Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Экспериментальная колиэнтеротоксемия, обусловленная шигаподобным токсином Escherichia coli

на правах рукописи

КОТКОВА Наталья Валерьевна

Экспериментальная колнэнтеротоксемия, обусловленная шигаподобным токсином Escherichia coli

16 00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Краснодар 2007

003070728

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» на кафедре эпизоотологии и вирусологии факультета ветеринарной медицины

Научный руководитель

доктор биологических наук Терехов Владимир Иванович

Официальные оппоненты

доктор ветеринарных наук, профессор

Дорофеев Виталий Иванович

доктор ветеринарных наук Басова Наталья Юрьевна

Ведущая организация ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет»

Защита состоится « 29 » мая 2007 г в О » часов на заседании диссертационного совета Д 220 038 07 при ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» (350044, г Краснодар, ул Калинина, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»

Автореферат разослан « 28 » апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

д в н , профессор

Родин Игорь Алексеевич

1. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность работы. Для увеличения продукции животноводства необходима высокая сохранность молодняка свиней и крупного рогатого скота Одним из факторов, которые препятствуют этому, является гибель телят и поросят на раннем периоде своего развития Основной причиной падежа служат болезни желудочно-кишечного тракта (Субботин В В с соавт, 2001) Среди данной группы заболеваний, существенное место занимает эшерихиоз (Зароза В Г, 1991) По данным ветеринарной отчетности ежегодно в Краснодарском крае погибает от эшерихиоза от 500 до 1000 тыс телят и 1500-2000 тыс поросят Животные заболевают и гибнут в первые дни и недели жизни, а поросята, кроме того, и в послеотьемный период

В мире нет страны, где бы эта инфекция не регистрировалась у животных и человека В последние годы во многих развитых странах (США, Канада, Великобритания и др) эшерихиоз животных находится под пристальным вниманием ветеринарных и медицинских врачей, а также Всемирной организации здравоохранения, так как важную роль в инфекционной патологии человека стали играть эшерихии, вырабатывающие шигаподобный токсин, резервуаром которых являются сельскохозяйственные животные (Куликовский А В с соавт, 1997, Ратинер Ю А с соавт, 1998, Степаншин ЮГ с соавт, 2005, Marcs et al, 1993, Gray W С , Moon H W , 1995, Nataro et al, 1998)

Наличие у E coli целого ряда факторов патогенности и, прежде всего, токсинообразования, адгезивной и инвазивной активности, обуславливает многообразие форм клинического и патологоанатомического проявления эшерихиоза у молодняка сельскохозяйственных животных, что затрудняет диагностику болезни, а, следовательно, проведение профилактики и адекватного и своевременного лечения Отсутствие достаточно полных сведений о патогенных штаммах Е coli и механизмах развития эшерихиозной инфекции являются основной причиной низкой эффективности коммерческих вакцин и традиционно осуществляемой этиотропной терапии

В связи с этим, изучение распространения потенциально опасных эшерихий и определение особенностей патогенного действия вырабатываемых ими токсинов на организм животных является актуальным направлением для ветеринарной науки и практики, так как может способствовать усовершенствованию мероприятий по профилактике и ликвидации эшерихиоза

1.2. Цель и задачи исследований. Основной целью работы было изучение распространения патогенных штаммов кишечной палочки и особенностей действия шигаподобного токсина эшерихий на организм лабораторных животных

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи

- выяснить степень распространения патогенных штаммов Е coli изолированных от телят и поросят,

- установить оптимальные условия культивирования токсигенных штаммов Е coli,

- изучить патогенное действие разных видов токсинов на организм лабораторных животных,

- изучить особенности клинико-морфологического проявления экспериментальной колиэнтеротоксемии, обусловленной шигаподобным токсином Е coli

13. Научная новизна. Впервые были проведены исследования по изучению распространения на фермах Краснодарского края энтеротоксигенных и энтерогеморрагических эшерихий с использованием метода полимеразно-цепной реакции, а также отработан способ биотестирования их токсигенных свойств и уровня накопления токсинов в питательной среде с использованием инфузорий Stylonychia mytilus Установлены особенности изменения картины крови и фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов у лабораторных животных под действием термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов Е coli Разработана экспериментальная модель, позволяющая воспроизводить и изучать патогенетические механизмы колиэнтеротоксемии, обусловленной шигаподобным токсином энтерогеморрагических эшерихий

1.4. Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенной работы позволили установить широту распространения экзотоксинпродуцирующих эшерихий, определить оптимальные условия культивирования различных токсигенных вариантов Полученные результаты дали возможность определить характер краткосрочного и долгосрочного реагирования организма животных на введение токсинов кишечной палочки, а также получить экспериментальную модель колиэнтеротоксемии для разработки и изучения биологических и фармакологических средств профилактики и терапии телят и поросят при данной патологии

1.5. Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научных конференциях сотрудников факультета ветеринарной медицины Кубанского ГАУ (Краснодар, 2005,2006, 2007), 2-ой международной научно-практической конференции (Прага, 2005), международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию Краснодарского НИВИ (Краснодар, 2006)

1.6. Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 научные работы, в т ч в рецензируемом журнале, рекомендованном для публикаций высшей аттестационной комиссией

1.7. Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- Эшерихии, изолированные от молодняка крупного рогатого скота и свиней в хозяйствах Краснодарского края, представлены широким диапазоном серологических вариантов, среди которых 50,4% обладает маркерами генов экзотоксинов Гены шигаподобного токсина (STX 1 и STX 2) выявлены у 21,5% штаммов, термолабильного токсина - у 33,3% штаммов, термостабильного токсина - у 4,4% штаммов

- Реализацию генов экзотоксинов Е coli можно установить методом биотестирования на инфузориях Stylonychia mytilus Продукция экзотоксинов зависит от состава питательной среды, а уровень их накопления от сроков культивирования

- ST, LT и STX эшерихии обуславливают лейкоцитоз с резким сдвигом нейтрофильного ядра влево и подавляют фагоцитарную активность нейтрофилов, а комплекс этих токсинов, напротив, вызывает лейкопению, появление в периферической крови базофилов, эозинофилов, миелоцитов и большого количества незрелых нейтрофильных гранулоцитов, при этом фагоцитарная активность нейтрофилов возрастает в 1,5 раза

- Шигаподобный токсин эшерихий вызывает острое воспаление в желудочно-кишечном тракте и паренхиматозных органах с преобладанием альтеративных и экссудативных процессов, а также острое расстройство кровообращения

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов исследования, выводов, предложений и списка использованной литературы Работа включает 12 таблиц и 26 рисунков Список литературы содержит 180 источников, из числа которых 85 иностранных

2. Материалы и методы исследований

Основные исследования проводили в 2003-2006 гг на кафедре эпизоотологии и вирусологии факультета ветеринарной медицины Кубанского ГАУ

В ходе выполнения работы было проведено 250 бактериологических, 200 гематологических и 56 патоморфологических исследований

Серологическим и генетическим исследованиям было подвергнуто 135 полевых штаммов Е coli В исследованиях по экспериментальному изучению токсинов Е coli было использовано 140 белых мышей, 220 белых крыс и 15 кроликов пород Шиншилла и Бабочка, изготовлено 500 микропрепаратов

Изоляты Е coli выделяли из патологического материала от больных и павших телят и поросят из неблагополучных по эшерихиозу хозяйств Краснодарского края, при этом бактериологические исследования проводили общепринятыми методами, согласно «Методическим рекомендациям по

бактериологической диагностике колибактериоза животных и птицы» (2000) Для определения степени распространения патогенных штаммов Е coli изолированных от телят и поросят осуществляли анализ данных бактериологического отдела межобластной ветеринарной лаборатории «Краснодарская», а также собственных исследований

Серологический профиль выделенных Е coli определяли с помощью типоспецифических О-агглютинирующих колисывороток (Армавирская биофабрика) и адгезивных колисывороток (ВНИИ прикладной микробиологии, г Оболенск)

Патогенность выделенных изолятов Е coli устанавливали при внутрибрюшинном заражении белых мышей взвесью суточных агаровых культур Способность продуцировать гемолизины выявляли на 5% кровяном агаре

Наличие генов патогенности у эшерихий определяли с помощью ПЦР-диагностики в Цетральном НИИ эпидемиологии (Москва) и НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи (Москва) Для выявления специфических участков ДНК генов шигатоксина I типа (STX 1), шиготоксина П типа (STX 2) энтерогеморрагических Е coli, термостабильного (ST) и термолабильного (LT) энтеротоксинов энтеротоксигенных Е coli были использованы тест-системы "АмплиСенс Е Coli-tox" ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ

Амплификация специфических участков ДНК осуществлялась на амплификаторе с активным регулированием "Терцик" (ДНК-технология) по следующей программе инициализация 1 цикл - 5 мин при температуре 95°С, затем 40 циклов по следующей последовательности каждого из них 10 сек 95°С, 10 сек 65°С и 10 сек 72°С Анализ продуктов амплификации проводился разделением фрагментов ДНК в агарозном геле Длина амплифицированных специфических фрагментов Е coli VT-1 - 730, VT-2 - 310, ST - 170, LT -700 нукпеотидных пар

Для определения токсигенных свойств, выделенных Е coli использовали методы биотестирования, которые позволили не только выявить токсигенные штаммы и установить степень их патогенности, но и определить оптимальные условия и продолжительность культивирования тест-штаммов эшерихий С этой целью был использован биотест на инфузориях Stylonychia mytilus (Терехов В И с соавт, 2005), тест отека мышиной лапы (Вартанян Ю П , 1978) и анальная проба на мышах-сосунках (Романенковой НИ, 1980) Тестируемые штаммы культивировали на жидких питательных средах и через каждые 24 ч проводили контроль уровня накопления токсинов

Определение токсичности культур с помощью инфузорий выполняли в серологических круглодонных планшетах, для этого в среду с простейшими вносили бульонную культуру кишечной палочки в соотношении 3 1 Для исключения погрешности, связанной с влиянием различных факторов окружающей среды спустя пять минут осуществляли предварительный просмотр и подсчет количества живых стилонихий с помощью бинокулярной лупы По истечении двух часов производили окончательный подсчет числа

живых инфузорий Опыт дублировали трижды, после чего определяли средний процент выживания микроорганизмов

Для сравнительной оценки активности экзотоксинов исследуемых штаммов кишечной палочки были испытаны тест отека мышиной лапы и проба на мышах-сосунках Для этого штаммы-продуценты №546 и №533 культивировали на авторской среде (АС), в состав которой входили такие ключевые компоненты как кислотный гидролизат крови и аутолизат пекарских дрожжей, в течение 6 дней, а штамм №44 - в течение 7 суток при 37°С После чего культуральную среду для удаления бактериальной массы центрифугировали в течение 1 ч при 10000 об/мин

Для выявления термолабильного токсина центрифугат вводили в область плантарной поверхности правой лапы 15 белым мышам (по пять животных в каждой группе) массой 10-14 г в дозе 0,05 мл В качестве контроля использовали исходную стерильную питательную среду, которую вводили параллельно в левую заднюю лапу в той же дозе Учет результатов проводили по величине отека лапы через 48 ч Величину отека определяли по разности веса лапок мышей в контроле и опыте За положительный принимали показатель отека равный 65 мг и более

Для выявления термостабильного экзотоксина использовали 20 мышат 3-4-дневного возраста, которых выдерживали в течение 18 ч на голодной диете Как и в тесте отека мышиной лапы, мышам-сосункам использовали центрифугат культур тестируемых штаммов, который вводили анально в дозе 0,1 мл Мышатам контрольной группы вводили стерильный бульон в той же дозе Через 4 ч после введения токсинов производили учет результатов, который заключался в определении показателя отношения суммы масс тонких кишок к сумме масс тушек За положительный принимали показатель равный 0,09 и более

Изучение патогенного действия разных видов токсинов Е coli проводили на белых крысах и кроликах, на примере которых выясняли влияние токсинов на морфологические показатели крови, функциональную активность нейтрофилов и клеточную структуру внутренних органов

Влияние токсинов Е coli на кровь определяли, используя белых крыс массой 175±10 г, которым однократно внутрибрюшинно вводили заранее установленную сублетальную дозу культуральной среды, содержащей тот или иной вид токсина Эта доза составляла 1,8 мл

Для изучения влияния шигаподобного токсина на внутренние органы животных использовали крыс со средней живой массой 150±10 г и кроликов 1,5-месячного возраста, со средней живой массой 600±50 г Крысам безмикробную культуральную среду вводили внутрибрюшинно в дозе 1,5 мл, а кроликам - ректалыю с помощью уретрального катетера на глубину 7-8 см в дозе 3,0 мл

Количество эритроцитов и лейкоцитов подсчитывали в камере с сеткой Горяева, а лейкоформулу в окрашенных по Романовскому-Гимза мазках крови, концентрацию гемоглобина устанавливали гемоглобинцианидным методом («Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии», 1985)

Для оценки выраженности степени эндотоксикоза и уровня воспалительной реакции выводили лейкоинтоксикационный индекс (ЛИИ) и индекс сдвига (ИС) ЛИИ рассчитывали по следующей формуле (Караулов А В , 1999) ЛИИ=Ми+ Ю+Пл+С+П / Э+Б+Л+М, где Ми - миелоциты, Ю -юные, Пл - плазматические клетки, П - палочкоядерные, С -сегментоядерные, Э - эозинофилы, Б - базофилы, Л - лимфоциты, М -моноциты ЛИИ больше 1,5 свидетельствует об интоксикации организма, а свыше 4-5 о преобладании в ней бактериального компонента ИС рассчитывали по формуле Ми+Ю+П / С (Камышников В С , 1997, Назаренко Г И , Кишкун А А , 2002)

Фагоцитарное звено иммунитета оценивали по показателям фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН), фагоцитарному числу (ФЧ), проценту переваривания и коэффициенту мобилизации (КМ) В качестве объекта фагоцитоза использовали S aureus 209Р (Методы оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, 1993)

Патологоанатомическое вскрытие проводили по методу А В Жарова, ИВ Иванова, АН Кунакова и др (1981) При этом внимание обращали на наличие выделений из естественных отверстий, состояние видимых слизистых и серозных оболочек, а при осмотре полостей - на расположение органов, их форму, размер, цвет, консистенцию, а также состояние плевры, брюшины и перикарда

Патогистологический метод использовали для изучения влияния токсинов эшерихий на структурные компоненты внутренних органов (печени, сердца, почек, легких, желудка, тонкого и толстого отделов кишечника, брыжеечных, портальных, желудочных, околопочечных лимфатических узлов) лабораторных животных Материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина После формалиновой фиксации материал промывали в проточной воде и осуществляли проводку и заливку в парафин по общепринятой методике (Меркулов Г А , 1969)

Гистологические срезы толщиной 5-6 мкм готовили при помощи санного микротома МС-2 Окрашивали микропрепараты гематоксилином и эозином на предметных стеклах (Афанасьев Ю И , 1999, Жаров А В с соавт, 2005)

Микрофотографирование осуществляли при помощи микроскопа «Микмед - 11» и цифрового фотоаппарата CANON DIGITAL IXUS 60

Математическую и биометрическую обработку всех полученных результатов проводили с помощью программы Exsel на персональном компьютере с системным блоком Athlon 1700 Степень достоверности устанавливали по распределению Стьюдента (Гельман В Я , 2001)

Выражаю большую благодарность доценту кафедры анатомии сельскохозяйственных животных, к в н В М Кравченко за оказанную помощь в проведении патоморфологических исследований

3. Результаты собственных исследований

3.1. Антигенный состав Е. coli изолированных от телят и поросят в Краснодарском крае

Изучение материалов отчетности управления ветеринарии показало, что в Краснодарском крае эшерихиозом ежегодно поражается от 1000 до 1500 телят и от 3500 до 8500 поросят, при этом летальность, как в том, так и в другом случаях составляет 24-29% Между тем, результаты собственных исследований показывали, что в отдельных хозяйствах заболеваемость молодняка может достигать 50-80%, а летальность доходить до 50% Изучение антигенного профиля изолированных эшерихий позволил нам констатировать, что только 22-25% штаммов Е coli положительно реагировали с О-сыворотками Армавирской биофабрики, в остальных случаях серотип возбудителя не был установлен

Между тем, мониторинговые исследования, проведенные за последние 13 лет показали, что в Краснодарском крае от поросят чаще всего выделялась Е coli 026 (8,5%), 08 (7,5%), 018 (6,3%), 0138 (5,7%), OlOl (5,2%), 015 (4,4%), 078 (4,3%), а от телят - 078 (9,5%), 015 (8,9%), 08 (8,8%), 020 (6,5%), 09 (6,1%), 026 (6,1%), 018 (5,7%) Маркирование по пилевым антигенам показало, что изолированные от телят эшерихии в 23,9% случаев положительно реагировали с соответствующими сыворотками, а от поросят - в 33,5% При этом ведущую роль в этиологии эшерихиоза у телят играют штаммы с адгезином А20 (43,8%), а у поросят - К88 (52,7%)

Кроме того, изучение серотипового профиля Е coli, выделенных от больных и павших телят показало, что в 65-75% случаев в патологическом материале могут одновременно присутствовать эшерихии 2 и более серотипов, а также полиадгезивные варианты

3.2. Распространение детерминант патогенности у эпизоотических штаммов Е. coli, изолированных от телят и поросят

Предварительное тестирование Е coli с использованием теста отека мышиной лапки показало, что количество экзотоксинпродуцирующих штаммов находится в пределах 39,1^47,2% Данное обстоятельство послужило предпосылкой для проведения исследований на предмет обнаружения у полевых штаммов Е coli детерминант патогенности, а именно генов, отвечающих за выработку LT, ST, STX 1 и STX 2

С этой целью ДНК-диагностике было подвергнуто 135 штаммов эшерихий, 68 из которых были изолированы от телят, а 67 от поросят

Результаты проведенных исследований показали, что у эшерихий изолированных от телят и поросят в хозяйствах Краснодарского края, в 50,4% случае присутствуют гены различных экзотоксинов Больше всего

штаммов, обладающих генами различных экзотоксинов, было выделено от поросят (58,0%), а меньше от телят (42,0%)

Гены шигаподобных токсинов были выявлены у 21,5% штаммов, 69,0% из которых имели только ген STX 2, а 31,0% - STX 1 и STX 2

Штаммы, у которых присутствовал бы только ген STX 1 не встречались Ген, отвечающий за выработку STX 2 чаще выявляли у Е coli изолированных от поросят (75%), нежели от телят Однако от телят чаще выделяли (88,9%) штаммы с детерминантами обоих типов шигатоксина (STX 1 и STX 2), которые были установлены в 6,7% случаях

Маркеры гена термолабилыюго токсина были обнаружены у 33,3% штаммов, распределение которых по происхождению было следующим 57,8% было изолировано от поросят, и 42,2% - от телят

Специфические участки ДНК, контролирующие выработку термостабильного токсина, были выявлены только у 4,4% штаммов, 33,3% из которых изолированы от телят, а 66,7% от поросят

Наличие только генов LT было выявлено у 24,4% штаммов, только ST - у 3,0% штаммов, у 0,7% штаммов выделенных от поросят было зафиксировано наличие маркеров LT и ST

У 4,4% штаммов одновременно были установлены детерминанты LT и STX 1, 2, причем 83,3% из них изолированы от телят и 16,7% от поросят У 2,2% штаммов было обнаружено наличие маркеров LT и STX 2, а у 0,7% штаммов выявили наличие маркеров ST, STX 2 и LT

3.3. Тестирование токсигенности эшерихий с использованием микроорганизмов

Само наличие генов не является свидетельством их реализации, кроме того, поскольку чаще всего они локализуются не непосредственно в бактериальной хромосоме, а на внехромосомном участке ДНК - плазмиде, то могут с легкостью как приобретаться, так и теряться бактериальной клеткой Поэтому на следующем этапе наших исследований предусматривалось проведение работ по выявлению экзотоксинпродуцирующих штаммов, для чего были апробированы различные методы биотестирования

Для тестирования токсигенности эшерихий были отобраны 3 штамма, у которых методом многократных ДНК-исследований осуществляемых в течение 3-х лет установили стабильное присутствие генов, отвечающих за выработку термолабильного, термостабильного и шигатоксинов Штамм №44 с антигенной структурой Ol57 Н7 и генами STX типов I и П, штамм №533 с антигенной структурой 0141 К99 и геном ST, штамм №546 с антигенной структурой 0?F41 и геном LT Биотестирование проводили ранее разработанным на кафедре эпизоотологии Кубанского ГАУ методом с использованием инфузорий Stylonychia mytilus

Предварительные исследования на S mytilus с использованием авторской среды (АС) и мясо-пептоного бульона (МПБ) показали, что выбранные штаммы Е coli действительно продуцируют токсины, о чем

свидетельствовала гибель инфузорий Оказалось, что процент выживания инфузорий после добавления к ним среды культивирования Е coli, полученной при использовании АС, в состав которой входили такие ключевые компоненты как кислотный гидролизат крови и аутолизат пекарских дрожжей, был ниже, чем при использовании МПБ Следовательно, культуры, полученные на АС были более токсичными для эукариотических организмов, чем культуры полученные на МПБ Особенно это было выражено у штаммов №44 и №546 На АС у данных изолятов накопление токсинов, начиная со второго дня культивирования, было на 13,5-23,7% выше, чем на МПБ, а через 72 ч уже эта разница составляла 16,2-24,7% Учитывая данные обстоятельства в дальнейшем для выяснения влияния сроков инкубации на накопление токсинов в культуральной среде мы использовали только АС В качестве контроля использовали стерильную АС При этом было установлено, что накопление токсинов не ограничивается первыми тремя днями инкубации и продолжается в течение последующих дней

Штамм №44, у которого имелись гены, отвечающие за выработку STX 1 и 2 в течение первых 4 суток продуцировал токсин медленно, а начиная с 5-х суток синтез шигаподобного токсина резко возрастал На 7-е сутки инкубации, культуральная среда содержала максимальное количество токсина, о чем свидетельствовала гибель 88% клеток инфузорий

Динамика продуцирования токсинов культурами №546 (LT) и №533 (ST) была схожей Эти штаммы также начинали продуцировать токсины уже с первого дня культивирования, но в течение первых 3-х суток интенсивность была не высока, а, начиная с 4-х суток, она резко увеличивалась и нарастала вплоть до 6 дня инкубации К этому времени происходило максимальное накопление токсинов, приводящее к гибели 80,5% инфузорий при добавлении культуральной среды штамма 546 и 90,7% - при добавлении культуральной среды штамма 533 Однако на 7 день установили четкую тенденцию снижения токсичности культуральных сред этих штаммов, что могло быть связано с инактивацией токсинов

Таким образом, результаты проведенного опыта показали, что выбранные нами штаммы Е coli действительно продуцируют экзотоксины, интенсивность выработки которых зависит как от состава питательной среды, так и сроков культивирования, продолжительность которого должна быть для получения LT и ST не менее 6 дней, но не более 7, а для STX не менее 7 дней

3.4. Тестирование токсигенности Е. coli с использованием белых мышей

Для подтверждения наличия в культуральной среде LT и ST мы воспользовались дополнительно референс-методами по их обнаружению, которые были предложены и описаны ЮП Вартаняном (1978) и НИ Романенковой (1980) Первый автор разработал метод отека мышиной лапки

для определения термолабильного токсина Е coli, а второй - метод расширения тонкой кишки у мышат-сосунов для определения термостабильного токсина Е coli

Результаты проведенных нами исследований показали, что наибольшая разница в весе лапок была установлена после введения культуральной среды штамма №546, который продуцировал LT В этой группе животных величина отека составила в среднем 113±9,4 мг Полученные данные полностью согласуются с данными автора методики, а, следовательно, методика действительно может использоваться для индикации термолабильного токсина эшерихий

Однако появление выраженного отека (89,0±4,2 мг), хотя меньшего чем после введения культуральной среды штамма №546, мы установили и после введения культуральной среды штамма №44, который продуцирует шигаподобный токсин Следовательно, данный вид токсина также может обуславливать воспалительную реакцию при введении его подкожно

Отек на введение культуральной среды штамма №533 был незначительным (23,0±3,1мг) и достоверно не отличался от величины отека (15,0±3,3 мг) лап мышей из контрольной группы, которым вводили бульон Это в общем-то закономерно, поскольку термостабильный токсин как указывает ЮП Вартанян (1978) не вызывает значительной воспалительной реакции при интраплантарном введении его белым мышам Напротив, в тесте расширения тонкой кишки новорожденных мышат данный штамм вызывал наибольшее увеличение массы кишечника за счет заполнения ее жидкостью, коэффициент которого составил 0,20±0,02 В контрольной группе этот коэффициент был равен 0,01±0,002

Достоверное увеличение массы тонкого кишечника было установлено также и у мышат, которым вводили культуру штамма №44 У животных этой группы коэффициент расширения тонкой кишки составил 0,10±0,01 Однако механизм повышенного содержания в просвете кишки жидкости, вероятно, связан с воспалительной реакцией, поскольку известно, что STX повреждает клетки эпителия, что приводит к развитию воспаления (Полесская А Н, 1997)

Наименьший показатель расширения кишки был установлен после введения культуральной среды штамма №546, который вырабатывает термолабильный токсин, что свидетельствует об отсутствии специфичности данного теста для выявления LT

3.5. Характер клинических и морфологических изменений на введение токсинов Е. coli белым крысам 3.5.1. Влияние разных видов токсинов на гематологические показатели и фагоцитоз у крыс

При анализе результатов гематологических исследований было установлено, что уже через 3 ч после введения токсинов у крыс во всех опытных группах происходит достоверный нейтрофильный сдвиг влево, за

счет появления миелоцитов и незрелых нейтрофилов в крови, что может указывать на развитие острого воспалительного процесса и интоксикацию У животных первых трех опытных групп данные изменения происходили на фоне лейкоцитоза (4,6-5,3 х109/л), а четвертой опытной группы, которым вводили смесь токсинов, напротив, резко выраженной лейкопении (1Д2±0,1 х109/л) Следовательно, каждый из токсинов в отдельности (ЬТ, БТ, БТХ) на начальном этапе взаимодействия с организмом животных оказывает стимулирующее влияние на лейкопоэз, однако эта стимуляция заключается в выбросе в кровяное русло большого количесвта гранулоцитарных клеток и их предшественников При этом появление базофилов (до 1%), по всей видимости, указывает, что эта стимуляция не что иное, как раздражение и реализация резервных возможностей системы гемопоэза У животных четвертой группы введение комплекса токсинов привело к резкому угнетению лейкопоэза, ярко выраженной эозинофилии (3,7±0,2%), появлению в крови миелоцитов (1,0±0,1%) и метамиелоцитов (11,0±0,5%)

Выраженные изменения в структуре нейтрофильных гранулоцитов отразились и на их функциональных способностях Под действием ЬТ и БТ наблюдали подавление фагоцитарного ответа и переваривающей способности фагоцитов, БТХ не оказывал влияние на захватывающую способность нейтрофилов, но снижал их переваривающую активность, а комплекс токсинов, напротив, стимулировал как фагоцитирующие, так и переваривающие возможности нейтрофилов

Через 6 ч после введения токсинов гематограмма в целом оставалась такой же, как и через 3 ч, за исключением животных третьей опытной группы, которым вводили шигаподобный токсин, у них из периферической крови практически исчезали сегментоядерные нейтрофилы (1,7±0,1%) Функциональная активность нейтрофилов к этому времени в основном восстанавливается и не отличается от таковой у животных контрольной группы Однако мобилизационная способность фагоцитов крыс разных групп неодинакова У животных первой группы, где применяли термостабильный токсин, коэффициент мобилизации составлял 0,4 ед, что свидетельствовало о блокировании кислородзависимой микробицидной системы нейтрофилов

Характер изменений в картине крови в последующие часы свидетельствовал об адаптивных процессах у подопытных животных, что выражалось повышением в 1,5-2 раза относительно животных контрольной группы содержания лейкоцитов, уменьшением индекса сдвига и лейкоинтоксикационного индекса, возрастанием фагоцитарной активности нейтрофилов и усилением их мобилизационной способности Между тем, у животных, которым вводили шигаподобный токсин, отмечали низкий уровень поглотительной (9,0±0,8%) и переваривающей способности (1,1±0,02%) фагоцитов даже спустя 24 ч, что свидетельствует о специфическом действии токсина на нейтрофилы и другие клетки, и тканевые структуры макроорганизма Данное предположение было подтверждено, патоморфологическими исследованиями, результаты которых показали, что БТХ вызывал атрофию и нарушение кровообращения в

селезенке, обуславливал дистрофические процессы и некроз в эпителии почечных канальцах, толстого и тонкого кишечника, сердечной мышце и печении

3.5.2. Клиническое и патоморфологическое проявление экспериментального токсикоза у белых крыс, обусловленного шигаподобным токсином Е. coli

Изучение картины крови и параметров фагоцитоза при введении белым крысам различных токсинов Е coli показало, что наиболее существенные изменения происходили в ответ на введение шигаподобного токсина Эти изменения, прежде всего, характеризовались ярко выраженными токсическими и воспалительными реакциями В связи с этим нас интересовало, каким образом это отражалось на внутренних органах животных, и какие именно патологические процессы там развивались

Клинические признаки заболевания развивались через двое суток с момента введения токсина У крыс отмечали угнетение, взъерошенность шерстного покрова, конъюнктивит, снижение и полное отсутствие аппетита, жажду и диарею У некоторых животных отмечалась агрессивность Шерстный покров вокруг анального отверстия и в области задних лап был испачкан жидкими испражнениями темно-коричневого цвета После развития симптомов токсикоза животных убивали методом декапитации и проводили патологонатомическое и патогистологическое исследование

При патологоанатомическом исследовании у всех опытных животных в кишечнике отмечали острое катаральное воспаление, которое характеризовалось гиперемией и набуханием слизистой оболочки, а также выпотом на ее поверхности большого количества катарального экссудата Печень была незначительно увеличена в размере, дряблой консистенции, с участками серо-белого цвета Поверхность разреза тусклая, рисунок сглажен Почки слегка увеличены в размере, дряблой консистенции, серого цвета Рисунок между корковой и мозговой зонами не определялся Брыжеечные, портальные и околопочечные лимфатические узлы, резко увеличены, плотной консистенции, окрашены в серый цвет Поверхность разреза тусклая, влажная, рисунок не выражен Селезенка увеличена в размере, края тупые, капсула напряжена, темно-вишневого цвета Соскоб с поверхности разреза обильный кровянистый, рисунок плохо выражен Сердце ассиметричное, правый желудочек нависал на верхушку Миокард дряблый, серого цвета, на разрезе тусклый Соотношение толщины миокарда правой половины к левой определялось как 1 7

Патогистологические исследования показали, что в селезенке происходило уменьшение объема белой пульпы, при этом она располагалась небольшими по размеру участками, в которых количество лимфоцитов было снижено В красной пульпе выявлялась ярко выраженная венозная гиперемия с усиленным распадом эритроцитов и образованием большого количества пигмента гемосидерина В отдельных участках наблюдали альтеративный

процесс, который характеризовался лизисом стромальных и клеточных структур

В почках у всех подопытных животных отмечали преобладание альтеративных процессов, которые характеризовались белковой и зернистой дистрофией эпителия канальцев В отдельных канальцах наряду с этим наблюдали некроз эпителия по типу лизиса В отдельных клубочках отмечали экстракапиллярное серозное воспаление

В брыжеечных, портальных и околопочечных лимфатических узлах выявляли увеличение количества лимфатических клеток в первичных фолликулах, а вследствие этого увеличение размера самих фолликулов Такие фолликулы, как правило, имели полигональную форму Помимо этого возросла численность вторичных фолликулов, у которых хорошо были выражены реактивные центры Экссудативные процессы сопровождались гиперемией сосудов трабекул

В сердце большая часть мышечных волокон находилась в состоянии атрофии Такие волокна были истончены, лишены поперечной исчерченности, ядра в них имели уплощенную форму, а цитоплазма была окрашена неравномерно В отдельных участках выявляли зернистую дистрофию и кариолизис

В печени определяли зернистую дистрофию, которая характеризовалась нарушением балочной структуры и неравномерной окраской цитоплазмы гепатоцитов, в некоторых из них наблюдали лизис ядер

В тонком и толстом отделах кишечника отмечали слизистую дистрофию и некроз эпителия кишечных ворсинок В отдельных участках имелись пролифераты из лимфатических и плазматических клеток

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что шигаподобный токсин Е coli действует на паренхиматозные органы крыс и вызывает в них развитие дистрофических и некротических процессов и нарушения кровообращения Особенно глубокие некротические поражения выявлены в миокарде, эпителии почечных канальцев и слизистой оболочки кишечника

3.6. Клиническое и патоморфологическое проявление экспериментальной колиэнтеротоксемии у кроликов, обусловленной шигаподобными токсинами Е. coli

Опыты на крысах позволили нам выяснить общие механизмы действия различных токсинов Е coli на организм животных и выявить особенности этого влияния Однако те изменения в картине крови и органах крыс, которые мы наблюдали, происходили после внутрибрюшинного введения токсинов, а при эшерихиозе он не является естественным способом их поступления Воспроизвести характерную клинику диареи и сопровождающую ее патоморфологические изменения удалось при использовании в качестве биологической модели кроликов 1,5-месячного возраста, которым ректально вводили культуральную среду, содержащую

шигатподобный токсин (первая опытная группа) и культуральную среду, содержащую комплекс (БТ, ЬТ и 8ТХ) токсинов (вторая опытная группа)

Результаты экспериментальных исследований показали, что выбранная нами биологическая модель позволяет полностью воспроизвести колиэнтеротоксемию, обусловленную энтерогеморрагической кишечной палочкой Спустя 2—4 ч после ректального введения у кроликов наблюдали развитие болезни, характеризовавшееся кратковременным повышением температуры, угнетением, потерей аппетита, выделением жидких каловых масс Типичный «черный понос», который развивается у поросят в постотьемный период, отмечали у кроликов спустя 12-19 ч, а развитие нервных проявлений свойственных отечной болезни, спустя 24—48 ч Следует отметить, тот факт, что обозначенный симптомокомплекс наблюдался как у кроликов на введение только шигаподобного токсина, так и смеси токсинов, но у последних он развивался на 1-2 ч раньше и заболевание протекало более тяжело с резким нарастанием нарушений центральной нервной системы Подтверждением тому служили изменения гематологических показателей подопытных животных, которые характеризовались резко обозначенной эритроцитопенией, а у кроликов, которым вводился шигаподобный токсин -и лейкоцитопенией Индекс сдига нейтрофильного ядра у животных первой опытной группы (вводили 8ТХ) вырос до 1,8, а второй - до 2,8 единиц

При вскрытии у кроликов первой группы в сердце обнаруживали участки некроза, в печени белково-жировую дистрофию и переполнение желчного пузыря, белковую дистрофию почек, переполнение и растяжение мочевого пузыря, в селезенке венозное полнокровие, в тонком и толстом отделах кишечника гиперемию и отек стенки

При патологоанатомическом вскрытии трупов кроликов 2 опытной группы выявляли следующие патологические процессы- в желудке, тонком и толстом отделах кишечника метеоризм, катаральное воспаление множественные кровоизлияния и отек стенки, в брыжеечных лимфатических узлах воспалительный процесс, в печени венозную гиперемию и белковую дистрофию, в селезенке венозную гиперемию, в почках белковую дистрофию и венозное полнокровие, в легких венозную гиперемию, отек и небольшие по размеру участки ателектазов, в сердце белковую дистрофию и дилатацию

При патогистологическом исследовании у кроликов первой опытной группы в сердце отмечали преобладание альтеративных изменений При этом в миокарде определяли некроз мышечных волокон и множественные различные по величине очаги кровоизлияний Большинство мышечных волокон были набухшими и лишенными ядер Ультраструктура в таких волокнах тоже не выявлялась В некоторых кардиомиоцитах выявляли зернистую дистрофию

В печени отмечали острую венозную гиперемию, которая характеризовалась переполнением капилляров между балками дольки, а также вен и артерий в междольковой соединительной ткани На отдельных участках в гепатоцитах наблюдал и зернистую дистрофию и кариолизис Кроме этого, в некоторых местах, отмечали нарушение балочной структуры

и дискомплексацию балок на отдельные гепатоцнты Некоторые клетки печени находились в состоянии жировой дистрофии

В почках, как в корковом, так и в мозговом слоях, наблюдали острую венозную гиперемию В отдельных участках отмечали небольшие по размеру кровоизлияния Большая часть канальцев свою структуру сохраняла, их эпителий не имел изменений Другая часть канальцев находилась в состоянии зернистой дистрофии В отдельных канальцах наблюдали альтеративные изменения в виде кариолизиса

В селезенке, тонком и толстом отделах кишечника отмечали острую венозную гиперемию

В лимфатических узлах брыжейки наблюдали увеличение количества вторичных фолликулов, в которых резко увеличивалось количество лимфатических клеток

У животных второй опытной группы в сердце устанавливали небольшие по размеру участки некроза, который характеризовался лизисом и пикнозом ядер кардиомиоцитов и распадом мышечных волокон В отдельных участках имелись кровоизлияния, характеризующиеся скоплением экстравазата в периваскулярных пространствах

В печени отмечали венозную гиперемию, которая характеризовалась переполнением и расширением синусоидных капилляров, и нарушением балочного строения Одна часть балок имела деформированную форму, другая была дискомплексована на отдельные гепатоциты В гепатоцитах наблюдали зернистую дистрофию и некроз с лизисом ядер

В почках выявляли полнокровие капилляров и венозных сосудов В эпителии отдельных канальцев отмечали зернистую и гидропическую дистрофию и некроз При этом в эпителии канальцев происходил лизис ядер, а просвет их был заполнен однородной базофильной массой Большая часть канальцев и клубочки свою структуру сохраняли

В тонком и толстом отделах кишечника наблюдали острое, диффузное катарально-геморрагическое воспаление, которое характеризовалось ярко выраженной слизистой дистрофией и некрозом эпителия слизистой оболочки, а также выпотом геморрагического экссудата в ее подслизистый слой

В желудке отмечали острое диффузное катаральное воспаление, которое проявлялось слизистой дистрофией В отдельных участках слизистой оболочки происходили альтеративные процессы, которые характеризовались некрозом собственно слизистого и подслизистого слоев

В селезенке наблюдали венозную гиперемию и снижение количества лимфатических клеток в белой пульпе

В легких отмечали венозную гиперемию и отек При этом значительное количество венозных сосудов и межальвеолярных капилляров было переполнено кровью В некоторых альвеолах наблюдался ателектаз При этом просветы альвеол были практически не различимы, межальвеолярные перегородки утолщены и плотно прилегали друг к другу

Таким образом, результаты проведенного опыта показали, что шигаподобный токсин Е coli вызывает ярко выраженную воспалительно-

токсическую реакцию, проявляющуюся развитием альтеративных процессов не только в толстом отделе кишечника, куда он был введен, но и поражением паренхиматозных органов сердца, печени, почек, легких, а также других органов, в которых наблюдали различного рода дистрофические и некротические изменения, и расстройство кровообращения в виде венозной гиперемии и кровоизлияний

После введения кроликам культуральной среды содержащей термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины кишечной палочки у них развились клинические симптомы и патоморфологические изменения во внутренних органах аналогичные таковым после введения шигаподобного токсина Однако величина и тяжесть поражений были гораздо более значительными, что может свидетельствовать о потенцирующем эффекте токсического комплекса, когда каждый из его составляющих не только реализует свое индивидуальное действие, но и усиливает действие другого компонента

Выводы

1 Эшерихии, изолированные от молодняка крупного рогатого скота и свиней в хозяйствах Краснодарского края, представлены широким диапазоном серологических вариантов, среди которых чаще всего выделяются от телят - 078 (9,5%), 015 (8,9%), 08 (8,8%), 020 (6,5%), 09 (6,1%), 026 (6,1%), Ol 8 (5,7%) с пилевыми антигенами А20 (43,8%), от поросят - 026 (8,5%), 08 (7,5%), 018 (6,3%), 0138 (5,7%), 0101 (5,2%) с пилевыми антигенами К88 (52,7%)

2 Установлено, что среди изолированных от телят и поросят Е coli маркеры генов экзотоксинов обнаружены у 50,4% штаммов Больше всего штаммов, обладающих генами различных экзотоксинов было выделено от поросят (58,0%), меньше от телят (42,0%) Гены шигаподобных токсинов были выявлены у 21,5% штаммов, 69,0% из которых имели только ген STX 2, а 31,0% - STX 1 и STX 2 Штаммы, у которых присутствовал бы только ген STX 1 не встречались Маркеры гена термолабильного токсина были обнаружены у 33,3% штаммов, а термостабильного токсина - 4,4% штаммов Одновременно детерминантами LT и STX 1, 2 обладало 4,4%, LT и STX 2 -2,2%, ST, STX 2 и LT - 0,7% штаммов

3 Методом биотестирования на инфузориях Stylonychia mytilus была установлена реализация генов патогенности у штаммов Е coli, при этом продукция экзотоксинов зависит от состава питательной среды, а уровень их накопления от сроков культивирования, оптимум которых для ST и LT составляет 6 суток, a STX - 7 суток Тестирование на белых мышах подтвердили пригодность Stylonychia mytilus в качестве тест-объекта для выявления энтеротоксигенных и энтерогеморрагических эшерихий

4 Действие ST, LT, STX на организм лабораторных животных характеризуется лейкоцитозом с резким сдвигом нейтрофильного ядра влево

и подавлением фагоцитарной активности нейтрофилов Введение комплекса токсинов, напротив, сопровождается лейкопенией (1,12±0Дх 109/л), появлением в периферической крови базофилов, эозинофштов, миелоцитов и большого количества (до 44—50%) незрелых нейтрофильных гранулоцитов, при этом фагоцитарная активность нейтрофилов возрастает в 1,5 раза относительно аналогичного показателя у животных контрольной группы

5 Внутрибрюшинное введение белым крысам шигаподобного токсина обуславливает развитие у них в желудочно-кишечном тракте, паренхиматозных органах и лимфатических узлах застойной гиперемии, острого воспаления с выпотом большого количества катарального экссудата и альтеративных процессов (некроз, белковая и жировая дистрофии, атрофия)

6 В ответ на ректальное введение шигаподобного токсина (STX 1 и 2) у подопытных кроликов развиваются характерные признаки колиэнтеротоксемии - диарея и нейротоксический синдром При этом патогенетическое действие токсина выражается появлением в желудочно-кишечном тракте, паренхиматозных органах и лимфатических узлах участков некроза и белково-жировой дистрофии, а также нарушением кровообращения в виде острой венозной гиперемии и кровоизлияний

7 Действие комплекса токсинов Е coli (ST, LT и STX 1 и 2) характеризуется аналогичными клиническими и морфологическими изменениями как и действие шигаподобного токсина (STX 1 и 2) Однако в этом случае развитие клинических признаков происходит быстрее по времени

Практические предложения

1 Метод биотестирования с использованием инфузорий Stylonychia mytilus можно использовать для выявления токсигенных эшерихий

2 Экспериментальная колиэнтеротоксемия легко воспроизводится на 1,5-месячных крольчатах при ректальном введении бульонной культуры энтерогеморрагической Е coli Данную модель можно использовать для более подробного изучения патогенеза заболевания, а также для проведения исследований связанных с разработкой методов специфической терапии и профилактики

3 Основные положения работы можно использовать в учебном процессе при изучении дисциплин «Эпизоотологиия и инфекционные болезни животных» и «Патологическая анатомия животных»

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Колесникова Н В Патологоанатомические изменения при экспериментальном эшерихиозном токсикозе / Н В Колесникова /AViksztä сеше 1 nauka bez grame 2005 Matenaly II miedzynarodowej naukowe-praktycznej konfereneji, tom 2 Nauk biologicznych, wetennana - Przemysl -Praha, 2005 -C 24-25

2 Колесникова H В Эшерихиоз поросят и его профилактика / В И Терехов, Н В Колесникова, Я М Караев // Ветеринария Кубани, 2006 - №1 -С 12-13,-№2 - С 2-3

3 Колесникова Н В Экспериментальный эшерихиозный токсикоз у кроликов / Н В Колесникова // Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию ГНУ Краснодарского НИВИ, -Краснодар, 2006 - С 158-160

4 Колесникова Н В Клинико-морфологические изменения при экспериментальном токсикозе / Н В Колесникова, В М Кравченко, В И Терехов // Ветеринария, 2007 №2 С 21-23

Формат А5

Гарнитура Тайме Тираж 115 экз Заказ № 048

отпечатано в типографии ООО «Световод» г Краснодар ул Калинина 126/1

Актуальность работы. Для увеличения продукции животноводства необходима высокая сохранность молодняка свиней и крупного рогатого скота. Одним из факторов, которые препятствуют этому, является гибель телят и поросят на раннем периоде своего развития. Основной причиной падежа служат болезни желудочно-кишечного тракта (Субботин В.В. с соавт., 2001). Среди данной группы заболеваний, существенное место занимает эшерихиоз (Зароза В.Г., 1991). По данным ветеринарной отчетности ежегодно в Краснодарском крае погибает от эшерихиоза от 500 до 1000 тыс. телят и 1500-2000 тыс. поросят. Телята и поросята заболевают и гибнут в первые дни и недели жизни, а поросята, кроме того, и в послеотъемный период.

В мире нет страны, где бы эта инфекция не регистрировалась у животных и человека. В последние годы во многих развитых странах (США, Канада, Великобритания и др.) эшерихиоз животных находится под пристальным вниманием ветеринарных и медицинских врачей, а также Всемирной организации здравоохранения, так как важную роль в инфекционной патологии человека стали играть эшерихии, вырабатывающие шигаподобный токсин, резервуаром которых являются сельскохозяйственные животные (Куликовский A.B. с соавт., 1997; Ратинер Ю.А. с соавт., 1998; Степаншин Ю.Г. с соавт., 2005; Marcs et al., 1993; Gray W.C., Moon H.W., 1995; Nataro et al., 1998).

Наличие у E. coli целого ряда факторов патогенности и, прежде всего, токсинообразования, адгезивной и инвазивной активности, обуславливает многообразие форм клинического и патологоанатомического проявления эшерихиоза у молодняка сельскохозяйственных животных, что затрудняет диагностику болезни, а, следовательно, проведение профилактики и адекватного и своевременного лечения. Отсутствие достаточно полных сведений о патогенных штаммах Е. coli и механизмах развития эшерихиозной инфекции являются основной причиной низкой эффективности коммерческих вакцин и традиционно осуществляемой этиотропной терапии.

В связи с этим, изучение распространения потенциально опасных эшерихий и определение особенностей патогенного действия вырабатываемых ими токсинов на организм животных является актуальным направлением для ветеринарной науки и практики, так как может способствовать усовершенствованию мероприятий по профилактике и ликвидации эшерихиоза.

Цель и задачи исследований. Основной целью работы было изучение распространения патогенных штаммов кишечной палочки и особенностей действия шигаподобного токсина эшерихий на организм лабораторных животных.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- выяснить степень распространения патогенных штаммов Е. coli изолированных от телят и поросят;

- установить оптимальные условия культивирования токсигенных штаммов Е. coli;

- изучить патогенное действие разных видов токсинов на организм лабораторных животных;

- изучить особенности клинико-морфологического проявления экспериментальной колиэнтеротоксемии, обусловленной шигаподобным токсином Е. coli.

Научная новизна. Впервые были проведены исследования по изучению распространения на фермах Краснодарского края энтеротоксигенных и энтерогеморрагических эшерихий с использованием метода полимеразно-цепной реакции, а также отработан способ биотестирования их токсигенных свойств и уровня накопления токсинов в питательной среде с использованием инфузорий Stylonychia mytilus.

Установлены особенности изменения картины крови и фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов у лабораторных животных под действием термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов Е. coli. Разработана экспериментальная модель, позволяющая воспроизводить и изучать патогенетические механизмы токсикоза, обусловленного шигаподобным токсином энтерогеморрагических эшерихий.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенной работы позволили установить широту распространения экзотоксинпродуцирующих эшерихий, определить оптимальные условия культивирования различных токсигенных вариантов. Полученные результаты позволили определить характер краткосрочного и долгосрочного реагирования организма животных на введение токсинов кишечной палочки, а также получить экспериментальную модель колиэнтеротоксемии для разработки и изучения биологических и фармакологических средств профилактики и терапии телят и поросят при данной патологии.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научных конференциях сотрудников факультета ветеринарной медицины Кубанского ГАУ (Краснодар, 2005, 2006, 2007); 2-ой международной научно-практической конференции (Прага, 2005); международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию Краснодарского НИВИ (Краснодар, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 научные работы, в т.ч. в рецензируемом журнале, рекомендованном для публикаций высшей аттестационной комиссией.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- Эшерихии, изолированные от молодняка крупного рогатого скота и свиней в хозяйствах Краснодарского края, представлены широким диапазоном серологических вариантов, среди которых 50,4% обладает маркерами генов экзотоксинов. Гены шигаподобных токсинов (STX 1 и STX

2) выявлены у 21,5% штаммов, термолабильного токсина - у 33,3% штаммов, термостабильного токсина - у 4,4% штаммов.

- Реализацию генов экзотоксинов Е. coli можно устанавливать методом биотестирования на инфузориях Stylonychia mytilus. Продукция экзотоксинов зависит от состава питательной среды, а уровень их накопления от сроков культивирования.

- ST, LT и STX эшерихий обуславливают лейкоцитоз с резким сдвигом нейтрофильного ядра влево и подавляют фагоцитарную активность нейтрофилов, а комплекс этих токсинов, напротив, вызывают лейкопению, появление в периферической крови базофилов, эозинофилов, миелоцитов и большого количества незрелых нейтрофильных гранулоцитов, при этом фагоцитарная активность нейтрофилов возрастает в 1,5 раза.

- Шигаподобный токсин эшерихий вызывает острое воспаление в желудочно-кишечном тракте и паренхиматозных органах с преобладанием альтеративных и экссудативных процессов, а также острое расстройство кровообращения.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов исследования, выводов, предложений и списка использованной литературы. Работа включает 12 таблиц и 26 рисунков. Список литературы содержит 180 источников, из числа которых 85 иностранных.