Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Роль M. OVIPNEUMONIAE в развитии респираторных заболеваний овец

. г - * о ^ 'и

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

Э1КПЕРШЕНТАЛЫ0Й ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р.КОВАЛЕНКО ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНА!ШИ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК пкеяи В «И. ЛЕНИНА

На правах рукописи

БАСОВА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА

РОЛЬ М.ОУСТЕТЖСШАЕ В РАЗВИТИИ РЕСПИРАТОРНЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЙ ОВЕЦ

16.00.03 - ветеринарная ьепсробиология, вирусология, эпизоотология, микология и имцунэлогия

Автореферат диссертации на соискание ученой стопзет кандидата Езторппарннх наук

Нзеква - 1991

У -) ' /

) - , / /> -и

'л- 'Г.

V.. ( V -

Работа выполнена в лабератории микробиологии, лаборатории иммунологии и биотехнологии, на экспериментальной базе (остров ЛисиЯ) Всесоюзного Ордена Ленина научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко, в хозяйствах Краснодарского края и районных ветлабораториях.

Научный руководитель - кандидат ветеринарных наук

Э.А.Шегидевич

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

К.020.28.01 по заприте кандидатских диссертаций во Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко

Адрес: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЭВ.

Г.А.Грошева

кандидат ветеринарных наук, доцент

А.Я.Пусговар

Ведущее учреждение - Московская ветеринарная академия имени К.И.Скоябина

Защита диссертации состоится в ас. на заседании Специализированного совета

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета Еавдвдат ветеринарных наук

Ф.Г.Терешков

кщгстгящ

'ПШ j

I

J

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Респираторные болезни сельскохозяйственных животных, широко распространенные в нашей стране и за рубежрм, наносят огромный экономический ущерб современному животноводству, который складывается из прямых убытков от падежа и вынужденного убоя животных, снижения продуктивности, затрат на лечение и профилактические мероприятия.

Массовые респираторные заболевания овец, приводящие к значительному (до 85^ от числа заболевших) отходу ягнят, являются полизтиологичными болезнями, в возникновении и развитии -которых принимают участие пастереллы, некоторые виды вирусов

и другие микроорганизмы ( Alley M.K. ,et. ,el., I975i М-*-8 N' et.,el.,1976; Hamirez R., Pioain С., 1979; Moriab В., IS8I; Shimshony А., 1983; Francisco Т., Jesus K.M., 1986; Bocklisch H. ,et. ,el., 1987).

• При изучении респираторных заболеваний овец большинство исследователей ( Bonerjee м., 1979; Егао Н., 1987; Konte М» Beard А., 1987) из пораженных участков респираторного тракта часто ввделяют различные виды микоплазм, роль которых в развитии этих болезней окончательно не выяснена.

В связи с изложенным, перед нами была поставлена цель — уточнить этиологическую роль микоплазм в респираторной патологии ягнят.

-г -

Основные задачи исследований

Для достижения намеченой цели перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Провести эгшзоотологическое обследование овцеводческих хозяйств, где в течении ряда лет регистрируются массовые респираторные заболевания овец, изучить особенности эпизоото-логического процесса, характера течения и клинических проявлений этого заболевания.

2. Установить частоту выделения микоплазы из пораженных легких больных пневмонией ягнят и изучить морфологические, культуральные, биологические свойства, видовой состав выделенных культур.

3. Отработать непрямой твердофазный иммунопероксидазный метод для ретроспективной диагностики респираторных заболеваний овец, развивающихся с участием микопяазм, и с его помощью выявить шроту распространения микоплазы различных видов в овцеводческих хозяйствах среди различных возрастных групп животных.

4. С использованием ®А выяснить наличие колострального иммунитета к микоплазмам у ягнят, полученных от серопозитивных овцематок и его продолжительность.

5. Определить сроки появления в крови ягнят активных антител к микоалаэмам, выяснить взаимосвязь их динамики с характером течения болезни, развитием клинических проявлений и морфологических изменений в процессе естественного перебо-левания.

6. Экспериментально воспроизвести заболевание серонега-тквних в ША ягнят эпизоотическим штаммом микоплазы при моно-

инъецировании и в ассоциации с Р. Ьаето1у1;1са , изучить динамику титров антител к шкоплазмам в процессе переболевания, характер течения болезни, клинические проявления и патолого-анатомические изменения у экспериментально зараженных животных.

Научная новизна работы

Впервые в нашей стране иммуноферментный анализ применен для выяснения значения микоплазм в респираторной патологии овец. Серологически определена широта распространения М. оПрпеи-дюп!ае в овцеводческих хозяйствах среди различных возрастных групп животных. Получены данные о наличии колоетрального иммунитета у ягнят, его продолжительности. Впервые изучена динамика титров антител к ыикоплазмам в процессе естественного, переболевания и экспериментального заражения ягнят, их взаимосвязь с характером течения болезни, клиническими и морфологическими изменениями.

Практическая значимость работы

Изучен видовой состав мл ко плазм, выделяемых от больных пневмонией ягнят и экспериментально показано участие М. стрпви-топхае в развитии болезни.

Изучены особенности течения пневмонии овец, развивающийся с участием М. отарпешюгиае в естественных условиях и в процессе экспериментального заражения.

Отработан иммуноферментный метод, который нош быть использован для выяснения широты распространения 1!. отхрпеигсо-и1ае в ранней диагностики болезни, протекавшей с участием этого возбудителя

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на конференции молодых ученых (Москва, ВИЭВ, 1990, 1991), на заседании Ученого Совета ВИЭВ (Москва, 1991).

Публикация результатов исследований

По материалам диссертации опубликована I работа и 2 работы сданы в печать.

Объем работы

Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список использованной литературы. Рабета иллюстрирована 14 таблицами и 16 рисунками. Список литературы содержит <ZW источников, в том числе /б/ иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Работа выполнена в 1986-1989 годах в лаборатории бактериологии ВИЭВ (завлабораторией, кандидат ветеринарных наук Э.А.Шегидевич), в лаборатории иммунологии и биотехнологии ВИЗ! (завлабораторией, профессор Ю.Н.Федоров), на экспериментальной базе ВИЭВ (остров Лисий), в хозяйствах Краснодарского кра* и в районных ветбаклабораториях.

Анализ статистических данных и эпизоотологическое обследование проводили с использованием отчетных документов овцеводческих хозяйств и районной ветеринарной службы, материалов собственных наблюдений и исследований.

В отарах этих хозяйств и в специально сформированных опытных группах ягнят регулярно проводили клиническое обследование с целью изучения особенностей течения и клинического проявления респираторных болезней. Проведено патологоанатоми-ческое вскрытие ЗГ2 животных, павших и вынужденно убитых в различные стадии болезни. Патологический материал подвергнут бактериологическим и патслогокореологическим исследованиям.

Выделение и изучение микоплазм проводили в соответствии с "Методическими рекомендациями по выделению, культивирования и идентификации микоплазм, ахолеплазм, уреаплазм" И., 1982.

Для выделения микоплазм использовали бульон и агар Мартена с ингибиторами и без ингибиторов, (рН 7,8 - 8,0). В качестве ингибиторов применяли уксуснокислый таллий в конечной концентрации 1:2500 и пенициллин - 1000 ¡¡¡ц/мл среды.

Выделенные культуры триады клонировали и лиофилизировали. В качестве суспендирующей среды для лиофилизации использовали стерильную инактивированную сыворотку крови лошади, которую добавляли в бульонные культуры до 50^-й конечной концентрации.

Культуральные и морфологические свойства выделенных культур изучали в процессе выравнивания на питательных средах, в препаратах, окрашенных по методам Динеа, Грама, Роиановского-Гимэа.

Гемолитическую, прогеолегичеекуз и сахарэлитяческув активность, стеролзависимость я редуцирующие свойства выделенных культур изучали в сравнении с референтными штакыаш еле-

дующих ВИДОВ микоплазм: И. oTipiiemoniae ï -98, M. arginini р -5, M.capricolum 8411, M. putrefacieas 8411, любезно предоставленных нам доктором Штипковичеи Л., и A. laidlawii , полученный из лаборатории иммунитета ВИЭВ.

Серологическую типизации выделенных культур микроорганизмов семейства üycoplaecataceae проводили в реакции ингибиции' .. роста (РИР) по методике Edward D., Fizgerald w., (1954), на пластинчатом агаре в бактериологических чашках4. Гиперинмуннае сыворотки для серологической идентификации культур получали путем иммунизации кроликов референтными штаммами-микоплазм 4-х указанных видов ПО методу Al-A.ubaldi, Fabricant (1971) в модификации ВИЭВ. Гипернымунная сыворотка к A. laidlawii была предоставлена сотрудниками лаборатории иммунологии ВИЭВ. Предварительную очистку карпускулярных антигенов микоплазм проводили по методу, предложенному Афанасьевым В.Н. , с соавт., (1982).

Дня проведения серологических исследований и ретроспективной диагностики респираторных заболеваний овец, развивающихся с участием микоплазм * была отработана тест-система ИЗД. с гипериммунными сыворотками к 4-м видам микоплазм. Сыворотки были получены путем гипериммунизации баранов.

Некоторые специальные методики, применяемые при отработки ®А, изложены в соответствующем разделе собственных исследований.

Проведено сравнительное изучение ИМ с реакциями диффузионной преципитации в агаре (РДП) и непрямой гемагглютинации (ШГА). РДП и FHTA проводили по общепринятым методикам.

Для выяснения широты распространения микоплазм различных видов методом ®А провели исследования 520 проб сывороток крови овец, полученных из б хозяйств Краснодарского края.

С целью изучения динамики изменения уровня колостральных и активных антител к микоплазмам в процессе переболевания, было сформировано 3 группы животных: всего 165 овцематок и 167 новорожденных ягнят, за которыми в течении 7 месяцев вели клинические наблюдения и проводили серологические исследования кровн в ®А.

Для подтверждения этиологической роли М.отхрпеитовАае провели экспериментальное заражение серонегативных в ®А ягнят культурой М.отирпешпопаае при моноинфецировании и с последующим наслоением культуры Р. Ьаешо1уИса.

Материал, полученный от павших и вынужденно убитых животных был подвергнут бактериологическим исследованиям.

Патологический материал, отобранный для проведения гистологических исследований фиксировали в 10^-м нейтральном формалине, срезы готовили из кусочков, залитых в целлоидин и окрашивали гемотоксилин-зозином. Гистологические исследования проводили совместно с профессором Шубиным В.А., в лаборатории патологической морфологии ВИЭВ и доктором ветеринарных наук Стрельниковым А.П., на кафедре патологической анатомии МВА.

В процессе работы было проведено 312 патологоанатомичес-кнх вскрытий, 77 ыикоплазматологическях, 14 гистологических, более 5 тыс. серологических исследований, выделено 41 культура иикоплазм и 12 культур ахолеплазм. Использовано 15 кроликов, 4 барана, 12 ягнят. '

Статистическую обработку полученных результатов проводили по схеме Лакина Г.Ф.,С1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Общая эпизоотологическая характеристика хозяйств

и результаты микоплазматологичееких исследований

При предварительном эпизоогологическом обследовании хозяйств, неблагополучных по массовым респираторным заболеваниям овец (колхозы имени Мичурина, "Россия", совхоз "Спокойненский" ОПХ "Отрадненское") установлено, что заболевание у ягнят начинается в 2,5 - 3,5 месячном возрасте, не имеет одномоментного охвата, развивается медленно и вяло с выявлением животных в л острой стадии болезни в высоком проценте с июля по октябрь-ноябрь месяцы, а отход ягнят от пневмонии по отдельным отарам составляет от 34 до 57,5^.

Клинически наблюдаемый процесс развивается в 3 стадии, которые довольно четко отличаются друг от друга.

В начальной стадии болезни у ягнят наблюдали слабо выраженные клинические признаки поражения респираторного,тракта:- .'. кашель, положительную трахеальную пробу, легкую гипертермию у отдельных животных.

В более поздний период у части ягнят болезнь прогрессировала и переходила во вторую, острую стадию, которая характери!о-валась резко выраженными клиническими признаками пневмонии: подъемом температуры тела до 41°С и выше. Отдельные животные в острой стадии болезни погибали, а у остальных процесс в дальнейшем протекал хронически.

При хроническом течении болезни у ягнят наблюдали ремер-тирупцую лихорадку, истощение, влажный кашель, обильные слизис-то-гнойные истечения из носовых ходов.

При бактериологических исследованиях патологического материала от 70 ягнят, убитых в острой стадии пневмонии и 7 ягнят, убитых в начальной стадии болезни, имеющих титры антител к II. oYipneumoniae 1:400 и выше в 68,8$ случаев (53 культуры) из пораженных легких были выделены микроорганизмы семейства Мусорlasmataceae . Из пораженных участков легких клинически больных ягнят частота выделения составила 65,7%, тогда как от животных в начальной стадии болезни в 85$ случаев были изолированы культуры M.oTipneumoniae.

Выделенные культуры не реверсировали з бактериальные формы и после 25 пассажей на средах без ингибиторов, их колонии интенсивно окрашивались по методу Динса, мазки из бульонных культур красились по Романовекому-Гимза, но не окрашивались по Граму. Посевы на простых питательных средах оставались стерильными.

12 стеролнезависимых и нечувствительных к дигитотну изо-лятов предварительно были отнесены к роду Acholeplaema, 41 стеролзависимая культура - к роду Mycoplasma.

29 культур микоплазм (54,6$ от общего количества выделенных штаммов) на Iагаре Мартена росли без образования врастающего в агар центра, но при снижении концентрации агар* агара в среде до 0,9%, формировали типичные для микоплазм колонии в форме "яичницы-глазуньи", что по данным Jonrlay S., Zeard L. , (1970) характерно ДЛЯ M.diapar и !.{. oripneumoniae Все вьделенные культуры обладали гемолитической активностью по отношению к эритроцитам барана. 8 штаммов (15,1$) разлагали аргинин, I культура обладала протеолитической активностью.

При проведении серологической типизации выделенные от ягнят культуры микоплазм были отнесены к 3 видам: Ы. от1рпгшгюп1аа - 29 культур (54,6%), все штаммы, не формирущие врастающего

центра на 1,5^-м агаре Мартена; М. агехrj.nl - 7 культур (13,2%), ферментирующие аргинин, но не обладающие протеолитической активностью; М. саргд.со1ша - I протеолитически активная культура {1,9%). Из 12 штаммов ахолеплазм, 9 серологически были отнесены

к А. 1а1|11а1и11.

Четыре культуры микоплазм и три ахолеплазм имеющимися в наличии сыворотками не типировались.

В наибольшем проценте случаев (54,6% от всех выделенных культур) из пораженных легких ягнят изолировали культуры М. отарпеияюгпае.

Отработка тест-системы ИМ

Для ретроспективной диагностики респираторных заболеваний овец, развивающихся с участием микоплазм был отработан непрямой твердофазный иммунопероксидазный метод (®А).

Первоначально ИМ отработали на гипериммунных овечьих сыворотках. Сыворотки были получены путем гипериммунизации баранов антигенами-4 видов микоплазм: М. оу1рпешюп1ае , М„ агвз.п1ш. М.сарг1сс1ит , М.риЪгеГао1епо . Разрушенные антигены вводили баранам в паховый лимфатический узел в смеси с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 и одновременно в 4 точки спины - подкожно. Последующие 5 введений проводили внутривенно, без адъюванта. Титры антител гипериммунных сывороток контролировали в РДП. В результате иммунизации были получены сыворотки к перечисленным видам микрплазм с активностью 1:32 - 1:64.

Антивидовой конъюгат к иммуногло булину а овец получали путем конъюгирования пероксидазы из корня хрена периодатным методом по методике Иакапе Каиао!е к., (1974). Рабочее

»азведение коныогата определяли путем его титрования в системе ВА.

Антигены для проведения реакции готовили путем разрушения эчищенной бактериальной массы на ультрозвуковом дезинтеграторе ларки М S Е при 20 кГц в течении 2,5 минут. Реакцию ставили в объеме 100 мкл реагирующих компонентов в каждой лунке. Рабочее разведение антигенов при сенсибилизации твердой фазы готовили

на 0,01 М бикарбонатном буферном растворе pH 9,6.

В качестве нейтрального белка при сенсибилизации плашек

антигенада микогглазм опробировали 10% сыворотку крови лошади в фосфатно- солевом буферном растворе pH 7,2 (РВ 3), 2,5% раствор желатина, 2,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (ВСА).

В процессе отработки ША были опробированы температурные и временные параметры сенсибилизации твердой фазы: 2 часа при 37°С; 18-20 часов при 4°С; I час при 37°С,а затем 18-20 часов при комнатной температуре.

Для адсорбции испытуемых сывороток - инкубация в течении 2 часов при 37°С; в течении 18-20 часов при 4°С.

Связывание коныогата проводили в течении In 2 часов при

37°С.

После внесения субстратной смеси учет реакции проводили на фотометре марки "wtertek " (Flaw ) при длине волны 450 нм через 10 минут и I час.

Положительным считали разведение, при котором соотношение величин сигналов опытного и контрольного отрицательного образцов составляет не менее 2,0.

Установлено, что оптимальные параметры адсорбции антигенов на твердой фазе составляют 2 часа при 37°С и затем 18-20 часов при комнатной температуре. При сенсибилизации плашек антигены

используют б рабочем разведении 80 мкг/мл.

В качестве нейтрального белка применяли 10& сыворотку крови лошади в РВз .

Для полноценной адсорбции сыворотки к конъюгата плашки выдерживали при гемпературе_37°С в течении 2 часов.

После внесения субстратной смеси результат реакции учитывали через I час.

При сравнительном изучении ИЗА, РДП и РИГА с использованием гипериммунных сывороток установили, что в ИМ антигены микоплазм с гомологичными сыворотками реагируют в разведении 1:12800 и бьше, а с гетерологичными сыворотками перекрестные реакции максимально выявлялись в разведении 1:400. Шк в б раз чувствительнее, чем РИГА и в 200 раз - чем РДП. РНГА, обладая достаточно высокой чувствительностью, является слабо специфичной реакцией ( при титрах антител в реакциях с гомологичными сыворотками 1:2048, перекрестные реакции с гетерологичными сыворотками выявлены в пределах 1:32 - 1:1024). При высокой специфичности, РДП недостаточно чувствительная реакция: с гипериммунными сыворотками титры антител выявлены в разведениях 1:32 - 1:64.

При тестировании 30 полевых сывороток, полученных от овец из неблагополучных по респираторным заболеваниям хозяйств, обнаружили, что с помощью РДП выявить антитела к шкоплаэмам в сыворотке крови естественно больных животных не удается совсем. В РНГА антитела были обнаружены в низких титрах, но в связи со слабой специфичностью реакции, ее использование для обнаружения антител к микоплазмам не представляется возможным. При использовании РИА антитела в исследуемых полевых сыворотках были выявлены в титрах от 1:50 до 1:1600.

Таким образом в дальнейшей работе нами был использован

наиболее чувствительный и специфичный тест серологической диагностики - ИМ.

!

Результаты серологического обследования хозяйств. изучение динамики титров колостральных и активных антител к микоплазмам в процессе естественного развития болезни.

В результате серологического обследования овец различных возрастных групп было установлено, что во всех хозяйствах в высоком проценте выделены животные, реагирующие с антигеном М. от1раеш1оп1ае (около 50$). Животных, реагирующих с антигена!® К. агехпаш. » М. саргд.со1ит , М. риЪгеГасхепз обнаружено не было.

Суммарные результаты исследований в разрезе возрастных групп представлены в таблице.

Как видно из таблицы, наибольший процент положительных реакций был выявлен среди овцематок - 30,4%, всего в этой возрастной группе реагировало 51,995 животных. В отарах, где содержались бараны-производители этот показатель был ниже и составлял 171!, а всего с микоплазменными антигенами реагировало 49,05л

баранов. Среди ягнят 5-7 месячного возраста количество положительно реагирующих животных было наименьшим - всего 10,7%, но количество сомнительно реагирующих живэтных в этой возрастной группе было наиболее высоким, и общее количество ягнят, реагирующих с микоплазменным антигеном также приближалось к среднему значении и составляло 49,2&, Полученные данные свидетельствуют о широком распространении М. ог1рпешаопгае в овцеводческих хозяйствах, неблагополучных по респираторным заболеваниям.

Суммарные результаты исследований проб сывороток крови от овец различных возрастных групп в ®А с антигеном \h.ovipneumoniae.

№ Возрастные группы п/п животных

Всего исследовано Положительно реагировало

Сомнительно Отрицательно реагировало реагировало

голов % голов % голов %

I. Бараны-производители 53 9 16,98 17 32,07 27 50, %

2. Овцематки 158 48 30,4 34 21,5 76 48,1

з4 Ягнята 5-7 месячного возраста 309 33 10,7 119 38,5 157 50,8

Итого: 520 90 17,63 170 32,7 260 50,0

- id -

С целью изучения наличия и продолжительности колострального иммунитета у ягнят, полученных от серопозитивных овцематок, выяснения сроков появления у ягнят в сыворотке крови активных антител к микоплазмам в процессе естественного переболевания, выяснения взаимосвязи их динамики с характером течения болезни и развитием клинических признаков в 3-х хозяйствах Краснодарского края было сформировано 3 группы овцематок: две группы животных во второй половине беременности, пеложительно реагирующих с антигеном М,с1рпеитоп1ае (51 и 64 головы) и,для контроля, I группа в хозяйстве, где при предварительном обследовании положительно реагирующих животных выявлено не было.(50 голов).

У всех овцематок сразу после окота сыворотки крови исследовали в Шк с 4 микоплаэыенными антигенами. У ягнят, полученных от этих овцематок, кровь исследовали до приема молозива, на 3-? день после рождения и затем через 15, 25,.35, 65, 90, 120 и 150 дней после первого взятия крови.

Положительно реагирующие животные были выявлены только в реакциях с антигеном М. ovipneumoniae , у всех овцематок опытных групп, сформированных в хозяйствах, неблагополучных по респираторным болезням овец в сыворотке крови обнаружили антитела к микоплазме, тогда как в контрольной группе овцематок реагирующих животных не выявляли.

До приема молозива все ягнята как опытных, так и контрольной групп были серонегатиэны.

После приема молозива у 80,3 - I00& ягнят опытных групп в сыворотке крови обнаружили антитела к М. oYipneunioiiiae. У ягнят контрольной группы антител к микоплазме и после приема молозива обнаружено не было.

При дальнейших исследованиях наблюдали снижение количества положительно реагирующих животных в опытных группах. На 15 день

после рождения положительно реагировало 24,2 - 25,5$ ягнят, на 25 день - 8,3 - 10,9$, а на 35 день исследования только по I ягненку в каждой опытной группе положительно реагировало с антигеном М. о^рпегджогиае , что составляло 1,64 - 2,3%. В этот период клинических признаков поражения органов дыхания у ягнят

еще не наблюдали. Таким образом, в сыворотке крови ягнят, полученных от серопозиг ивных овцематок нолостральные антитела сохраняются до 25 - 35-дневного возраста.

Впервые активные антитела были обнаружены у 3 ягнят (5,7%) в 65-дневном возрасте. Клинических признаков заболевания органов дыхания в этом возрасте также не наблюдали.

При обследовании ягнят в 90-дневном возрасте количество положительно реагирующих животных в опытных группах возрасло и составляло соответственно 14 гелов (34,1$). В этот период среди положительно реагирующих ягнят впервые наблюдали начальные клинические признаки поражения органов дыхания (кашель, положительная трахеальная проба, слабо шраженная гипертермия). В последующим у части положительно реагирующих животных заболевание клинически прогрессировало, а титры антител к микоплазме постепенно снижались. При обследовании этих живвтных в 120-днеь-ном возрасте среди ягнят с резко выраженной клиникой пневмонии кавотных, с тирами антител к микоплазме, превышающих значение 1:50 не выявляли. Среди остальных ягнят, отрицательно реагировавших в 90-дневном возрасте, в 120-дневном возрасте вновь были выявлены первично положительно реагирующие животные в количестве 7-8 голов (21,8-23;5$). Среди первично положительно реагирующих животных, как и при обследовании в 90-дневном возрасте, наблюдали начальные клинические признаки поражения органов дыхания.

При обследовании ягнят опытных групп в 150-дневном возрасте в каждой группе вновь было выявлено по 7 первично положительно реагирующих животных.

При индивидуальном учете результатов серологического обследования ягнят опытных: групп было установлено, что в процессе переболевания активные антитела к микоплазмам обнаруживаются на протяжении 30 дней, через 55-60 дней антитела у этих животных уже не выявляются.

Для выяснения патологоморфологических изменений в органах дыхания у ягнят, первично положительно реагирующих с микоплаз-менным антигеном 7 животных опытных групп с титрами антител к М.оу1рпеш1ов1ае в пределах 1:400 - 1:800 были убиты. От всех ягнят был взят патологический материал для проведения бактериологических и патологоморфологических исследований. Перед убоем у 5 ягнят были отмечены слабо выраженные клинические признаки поражения респираторного тракта, 2 ягненка были клинически здоровы.

При паталогоанатомическом вскрытии у йгнят обнаружили еде-ничные очажки пораженной легочной ткани в краниальных долях легких. У клинически здоровых животных видимых изменений в легких не наблюдали.

. Гистологически изменения как у клинически больных, так и у клинически здоровых ягнят в основном наблюдались в бронхах и характеризовались поражением слизистой оболочки бронхов (утолщение стенок бронхов за счет инфильтрации слизистой оболочки полиморфноядерными лейкоцитами, местами обнаружили дистрофию и десквамацяю покровного эпителия). Просветы бронхов были заполнены серозным экссудатом. Перибронхиально обнаружили крупноклеточную пролиферацию, скопления клеток лимфоидного ряда с лимфатическими фолликулами, участки аталектазов с ярко выраженной нейтрофильной реакцией. 7 клинически больных животных кроме того в участках поражения альвеолы были заполнены серозным выпотом с большим количеством лейкоцитов и слупрваихся эпителиальных клетон.

При бактериологических исследованиях от б ягнят были выделены культуры М«отарпеш!1ст1ае , в одном случае - культура Р. bae.fflolyt.ica.

Экспериментальное заражение ягнят

Для уточнения роли М.о^рпеитот-ае в этиологии респираторных заболеваний-овец был проведен опыт по заражению ягнят культурой М.от1рпешюпхае эпизоотического штамма "С" при моноинфицировании и с наслоением культуры Р.йаетогуЯса серологического варианта А-1.

Перед заражением ягнят опытной и контрольной групп исследовали на наличке антител к микоплазмам и вирусу ПГ-3. В опыте использовали серонегативных животных.

На первом этапе эксперимента 9 ягнят опытной группы интра-трахеально были заражены 4-х суточной бульонной культурой ыи-коплазм, сконцентрированной в.100 раз в дозе 1,5 мл. Культуру вводила трижды с интервалом в 24 часа. 3 ягнята!! контрольной группы по той же схеме инокулировали стерильный бульон Мартена.

На вторые сутхи после заражения у ягнят опытной группы бьии отмечены первые клинические признаки болезни, температура тела у всех животных повысилась до 40,1 - 41,4°С и удерживалась вше физиологической нормы в течении двухнедельного периода.

Антитела к М.о-»1рпешюпаае в сыворотке крови обнаружили на 7 сутки после первого введения антигена у 7 из 9 ягнят опытной группы.

Максимального значения титры антител к М. от1рпеитов1ае у ягнят опытной группы дбстигли на 17-27 день после заражения, затем начали постепенно снижаться в на 42 день только у 2 из оставшихся 3 ягнят опытной группы были выявлены в титрах 1:50.

У ягнят контрольной группы в указанный период клинических признаков заболевания и титров антител к микоплазмам не выявляли.

На 17 сутки после заражения культурой М.cnripneumoniae 3 ягненка с титрами антител 1:200 - 1-800 и явно выраженными клиническими признаками болезни были убиты, проведены патолого-морфологические и бактериологические исследования.

При вскрытии у всех ягнят обнаружили небольшие очажки пораженной ткани в краниальных долях легких, агалектазы, расположенные по ходу бронхов.

Гистологически наблюдаемые изменения характеризовались умеренно выраженным катаральным бронхитом, пролиферацией клеток лиьфЬидного ряда около бронхов мелкого и среднего калибра, ¡аз-ростом альвеолярного эпителия и соответствовали изменениям, наблюдаемым в начальной стадии при естественном течении болезни.

От всех животных была выделена ретрокультура микоплазк.

Через 20 дней после заражения культурой Ы.oripneumoniae 3 ягненка были дополнительно заражены культурой P.haemolytlca У зараженных животных через 12 часов после введения культуры температура тела повысилась до 41,5°С, у ягнят отмечали резко выраженные клинические признаки поражения респираторного траста. Один ягненок пал через 20 часов после заражения, а 2 ягненка были убиты на 5 сутки после введения культуры P.haemolytica

При гистологических исследованиях у убитых ягнят обнаружили изменения, характерные дня подоетрой катарально-гнойной бронхопневмонии, соответствующие изменениям, наблюдаемым у ягнят при естественном течении пневмонии. От всех животных была ввделена ретрокультура Р. baemolytica.

У убитого в те же сроки ягненка квнтрояьноЯ группы никаких паталогоанатомических и гистологических изменений не наблюдали.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о зироком распространении М, ovipneumoniae среди овец различных Боэврастных групп и ее участии в развитии массовых респираторных: заболевший ягнят.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что массовые пневмонии овец имеют широкое распространение в овцеводческих хозяйствах Краснодарского края и являются причиной значительного отхода ягнят (50,7 - 57,5% от общего количества павших животных). В ряде хозяйств заболевание протекает медленно и вяло с выявлением животных в острой стадии болезни примерно в одинаковом проценте на протяжении 4-5 месяцев.

2. В таких хозяйствах из пораженных легких больных пневмонией ягнят примерно в 70$ случаев были выделены микроорганизмы семейства Kycoplasmataceae. Наиболее часто (54,6% от всех выделенных культур) из пораженных легких ягнят изолировали культуры М. oYipneumoniae. В нанальной стадии болезни процент ввделения микоплазм этого вида был выше и составлял 85$.

3. Отработан икмуноферментный анализ (ИМ) для выявления . антител к микоплазмам в сыворотке крови овец. Определены оптимальные температурные и временные параметры постановки реакции: адсорбирующая доза антигенов 80 мкг/мл при рН комплексирующего буфера 9,6^,2 в течении I часа при 37°С, а затем 18-20 часов при комнатной температуре; адсорбция сывороток и конъюгата 2 часа при 37°С.

4. При сравнительном изучении чувствительности и специфичности ЖА, РДП и 7НГА установили, что с гипериммунными сыворотками '.ФА в 200 раз чувствительнее РДП и в 6,2 раза - FHTA и значительно специфичней последней. При аналогичных исследова-

ниях с полевыми сыворотками крови овец, полученными из неблагополучных хозяйств обнаружили, что с помощью РДГГ выявить антитела к микоплазмам нз представляется возможным, а РИГА в связи с низкой специфичностью не дает четких результатов.

5. В хозяйствах, неблагополучных по респираторным, заболеваниям овец установлен высокий процент (около 50$) животных различных возрастных групп (овцематки, бараны-производители, ягнята 5-7 месячного возраста), положительно реагирующих только С антигеном М. oyipneumoniae.

6. В сыворотке крови у новорожденных ягнят, полученных от серопозитивных овцематок антител к микоплазмам до приема молозива не выявляли. На 3-7 сутки после рождения в 80,3 - 100$ случаев ягнята реагировали с антигеном M.ovipneumoniae. Колостральные антитела максимально сохранялись у ягнят до

25 - 35-дневного возраста.

7. Установлено, что активные антитела н М; orlpneumoniae начинают выявляться у ягнят с 65-дневного возраста. При обследовании в 90-дневном возрасте количество первична положительно реагирующих ягнят максимально (34,1 39$), а в последующие сроки (120 и 150 дней) первично реагирующие животные были выявлены примерно в равном проценте (около 25$). Продолжительность выявления активных антител з сыворотке крови ягнят составляет более 30 дней, через 55 - 60 дней активных антител уже не выявляли.

8. У первично положительно реагирующих ягнят клинические признаки поражения органов дыхания отсутствовали, или же были слабо выражены. В дальнейшем у части этих животных заболевание клинически прогрессировало, а титры антител к шкоплазме постепенно снижались. У животных с резко выраженными клиническими признаками пневмонии антител it М. oripneumoniae в титрах, превышающих значение 1:50 уже не выявляли.

9. При экспериментальном заражении ягнят, серонегативных в ИВА, культурой U. ovipneuiaoniae у животных в легких развивались изменения, наблюдаемые в начальной стадии болезни в естественных условиях и характеризуемые катаральным бронхитом, пери-бронхиальными пролифератами из лимфоидных клеток, гиперплазией лимфатических фолликулов, развитием аталектазов. Антитела к

М. oripneumoniae в сыворотке крови зараженных животных выявляли начиная с 7 дня после инфицирования, что свидетельствует об участии М. oTipneuuioniae в развитии патологии органов дыхания у овец.

10. Последовательное заражение ягнят культурами М. ovipneuiaoniae и P.haejnolytica вызывает у животных развитие катарально-гнойной бронхопневмонии, по характеру изменений соответствующей патологическому процессу, наблюдаемо^ у ягнят при естественном течении пневмонии.

Практические предложения

Материалы диссертации вошли в методические рекомендации "Выявление антител к микоплазмам в сыворотке крови животных имаогноферментным методом™ одобренные Ученым Советом ВИЭЗ, протокол № 22 от 07.01.90 г. и Экспертной комиссией по биотехнологии

отделения ветеринарной медицины ВАСХНИД, протокол № 2 от II.12.90г.

f

Список опубликованных работ

1. ¡Пипицин А. Г., Басова Н.Ю., Пшеничный A.A., Лечение

и профилактика, неспецифических респираторных заболеваний рогатого скота. Информационный листок Краснодарского ЩТИ № 6Т>¥~9/

2. Басова Н.Ю. Экспериментальное заражение ягнят культурами M.ovipneuaoziiae и p^haemolytica , Деп. $