептококки се-рогрупп И, С, Э, Ь, В и Е.

При менингитах были выделены стрептококки лишь двух серогрупп К и С Кроме того, стрептококки группы С занимали ведущее место среди стрептококков, выделенных из патматериала от поросят, павших с признаками септицемии пневмонии, артритов, полисерозитов (24,0; 31,8; 47,1 и 20 %). Стрептококки серогруппы К выделены при септицемии (23,5%), пневмонии (24,5%), эндокардита? (20,1%) и превалировали при менингитах (86,4%).

Результаты изучения этиологической структуры стрептококкозов свиней (постмортальиые исследования)

Источники выделения Исследование проб Количество выделенных культур стрептококков

Всего В т. числе серогрупп:

А В С Б Е Ь И Нсвдапи-фировано

Головной мозг 5565 532 - - 75 9 - 27 298 126

Кровь 5286 637 1 14 175 183 13 88 117 46

Селезенка 4350 387 - 13 74 205 35 43 - 17

Легкие 5494 408 - 14 92 46 - 32 108 116

Синовиальная жидкость 2986 301 - 8 155 2 - 78 23 35

Миндалины 1358 70 - 2 9 17 1 30 4 7

Итого Количество 25039 2335 1 51 580 462 49 298 550 344

% ~0~041 2,2 24,8 19,8 2,1 12,8 23,6 14,6

При энтеритах поросят первое место по частоте выделения занимали стрептококки группы Б (56,7%). В 18,9% случаев они были выделены от поросят, павших от септицемии, в 18,6% - от павших животных с признаками эндокардитов и в 17,2%, 15,3% случаев с признаками полисерозитов и пневмоний.

У поросят, павших с признаками поражения суставов, на первом месте по частоте выделения находились стрептококки серогруппы С (47,1%) и Ь (30,7%) и О (11,8%). Культуры стрептококков серогруппы Ь выделены при септицемии, полисерозите и эндокардитах (20,4%; 15,6% и 10,9%) Участие в патологическом процессе у поросят стрептококков серологических групп В и Е было менее выражено.

От больных животных с клиническими признаками артритов количество выделенных стрептококков группы С составило 27,4%,на долю стрептококков группы Ь приходилось 33,7%, и группы И. - 15,8%. Стрептококки группы С выделены в высоком проценте случаев при эндометритах (23,4%), и маститах (20,7%).

Обращает на себя внимание частота выделения стрептококков серогруппы Ъ от свиноматок, больных эндометритами (27,3%) и маститами (20%).

Высокий процент выделения стрептококков серогрупп С и Ь от свиноматок при эндометритах и маститах в сочетании со стойкой агалаетией, дает основание предполагать, что микроорганизмы этих серогрупп являются этиологическим фактором мастит-метрит-агалактийного синдрома.

Инфицирование свиней стрептококками серологических групп С, 11 и О без клинических признаков заболевания указывает на широкое их носительство в стаде, в результате чего происходит постоянное накопление инфекционного агента среди животных в хозяйстве и окружающей среде, зачастую приводящее к энзоотическим вспышкам стрептококковой инфекции, которые свидетельствуют о стойком неблагополучии хозяйства в целом.

Выделение стрептококков серогрупп С, Ь и II из синовиальной жидкости пораженных суставов новорожденных и поросят на подсосе, при отсутствии высокого процента смертности, указывает на превалирование хронической формы течения стрептококковой инфекции.

Результаты изучения зависимости проявления стрептококкозов от серогрупповой принадлежности возбудителя

Серогруп-пы стрептококков Выделено культур стрептококков при основных формах проявления стрептококкозов

Всего Септицемия Пневмония Меиингиты Артриты Полисерозиты Эндокардиты Энтериты

Кол. % Кол. % Кол. % Кол. % Кол. % Кол. % Кол. %

Я 550 141 23,5 104 24,5 204 86,4 18 10 13 7,2 68 20,1 2 0,72

С 580 144 24,0 135 31,8 29 15,3 132 47,1 36 20,0 67 19,8 37 13,4

О 462 113 18,9 65 15,3 - - 33 11,8 31 17,2 63 18,6 157 56,7

Ь 298 122 20,4 25 5,9 - - 86 30,7 28 15,6 37 10,9 - -

В 51 15 2,5 18 4,2 - - 7 2,5 6 3,3 5 1,5 - -

Е 49 26 4,9 - - - - - - - - 23 6,8 - -

А 1 1 0,2 - - - - - - - . - - -

Не идентифицирование 344 37 6,2 78 18,4 3 1,3 4 1,4 66 36,6 75 22,1 81 29,2

Итого 2335 599 25,7 425 18,2 236 10,1 280 12,0 180 7,7 338 14,5 277 11,9

2.2.4. Результаты бактериологической идентификации стрептококков,

выделенных от свиней

Были изучены фенотипические свойства 1697 культур стрептококков разных серологических групп, выделенных от павших и живых животных в хозяйствах, неблагополучных по стрептококковой инфекции.

Отличительной особенностью стрептококков серогруппы А {Streptococcus pyogenes) является чувствительность к 0,04 ед бацитрацина. Наличие положительной реакции при постановке CAMP -теста установлено только у стрептококков серологической группы В {Streptococcus agalactiae - 41 культура). Стрептококки серологической группы С {Streptococcus dysgalactiae-{96 культур, Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis - 197 культур и Streptococcus equi subsp. zooepidemicus - 179 культур) отличались от представителей других серогрупп способностью ферментировать гликоген и отсутствием роста на бульоне Хоггавгера с 6,5% хлористого натрия и 40% желчи. Альфа-гемолитические стрептококки серологической группы D (356 культур вида Enterococcus faecalis. 14 - Streptococcus bovis) и 53 - Streptococcus equinus) не образовывали колоний на агаре МасСокеу и росли на средах с теллуритом калия и бульоне Хотгингера с 6,5% хлористого натирия и 40% желчи при t° 10 °С.

Способность к ферментации инулина и гидролиз гиппурата натрия характерны для стрептококов серогруппы G ( 75 культур - вид Streptococcus canis). Стрептококки серогруппы R {Streptococcus suis type 2 - 399 культур) не росли на бульоне Хотгингера в присутствии 6,5% хлористого натрия.

По нашему мнению нецелесообразно заниматься дифференциацией видов стрептококков, поскольку это трудоемкая процедура, требующая разнообразных реактивов и занимающая много времени, не позволят получать практически значимых результатов.

» в

■а

£

си

2 5 Б я

•а

№ »

3 » г О ейк < в в в П Г> О К > Серогрупповая принадлежность по Лендсфильд

? 1 1 1 м §г сл р л «в а Я* | $ Я я сл г ег о 4в' В1 г- и |Г| | I Вид микроорганизмов

в Й "та "03 •со в Р й ТО тр хэ ■ев то Тип гемолиза

• 1 • - ■ • 1 • • « 1 ■ + -багжпрл**!у(ОД|£д) II

■ - • 1 1 1 1 г » 1 -оптохину Я |

1 < * • • • { ■ г + САМР-тест

+ + + + 1 + + + т + Глюкоза

+ + + + + • + < + + + Мальтоза

+ + 4- + ■ + + + < + + Лактоза

+ + + + + • I 1 + + + + + Сахароза

■ • 1 ■ 1 • • ■ ) 1 Раффиноза с

1 + г + - + + • ■ ( • • 1 Инулин 01 ■в м

+ 1 1 + + + + + + + + + Салицин ы о а

+ + + 1 • + • + 4Г + 1 1 Гликоген в ге Г, С

+ 1 1 + 1 + 1 1 1 • 1 Маниит

+ # < + • з + ■ 1 Сорбит § ¡г

1 • • I • ■ • ■ + 1 Глицерол ы

1 1 1 • • • • 1 - » Арабиноза

+ + • + + + 1 3 1 + Трегалоза

• 1 • I • + + + * I 1 • < Мелнзитоза

• ( 1 1 • + + + • ( 1 Мелибиоза

+ 1 > » + + + + « 1 1 • 1 Эскулина ■а я>

■ 1 + 1 1 1 1 + 1 1 1 + 1 Гиппурата N8 «■

+ 1 + ■ ■ I 1 1 - 6,5 % №С1 п 1_

• • • • • ■ 1 • 4 - теллуригом калия а 2 1а 3 и я

+ ■ + + + +■1 +■ 1 1 + 1 - 40% желчи Г! в

-ь < + + + + + + + + Образование аммиака из аргинина

о Ы сл о <1 У» (Л ы с и и« о-* О \с <1 вч А - Количество нааттифи-цярованных штаммов стрептококков, вьпе-ленных от свиней

И 5 О

и в

3

х

8

я

л г> я о

8! »

«

л

■ц

ьа л

а ■н о К о к я о ев

Н

а

I

В й

,2.5. Патологоанатомическая картина при вскрытии животных в неблагополучных по стрептококкозам хозяйствах

При вскрытии 2335 трупов павших и/или вынужденно убитых поросят основными видами патологий являлись в 74,1% случаев эндокардиты и дистрофические изменения в сердце, в 68,6% случаев серозно-катаралыше, катарально-геморрагические, крупозные пневмонии и гнойное воспаление легких, в 8,5% -фибринозный плеврит и плевроперикардит (8,8%).; в 21,6% - артриты; в 13,3% -полисерозиты; в 9,3% - менингиты, а также гастроэнтероколиты (72,0%).

Катаральное и катарально-геморрагическое воспаление слизистой желудка (38,3%) и тонкого отдела (28%) кишечника (гастроэнтериты). При остром и сверхостром течении стрептококкоза отмечали менингоэцефалиты. При хроническом течении инфекции наиболее часто обнаруживали серозно-фибринозное и гнойное воспаление суставов.

2.2.6. Особенности проявления стрептококковой инфекции в зависимости от серогрупповой принадлежности возбудителя

Форма проявления стрептококковой инфекции обусловлена серогрупповой принадлежностью возбудителя. Сверхострую форму заболевания вызывали только стрептококки серогруппы II. Для стрептококковой инфекции, возбудителями которой являются стрептококки серогрухш С и Ь, более характерно острое и хроническое течение болезни.

2.2.6.1.Стуептококкоз свиней серогруппы С

Стрептококки серогруппы С поражают поросят, начиная с первых дней жизни. При остром течении болезни стрептококкоз серогруппы С у поросят протекал в септической форме и проявлялся общим угнетением животного, отказом от корма, лихорадкой, отеками головы, подгрудка, кольцевидными пятнами гиперемии на коже грудной и брюшной частей тела. Хроническая форма заболевания

растеризовалась развитием поражения суставов (артритов и полиартритов). У цельных поросят были отмечены судороги и случаи пареза конечностей. Житные, как правило, отставали в росте и развитии.

2.2.6.2Стрептококкоз свиней серогруппы L.

Впервые в стране в свиноводческих хозяйствах промышленного типа диагно-ировано заболевание свиней, вызываемое стрептококками серогруппы L, к ко-рым наиболее восприимчивы поросята первых дней жизни. Острое течение рептококкоза серогруппы L проявляется отеками конечностей в области сустав с дальнейшим развитием гнойного воспаления суставов. Характерным клини-ским признаком является артрит венечного сустава. У заболевших поросят на-шаются двигательные функции. Поросята угнетены, аппетит и температура те-сохрашпотся в норме. Гибель животных наступает через 2-5 суток после появ-ния первых клинических признаков.

При хроническом течении инфекции поросята отстают в росте и развитии, феболевшие поросята не жизнеспособны, и чаще всего подвергаются выбра-вке.

У свиноматок инфекция серогрупп С и L проявляется в виде абортов и рож-ния мертворожденных поросят и симтокомплексом метрит-мастит-агалактия.

2.2.63Стрептококкоз свиней серогруппы R.

Стрептококки серогруппы R (Streptococcus suis type 2) вызывают заболевание росят (менингиты и артриты) в возрасте 35-60 дней. Заболевание протекает в грхострой, острой и за редким исключением в хронической форме и характери-зтся высокой смертностью. При сверхостром течении инфекции за несколько сов развиваются признаки септицемии с повышением температуры тела живот-го (41,8-42,0 °С) и во всех случаях наступает летальный исход. Острое течение 5олевания характеризуется поражением центральной нервной системы. У житных нарушена координация движений, они совершают «манежные» движения кругу со «слепым» натыканием на препятствия, запрокидывают голову, виз-т. Постепенно поросенок перестает реагировать па внешние раздражители, на-

^ступает паралич дыхательного центра и гибель животного. Хроническая форме стрептококкоза серогруппы R отмечена у незначительной части заболевших поросят. Заболевание проявляется поражением суставов (артриты, полиартриты) передних и задних конечностей. Животные истощены, отстают в росте и развитии.

Анализ динамики развития клинических симптомов стрептококкозов свине? серогрупп С, L и R показал, что сверхострую форму заболевания вызывают только стрептококки серогруппы R. Для инфекции, вызванной стрептококками серогрупп С и L, характерно острое и хроническое течение болезни. Каких либо различий в проявлении инфекционного и эпизоотического процессов, вызываемых названными видами стрептококков, нами не установлено. При этом стрептококк! обоих видов выделяли при вспышке заболевания в одном и том же хозяйстве.

Основными отличительными симптомами стрептококковой инфекции серогруппы R являются признаки поражения нервной системы (менингиты и менинго-энцефалиты). В единичных случаях у поросят отмечены случаи септицемии и по ражения суставов (артриты). Признаками стрептококковой инфекции серогрупп С и L у поросят являются септицемия и артриты. Воспаление венечного сустава з поросят характерно для стрептококкоза серогруппы L.

2.2.7. Селекция и отбор штаммов стрептококков серологической группы R

{Streptococcus suis type 2)

Изучены антигенные, вирулентных и иммуногенные свойства 6-ти штамм« стрептококков серогруппы R {Streptococcus suis туре 2), выделенных от свиней i неблагополучных по стрептококковой инфекции хозяйствах, в сравнении с эталонным штаммом этой же серогруппы.

Антигенную активность определяли в РА по уровню накопления агглютинирующих и прецнпитирующих антител в сыворотке крови кроликов, иммунизированных антигенами из бактериальных клеток штаммов стрептококков в сравненю

эталонным штаммом. Вирулентные (ЛД50) свойства каждого штамма определя-!и на белых мышах массой 16-18 г. путем внутрибрюшинного введения 7-10 ча-овых бульонных культур в дозах от 180 млн до 5,8 млрд микробных клеток и читывали пределы колебаний (средние, минимальные и максимальные значения 1Д5о). Иммуногенную активность штаммов (ИМД50) определяли путем однократ-гой иммунизацией мышей инактивированными формалином культурами стрепто-:окков в дозах от 300 млн до 4,8 млрд.микробных клеток. Через 10 дней после гммунизации мышей заражали предварительно оттитрованной смертельной дозой ультуры вирулентного штамма стрептококков гомологичной серогруппы.

Все штаммы стрептококков различались по антигенной, иммуногенной и ви-улентной акгавности.

Таблица 5

Сравнительные характеристики иммуногенных свойств стрептококков серотруппы R

ш<> Номер и/или наименова- ИмД5о(млрд.м.к.)

п./п. ние штамма р=0,05

Минима- Средняя Макси-

льная. мальная

1. «4» 1,02 х 10s 1,38x16* 1,86 х 10*

2. «181/20 Касли» 0,45 х 10* 0,65x10* 0,93 х 10*

3. «242» 0,91 х 10* 1,29 х 10* 1,82 х 10*

4. «301» 1,95 хЮ* 2,57x10* 3,38x10*

5. «561» 1,87 хЮ* 2,39x10" 3,26x10*

6. «303» 1,18x10' 1,58x10* 2,12 х 10*

Селекционирован штамм стрептококков серологической группы К 181/20 Касли» с высокими антигенными, вирулентными и иммуногенными свойствами, штиген полученный из штамма стрептококка №181/20, обеспечивал накопление итра антител 160,0+18,34 после 8-кратной иммунизации кроликов 36 млрд. мик-обных клеток, что в два раза выше, чем у эталонного штамма. Культура штамма

N2 181/20 «Касли» в дозе от 300 до 500 млн.м.к. с вероятностью 95% вызывала ги бель 50% белых мышей. Штамм стрептококков № 181/20 «Касли» оказался наи более активным в иммуногенном отношении, величина ЙД50 штамма не превы шает 650 млн.м.к.

Штамм используется для изготовления диагностической сыворотки и вакци ны против стрептококкозов свиней.

ВЫВОДЫ.

1. Стрептококкозы свиней широко распространены в свиноводческих хозяй ствах Российской Федерации. Среди микроорганизмов, выделенных из патмате риала, полученного от свиней, по частоте выделения стрептококки занимают пер вое место.

2. В свиноводческих хозяйствах установлена циркуляция стрептококков, от носящихся к 9 серологическим группам АВАДЕХДД и

3. Клинически здоровые взрослые свиньи являются носителями стрептокок ков серогрупп В, С, Б, Е, в, Ь, Л.

4. У свиноматок распространено вагинальное носительство стрептококка серогруппы Ь, вызывающих мастит-метрит-агалактийный синдром. Инфициро ванные животные являются основным источником возбудителей стрептококкозов выделяя их с молоком и влагалищной слизью.

5. Заболевания поросят, возбудителями которых являются стрептококки, от носящиеся к серологическим группам С, И и Ь, протекают с большим охватог (75-100%) поголовья и высокой летальностью (34-76%). Максимальная заболе ваемость стрептококкозами регистрируется среди поросят-сосунов, у которы инфекция в подавляющем большинстве случаев протекает в острой форме и за частую заканчивается летально. Переболевшие поросята остаются стрептококке носителями.

6. Селекционирован штамм стрептококков серогруппы R (Streptococcus suis уре 2) с высокой антигенной, иммуногенной и вирулентной активностью для из-товления стрептококковых диагностических, профилактических и лечебных >епаратов.

7. Предложена схема гипериммунизации кроликов, позволяющая получать 1СОкоактивные и специфичные групповые стрептококковые преципитирующие георотки, предусматривающая введение 64 млрд. м.к,- в течение 4 недель

8.Разработана методика изготовления диагностикума для идентификации рептококков 10 серологических групп в реакции преципитации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предложен для применения в ветеринарной и научной практике набор груп-1вых диагностических стрептококковых преципитирующих сывороток к стреп-коккам серогрупп А, В, С, D, Е, G, L, N, S и R. Разработано наставление по вменению стрептококковых групповых диагностических сывороток, утвержде-. 30.07.1987 г.

Разработаны «Методические указания по лабораторной диагностике стрепто-ккозов животных" № 115-6а (утверждено ГУВ Госагропрома СССР 28.09.1990 г).

Разработана и утверждена нормативно-техническая документация на: «Вак-ну депонированную против стрептококкозов свиней (серогрупп С и R)», - тех-ческие условия ТУ 10-19-460-87, утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 15 )ля 1987 г., - наставление по применению, утвержденное ГУВ Госагропромом :СР 30 июня 1987, инструкция по изготовлению, утвержденная Госагропромом ;СР25 ноября 1987 г.

Разработано наставление по применению стрептококковых групповых диаг-сгаческих сывороток (утверждено ГУВ Госагропрома СССР 30.07.1987 г).

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Панин А.Н., Цветков Е.И., Малик Е.В., Бошьян Е.Г. Штамм бактери Streptococcus suis, тип 2 серогрушш R, используемый для изготовления да агностикумаУ/ авторское свидетельство № 1554361, 1988 г.

2. Панин А.Н., Засепский Н.Х.. Цветков Е.И., Бошьян Е.Г.. Малик Е.В.. Тяь кина Т.Л.. Ловцова Н.А., Захаров В.Б. Способ изготовления вакцины да профилактики стрептококкозов свиней//Авторское свидетельство № 156478! 1988 г.

3. А.Н.Панин и Е.В.Малик. Разработка методов получения стрептококковы диагностических сывороток. - Усовершенствование методов изготовления, koi троль качества и стандартизация бактериальных препаратов. Сб. научн. i] ВГНКИ - М., 1988 стр.28-31.

4. Панин А.Н., Малик Е.В., Романенко А.Н., Борисов В.Н.. Роль стрептоко! ков серогруппы L в инфекционной патологии свиней. //Эпизоотология, эпидемис логия, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекщ онных болезней, общих для человека и животных. Тез. докл. Всесоюзн. конф. Львов, 1988, стр. 449-450.

5. Малик Е.В., Панин А.Н., Цветков Е.И., Бошьян Е.Г. К вопросу об этиолс гической структуре стрептококкозов свиней. Там же - стр. 447.

6. Панин А.Н., Малик Е.В.. Биологические свойства стрептококков, выделет ных от свиней. //Вестник сельхоз. науки, 1991, №3, стр. 139-142.

7. Панин А.Н., Малик Е.В.. Стрептококковый менигоэнцефалит свине] //Ветеринария, 1991, №7, стр. 35-39.

8. Panin A.N., Malik Е.В. Etiological structure of streptococcus of swine in Ru: sia. - Proceeding of the Xllth of LISSD, 6-10 September, St.-Petersburg, Russia, 1993.

9. Panin A.N., Malik E.B. Ways of increasing the efficacy of vaccination again streptococcus's of animal. Proceeding of the Xlllth of LISSD, France, Paris, 1996.