Роль генетического обмена в формировании энтеротоксигенных вариантов вакцинных штаммов Escherichia coli

Тихонова, Наталия Борисовна

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Роль генетического обмена в формировании энтеротоксигенных вариантов вакцинных штаммов Escherichia coli

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Тихонова, Наталия Борисовна Моск. обл., п. Родники 2004 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Роль генетического обмена в формировании энтеротоксигенных вариантов вакцинных штаммов Escherichia coli

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПУШНОГО ЗВЕРОВОДСТВА И КРОЛИКОВОДСТВА ИМ. В.А. АФАНАСЬЕВА

На правах рукописи

Тихонова Наталия Борисовна

Роль генетического обмена в формировании энтеротоксигенных вариантов вакцинных штаммов Escherichia coli

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Московская область, п Родники 2004

Работа выполнена в Гос\дареIвенном научном учреждении Научно-исследовательский институт п\ итого звероводства и крочиководетва им В Л Афанасьева (ГНУ НИИПЗК) РАСХН и в Гос\ дарственном учреждении Научно-исстедовательский институт морфотогии человека РАМН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Козловский Юрий Евгеньевич

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук

Литвинов Олег Борисович

кандидат биологических наук Гагарина Екатерина Юрьевна

Ведущая организация: Федерачьное государственное образова-

течьное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»

Защита диссертации состоится декабря 2004 г в часов на заседании специализированного совета КР 006 047 53 по защите диссертаций на соискание \ ченой степени кандидата биологических на\ к при Государственном на\ ч-ном учреждении Научно-исследовательский инс1ит\т пушного звероводства и кролиководства им В А Афанасьева (140143, Московская обл , Раменский район, п Родники, ул Трудовая, д 6, тел (095)501-53-55) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 111У НИИПЗК Автореферат разослан «

ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Л ое н ко Н.Н.

- У

mfflo

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема токсикоинфекций до сих пор оста-

ётся одной из нерешённых в ветеринарии и медицине. Попытка создания вакцинных препаратов традиционным путём либо вообще не приводила к успеху, либо эффективность их применения была крайне мала, что объясняется физиологическими особенностями желудочно-кишечного тракта, играющего барьерную роль. Болезнь развивается при условии колонизации энтеротоксигенных Escherichia coli (ЕТЕС) тонкого кишечника и выработки ими энтеротоксинов. Основную защиту против ЕТЕС обеспечивают антитела класса IgA к фимбри-альным факторам колонизации, LT-токсину и О-антигенам. В процессе заболевания вырабатывается как антибактериальный, так и антитоксический иммунитет. До недавнего времени считалось, что антитоксический иммунитет в первую очередь направлен против субъединицы В термолабильного токсина, однако, согласно имеющимся литературным данным, А-субъединица холерогена, близкого по структуре к LT-токсину, обладает выраженными суперантигенными свойствами. Логично было бы предположить, что и А-субъединица LT-токсина является суперантигеном.

Иммунный отвег на текущий инфекционный процесс является многосторонним и связан с выработкой специфических антител на различные новые антигенные раздражители, последовательно вступающие в действие в динамике заболевания, что существенно отличается от вакцинального, формируемого традиционными парентеральными вакцинами, направленного, как правило, на один антигенный раздражитель. В настоящее время наиболее перспективным путём создания современных эффективных препаратов является разработка генно-инженерных живых перорапьных субъединичных вакцин на резидентном носителе.

Основной проблемой при создании таких препаратов являося обеспечение их биологической безопасности. В данном случае имеется ввиду невозможность восстановления токсического фенотипа вакцинными штаммами и пре-

догвращеиие появления высокотоксичиых полирезистентных штаммов. В этом плане большой теоретический и практический интерес представляет изучение особепиостсй обмена генетической информацией между вакцинными и природными иламмамм, а также создание генетических конструкций, делающих такой обмен невозможным.

Цели и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение роли генетического обмена в формировании энтеротоксигенных вариантов вакцинных штаммов П.coli, а 1акже ра¡работка теоретических и практических подходов к созданию пероральных биологически безопасных живых генно-инженерных вакцин.

В соответствии с изложенным были поставлены следующие задачи:

1. Создать генно-инженерную конструкцию на основе неконъюгативной стабильной плазмиды и детерминанты термолабильного токсоида.

2. Сконструирован, паркам i эксмсрпмсн тальною потенциально вакцин-IIOTO штамма на основе aiiaioieiiHoro высокоадгезивного резидентного штамма E.coli и полученной конструкции

3. Ввести в сконструированный штамм факторы обеспечивающие биологическую безопасность.

4. Провести коныотативные скрещивания для оценки возможности восстановления токсической детерминанты путём рекомбинации in vivo.

5 Исследовать возможность восстановления токсического фенотипа in

vitro

Научная новизна. Впервые изучена возможность восстановления токсическою фенотипа у нетокешенных штаммов E.coli - продуцентов токсоида, изучены факюры, влияющие на мереное генетических детерминант токсиген-ностм между различными штаммами Е coli, а также сконструирован биологически безопасный продуцент токсоида, неспособный к восстановлению токсического фенопша путём реверсии или обмена генетической информацией.

Практпческая цснносп,. Разработаны теоретические и практические подходы -к конструированию био готически безопасных рекомбинантных

штаммов для изготовления живых пероральных вакцин против токсикоинфек-ций. Сконструированы потенциально биологически безопасные штаммы для создания вакцинных препаратов Данные полученные в ходе работы могут быть использованы в создании вакцинных препаратов против токсикоинфекций, а также в курсе лекций по микробиологии и молекулярной генетике. Основные положения, выносимые на защиту.

- разработан подход к конструированию биологически безопасных рекомби-нантных штаммов для изготовления пероральных вакцин против токсикоинфекций;

- изучены возможности восстановления токсического фенотипа генно-инженерного штамма путём рекомбинации;

- получена генетическая конструкция и штамм, созданный на её основе;

- разработаны подходы, предотвращающие восстановление токсичности.

Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доложены на

- II Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» - 2003г;

- научной сессии РАМН «Актуальны вопросы морфогенеза в норме и патологии»;

- Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина

- 2004» - Феодосия;

-на межлабораторном семинаре сотрудников ГНУ НИИ Пушного Звероводства и Кролиководства им. В. А. Афанасьева, 2004г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, отражающих основное содержание диссертации.

Структура и обьём диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы. В тексте содержится 7 таблиц и 12 рисунков. Список использованной литературы включает 242 источника

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования

Рабом выполнена в лаборатории генно-инженерных препаратов отдела биотехиоло! ии Государственною научною учреждения Научно-исследовательскою iiiiciiiiyia пушною звероводства и кролиководства им. В А. Афанасьева (ГНУ 11И ИI ПК) РЛСХН и ГУ НИИ морфологии человека РАМН

Ш 1аммы бактерий и илазмиды. Вся работа проводилась со штаммами П coli (габл I) п илпзмидами (табл2) из коллекции лаборатории генно-имжемермых препараюв I НУ НИИ1ГЗК В исследовании также использовались производные этих ипаммов, полученных в ходе работы путём введения в их геном рекомбинантнмх нлазмпд pLT5, pLTA2, pLTAAB124.

Таблица I

Штаммы E.coli, использопанные в исследовании

Штамм Характеристика

С600 F-, supE44, thrl, thi-1, leuB6, lacYl, tonA2l Д-

C600Rif* F-, supE44, thrl, thi-1, leuB6, iacYl, 1опА2ГД-~т?* GIV12313 dam-, dem-AmpR Jac-

rccÄT, ciKlA I, hy7Ä9MbT-1, hsdRI7, hiH, supE44, relAI, lac, {F7 proAB, laclq, MM 15, Тп 10 (TetR)} F", дикий тин

Питательные среды. Для получения жидкой культуры Е coli использовали LB-бульон (1% бакт-триптон. 0,5"о дрожжевой экстракт, 1% NaCI). В ка-

В-148

XL-1

честве плотной среды для культивирования Е coli применяли LB-arap (1% бак-то-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCI, 2% агар-агар).

Таблица 2

Плазмиды, использованные в экспериментах

плазми-да размер единичные сайты рестрикции селективные маркёры

рВК322 4,3 kb Aval, Pstl, BamHl, Pvull, Clal, Sali, EcoRI, Hindill Ар, Тс

pSCIOl 9,09 kb EcoRl, Hindlll, BamHl, Sali, Xhol, Pvull, Smal Тс

pCRl 11,4 kb EcoRI, Hindlll Km

рВ148 -70 kb Ар

pLG74 h/o + + г it)

рН74114 h/o eh

F h/o tra+, Тс

pLT5 h/o Aval, BamHl, Pvull, Clal, Sali elf, Тс

pLTAAl 7 Aval, BamHl, Pvull, Clal, Sali Тс

pLTÄAl 24 Тс

pLTA2 Тс

pLTA8 Km

Ар - ампициллин, Тс - тетрациклин, Km - канамицин, н/о - не определяли

Культивицованне штаммов. Для выделения плазмидной ДНК в препаративных количествах культуру E.coli выращивали в 5 мл LB-бульона в течение 18 часов при 37 °С в условиях интенсивной аэрации. В селективные среды добавляли антибиотики: тетрациклин, ампициллин, канамицин, рифампицмн.

Выделение ii очис1ка плазмидиой ДНК. Для получения плазмидной ДИК из культуры / coli исиользовапи мегод быстрой щелочной экстракции (Birnboim HC', Doly 1 , 1979) с некоторыми модификациями, принятыми в лаборатории генно-инженерных препаратов Электрофорез ДНК проводили в 1% шпротом теле с бромистым этднем "Элюцию ДНК из агарозного теля проводили с помощью сорбента GlassMilk.

КонеIруироиапие рекомбинанiны\ ила)мид. При конструировании рс-комбипаиишх плазмид использовали эидонуклеазы рестрикции EcoRl, Pstl, Bell, Xbal и Pvull. нуклеазу Sl, ДНК-литазу фага Т4 производства MBI 'Tcrmenlas" (Литва) Обработку плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции и нуклеазой SI, лшнрование рестрикционных фрагментов проводили по методикам. описанным п руководстве по молекулярному клонированию (Маниатис и лр 1984)

Трансформация нпаммов E.coli плазмидной ДНК. В процессе работы иснользоналп метоп трансформации, предложенный Kushner, 1978, для штамма Г. coli SKI590.

Kom.ioi ацноинме скрещивания штаммов E.coli. Конъюгационные скрещивания проводили на плотной среде по методу Bradly D , 1980, с некоторыми модификациями для триродительского скрещивания.

Бнопроба. В работе использовались мыши линии Balb/c Оценку токсической акптвности I 1-токсина проводили используя тест отёка лап белых мышей

РЕЗУЛЫЛ1Ы ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Клонпрованне elf ouepona в плазмпде pBR322

Для исследования роли генетическою обмена в восстановлении токсическою фепошпа вамшнныч штаммов Е coli, решено было сконструировать мо-

дельный потенциально вакцинный штамм, продуцирующий генно-инженерный токсоид В ходе выполнения этой задачи необходимо было выделить eh оперон из природной плазмиды токсигенного штамма E.coli H74114 и клонировать в плазмиду pBR322. Проведённый ранее анализ физической карты токсигенной плазмиды из штамма E.coli H74114 показал, что гены токсинообразования расположены на Pstl-Pstl фрагменте Ent-плазмиды, размер которого составляет 6,08 т.п.н. (рис.1). Плазмида токсигенности природною штамма E.coli Н74114 была выделена, очищена и гидролизована ферментом Pstl. Фрагменты ДНК, полученные после гидролиза, были разделены с помощью электрофореза в ага-розном геле, причём в качестве маркеров размеров фрагментов использовали ДНК фага X, предварительно обработанную ферментами Есо1301 и Mlul. Затем Pstl-Pstl фрагмент токсигенной плазмиды, соответствующий размеру 6,08 т п.н., был элюирован. Этим же ферментом Pstl расщепляли плазмиду pBR322. Полученной после обработки ДНК-лигазой смесью молекул трансформировали компетентные клетки штамма E.coli С600, которые высевали на LB-arap с тетрациклином (20 мкг/мл). При учёте результатов на чашках было обнаружено 263 колонии, из которых при повторном пересеве только 143 были резистентные к тетрациклину и чувствительны к ампициллину (100 мкл/мл). В отличие от pBR322 рекомбинантные плазмиды были чувствительны к ампициллину, так как вставка в сайт Pstl плазмиды pBR322 инактивирует ген резистентности к ампициллину (рис.2). Каждая колония из 142 была проверена на наличие Pstl-Pstl фрагмента размером 6,08 т.п.н., содержащего eh оперон, путём выделения плазмидной ДНК с последующим гидролизом ферментом Pstl. Электрофорети-ческий анализ продуктов гидролиза показал, чго пять колоний содержат плазмиду, Pstl-Pstl фрагмент которой соответствует по размеру фрагменту, включающему elt оперон. Из этих пяти колоний только одна дала положительный результат при постановке ПЦР. Кроме того, лизат культуры, полученной из отобранного клона, дал положительный результат на наличие LT-токсина в реакции Ухтерлони с антисыиоротками против термолабилыюго токсина E.coli.

l'ccipiiKiiiioiiiiiiM карга Pstl-Pstl фрагмента Ent-плазмиды нплмма E.coli 1174114, содержащего <?//-онерон

Ijl ^¡¡«ICcifllGjlt Hr4i НкйТ

| 1.00 ~ D4'j| • ).д{ 0 *J ja ))

+CI1 РУ1

I I

2,<0

Размеры фра! ментов между сайтами рестрикции указаны в т.п.н.

Рисунок 2

Схема конструирования нлазмнды pLTS из плазмиды pBR322 и Ent-плазмиды штамма E.coli Н74114

гч!

т 8

PjII Pill |ij,i

i %

| f

« L p,,i

pul

Таким образом, полученные результаты позволили утверждать, что нам уылось прок 1оннрона1ь в сайт РбИ плазмиды рВЯ322 е//-оиерон Новую ре-комбпненм п\ ю п 1а шиду, на основе рВК322, содержащую с7/-опсрон, обозна-чичи как р1 I >

Получение делеции в eli опероне

Согласно имеющимся данным данным первичная структура А-субъединицы термолабильного токсина содержит несколько участков, изменение которых ведёт к потере токсической активности. К таким участкам относится аминокислота гистидин (His) в положении 44 (рис.3). Учитывая эти обстоятельства, решено было для устранения токсической активности делегировать участок А-субъединицы, содержащий His-44.

Проанализировав физическую карту е//-оперона штамма E.coli Н74114 мы обнаружили, что удаление участка ДНК между сайтами Xbal и Bell затрагивает и триплет кодирующий His-44 (рис. 4А). Плазмида pLT5 была введена путём трансформации в штамм E.coli GM2113 с фенотипом dam'dem', затем выделена и очищена. Однако после обработки очищенной плазмиды pLT5 ферментами Xbal и Bell нами была получена линейная молекула ДНК с липкими, но некомплементарными концами (рис. 4Б). После удаления выступающих 5'-концов нуклеазой S1 и дезактивации нуклеазы было проведено лигирование по тупым концам и получена кольцевая молекула ДНК, содержащая е/?-оперон с делеци-ей участка между сайтами рестрикции Xbal и Bell, включая сами сайты (рис. 4В). Полученными рекомбинантными молекулами трансформировали компетентные клетки штамма E.coli GM2113. В результате было получено около 60 трансформантов Из каждой полученной колонии была выделена плазмидная ДНК, очищена и обработана ферментами рестрикции Xbal и Bell. Практически все анализируемые плазмидные ДНК трансформантов, за исключением двух, показали на электрофореграмме отсутствие сайтов для Xbal и Bell и были использованы для дальнейшего анализа.

llyKJicoiпутай последовательное il» lena ellA il аминокислотный состав А-субьеднннцы LT-токспна

fokl -,S r*»""

V CGTGCACTCTTTCTTÎArCGCTtCACTACArATTnATCCTCIXATCGATGTTTTATAAAAAACATGArTGACATCAT

• tcVFcXí«T i

Rlbosom« binding sequence

GITGCAlAlAGGTTAAACAAAACAAGTGKf.nATCTTTIlCCCGATT6TCTTCTTGTAlGATATAÎAAGTTrTCCTCi

«nUMA — UAAü -

1«S ГЮ1А *,МЛКСаа:ЛсиЛО-

A1G AAA AAT ATA ACT Tit ATI T TT TT» A4 ПА TTA GCA ICO CCA TIA ТАГ «А ААТ 5«С

Het lys Asn Ile Thr Phe II» phe Phe IT« Leu Leu A1 « Ser 1-го Leu Tyr AW Asn Gly

•18 -TO -1 I xb«l

GAC AAA ITA тл< CCт СС* G*C ТСТ ЯСА CLC ССА йЛТ CAA ATA AAA ССТ ТСС CCA ССТ СТТ

Aso Lys Leu Туг Ai g AI« Aii, Ser Arg Pro Pro Alp Glu 11* Lys Arg Ser ßly Gly Leu 10 70

ATG CCC ACA GGG CAT ААТ GAG TAC TIC GAT AGA GGA ACT CAA A1G ААТ ATT ААТ СТТ TAT Mel Pro Arg Gl у И » j Ain Glu гуг Pf,е Asp Arg GT y Thr Gin Ket Asn II« Asn Leu Tyr ЭО «0

GAl'cAC GCG AGA GGA ACA CAA ACC CGC TTT GTC AGA TAT GAT GAC GGA TAT GIT TtC ACT Aso His AU Ar«) Gly Thr Gin Thr Gly Phe val Arg Tyr A it Asp Gly Туг V»! S er Thr 50 GO

TrT (II AGI TTG AGA AGГ GTT CAC TTA GCA GGA CAG TCT ATA TTA TCA GGA ТАГ ТСС ACT Ser Leu Ser Leu Arg Ser AI» Hl* Leu Ale Gly Gin Ser Ile Le« Ser G>y T yr Ser Thr 70 «О

ТАГ TAT ATA TAT GTT ATA GCG АГА GCA СГА ААТ ATG ITT AA1 GTT HAT GAT GTA TTA GQC

Tyr Tyr Ile Tyr Vftl Ile AU Thr Ale Pro A»n Hei Plie Asn v«1 Asn Asp Val (.eu GTy

9Ù ICO

Accl

СТА 'Al AGC c:> CAC С CA TAT йАЛ CAG йАГ, GTT ТСТ CCS Г»А GGf BGA ATA С С» TAT ТСТ

Vel Туг Ser Pro H1s Pro Туг Glu GTn Gly Val Ser Ale Leu Gly Gly Tie Pro Tyr Ser

110 IfO

ToH

CAG ATA TAT GGA TGG TAT Ct,T GTT ААТ ТГТ GGT CTG ATT GAT GAA CGA TTA CAT CGT AAC

Gin Tie Tyr Gly Trp Tyr Arg val Asn Phe Gly Val 11« Asp Qlu Arg Lew Hl« Arg Atn

130 1«0

AGG CAA TAI AGA GAC CGC TAT TAC AGA AAT CTG AAT A1A 6CT CCG GCA GAG GAT GGT TAC At y Туг Д. g Alf, Л. у *>. Туг Ayti Leu Aso Ii« AI« г, 0 а79 Qlu Alp Gly Туг

IM 140

Hin,tut Hfrlfl

AGA IIA GCA GGT ПС СLA CtG GAT CAC CAA GCT TGG AGA GAA CAA CCC TGC ATT CAT CAT Arg leu AI« Gly Phe fro P'O Asp MIS Gin AI« Trp Arg Çlu Glu fro Tro II« His MIS 1?0 1 «О

GCA «.CA CAA ССТ IGT GGA USt TCA ТСЛ AGA АСА ЛГТ АСА ССТ CAT ACT ТСТ AAT GAC GAC AI« «го Gin Gly Cys Gly A\p s«r S«r «rq Ihr Ile.Thr Sly Asp Thr Cy« Asn Glu Glu

igo V T

Mel

А'- ГЛГ, ДАТ CU, A',c A.-A »I« TAT СТГ АПв AAA TAT CAA TCA AAA OTT AAG AGG CAG ATA

Ihr '.In Ain Leu Ser Ihr lie lyr Leu Arg Lys Tyr Gin Ser Lys Vil Lys Arg Gin Ile

но гго

EíuRl

'TT KA GA' TAT TAG T.t. GTT GAC ATA TAT AAC AGA ATT rGG AAT GAA TTA Г6А

Ph« ' rr f • ü lyr Gin Srr Ы «j V«1 Asp Ile Tyr Ash Arg lie Arg Asn Glu Leu Stop

г jo но

U результате анализ.) продуктов совместного гидролиза плазмидной ДНК ферментами Pstl и HcoRI. было отобрано 24 трансформанта, плазмиды которых обладали ч.фамерпегпк.шп плазмиды pLT5. В соответствии с проведённым .шали юм, отобранные ф.шеформашм содержали clt-оперои, утративший с.н'мы

Bell и Xbal, что давало основание предполагать наличие в данном опероне де-леции участка BclI-Xbal, включая сами сайты рестрикции. Теперь нам необходимо было доказать отсутствие сдвига рамки считывания гена еИА полученной генно-инженерной конструкции. Для этого ультразвуковой лизат каждого из отобранных трансформантов был проанализирован в реакции преципитации по Ухтерлони на наличие антигенных детерминант А-субъединицы LT-токсина. Наиболее чёткие полосы преципитации были получены с двумя трансформантами из 24 проанализированных. Плазмиды, выделенные из отобранных клонов, были обозначены pLTAA17 и pLTAA23. Для дальнейших исследований мы использовали плазмиду pLTAA17.

Рисунок 4

Схема получения делеции в А-еубъединице

А.

Хх1

QAC АААТТАТАЕ CGI ОСТ jOAC Т| CTACUj| ССС СС А ВАТ G АА АГ А ААА с ct ТС с ооаып СТГ Лср l.ys 1жи Тэг Ас AU Aip Ли Ло Asp сам а L* Ас За G& G& L«u

10 20

at о ссс aga GGG сат ааг GAGTAC ттс GAT ACSAGOA ACT CAAATG аат ахтааг стттат Mrt IM As G1/ Mk Am eil ту A«j> Ag C3y 1k Gh Мл Лсп Dt ta Lra Ту

Bell_

|| GAT C.AC GCPtACACOAACACAAACC GCC ТГТ GTC AGATAT OAT OAC GGA. TAT GTT T С С ACT Аф Hi* Ak A C OVTlr CBnTTi U/IhlU*tT]rAip*jiVT>»lS«Tli 50 <0

GAI _

ПС AGA TC|T V CTGAGATC|

CAC T|CT A«iA | % GAE T|

|GAT C.AC ССС r——•*> |CAT C.AC CCC СТА C|TC ССС ^ TG CGC

CAC Т|.АГ CCC CTC А. [ГС CCC

DA Г AAATTATAC CCT ОСГ GAC ТАГ GCG AGA GGA АСА CAA ACC GGrTTT GTC АГ.АТАТОАГ A«p Lys Im T> /rg AU Ag> Lw Ah >rc Gy Thr Ог TVr Ca-/ и* Vil Ту Aap

GAC GGATAT OTT TCC ACT AV б|Г 1У Vit Si Th"

Конструирование потенциально вакцинного штама, продуцирующего токсоид

Для получения П01СНЦППЛЫ10 вакцинною штамма необходимо было решим,, по крайней мере, ipn основные задачи Получим» ниамм E.coli, способный, во-первых, стабильно продуцировать иммуногенный токсоид, во-вторых, колонизировать кишечник пушных зверей и, в третьих, этот штамм должен бьпь биолотпчеекп безопасным В ходе выполнения первой задачи было решено ввести дегермннашу токсоида в плазмиду pSClOI. По литературным данным плазмида pSCIOl, блаюдаря своим раг-участкам, достаточно стабильно наследуемся в пмаммс-\озяине даже в 01су1ствии селективного давления. Кроме того, в штаммах IZ coli случаи передачи данной плазмиды реципиенту крайне редки н Ol мечены лишь при участии в качестве мобилизующей плазмиды F-модобнот дспрессированиою фактора переноса рЛР42 Причём, по данным Л II 11с\ова с coant ,1()Н4, в процессе мобилизации pSCIOl происходит её физическое 001,единение с конъюгaiпвнои плазмидой и в результат формируются копнтеграты По мнению Curtiss R с соавторами вероятность мобилизации пчазмиды pSCIOl в условиях скрещивания трёх родительских клеток составляет 10 23 на каждую выжившую клетку

Pstl-Pstl фрагмент плазмиды рЬТДА17, содержащий мутантный eh-оперон, был переклонирован в сайт Pstl плазмиды pUCI8. Новая рекомбинанг-ная пчазммча была выделена, очищена и одновременно! идролизована эндонук-леавами реырнкции Ndcl и Xbal, обработана нуклеазон S1 и подвергнута элск-!ро(|)ореп!ческому анализу в процессе которою был определён фрагмент, содержащий ¡'//-оперой Экл фрагмент затем был вырезан и элюирован из 1еля

Вычеченная и очищенная плазмида pSCIOl была обработана ферментом РVUII а з.пем лнгирована с фрлшентм, содержацим мчтаншый е//-оперон Лш ированмон смесью протрансформировали компетентные клетки штамма Г coli Г600 IJbui проведен скрининг трансформатов па начичие детерминашы I l-ioKLoiin и отбран клон, сочерж.миии рекомбшмшную конструкцию на

основе плазмиды pSCIOl и мутантного е//-оперона. Ультразвуковой лизат ночной культуры отобранного трансформанта, в реакции преципитации по Ухтер-лони дал чёткие полосы преципитации с антисыворотками против А-субъединицы и против В-субъединицы LT-токсина. Плазмида, выделенная из оюбранною клона, обозначена рЬ'ГДА124. Таким образом, нами была получена конструкция на основе природной неконьюгативной мультикопийной стабильной плазмиды pSCIOl, детерминирующий термолабильный токсоид, который содержит антигенные детерминанты LT-токсина и не способен оказывать токсическое действие.

Для выполнения следующей задачи, полученный на предыдущем этапе вектор необходимо было ввести в штамм E.coli, способный колонизировать кишечник и персистировать в организме пушных зверей достаточно длительное время В качестве такого штамма решено было выбрать высокоадгезивный бес-плазмидный апатогенный резидентный штамм Е coli №4, ранее выделенный от норки и хранящийся в музее лаборатории генно-инженерных препаратов ГНУ НИИПЗК. Наша рекомбинантная конструкция была введена путём трансформации в штамм №4, чувствительный к тетрациклину. Трансформанты, выросшие на LB-arape с тетрациклином, были отсеяны и проверены на наличие плазмиды рЬТДА124. Один из трансформантов, содержащий pLTAA124, был отобран и обозначен E.coli LTAA.

Последней задачей данного этапа стало введение в штамм E.coli LTAA детерминанты, обеспечивающей биологическую безопасность данной конструкции. Поскольку рекомбинантная плазмида на основе pSCIOl является не-конъюгативной, она не способна самостоятельно передаваться от штамма E.coli ЬТДА другому штамму, однако, существует опасность переноса в штамм Е coli LTAA чужеродной ДНК, несущей участок, комплементарный делеции. введённой нами в eh-оперон. В результате генетической рекомбинации можс! произойти восстановление токсического фенотипа и во ¡никнуть супервирулентный энтеротоксигенный штамм. Для уменьшения такой вероятности нами была нре [принята ионьпка заблокировать возможность проникновения в наш реком-

бпнашный штамм чужеродной ДНК с помощью системы рестрикции и модификации С эти пелыо плазмидой pLG74, которая несёт детерминанту системы рестрикции и модификации I'coRV, были протрансформнрованы компетентные клемки инамма II coli LI АЛ. Среди выросших трансформантов был отобран один, содержащий плазмнды pLTAAI24 и pLG74. Полученный рекомбинант-ный ипамм был натай Е coli RMLTAA. В опытах по коныогативному скрещиванию полученною штамма с природными штаммами Е coli, содержащими кот,Ю1 атнвные плазмнды, нам не удалось получить переноса коныогативных плазмид в наш штамм, н то время как в контрольном эксперименте частота их переноса из природных штаммов Е coli в штамм Е coli LTAA была достаточно высока и составляла 10 '-102 на одну клетку донора.

Л патогенное! ь штамма E.coli RMLTAA была проверена в тесте отека лап у белых мышей В качестве положительною контроля служил лизат штамма, несущею в своём составе плазмиду pLT5 с полноразмерным <?/мэпероном. Штамм Г, coli RMLI'AA во всех случаях показал отрицательный результат.

Клонирование генов eltA и eltB в отдельные векторные плазмнды

Следующей задачей стоящей перед нами было получение плазмиды, которая содержала бы дслсшрованпый ранее участок гена ellA С этой целью было решено клонировать в плазмиду pBR322 Pstl-EcoRI участок е//-оперона, содержащий ich eh I Нла!мидиая ДНК pLT5 была выделена, очищена и одновременно обработан.) ферментами рестикции Pstl и EcoRl. Затем перевар был проанализирован Tiv Iсм электрофореза в агарозном i еле. На электрофоретрамме мы набчюдали 4 полосы, отличающиеся по размеру В качестве маркеров размера фратментов использовали Eco1301 и Mlul рестрикты ДНК факт X. Полоса размером примерно I 6 т Ii и соответствовала участку, содержащему eh I, полоса р.имером примерно 4,^ I и н соответствовала участку, содержащему eltB, ос-

тальные два фрагмента (размер которых составлял примерно 3,4 т.п.н. и 1,0 т.п.н.) соответствовали участкам плазмиды рВЯ322. Полученная нами смесь фрагментов ДНК была переосаждена и залигирована. Лигированной смесью проведена трансформация компетентной культуры штамма Е.соН С600 с последующим высевом на ЬВ-агар с тетрациклином. В результате проведённых манипуляций было получено 60 трансформантов, среди которых найдено 8 колоний, содержащих ген е/1Л, и одна колония, содержащая ген е1/В Из каждой колонии была выделена плазмидная ДНК, очищена, а затем проанализирована путём обработки ферментами рестрикции РбМ и ЕсоШ с последующим электро-форетическим анализом продуктов гидролиза в агарозном геле. Для дальнейшей работы была отобрана плазмида, в состав которой входил доминирующий участок гена е11А. Полученная плазмида названа рЬТА2.

На следующем этапе нашей работы необходимо было переклонировать ген еИЛ в плазмиду рСЯ1. Эта плазмида является дериватом природной плазмиды Со1Е1, стабильно наследуется, прекрасно мобилизуется и обладает устойчивостью к канамицину. Другим важным для нас свойством являлось отсутствие гомологии между плазмидами рСЯ1 и рБСЮ 1. Для успешного выполнения данной задачи ген еЬЛ был вырезан из рЬТА2 по сайтам ЕсоЮ и РбИ, выделен и лигирован с плазмидой риС18, предварительно гидролизованной по тем же сайтам. После трансформации штамма С600 был выделен клон, содержащий рекомбинантную плазмиду с геном е!/А. Из выделенной и очищенной рекомби-нантной плазмиды ген е1/Л был вырезан по сайтам Ме! и ЕсоЯ1, обработан нуклеазой 51, выделен посредством электрофореза с последующей элюцией. Плазмида рСШ также была выделена, очищена и после рестрикции ферментом ЕсоШ и обработки нуклеазой лигирована с предварительно выделенным геном е1/А. После трансформации лигированной смесью компетентной культуры была получена рекомбинантная плазмида рЬТА8.

Схема конструирования pLTA2

nugionn P'rtI ii Et oKI Pill

Оценка возможности восстановления токсического фенотипа экспериментальною штамма К.coli КМ LT Д Л

Основной проблемой при создании генно-инженерных препаратов является обеспечение их биологической безопасности, в данном случае неспособ-иоси, вакцинном) пмамма к восиановлснию юксическою феномша. Поскольку при коисфуированни штамма E.coli RMLIAA в полноразмерный е//-оперон была введена деления, а мутации типа делении к спонтанной реверсии не способны, единственно возможным путём воссшновления токсического фенотипа являе I с я рекомбинация между вакцинным имаммом и штаммом, несущим участок Д| IK, комплементарный делении

В связи с тем, что в природных штаммах ЕТЕС термолабильный токсин детерминируется Ent-плазмидами, которые могут быть как конъюгативные, так и неконыогативные, но способные к мобилизации, основным путём распространения е//-оперона в популяциях бактрерий является конъюгативный перенос. Поскольку два других пути обмена генетической информацией в популяциях энтеробактерий в случае еИ-оперона не возможны. Трансформация в природных популяциях E.coli мало вероятна и требует очень специфических, нехарактерных для среды обитания ЕТЕС, условий. Нет данных и о случаях переноса е//-оперона между бактериями путём трансдукции.

Сконструированный нами потенциально вакцинный штамм содержит гибридную плазмиду рЬТДА124, которая является неконъюгативной и неспособна к мобилизации. Кроме того, E.coli RMLTAA обладает системой рестрикции и модификации EcoRV, препятствующей проникновению чужеродной ДНК. Экспериментальное подтверждение биологической безопасности штамма E.coli RMLTAA было получено in vitro. В опытах по конъюгации ни одного случая переноса генетического материала из вакцинного штамма или в вакцинный штамм не наблюдалось Нами было поставлено конъюгационное скрещивание между штаммом E.coli ЬТДА и штаммом несущим плазмиду pLTA8 с полноразмерным геном токсической субъединицы А. Оба штамма были апато-генны, и токсический фенотип восстановился только в результате генетического обмена Поскольку, единственным критерием отбора трансконъюгантов с восстановившимся токсическим фенотипом, было их патогенетическое действие на организм экспериментальных животных конъюгационной смесью, мы заражали подопытных мышей линии Balb/c. О восстановлении токсичности говорила клиническая картина токсикоинфекции: угнетённое состояние, диарей-ный синдром и гибель подопытных животных. Культура, изолированная из желудочно-кишечного тракта погибших животных, давала положительную реакцию в биотесте с отёком лап мышей Это позволило нам судить о восстановлении токсическою фенотипа у нашего штамма (табл.3).

Таблица 3

Опенка возможное!и поишкновеиня токсическою фенотипа вакцинного

инамма

№ псполыусммс кулыуры Е. соН 1 руНМ1.1 N=10 результаты заболело / погибло

1 МЛ Контрольная группа -/-

2 Ы ДА (Г-111-) Контрольная группа -/-

3 С600 Г' Контрольная группа -/-

4 В148 Контрольная группа -/-

5 13801 Контрольная группа -/-

6 КМ Ь1 ЛЛ(ПмИ) Контрольная группа -/-

7 С600 1г' х ЬТЛ х 1УГДЛ (1-П1-) Опытная группа 8/2

8 С600 Р' х ЬТЛ х ЯМЫ ДА (гШН ) Опытная группа -/-

9 Н148 \ ЬТЛ х ЬТДА(г-т-) Опытная группа 6/4

10 В148 х ЬТЛ \ ЯМ ЬТДЛ (1+И1+) Опытная группа -/-

1 1 В801 х ЬТЛх 1/ГАА (1-И1-) Опытная группа 8/2

12 В801 х ЬТЛ \ НМЬТЛЛ (Г+111+) ()пытная группа -/-

Затем был поставлен опыт по конъюгации с модифицированным вакцинным штаммом E.coli RMLTAA. Возникновения диарейного синдрома у мышей, которым была введена конъюгационная смесь ни в одном из трёх независимых экспериментов не было. Выжившие мыши были забиты, путём смещения шейных позвонков, or них выделена тотальная микрофлора с лизатом которой была поставлена биопроба с реакцией отёка лап мышей. Биопроба полностью подтвердила данные полученные при пероральном заражении.

Таким образом, нами продемонстрирована биологическая безопасность штамма E.coli RMLTAA in vitro. Хотя контрольный штамм E.coli LTAA оказался прекрасным реципиентом и показал возможность приобретения токсического фенотипа (таблицаЗ).

Для изучения протективной активности рекомбининтного препарата подопытным мышам в течение одной недели дважды с трех дневным интервалом пероралыю вводили вакцинный штамм E.coli RMLTAA в дозе lxlO'KOE на голову. Затем провели заражение природным токсигенным штаммом в дозе IxlO9 КОЕ. В качестве контроля использовали интактных мышей, которым также вводили токсигенный штамм в дозе IxlO9 КОЕ (табл. 4)

Таблица 4

Оценка протективной активности рекомбинантного препарата

экспериментальные группы N=10 количество заболевших животных количество погибших животных

Контроль 10 4

Опыт 5 0

Через трое суток у подопытных животных клиническая картина соответствовала здоровым животным.

выводы

I Осуществлено клонирование полноразмерного elt-оперона и Генов кодирующих отдельные субъединицы ellA и ehR термолабилыюго энтероток-сина В coli.

2. Путём введения контрольной делеции в ген ellA, в положении 23-120 субъединицы, получен генно-инженерный токсоид, сохранивший имму-iioiспмыс дсмерминаты термолабилыюго токсина, по утративший его токсические свойства.

3. Получена теистическая конструкция на основе векторной плазмиды pSC'IOI ti делетированного е//-оперона, кодирующая авирулентный им-мунотенный токсоид.

4 IIa основе полученной конструкции и апатогенного штамма эшерихий сконсфуирован потенциальный вакцинный штамм для профилактики юксикоинфекций пушных зверей .

5 В опытах in vivo изучена возможность восстановления токсического фенотипа сконструированного штамма и доказана биологическая безопасность полученной конструкции и штамма в целом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ IIO ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Козловский IO Е , Гришина Л.Е., Тихонова Н.Б. Семейство ДНК-зондов для обнаружения i енов токсинообразования в популящиях энтеробак-крий /Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии Сб науч. Ф / MI АВМВиЬ им. К.И Скрябина, 1997, с.73-77

2 Козловский Ю Г , Серебряков С.Н., Плугина И.В., Барановская О П , Тихонова Н Б Анализ юксигенности штаммов энтеробактернй изоли-рованныч в зверохозяГк тва\ России // Доклады Российской академии ееш.екочо тяие i иенныч и.тук. 2002, №3, с 44-46.

3. Тихонова Н.Б., Козловский Ю.Е., Серебряков С.Н. Подходы к конструированию биологически безопасных антитоксических вакцин / Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии Сб. науч. тр./ НИИ морфологии человека РАМН, 2003, с. 74-76.

4 Тихонова Н.Б., Плугина И.В., Емельяненко П.А., Тинаева Е.А., Балакирев H.A., Серебряков С.Н., Козловский Ю.Е., Матевосян К.Ш., Пьянко-ва А.Н. Препараты с антитоксической активностью на основе резидентной микрофлоры// Международная научно-практическая конференция «Ветеринарная медицина - 2004», Феодосия, Меж. Тематический науч. сборник, 2004, №84, с. 857-860.

5. Козловский Ю.Е., Серебряков С.Н., Плугина И.В , Барановская О.П., Матевосян К.Ш., Тихонова Н.Б., Ефимов Б А. Генетикоо-иммунологические особенности LT-подобных токсинов энтеробакте-рий. /Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии. Сб. науч. тр./ НИИ морфологии человека РАМН, 2002, с. 100-102

I lo дипишти. 16 112004 <1*)рмт GOvWKhiOi.cm 11счап.1ик|||чк1ч Бумага "Paíonxr" Псчл M I >1)х1ж IOOtktï Зак. 142

^§65 ®

РНБ Русский фонд

2006-4 843

Оглавление диссертации Тихонова, Наталия Борисовна :: 2004 :: Моск. обл., п. Родники

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Бактериальные токсины

2.1.1. Классификация

2.1.2. Строение

2.1.3. Распространение среди микроорганизмов

2.2. Генетика токсинообразования у Escherichia coli

2.2.1. Строение генов

2.2.2. Роль горизонтального обмена генетическим материалом в формировании токсического фенотипа

2.3. Борьба с токсикоинфекциями и роль вакцинопрофи-лактики

2.3.1. Современные вакцины

2.3.2. Особенности противотоксических вакцин

3.3.3. Биологическая безопасность вакцин

3. Материалы и методы 39 3.1. Получение препаративных количеств плазмидной

3.1.1. Культивирование штаммов Е. coli

3.1.1.1. Использовавшиеся штаммы Е. coli

3.1.1.2. Использовавшиеся плазмиды

3.1.1.3. Среды для культивирования микроорганизмов

3.1.2. Трансформация штаммов Е. coli плазмидной ДНК.

3.1.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК

3.1.4. Электрофорез в агарозном геле и визуализация плазмидной ДНК

3.2. Клонирование генов

3.2.1. Расщепление плазмидной ДНК рестриктирующими эндонуклеазами

3.2.2. Выделения нужных1 фрагментов плазмидной ДНК из агарозных гелей

3.2.3. Обработка фрагментов ДНК нуклеазой S

3.2.4. Лигирование вектора со вставкой

3.4. Получение делении в гене.

3.5. Отбор штаммов, содержащих конъюгативные плазми

3.6. Введения вектора в бактерии-реципиенты с помощью мобилизации

3.6.1. Постановка триродителского скрещивания на плотной среде

3.7. Реакция двойной иммунодиффузии в агаровом геле по методу Ухтерлони.

3.8. Оценка токсичности штаммов Е. coli

3.9. Оценка протективной активности потенциально вакцинного штамма

4. Результаты

4.1. Клонирование оперона полноразмерного LT в плазмиду pBR

4.2. Клонирование детерминант А-субъединицы LT и В-субъединицы LT в плазмиду pBR

4.3. Введение делеции в А-субъединицу полноразмерного

4.4. Конструирование штамма Е. coli, содержащего детерминанту токсоида LT и систему рестрикции-модификации

4.4.1. Оценка эффективности мобилизации потенциального вектора в триродительском скрещивании

4.4.2. Введение детерминанты токсоида в плазмиду pSClOl

4.4.3. Получение штамма Е. coli, продуцирующего токсоид

4.4.4. Введение детерминанты, обеспечивающей биологическую безопасность потенциально вакцинного штамма

4.4.5. Контроль апатогенности полученной конструкции

4.5. Конструирование штамма Е. coli, содержащего детерминанту А-субъединицы LT.

4.5.1. Клонирование генов eltA и eltB в отдельные векторные плазмиды

4.5.2. Клонирование eltA в плазмиду pCRl

4.6. Оценка возможности восстановления токсической активности термолабильного токсоида при скрещивании штаммов

4.7. Оценка протективной активности рекомбинантного препарата

5. Обсуждение результатов

6. Выводы

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Тихонова, Наталия Борисовна, автореферат

Проблема токсикоинфекций до сих пор остается одной из нерешённых в ветеринарии и медицине. Попытка создания вакцинных препаратов традиционным путём либо вообще не приводила к успеху, либо эффективность их применения была крайне мала, что объясняется физиологическими особенностями желудочно-кишечного тракта, играющего барьерную роль. Болезнь развивается при условии колонизации энте-ротоксигенными Escherichia coh (ЕТЕС) тонкого кишечника и выработки ими энтеротоксинов. Основную защиту против ЕТЕС обеспечивают антитела класса IgA к фимбриальным факторам колонизации, LT-токсину и О-антигенам (Учайкин В.Ф. и др., 2001). В процессе заболевания вырабатывается как антибактериальный, так и антитоксический иммунитет. До недавнего времени считалось, что антитоксический иммунитет в первую очередь направлен против субъединицы В термолабильного токсина, однако, согласно имеющимся литературным данным, А-субъединица холерогена, близкого по структуре к LT-токсину, обладает выраженными суперантигенными свойствами (Васильев Г.И. и др., 2002). Логично было бы предположить, что и А-субъединица LT-токсина является суперантигеном.

Иммунный ответ на текущий инфекционный процесс является многосторонним и связан с выработкой специфических антител на различные новые антигенные раздражители, последовательно вступающие в действие в динамике заболевания, что существенно отличается от вакцинального, формируемого традиционными парентеральными вакцинами, направленного, как правило, на один антигенный раздражитель. В настоящее время наиболее перспективным путём создания современных эффективных препаратов является разработка генно-инженерных живых пероральных субъединичных вакцин на резидентном носителе.

Основной проблемой при создании таких препаратов является обеспечение их биологической безопасности. В данном случае имеется ввиду невозможность восстановления токсического фенотипа вакцинными штаммами и предотвращение появления высокотоксичных полирезистентных штаммов. В этом плане большой теоретический и практический интерес представляет изучение особенностей обмена генетической информацией между вакцинными и природными штаммами, а также создание генетических конструкций, делающих такой обмен невозможным.

2. Обзор литературы

Заключение диссертационного исследования на тему "Роль генетического обмена в формировании энтеротоксигенных вариантов вакцинных штаммов Escherichia coli"

Выводы

1. Осуществлено клонирование полноразмерного elt-оперона и генов кодирующих отдельные субъединицы eltA и eltB термолабильного энтеротоксина Е. coli.

2. Путём введения контролируемой делеции в ген eltA в положении 23-120 субъединицы получен генно-инженерный токсоид, сохранивший иммуногенные детерминанты термолабильного токсина, но утративший его токсические свойства.

3 Получена генетическая конструкция на основе векторной плазмиды pSClOl и делетированного е/?-оперона, кодирующая авиру-лентный иммуногенный токсоид.

4 На основе полученной конструкции и апатогенного штамма эшерихий сконструирован потенциальный вакцинный штамм для профилактики токсикоинфекций пушных зверей.

5. В опытах in vivo изучена возможность восстановления токсического фенотипа сконструированного штамма и доказана биологическая безопасность полученной конструкции и штамма в целом.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2004 года, Тихонова, Наталия Борисовна

1. Вартанян Ю.П., Северцев М.К., Введенская О.И., Станиславский Е.С. Отек лап белых мышей тест для оценки активности эн-теротоксинов Escherichia. Бюл. эксперим. биол. и мед. 1978, 85, №2, С. 150-152.

2. Васильев Г.И., Козловский И.Н., Мишанькин Б.Н., Мишанькин М.Б. Холерный токсин суперантиген Vibrio cholerae. Журн. Микробиол. 2002, №2, С. 50-55.

3. Вельков В.В. Оценка риска при интродукции генетически модифицированных микроорганизмов в окружающую среду. Агрохимия, 2000, N8, с. 76-86.

4. Давыдова Л.И. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, 1998.

5. Далин М.В., Фили Н.Г. «Белковые токсины микробов», «Медицина», 1980г.

6. Езепчук Ю.В. «Биомолекулярные основы патогенности бактерий» М., «Наука», 1977г.

7. Кунь Т.В., Р.А.Янг, Р.В.Дэвис 1988 в кн. Молекулярное клонирование. Методы. Пер. с англ., Москва «Мир»

8. Лихтенштейн К., Дрейпер Дж. Генетическая инженерия растений. В кн. Клонирование ДНК. Методы., под ред. Д. Гловера, М.: «Мир», 1988, С. 330-332.

9. Льюин Б. 1987 Гены Изд. «Мир»

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984 Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. М.

11. Медуницын Н.В. Вакцинология. //М.: «Триада-Х». 1999.

12. Остерман JI.A. Исследование биологических хмакромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983, С. 304.

13. Учайкин В.Ф., Шамшева О.В. Вакцинопрофилактика. Настоящее и будущее. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.

14. Хромова С.С., Ефимов Б.А., Тарабрина Н.П., Шкопоров А.Н., Кафарская Л.И., Сепиашвили Я.Р. Иммунорегуляция в системе микрофлора интестинальный тракт., Аллергология и иммунология, 2004, №2, С. 265-271.

15. Altwegg, М., and Н. К. Geiss. 1989. Aeromonas as a human pathogen. Crit. Rev. Microbiol 16:253-286.

16. Arber, W. 1993. Evolution of prokaryotic genomes. Gene 135:49— 56.

17. Asao, Т., Y. Kinoshita, S. Kozaki, T. Uemura, and G. Sakaguchi. 1984. Purification and some properties of Aeromonas hydrophila hemolysin. Infect. Immun. 46:122-127.

18. Baldwin, T. J., S. Knutton, L. Sellers, H. A. Manjarrez-Hemandez, A. Aitken, and P. H. Williams. 1992. Enteroaggregative Escherichia coli strains secrete a heat-labile toxin antigenically related to E. coli hemolysin. Infect. Immun. 60:2092-2095.

19. Betley, M. J., V. L. Miller, and J. J. Mekalanos. 1986. Genetics of bacterial enterotoxins. Annu. Rev. Microbiol. 40:577-605.

20. Birnboim H.C., Doly J. 1979 A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Acids Res., 1979, v. 7, №6, p. 1513

21. Bishai, W. R., and J. R. Murphy. 1988. Bacteriophage gene products that cause human disease, p. 683-724. In R. Calendar (ed.), The bacteriophages. Plenum, New York, N.Y.

22. Black, R. E. 1990. Epidemiology of travelers' diarrhea and relative importance of various pathogens. Rev. Infect. Dis. 12:73-79.

23. Black, R. E. 1993. Epidemiology of diarrhoeal disease: implications for control by vaccines. Vaccine 11:100-106.

24. Black, R. E. 1993. Persistent diarrhea in children of developing countries. Pediatr. Infect. Dis. J. 12:751-761.

25. Bonventre P.F., Lincoln R.E., Lamanna C. Bacteriol. Revs, 1967, 31, №2, 95

26. Bundock P., Hooykaas P.J., 1996, Integration of Agrobfcterium tu-mefaciens T-DNA in the Saccharomyces cerevisiae genome by illegitimate recombination, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 15272-15275.

27. Busoni-Gatel D., De Ryeke I., Bosseray N. 1984 A footpad lesion test to demonstrate the pathogenicity of E. coli strains. Ann. Microbiol, v. 135 В №3 p.311-321.

28. Casadaban, M. J. 1976. Transposition and fusion of the lac genes to select promoters in Escherichia coli using bacteriophage lambda and Mu. J. Mol. Biol. 104:541-555.

29. Celemin, C., Anguita, J., Naharro, G. & Suarez, S. (1994). Evidence that Escherichia coli isolated from the intestine of healthy pigs hybridize with LT-П, ST-Ib and SLT-П DNA probes. Microb. Pathog. 16, 77

30. Chang, А. С. Y., and S. N. Cohen. 1978. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the PI5A cryptic miniplasmid. J. Bacteriol. 134:1141-1156.

31. Curtiss R., Clark J.E., Goldschmidt R., Hsu J.C., Hull S.C., Inoue M., Maturin L.J., Moody R., Pereira D.A. Biohazard assessment of recombinant SNA molecule research. //Proceedings of the Third International Symposium of Fntibiotic Resistance. 1976.

32. Dallas W.S., Falkow S., 1980, Amino acid sequence homology between cholera toxin and Escherichia coli heat-labile toxin. Nature1.ndon) 288:499-501.

33. Dallas W.S., Gill D.M., Falkow S., 1979, Cistrons encoding Escherichia coli heat-labile toxin. J Bacteriol, 139(3):850-858.

34. Dallas, W. S., and S. Falkow. 1980. Amino acid sequence homology between cholera toxin and Escherichia coli heat-labile toxin. Nature 288:499-501.

35. David E. Bradley, Diane E. Taylor, Doris R. Cohen. 1980. Specification of Surface Mating System Among Conjugative Drug Resistance Plasmids in Escherichia coli K-12. J.Bacteriol. 143:1466-1407 (No. 3).

36. Dickinson, B. L., and J. D. Clements. 1995. Dissociation of Escherichia coli heat-labile enterotoxin adjuvanticity from ADP-ribosyltransferase activity. Infect. Immun. 63:1617-1623.

37. Domenighini, M., C. Montecucco, W. C. Ripka, and R. Rappuoli. 1991. "Computer modelling of the NAD binding site of ADPribosylating toxins: active-site structure and mechanism of NAD binding." Mol. Microbiol. 5:23-31.

38. Donnenberg, M. S., and J. B. Kaper. 1991. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59:4310-4317.

39. Donnenberg, M. S., C. 0. Tacket, S. P. James, G. Losonsky, J. P. Nataro, S. S. Wasserman, J. B. Kaper, and M. M. Levine. 1993. Role of the eaeA gene in experimental enteropathogenic Escherichia coli infection. J. Clin. Invest. 92:1412-1417.

40. Dreyfus, L. A., J. C. Frantz, and D. C. Robertson. 1983. Chemical properties of heat-stable enterotoxins produced by enterotoxigenic Escherichia coli of different host origins. Infect. Immun. 42:539-548

41. Dziejman, M., and J. J. Mekalanos. 1994. Analysis of membrane protein interaction: ToxR can dimerize the amino terminus of phage lambda repressor. Mol. Microbiol. 13:485-494.

42. Echeverria, P., L. Verneart, С. V. Ulyangco, S. Komalarini, and M. T. Ho. 1978. Antimicrobial resistance and enterotoxin production among isolates of Escherichia coli in the Far East. Lancet 8090:589592.

43. Fasano, A., B. A. Kay, R. G. Russell, D. R. Maneval, and M. M. Levine. 1990. Enterotoxin and cytotoxin production by enteroinvasive Escherichia coli. Infect. Immun. 58:3717-3723.

44. Finlay В. B.,. Falkow S "Common Themes in Microbial Pathogenicity Revisited", Microbiology and Molecular Biology Reviews, June 1997, p. 136-169

45. Fishmann, P. H. 1990. Mechanism of action of cholera toxin, p. 127-137. In J. Moss and M. Vaughan (ed.), ADP-ribosylating toxins and G proteins. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

46. Focco van den Akker, Steve Sarfaty, Edda M Twiddy, Terry D Con-nell, Randall К Holmes and Wim GJ Hoi., 1996, Crystal structure of anew heat-labile enterotoxin, LT-IIb, Structure 15 June 1996, 4:665*678.

47. Fukuta, S., Magnani, J.L., Twiddy, E.M., Holmes, R.K. & Ginsburg, V. (1988). Comparison of the carbohydrate-binding specificities of cholera toxin and Escherichia coli heat-labile enterotoxins LTh-I, LT-Ila, and LT-IIb. Infect. Immun. 56, 1748-1753.

48. Gaastra, W., and A. M. Svennerholm. 1996. Colonization factors of human enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Trends Microbiol. 4:444-452.

49. Gaastra, W., and A. M. Svennerholm. 1996. Colonization factors of human enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Trends Microbiol. 4:444-452.

50. Gorbach, S. L., J. G. Banwell, B. D. Chatterjee, B. Jacobs, and R. B. Sack. 1971. Acute undifferentiated human diarrhea in the tropics. J. Clin. Invest. 50:881-889.

51. Guerrant, R. L., C. A. Wanke, R. A. Pennie, L. J. Barrett, A. A. M. Lima and A. D. O'Brien. 1987. Production of a unique cytotoxin by Campylobacter jejuni. Infect. Immun. 55:2526-2530

52. Guth, B.E.C., et al., & Trabulsi, L.R. (1986). Production of type II heatlabile enterotoxin by Escherichia coli isolated from food and human faeces. Infect. Immun. 59, 587-589.

53. Gyles, C. L. and Barnum, D. A. (1969). A heat-labile enterotoxin from strains of Escherichia coli enteropathogenic for pigs. J. Infect. Dis. 120, 419-426.

54. Hacker J., Blum-Oehler G., Muhldorfer I., Tschape H., 1997, Pathogenicity islands of virulent bacteria: Structure, function and impact on microbial evolution, Mol. Microbiol., 23, 1089-1097.

55. Hacker, J., G. Blum-Oehler, I. Mu'hldorfer, and H. Tscha"pe. 1997. Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution. Mol. Microbiol. 23:1089-1097.

56. Halpern JL, Neale EA. 1995 Neurospecific binding, internalization and retrograde axonal transport. Curr Top Microbiol Immunol; 195:22141.

57. Holmgren J, Lycke N, Czerkinsky C. Cholera toxin and cholera В subunit as oral-mucosal adjuvant and antigen vector systems. // Vaccine. 1993 11, 1179-84.

58. Houston, C. W., A. K. Chopra, J. M. Rose, and A. Kurosky. 1991. Review of Aeromonas enterotoxins. Experientia 47:424-426.

59. Huisman, Т. Т., D. Baker, P. Klaasen, and F. K. de Graf. 1994. Leu-cineresponsive regulatory protein, IS 1 insertions, and the negative regulator FeaA control the expression of the fae (K88) operon in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 11:525-536.

60. Igimi S., Park S.H., Sasaki Т., Kumagai S., 1996, Transfer of conju-gative plasmid pAMpi from Lactococcus lactis to mouse intestinal bacteria, Lett. Appl. Microbiol., 23, 31-35.

61. Janda, J. M. 1991. Recent advances in the sUidy of the taxonomy, pathogenicity and infectious syndromes associated with the genus Aeromonas Clin. Microbiol. Rev. 4:397-410.

62. Jertborn, M., C. Ahren, J. Holmgren, and A. M. Svennerholm. 1998. Safety and immunogenicity of an oral inactivated enterotoxigenic Escherichia coli vaccine. Vaccine 16:255-260.

63. Jobling M.G., Holmes R.K. Biological and biochemical characreti-zation of variant A subunits of cholera toxin constructed by site directed mutagenesis. И J. Bacteriol. 2001. 183, 4024-4032.

64. Jobling M.G., Holmes R:K. Mutational Analysis of Ganglioside GM1-Binding Ability, Pentamer Formation, and Epitopes of Cholera Toxin В (CTB) Subunits and CTB/Heat-Labile Enterotoxin В Subunit Chimeras. I I Infection and Immunity. 2002. 70, 1260-1271.

65. Johnson, W. M., and H. Lior. 1988. A new heat-labile cytolethal distending toxin (CLDT) produced by Campylobacter spp. Microb. Pathog. 4:115-126

66. Kaper, J. В., A. Fasano, and M. Trucksis. 1994. Toxins of Vibrio cholerae, p. 145-176. In I. K. Wachsmuth, P. A. Blake, and 0. Olsvik (ed.), Vibrio cholerac and cholera. American Society for Microbiology, Washington,

67. Kato M., Imamura S., Kawase H., Miyama A., Tsuji T. Histidine-44 of the A subunit of Escherichia coli enterotoxin is involved in its enzymatic and biological activities. J/Microbiol. Letters. 1997. 152, 219225.

68. Kessler KR, Benecke R. 1997 Botulinum toxin: from poison to remedy. Neurotoxicology;18:761-770.

69. Keusch G.T. and S.T. Donta "Classification of enterotoxins on the basis of activity in cell culture.", J.Infect.Dis. 1975r. 131: 58-63

70. Klipstein, F. A., and R. F. Engert. 1984. Properties of crude Campylobacter jejuni heat-labile enterotoxin. Infect. Immun. 45:314-319.

71. Lawrence J.G., 1997, Selfish operons and speciation by gene transfer, Trends Microbiol, 5, 355-259.

72. Lee, C. A. 1996. Pathogenicity islands and the evolution of bacterial pathogens.Infect. Agents Dis. 5:1-7.

73. Leong, J., A. C. Vinal, and W. S. Dallas. 1985. Nucleotide sequence comparison between heat-labile toxin B-subunits from Escherichia coli of human and porcine origin. Infect. Immun. 48:73-77.

74. Mahillon, J., and M. Chandler. 1998. Insertions sequences. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:725-774. Maniatis, Т., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

75. Matsutani, S., H. Ohtsubo, Y. Meada, and E. Ohtsubo. 1987. Isolation and characterization of IS elements repeated in the bacterial chromosome. J. Mol. Biol. 196:445-455.

76. McClane, B. A. 1994. Clostridium perfringens enterotoxin acts by producing small molecule permeability alterations in plasma membranes. Toxicology 87:43-67.

77. McClane, B. A., and A. P. Wnek. 1990. Studies of Clostridium perfringens enterotoxin action at different temperatures demonstrate a correlation between complex formation and cytotoxicity. Infect. Immun. 58:3109-3115.

78. McConnell, M. M„ H. Chart, A. M. Field, M. Hibberd, and B. Rowe. 1989. Characterization of a putative colonization factor (PCF0166) of enterotoxigenic Escherichia coli of serogroup 0166. J. Gen. Microbiol. 135:1135-1144.

79. McConnell, M. M., H. Chart, and B. Rowe. 1989. Antigenic homology within human enterotoxigenic Escherichia coli fimbrial colonization factor antigens: CFA/I, coli-surface-associated antigens (CS)1, CS2, CS4 and CS17. FEMS Microbiol. Lett. 61:105-108.

80. McConnell, M. M., L. V. Thomas, N. P. Day, and B. Rowe. 1985. Enzymelinked immunosorbent assays for the detection of adhesion factor antigens of enterotoxigenic Escherichia coli. J. Infect. Dis. 152:1120-1127.

81. McConnell, M. M., M. Hibberd, A. M. Field, H. Chart, and B. Rowe. 1990. Characterization of a new putative colonization factor (CS 17) from a human enterotoxigenic Escherichia coli of serotype

82. Oil4:H21 which produces only heat-labile enterotoxin. J. Infect. Dis. 161:343-347.

83. McCormick, B. A., S. P. Colgan, C. Delp-Archer, S. I. Miller, and J. L. Madara. 1993. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123:895-907.

84. McDaniel, Т. K., and J. B. Kaper. 1997. A cloned pathogenicity island from enteropathogenic Escherichia coli confers the attaching and effacing phenotype on E. coli K-12. Mol. Microbiol. 23:399-407.

85. McGee, D. W., С. O. Elson, and J. R. McGhee. 1993. Enhancing effect of cholera toxin on interleukin-6 intestinal epithelial cells: mode of action and augmenting effect of inflammatory cytokines. Infect. Im-mun. 61:4637-4644.

86. McKee, M. L., A. R. Melton-Celsa, R. A. Moxley, D. H. Francis, and A. D. O'Brien. 1995. Enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 requires intimin to colonize the gnotobiotic pig intestine and to adhere to HEp-2 cells. Infect. Immun. 63:3739-3744.

87. McKee, M. L., and A. D. O'Brien. 1995. Investigation of entero-hemoiThagic Escherichia coli 0157:H7 adherence characteristics and invasion potential reveals a new attachment pattern shared by intestinal E. coli. Infect. Immun. 63:2070-2074.

88. McKee, M. L., and A. D. O'Brien. 1996. Truncated enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) 0157:H7 intimin (EaeA) fusion proteins promote adherence of EHEC strains to HEp-2 cells. Infect. Immun. 64:2225-2233.

89. Me'nard, R., M. C. Pre'vost, P. Gounon, P. Sansonetti, and C. De-hio. 1996The secreted Ipa complex of Shigella flexneri promotes entry into mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1254-1258.

90. Mead, P. S., L. Finelli, M. A. Lambert-Fair, D. Champ, J. Townes, L. Hutwager, T. Barrett, K. Spitalny, and E. Mintz. 1997. Risk factors for sporadic infection with Escherichia coli 0157:H7. Arch. Intern. Med. 157:204-208.

91. Mecsas, J., and E. J. Strauss. 1996. Molecular mechanisms of bacterial virulence: type III secretion and pathogenicity islands. Emerg. Infect. Dis. 2:271-288.

92. Mekalanos, J. J., D. J. Swartz, G. D. Pearson, N. Harford, F. Groyne, and M. de Wilde. 1983. Cholera toxin genes: nucleotide sequence, deletion analysis and vaccine development. Nature 306:551-557.

93. Menard, R., and P. J. Sansonetti. 1994. ShigellaJlexneri: isolation of noninvasive mutants of gram-negative pathogens. Methods Enzymol. 236:493-509.

94. Menard, R., P. J. Sansonetti, and C. Parsot. 1993. Nonpolar mutagenesis of the ipa genes defines IpaB, IpaC, and IpaD as effectorsof Shigella jlexneri entry into epithelial cells. J. Bacteriol. 175:58995906.

95. Mendiola, V., I. Bernales, and F. de la Cruz. 1994. Differential roles of the transposon termini in IS91 transposition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1922-1926.

96. Mendiola, V., Y. Jubete, and F. de la Cruz. 1992. DNA sequence of IS9/ and identification of the transposase gene. J. Bacteriol. 174:13451351.

97. Meng, J., and M. P. Doyle. Microbiology of Shiga toxin-producing Echenchia coli in foods. In J. В. Kaper and A. D. O'Brien (ed.), Escherichia coli 0157:H7 and other Shiga toxin-producing Escherichia coli, in press. ASM Press, Washington, D.C.

98. Meng, J., S. Zhao, T. Zhao, and M. P. Doyle. 1995. Molecular char-acterisaion of Escherichia coli 0157:H7 isolates by pulsed-field gel electrophoresis and plasmid DNA analysis. J. Med. Microbiol. 42:258263.

99. Mezoff, A. G., R. A. Giannella, M. N. Eade, and M. B. Cohen. 1992. Escherichia coli enterotoxin (STa) binds to receptors, stimulates guanyl cyclase, and impairs absorption in rat colon. Gastroenterology 102:816-822.

100. Mietens, С., H. Keinhorst, H. Hilpert, H. Gerber, H. Amster, and J. J. Pahud. 1979. Treatment of infantile E. coli gastroenteritis with specific bovine anti-Я. coli milk immunoglobulin. Eur. J. Pediatr. 132:239-252.1. A.

101. Miliotis, M. D., H. J. Koornhof, and J. I. Phillips. 1989. Invasive potential of noncytotoxic enteropathogenic Escherichia coli in an in vitro Henle 407 cell model. Infect. Immun. 57:1928-1935.

102. Miller, J. H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

103. Miller, J. R., L. Barrett, K. Kotloff, and R. L. Guerrant. 1994. A rapid diagnostic test for infectious and inflammatory enteritis. Arch. Intern. Med. 154:2660-2664.

104. Mills, M., and S. M. Payne. 1995. Genetics and regulation of heme iron transport in Shigella dysenteriae and detection of an analogous system in Escherichia coli 0157:H7. J. Bacteriol. 177:3004-3009.

105. Moake, J. L. 1994. Haemolytic-uraemic syndrome: basic science. Lancet 343:393-397.

106. Moncrief, J. S., R. Obiso, L. A. Barroso, J. J. Kling, R. L. Wright, R. L. Van Tassell, D. M. Lyerly, and T. D. Wilkins. 1995. The enterotoxin of Bacteroides fragilis is a metalloprotease. Infect. Immun. 63:175181.

107. Moon, H. W., S. C. Whipp, R. A. Argenzio, M. M. Levine, and R. A. Giannella. 1983. Attaching and effacing activities of rabbit and human enteropathogenic Escherichia coli in pig and rabbit intestines. Infect. Immun. 41:1340-1351.

108. Moore, M. A., M. J. Blaser, G. I. Perez-Perez, and A. D. O'Brien. 1988. Production of a Shiga-like cytotoxin by Campylobacter. Microb. Pathog.

109. Moyer, M. P., P. S. Dixon, S. W. Rothman, and J. E. Brown. 1987. Cytotoxicity of Shiga toxin for primary cultures of human colonic and ileal epithelial cells. Infect. Immun. 55:1533-1535.

110. Muller, U., M. Brandsch, P. D. Prasad, Y. J. Fei, V. Ganapathy, and F. H. Leibach. 1996. Inhibition of the Hl/peptide cotransporter in the human intestinal cell line Caco-2 by cyclic AMP. Biochem. Biophys. Res. Commun. 218:461-465.

111. Mulligan, M. E., D. K. Hawley, R. Entriken, and W. R. McClure.1984. E. coli promoter sequences predict in vitro RNA-polymerase selectivity. Nucleic Acids Res. 12:789-800.

112. Mullis, К. В., and F. Faloona. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase chain reaction. Methods Enzymol. 155:335-340.

113. Muniesa M., Jofre J., 1998, Abundance in sewage of bacoteriphages that infect Escherichia coli 0157:H7 and that carry the Shiga toxin 2 gene, Appl. Environ. Microbiol., 64, 2443-2448.24

114. Murphy, G. L., and W. Dallas. 1991. Analysis of two genes encoding heatlabile toxins and located on a single plasmid from Escherichia coh. Gene 103:37-43.

115. Murray, В. E., J. J. Mathewson, H. L. DuPont, and W. E. Hill. 1987. Utility of oligodeoxyribonucleotide probes for detecting enterotoxigenic Escherichia coh. J. Infect. Dis. 155:809-811.

116. Myers, L. L., D. S. Shoop, B. D. Firehammer, and M. M. Border.1985. Association of enterotoxigenic Bacteroides fragilis with diarrheal disease in calves. J. Infect. Dis. 152:1344-1347.

117. Nalin, D. R., J. C. McLaughlin, M. Rahaman, M. Yunus, and G. Curlin. 1975. Enteropathogenic Escherichia coli and idiopathic diarrhoea in Bangladesh. Lancet ii:l 116-1119.

118. Nataro J.P., Kaper J.B., Diarrheagenic Escherichia coli, Clin. Microbiol. Rev., 1998, v. 11, Jan., p. 142-201

119. Nataro, J. P., D. Yikang, D. Yingkang, and K. Walker. 1994. AggR,a transcriptional activator of aggregative adherence fimbria I expressioniin enteroaggregative Escherichia coli. J. Bacteriol. 176:4691-4699.

120. Nataro, J. P., D. Yikang, J. A. Giron, S. J. Savarino, M. H. Kothary, and R. Hall. 1993. Aggregative adherence fimbria I expression in enteroaggregative Escherichia coli requires two unlinked plasmid regions. Infect. Immun. 61:1126-1131.

121. Nataro, J. P., D. Yikang, S. Cookson, A. Cravioto, S. J. Savarino, L. D. Guers, M. M. Levine, and С. O. Tacket. 1995. Heterogeneity of enteroaggregative Escherichia coli virulence demonstrated in volunteers. J. Infect. Dis. 171:465-468.

122. Nataro, J. P., I. C. Scaletsky, J. B. Kaper, M. M. Levine, and L. R. Trabulsi. 1985. Plasmid-mediated factors conferring diffuse and localized adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 48:378-383.

123. Nataro, J. P., J. B. Kaper, R. Robins Browne, V. Prado, P. Vial, and M. M. Levine. 1987. Patterns of adherence of diarrheagenic Escherichia coli to HEp-2 cells. Pediatr. Infect. Dis. J. 6:829-831.

124. Nataro, J. P., К. O. Maher, P. Mackie, and J. B. Kaper. 1987. Characterization of plasmids encoding the adherence factor of enteropatho-genic Escherichia coli. Infect. Immun. 55:2370-2377.

125. Nataro, J. P., M. M. Baldini, J. B. Kaper, R. E. Black, N. Bravo, and M. M. Levine. 1985. Detection of an adherence factor of enteropatho-genic Escherichia coli with a DNA probe. J. Infect. Dis. 152:560-565.

126. Nataro, J. P., S. Hicks, A. D. Phillips, P. A. Vial, and C. L. Sears. 1996. T84 cells in culture as a model for enteroaggregative Escherichia coli pathogenesis. Infect. Immun. 64:4761-4768.

127. Navarro-Garcia, F., C. Eslava, J. P. Nataro, and A. Cravioto. 1997. Unpublished data. 474. Neill, M. A. 1994. Pathogenesis of Escherichia coli 0157:H7 infection. Curr. Opin. Infect. Dis. 7:295-303.

128. Society for Microbiology 1995. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

129. Newland, J. W., and R. J. Neill. 1988. DNA probes for Shiga-like toxins I and II and for toxin-converting bacteriophages. J. Clin. Microbiol. 26:1292-1297.

130. Nijsten R., London N., van den Bogaard A., Stobberingh E., 1995, In vivo transfer of resistance plasmids in rat, human or pig-derived intestinal flora using a rat model, J. Antimicrob. Chemother., 36, 975985.

131. Nishikawa, Y., S. M. Scotland, H. R. Smith, G. A. Willshaw, and B. Rowe. 1995. Catabolite repression of the adhesion of Vero cytotoxin-producing Escherichia coli of serogroups 0157 and Olll. Microb. Pathog. 18:223-229.

132. Normore W.M. (1976) in Handbook of Biochemistry and Molecular Biology (Fasman G.D., ed) 3rd Ed, pp. 65-235, The Chemical Rubber Co, Cleveland, OH.

133. Nzegwu, H. C., and R. J. Levin. 1994. Neurally maintained hypersecretion in undernourished rat intestine activated by E. coli STa en-terotoxin and cyclic nucleotides in vitro. J. Physiol. (London) 479:159169.

134. O'Brien, A. D., and R. K. Holmes. 1987. Shiga and Shiga-like toxins. Microbiol. Rev. 51:206-220.

135. O'Brien, A. D., J. W. Newland, S. F. Miller, R. K. Holmes, H. W. Smith, and S. B. Formal. 1984, Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea. Science 226: 694-696.

136. O'Meara, D., E. O'Shaughnessy, B. Cryan, and S. Fanning. 1995.

137. Colorimetric detection of toxin-encoding gene of enterotoxigenic Escherichia coli by PCR. J. Clin. Microbiol. 33:1957-1960.

138. Ohishi, I. 1983. Response of mouse intestinal loop to botulinum C2 toxin: enterotoxic activity induced by cooperation of nonlinked protein components.Infect. Immun. 40:691-695

139. Peterson J.W. and S.C. Wliipp 1995. "Comparison of the mechanisms of action of cholera toxin and the heat-stable enterotoxins of Escherichia cole.", Infect.Immun. 63:1452-1461

140. Peterson J.W., and S.C. Wliipp 1989. "Role of prostaglandins and cAMP in the secretory effects of cholera toxin.", Science 245: 857-859.

141. Peterson J.W., Y. Lu, S. Duncan, y. Cantee and A.K. Chopra. 1994. "Interactions of intestinal mediators in the mode of action of cholera toxin.", J.Med.Microbiol., 41:3-9

142. Pickett, C.L., Twiddy, E.M., Coker, C. & Holmes, R.K. (1989). Cloning, nucleotide sequence, and hybridization studies of the type lib heatlabile enterotoxin gene of Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 49454952.

143. Pickett, C.L., Weinstein, D.L. & Holmes, R.K. (1987). Genetics of type Па heat-labile enterotoxin of Escherichia coli: operon fusions, nucleotide sequence, and hybridization studies. J. Bacteriol. 169, 51805187.

144. Ronecker, H. J., and В. Rak. 1987. Genetic organization of insertion element IS2 based on a revised nucleotide sequence. Gene 59:291-296.

145. Rose, R. E. 1988. The nucleotide sequence of pACYC177. Nucleic Acids

146. Roux E., Yersin A. 1888. "Contribution a l'etude de la diphtheria.", Annales de l'lnstitut Pasteur, 2:629-661

147. Rowe, В.,Taylor, J. and Bettelheim, K. A. (1970). An investigation of travellers'diarrhoea. Lancet 1, 1-5.

148. Ruschkowski, S., I. Rosenshine, and В. B. Finlay. 1992. Salmonella typhimurium induces an inositol phosphate flux in infected epithelial cells. FEMS Microbiol. Lett. 95:121-126.

149. Salyers A.A., Shoemaker N.B., 1996, Resistance gene transfer in anaerobes: New insights,new problems., Clin. Infect. Lis., 23, S36-S43.

150. Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:54635467.

151. Savelkoul, P. H., G. A. Willshaw, M. M. McConnell, H. R. Smith, A. M. Hamers, B. A. van der Zeijst, and W. Gaastra. 1990. Expression of CFA/I fimbriae is positively regulated. Microb. Pathog. 8:91-99.

152. Schiavo G, Montecucco C. 1997. The structure and mode of action of botulinum and tetanus toxins. In: Rood JI, McClane BA, Songer JG,

153. Titball RW, editors. The Clostridia: molecular biology and pathogenesis. San Diego: Academic Press; p. 295-322.

154. Schlessinger D., Dchaechter M. "Bacterial toxins" In: Schaecheter M., Medoff G., Eisenstein B.I. editors. "Mechanisms of microbial disease." 2nd ed. Baltimore: Williams and Wilkins; 1993, p.162-175.

155. Schlor S., Riedl S., Blap J., Reidl J., 2000, Genetic Rearrangenents of the Regions Adjacent to Genes Encoding Heat-Labile Enterotoxins (eltAB) of Enterotoxigenic Escherichia coli Strains, Appl. Env. Micro-bil., 66: 352-358.

156. Scotland, S. M., G. A. Willshaw, H. R. Smith, and B. Rowe. 1987. Properties of strains of Escherichia coli belonging to serogroup 0157 with special reference to production of Vero cytotoxins VT1 and VT2. Epidemiol. Infect. 99:613-624.

157. Scott K.P., Flint H.J., 1995, Transfer of plasmids between strains of Escherichia coli under rumen conditions, J. Appl. Bfcteriol., 78, 189193.

158. Sears, C. L., Kaper J. B. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion. I/Microbiol Rev. 1996. 60, 167— 215.

159. Seriwatana, J., P. Echeverria, D. N. Taylor, L. Rasrinaul, J. E. Brown, J. S. M. Peiris, and C. L. Clayton. 1988. Type II heat-labile en-terotoxinproducing Escherichia coli isolated from animals and humans. Infect. Immun. 56:1158-1161.

160. Singh BR, Li B, Read D. 1995 Botulinum versus tetanus neurotoxins: why is botulinum neurotoxin but not tetanus neurotoxin a food poison? Toxicon;33:1541 -1547

161. Sixma, Т. К., К. H. Kalk, B. A. van Zanten, Z. Dauter, J. Kingma, B. Witholt, and W. G. Hoi. 1993. Refined structure of Escherichia coli heatlabile enterotoxin, a close relative of cholera toxin. J. Mol. Biol. 230:890-918.

162. Sixma, Т. К., Kalk, К. Н., Van Zanten, В. А. М., Dauter, Z., Kingma, J., Witholt, В., Hoi, W. G.: Refined structure of Escherichia coli heat-labile enterotoxin, a close relative of cholera toxin. J. Mol. Biol. 230, 890-918(1993).

163. Smith H. R. 1984. Genetics of enterotoxin production in Escherichia coli. Biochem. Soc. Trans. 12:187-189.

164. Smith, W. H., and S. Halls. 1968. The transmissible nature of the genetic factor in Escherichia coli that controls enterotoxin production. J. Gen. Microbiol. 52:319-334.

165. So, M., and B. J. McCarthy. 1980. Nucleotide sequence of the bacterial transposon TNI 681 encoding a heat-stable (ST) toxin and its identification in enterotoxigenic Escherichia coli strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4011-4015.

166. Sobel, D. O., Yankelevich, В., Goyal, D., Nelson, D., Mazumder, A.: The B-subunit of cholera toxin induces immunoregulatory cells and prevents diabetes in the NOD mouse. Diabetes 47, 186-191 (1998).

167. Solinas, F., A. M. Maraconi, M. Ruzzi, and E. Zemaro. 1995. Characterization and sequence of a novel insertion sequence, IS 1162, from Pseudomonasfluoresceins. Gene 155:77-82.

168. Southern, E. M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 51:503-517.

169. Spangler B.D. Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin. I/Microbiol. Rev. 1992. 56, 622-647.

170. Spangler, B.D. (1992). Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Microbiol. Rev. 56, 622-647.

171. Sun, J.-B., Holmgren, J., Czerkinsky, C.: Cholera toxin В subunit: An efficient transmucosal carrier-delivery system for the induction of peripheral immunological tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. 10795-10799(1994).

172. Sun, J.-B., Rask, C., Holmgren, J., Czerkinsky, C.: Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis by feeding myelin basic protein conjugated to cholera toxin Bsubunit. Proc. Natl. Acad. Sci. 71967201 (1996).

173. Svennerholm, A. M., J. Holmgren, and D. A. Sack. 1989. Development of oral vaccines against enterotoxinogenic Escherichia coli diarrhoea. Vaccine 7:196-198.

174. Syvanen M., 1994, Horizontal gene transfer: Evidence and possible consequences, Annu. Rev. Genet., 28, 237-261.

175. Thompson, M. R., and R. A. Giannella. 1985. Revised amino acid sequence for a heat-stable enterotoxin produced by an Escherichia call strain (18D) that is pathogenic for humans. Infect. Immun. 47:834-836.

176. Trachmann, J. D., and W. K. Maas. 1998. Temperature regulation of the heat-labile enterotoxin (LT) synthesis in Escherichia colt is mediated by an interaction of H-NS protein with the LT A-subunit. J. Bacte-riol. 180:3715-3718.

177. Tsuji Т., Inoue Т., Miyama A., Okamoto 1С., Honda Т., Miwatami T. A single amino acid substitution in the A subunit of Escherichia coli enterotoxin results in a loss of its toxic activity. //J. Biol Chem. 1990. 265, 22520-22525.

178. Turnbull, P. С. B. 1981. Bacillus cereus toxins. Pharmacol. Ther. 13:453-505.

179. Turnbull, P. С. В., .Т. M. Kramer, К. Jorgensen, R. J. Gilbert, and J. Melling. 1979. Properties and production characteristics of vomiting,i diarrheal, and necrotizing toxins of Bacillus cereus. Am. J. Clin. Nutr.32:219-228.

180. Tzipori, S., I. K. Wachsmuth, C. Chapman, R. Birner, J. Britting-ham, C. Jackson, and J. Hogg. 1986. The pathogenesis of hemorrhagic colitis caused by Escherichia cmi 0157*.Н7-т gnotooiotfc piglets. J. Infect. Dis. 154:712-716.

181. Vellcov V. V., How environmental factors regulate mutagenesis and gene transfer in microorganisms. Journal of Biosciences, 1999, v.24, N 4, p.529-559.

182. Vinal, A. C., and W. S. Dallas. 1987. Partition of heat-labile enterotoxin genes between human and animal Escherichia coli isolates. Infect. Immun. 55:1329-1331.

183. Waldor M., 1998, Bacteriophage biology and bacterial virulence, Trends Microbiol., 6:295-296.

184. Waldor, К. W., and J. J. Mekalanos. 1996. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science 272:1910-1914.

185. Walker, R. Г., M. B. Caldwell, E. C. Lee, P. Guerry, T. Trust, and G. M. Ruiz-Palacios. 1986. Pathophysiology of Campylobacter enteritis. Microbiol. Rev. 50:81-94.

186. Willshaw, G. A., S. M. Scotland, H. R. Smith, and B. Rowe. 1992. Properties of vero cytotoxin-producing Escherichia coli of human origin of О serogroups other than 0157. J. Infect. Dis. 166:797-802.

187. Winsor, D. K., Jr., S. Ashkenazi, R. Chiovetti, and T. G. Cleary. 1992. Adherence of enterohemorrhagic Escherichia coli strains to a human colonic epithelial cell line (T84). Infect. Immun. 60:1613-1617.

188. Witham, P. К., С. T. Yamashiro, K. J. Livak, and C. A. Batt. 1996. A PCR-based assay for the detection of Escherichia coli Shiga-like toxin genes in ground beef. Appl. Environ. Microbiol. 62:1347-1353.

189. Wolf, M. К. 1997. Occurrence, distribution, and association of О and H serogroups, colonization factor antigens, and toxins of enterotoxigenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 10:569-584.

190. Wood, L. V., L. E. Ferguson, P. Hogan, D. Thurman, D. Morgan, H.

191. L. DuPont, and C. D. Ericsson. 1983. Incidence of bacterial enteropathogens in foods from Mexico. Appl. Environ. Microbiol. 46:328-332.

192. Wood, P. K., J. G. Morris, P. L. Small, O. Sethabutr, M. R. Toledo, L. Trabulsi, and J. B. Kaper. 1986. Comparison of DNA probes and the Sereny test for identification of invasive Shigella and Escherichia coli strains. J. Clin. Microbiol. 24:498-500.

193. Wren, B. W. 1992. Molecular characterisation of Clostridium difficile toxins A and B. Rev. Med. Microbiol. 3:21-27

194. Wright, D. J., P. A. Chapman, and C. A. Siddons. 1994. Immu-nomagnetic separation as a sensitive method for isolating Escherichia coli 0157 from food samples. Epidemiol. Infect. 113:31-39.

195. Wu, S.-X., and R.-Q. Peng. 1992. Studies on an outbreak of neonatal diarrhea caused by EPEC 0127:H6 with plasmid analysis restriction analysis and outer membrane protein determination. Acta Paediatr. Scand. 81:217-221.

196. Yamamoto, Т., and H. Yokota. 1983. Sequence of heat-labile enterotoxin of Escherichia coli pathogenic for humans. J. Bacteriol. 155:728733.

197. Yamamoto, Т., and P. Echeverria. 1996. Detection of the enteroag-gregative Escherichia coh heat-stable enterotoxin 1 gene sequences in enterotoxigenic E. coli strains pathogenic for humans. Infect. Immun. 64:1441-1445.

198. Yamamoto, Т., P. Echeverria, and T. Yokota. 1992. Drug resistance and adherence to human intestines of enteroaggregative Escherichia coh. J. Infect. Dis. 165.744-749.

199. Yamamoto, Т., Т. Gojobori, and T. Yokota. 1987. Evolutionary origin of pathogenic determinants in enterotoxigenic Escherichia coli and Vibrio cholerae 01. J. Bacteriol. 169:1352-1357.

200. Yamamoto, Т., Tamura, Т., Ryoji, M., Kaji, A., Yokota, Т., and Ta-kano, T. (1982) J. Bacteriol. 162, 506-509

201. Yamanaka, H., M. Kameyama, T. Baba, Y. Fujii, and K. Okamoto. 1994. Maturation pathway of Escherichia coli heat-stable enterotoxin I. Requirement of DsbA for disulfide bond formation. J. Bacteriol. 176:2906-2913.

202. Yolken, R. H., H. B. Greenberg, M. H. Merson, R. B. Sack, and A. Z. Kapikian. 1977. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Escherichia coli heat-labile enterotoxin. J. Clin. Microbiol. 5:439444.

203. Yu, H., and J. G. Bruno. 1996. Immunomagnetic-electrochemiluminescent detection of Escherichia coli 0157 and Salmonella typhimurium in foods and environmental water samples. Appl. Environ. Microbiol. 62:587-592.

204. Yu, J., and J. B. Kaper. 1992. Cloning and characterization of the eae gene of enterohaemorrhagic Escherichia coli 0157:H7. Mol. Microbiol. 6:411-417.

205. Yuhan, R., A. Koutsouris, and G. Hecht. 1995. Enteropathogenic E. coli induced phosphorylation of myosin light chain increases intestinal epithelial paracellular permeability. Gastroenterol. 108:A948. (Abstract.)

206. Zabala, J. C., J. M. Garcia-Lobo, E. Diaz-Aroca, F. de la Cruz, and J. M. Ortiz. 1984. Escherichia coli alpha-hemolysin synthesis and export genes are flanked by a direct repetition or ISP/-like elements. Mol. Gen. Genet. 197: 90-97.

207. Zadik, P. M., P. A. Chapman, and C. A. Siddons. 1993. Use of tellurite for the selection of verocytotoxigenic Escherichia coli 0157. J. Med. Microbiol. 39:155-158.

208. Zupan J.R., Zambryski P., 1995, Transfer of T-DNA from Agrobac-terium to the plant cell, Plant. Physiol., 107, 1041-1047.