Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Генетические детерминанты токсинообразования в семействе Enterobacteriaceae

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ГНУ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ПУШНОГО ЗВЕРОВОДСТВА И КРОЛИКОВОДСТВА им. В. А. АФАНАСЬЕВА

На правах рукописи

БАРАНОВСКАЯ ОКСАНА ПЕТРОВНА

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ТОКСИНООБРАЗОВАНИЯ В СЕМЕЙСТВЕ ЕГЧТЕНОВАСТЕШАСЕАЕ

16 00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в ГНУ Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства им. В. А. Афанасьева

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Козловский Ю. Е.

доктор ветеринарных наук,

профессор

Майоров А.И.

кандидат биологических наук Давыдова Л. И.

Ведущая организация:

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

Защита состоится "ОО^й 004г. в ^ часов на заседании

специализированного совета %Р00о.047.53 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при ГНУ Научно - исследовательском институте пушного звероводства и кролиководства им. В А Афанасьева (140143, Московская область, Раменский район, пос. Родники, ул.Трудовая, д 6, тел.501-53-55).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ НИИПЗК Автореферат разослан "ноября 2004г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, л q ^---

кандидат с.-х. наук , Лоенко H.H.

змиьо

^^ I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы:

Во многих районах земного шара острые диарейные заболевания до сих пор остаются нерешенной проблемой ветеринарии и медицины. Они являются причиной высокой смертности у людей, сельскохозяйственных животных, в том числе и пушных зверей. При этом большинство вспышек токсикоинфекций обусловлено энтеротоксигенными штаммами Е. соИ (ЕТЕС) которые продуцируют токсины, вызывающие диарейный синдром.

В большинстве случаев жертвами токсикоинфекции становятся дети младшего возраста и молодняк сельскохозяйственных животных. По данным ВОЗ, из 1млрд. ежегодно заболевающих детей умирает более 3-х млн.

Серьезную проблему представляют диареи, вызываемые ЕТЕС и в сельском хозяйстве, так даже в хорошо налаженных свиноводческих хозяйствах США от 2,5 до 5 % новорожденных поросят погибают от диарейного токсикоза.

В отечественном пушном звероводстве токсикоинфекции являются основной причиной дорегистрационного отхода новорожденных щенков и гибель молодняка в период отсадки.

Многочисленными исследованиями было установлено, что ведущую роль в патогенезе диарейных заболеваний играют так называемые цитотонические токсины: термолабильный (ЬТ) и термостабильные (8Т1 , БТИ).

Этот факт, по-видимому, явился причиной своеобразного перекоса в их изучении, длительное время основное внимание уделялось изучению химической структуры самых токсинов и различных аспектов их взаимодействия с макроорганизмом. Значительно меньше освещены вопросы, связанные с изучением структуры и локализации кодирующих их генов. Первые же работы в этом направлении показали большое сходство как в строении самих токсинов, продуцируемых таксономически отдаленными группами микроорганизмов, так I

ЯОСлНММАНМММРнгуре их генов БИБЛИОТЕКА Г

3 ¿»З^/о]

(Смирнов, 1984). Было установлено, что в большинстве случаев гены, кодирующие токсинообразование, локализованы на плазмидах внехромосомных генетических элементах, способных к автономной репликации с варьирующими размерами и числом копий. Однако, имеющиеся данные о таких плазмидах, носят далеко не полный характер и относятся в основном к плазмидам, изолированным, из штаммов выделенных от людей. Значительно меньше изучены плазмиды, кодирующие токсинообразование в штаммах ведущих происхождение от сельскохозяйственных животных и полностью отсутствуют данные о генетических детерминантах токсигенности штаммов, поражающих пушных зверей.

Наблюдаемое в последние 10-15 лет бурное развитие биотехнологии и генной инженерии дает возможность не только изучения, но и использования генетических детерминант токсигенности при создании диагностических и лечебно-профилактических препаратов.

Исходя из вышесказанного, изучение генетических детерминант токсинообразования в штаммах, изолированных из патологического материала, полученного от пушных зверей, представляется весьма актуальным и своевременным.

Цель исследования:

Целью нашей работы, стало изучение генетических детерминант токсинообразования, их физико-химических и молекулярно-генетических свойств у штаммов эшерихий, изолированных от пушных зверей.

Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1.Определить наличие внехромосомных элементов в клетках токсигенных штаммов, изолированных от пушных зверей.

2. Изучить плазмидные профили токсигенных штаммов и локализовать гены, кодирующие токсинообразование.

3. Провести анализ молекулярно-генетических характеристик плазмид, кодирующих тЬксинообрэдоврше и определить:

а) физическое строение

б) молекулярную массу

в) копийность.

4. Установить наличие корреляции между копийностью плазмид и уровнем токсинообразования.

5. Изучить возможность горизонтального переноса генов токсинообразования в популяции энтеробактерий посредством конъюгации.

Объектом исследования являлась коллекция штаммов энтеробактерий выделенная из патологического материала полученного от пушных зверей. Была выделена плазмидная ДНК, проведен анализ плазмидных профилей, установлены штаммы, содержащие tox-плазмиды, получены рестрикционные карты, определена устойчивость к антибиотикам, определена молекулярная масса и копийность, определено наличие в геноме F-фактора.

Научная новизна исследования:

Данная работа является первой и единственной, посвященной изучению внехромосомных факторов инфекционной наследственности токсигенных штаммов Е. coli, выделенных от пушных зверей в зверохозяйствах РФ.

В ходе работы был проведен анализ плазмидных профилей и установлена локализация генов, кодирующих токсинообразование, изучены молекулярно-генетические характеристики плазмид, кодирующих

продукцию цитотонических токсинов (физическое строение, молекулярная масса, копийность) и установлена корреляция между копийностью и уровнем токсинообразования. Также изучена возможность горизонтального переноса генов токсинообразования в популяции энтеробактерий посредством конъюгации.

Практическая ценность работы:

В данной работе впервые изучены молекулярно-генетические особенности детерминант токсинообразования у энтеробактерий изолированных от пушных зверей в зверохозяйствах РФ.

Результаты диссертационных исследований могут служить методологической основой для создания комплекса диагностических и лечебно-профилактических средств для борьбы с токсикоинфекциями, обусловленными, энтеротоксигенными эшерихиями.

Материалы настоящего исследования могут быть использованы при написании методических рекомендаций, а также в лекционном курсе по микробиологии.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

Изучение молекулярно-генетические характеристик внехромосомных факторов наследственности, кодирующих токсинообразование у ЕТЕС.

Определение корреляции между копийностью токсигенных плазмид и уровнем продукции энтеротоксинов.

Исследование возможности горизонтального переноса генов токсинообразования посредством конъюгации в популяции энтеробактерий.

Апробация материалов диссертации:

Основные положения диссертации доложены:

-на II Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», - 2003;

-на 3-rd International Veterinary Vaccines and Diagnostics Conference -Toronto, Canada, - 2003;

-на международной научно-практической конференции "Ветеринарная медицина - 2004", Феодосия, - 2004;

-на межлабораторном совещании сотрудников ГНУ НИИПЗК, - 2004.

Публикации:

По результатам исследований опубликовано пять статей, отражающих основное содержание диссертации:

Объем и структура диссертации:

Диссертация выполнена в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Диссертационное исследование изложено на 126 страницах, содержит 8 таблиц и 5 рисунков. Список цитируемой литературы включает 175 источников,- в том числе 152 иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В ходе выполнения работы проанализировано 274 музейные штамма Е.соН. В настоящем исследовании использованы следующие методы: выделение плазмид с помощью щелочного лизиса, выделение высокомолекулярной плазмидной ДНК, выделение ДНК модифицированным методом Экхарда, проведение расщепления ДНК рестриктазами, электрофорез ДНК и др.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Анализ плазмидных профилей изучаемых штаммов.

Известно, что клинические изоляты штаммов Е.соН в ряде случаев способны в составе своего генома нести не одну, а несколько различных плазмид. По определению, такое сочетание (несколько плазмид в одном штамме) принято называть плазмидными комплексами. (Д.Г.Кудлай, 1969). Поскольку в задачи нашего исследования входило изучение ряда физико-химических характеристик токсигенных плазмид, таких, как молекулярный вес, копийность и т. д., нам следовало убедиться, что мы работаем с одной плазмидой, а не с их комплексом, так как в последнем случае результаты могли сильно варьировать и не соответствовать действительному положению

7

вещей. В связи с вышеизложенным, следующим этапом нашей работы стало определение плазмидных профилей токсигенных штаммов.

На рисунке 1 приведены результаты одного из опытов. Как видно из 14 проанализированных штаммов 4 № 121, 125, 114,126- несли по одной плазмиде со значительной молекулярной массой. 6 штаммов № 120,127,135, 24,17,136 как видно из приведенного рисунка несли 2 и более плазмид. Так штамм №127 содержал две плазмиды с подформами, а № 120 нес две плазмиды - одну тяжелую, и одну более легкую. Сложнее обстояли дела с №24. Судя по фотографии, он нес, как минимум, три плазмиды: одну большой массы, другую более легкую с подформами и совсем легкую

Рисунок 1. Электрофореграмма плазмидной ДНК выделенной "горячей щелочью"

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14

1-плазмидная ДНК штамма 120; 2 - 121; 3 - 127; 4 -125; 5 -128 (плазмидная ДНК отсутствует); 6-135; 7-114; 8-24; 9-126; 10- 17; 11-3 (плазмидная ДНК отсутствует); 12-136; 13-5 (плазмидная ДНК отсутствует); 14- 7 (плазмидная ДНК отсутствует )

. Большой интерес представлял штамм №17. В его составе находились две плазмиды с высокой молекулярной массой и одна более легкая. В штаммах № 3, 5, 7, 128, как видно из фореграммы, плазмидная ДНК не была обнаружена, что может объясняться либо элиминацией плазмидной ДНК при культивировании штаммов в абиотических условиях, либо изначальным отсутствием плазмид в этих изолятах. Таким образом, нами была проанализирована вся коллекция из 274 штаммов Е. coli изолированных от пушных зверей и других сельскохозяйственных животных. Результаты этого анализа приведены в таблице 1.

Таблица 1 Количественный анализ плазмид,

содержащихся в клинических изолятах E.coli

№ п./п. № штамма Количество № п./п. № штамма Количество

плазмид плазмид

1 3 2 23 121 1

2 6 3 24 122* 3

3 7 4 25 123 1

4 8 1 26 124 1

5 9 1 27 125 1

6 17 2 28 126 1

7 21 1 29 127 2

8 23 3 30 130 1

9 24 3 31 132 1

10 28 2 32 135 1

11 30 2 33 136 1

12 31 4 34 138 2

13 34 1 356 107 2

14 39 1 36 108 1

15 45 2 37 36 2

16 102 1 38 144 3

17 106 2 39 148 2

18 108 1 40 149 1

19 111 1 41 157 2

20 114 1 42 160 1

21 118 2 43 164 2

22 120 2 44 117 3

Как видно из приведенных в таблице данных, плазмидная ДНК была обнаружена у 44 штаммах. В случае 22 штаммов было показано наличие плазмидных комплексов, включавших в свой состав от 2 до 4 различных плазмид, из них по две плазмиды одновременно несли 10 штаммов, три - 6 штаммов и два штамма содержали плазмидные комплексы из 4 различных плазмид. Остальные 22 штамма в составе своего генома содержали по 1 плазмиде. Таким образом, из 274 изученных штаммов плазмиды содержали лишь 44. У остальных штаммов внехромосомную ДНК нами обнаружить не удалось.

3.2. Анализ обнаруженных плазмид на наличие генов токсинообразования.

На этом этапе исследования нам необходимо было осуществить анализ изучаемых плазмид на наличие в их составе генов токсинообразования. Оптимальным методом, в данном случае, несомненно, являлась цепная полимеразная реакция. Используя ранее синтезированные олигонуклеотидные праймеры для определения термолабильного (ЬТ) и двух термостабильных токсинов (вТа и БТЬ) мы обнаружили, что детерминанты токсинообразования имели плазмиды, выделенные из 27 штаммов, номера которых и спектр продуцируемых ими токсинов, приведены в таблице 2.

Таблица 2 Анализ токсигенности плазмид посредством ПЦР.

№ п./п. № штамма Количество плазмид в штамме Наличие генов токсинообразования:

ЬТ ЭТа БТЬ

1 2 3 4 5 6

1 34 1 + - -

2 36 2 + - -

3 39 1 + - -

4 45 2 + - -

5 102 1 - - +

6 106 2 - + -

1 2 3 4 5 6

7 108 1 + - -

8 111 1 + + +

9 114 1 + - -

10 117 3 - - +

11 118 2 + - +

12 120 2 + - -

13 121 1 + + +

14 123 1 + + +

15 124 1 - + -

16 125 1 + + +

17 126 1 - - +

18 130 1 + - +

19 135 1 - + -

20 136 1 + + -

21 144 3 + - -

22 148 2 - + -

23 149 1 - + +

24 157 2 + - -

25 160 1 - + +

26 164 2 - - +

27 168 1 - + +

Как видно из таблицы, большинство из штаммов было способно кодировать только 1 токсин ЬТ, БТа или БТЬ. Пять штаммов кодировали два, причем в случае штаммов 130, 136 и 168 гены обоих токсинов локализовались на 1 плазмиде. В четырех случаях штамм продуцировал все три цитотонические токсина. Во всех случаях гены токсинообразования находились на одной плазмиде.

Поскольку работа со штаммами, несущими плазмидные комплексы связаны с существенными трудностями, в частности, не возможно в наших условиях определить какая из плазмид комплекса несет гены токсинообразования, для дальнейшей работы мы отобрали лишь штаммы,

имеющие по одной плазмиде. Их характеристика приведена в таблице 3.

И

Таким образом, нами были отобраны для дальнейшей работы 16 токсигенных штаммов, 4 из которых продуцировали исключительно 1Л\ 2-вТа и 2- вТЬ. В четырех случаях штаммы были способны к продукции всех трех видов токсинов. Остальные штаммы продуцировали по два токсина в разных сочетаниях

Таблица 3 Характеристика штаммов Е.соН использованных в дальнейшей работе.

№ № Количество Токсины, кодируемые

п./п. штамма плазмид на клетку изучаемыми плазмидами

1 34 1 иг

2 39 1 иг

3 102 1 вть

4 108 1 иг

5 111 1 ЬТ, БТа, ЭТЬ

6 114 1 ЬТ

7 121 1 ЬТ, БТа, вТЬ

8 123 1 ЬТ, вТа, вТЬ

9 124 1 вТа

10 125 1 ЬТ, БТа, вТЬ

11 126 1 БТЬ

12 130 1 БТа, БТЬ

13 135 1 БТа

14 136 1 ЬТ, вТа

15 160 1 БТа, вТЬ

16 168 1 вТа, БТЬ

3.3. Рестрикционный анализ плазмид, кодирующих, токсинообразование.

В предварительных экспериментах было установлено, что провести рестрикционный анализ всех изученных плазмид, используя унифицированный набор ферментов, не представлялось возможным. Ряд плазмидных ДНК был недоступен для действия отдельных рестриктаз, либо

12

количество сайтов для этих ферментов было столь велико, что делало невозможным их идентификацию. В результате был определен ряд ферментов: EcoRl, Ес1136, Hindi 11, SalGl, Xhol, используя которые, нам удалось получить данные по физическому строению анализируемых плазмид. Для визуализации результатов, рестрикционные анализы мы использовали электрофорез в 1,0% агарозном геле.

Рисунок 2. Электрофореграмма рестрикционных фрагментов, полученных при обработке ДНК плазмид эндонуклеазой EcoRI

1 2 3 4 5 6 7 8

1- А ДНК/М1и, 2- ЕсоЯЬрестрикция штамма136, 3- 160, 4- 149, 5- 123, 6126,7- 34,8-А ДНК/ ЕсоЯ! /М1и

На рисунке 2 приведены результаты одного из таких опытов. На треках 1и 8 видны фрагменты ДНК с известной молекулярной массой полученной в результате обработки ДНК бактериофага X рестриктазой М1и1 (1 трек) и ЕсоЮ- М1и1 (8 трек). На треках 2-7 видны фрагменты, полученные путем обработки плазмид из штаммов №№ 136, 160, 149, 123, 126, 34 рестриктазой ЕсоШ. При их рассмотрении, становится очевидным, что все проанализированные в этом опыте плазмиды отличаются

оригинальными, не повторяющими друг друга наборами фрагментов. Сходная картина наблюдалась и при анализе остальных плазмид, ни одна из них не имела, по данным рестрикционного анализа, аналогичной структуры с другими анализируемыми плазмидами. Цифровые данные приведены в таблице 4.

Таблица 4 Молекулярная стру!сгура токсигенных

рестрикционных фрагментов

№ штамма Ресгриктазы Количество фрагментов Размер (мол.масса фрагментов) ю6д

121 ЕсоШ 9 31,7

45 6 31,4

136 8 33,5

123 8 40,7

149 5 16,0

164 7 37,2

161 7 39,2

141 8 41,1

148 11 51,7

80 -\\- 10 54,8

34 ШШ 16 27,4

108 А\- 12 31,7

¡26 -\\- 9 49,3

168 7 37,9

39 16 69,9

102 8 44,1

124 12 58,0

125 9 40,9

160 ХЬо1 7 48,3

57 5 38,3

117 4 25,6

36 БаЮ 8 21,8

135 3 9,79

151 5 27,4

106 Ес1136 2 15,6

111 4 39,9

114 4 29,0

130 9 50,3

3.4. Определение молекулярной массы плазмид.

Рисунок 3 График расчета молекулярной массы плазмид.

О

20

40

60

80

100 тт

Молекулярная масса была определена путем сравнения длины пробега фрагментов, образовавшихся в результате рестрикции изучаемых плазмид, и длины пробега фрагментов ДНК с известной молекулярной массой. С этой целью ДНК изучаемых плазмид, после рестрикции наносили на 1% агарозный гель одновременно с препаратами ДНК бактериофага X, у которых, в результате рестрикции образовался набор фрагментов известного размера. Измеряли расстояние, пройденное фрагментами ДНК изучаемых плазмид и маркерными фрагментами. Используя натуральный логарифм расстояний, определяли размер изучаемых фрагментов.

В ходе работы была определена корреляционная зависимость между:

а) расстоянием фрагментов, прошедших в электрофорезе (мм) и количеством пар нуклеотидов. Выражена она уравнением у(Ьас)=-227(мм)+18116, коэффициент достоверности г =-0,72.

б) расстоянием фрагментов, прошедших в электрофорезе (мм) и log(bac) коэффициент корреляции r=-0,93, а уравнение имеет вид: log(bac)=-0,017(мм)+4,385.

в) расстоянием фрагментов, прошедших в электрофорезе (мм) и ln(bac), коэффициент достоверности r=-0,95; ln y(bac)=-0,038(mm)+10,10

Следовательно, из выше изложенного, можно сделать вывод, что наиболее адекватно отвечает всем требованиям последнее уравнение, т. е. коэффициент г =-0,95 , графический вид именно в этом случае принимает линейный вид. Поэтому, в последующем, для расчетов молекулярной массы внехромосомных элементов исследуемых штаммов, нами выбрана математическая зависимость вида:

ln у (bac) = b х(мм)+ а

Определенные таким образом величины фрагментов, образовавшихся при рестрикции каждой из изучаемых плазмид суммировались, что в результате давало искомую величину - молекулярную массу плазмиды. Для большей достоверности, полученные результаты проверялись в аналогичной процедуре с использованием другой рестриктазы.

Как оказалось, молекулярная масса изучаемых, плазмид варьировала в широком диапазоне (от 9,8х106Д до 69,9х106Д). Наблюдаемая гетерогенность по молекулярной массе наряду со значительными различиями в первичной структуре ДНК, обнаруженные при рестрикционном анализе, позволяют предполагать отсутствие генетического родства между ними и как следствие их разное происхождение.

3.5. Определение копяйности изучаемых плазмид.

Копийность, наряду с молекулярной массой является одной из основных характеристик плазмид. Поэтому, следующей задачей нашего исследования было определение этого показателя. Число копий плазмиды обычно определяют как отношение числа молей плазмидной ДНК и числу молярных эквивалентов хромосомной ДНК. Наиболее распространенным методом определения числа копий плазмиды является радиоизотопный метод, основанный на высокоскоростном центрифугировании тотальных лизатов бактериальных клеток в градиенте плотности. Поскольку мы не располагаем возможностью работы с радиоактивными изотопами, этот метод, не смотря на его удобства, был неприемлем, и мы остановили свое внимание на возможности использования микроденситометрии фотонегативов, полученных при фотографировании агарозных гелей. Для этого нам необходимо было решить рад задач.

Первая из них - отработка методов лизиса бактериальных клеток, несущих исследуемую плазмиду непосредственно в лунках агарозного геля. Разработанный метод подробно описан в разделе «материалы и методы»

Далее необходимо было определить количество бактериальных клеток, которое позволяло бы получить оптимальную картину разделения плазмидной и хромосомной ДНК. С этой целью, используя метод серийных разведений, в лунки вносили различное количество бактериальных клеток от 106 до Ю10 кл/мл, после чего в лунки вносили лизирующую смесь с красителем и запаивали их расплавленной агарозой, как было описано выше. Оказалось, что оптимальным количеством материала в лунку является 5х108 кл/мл. Варьируя силу тока, напряженность электрического поля и время электрофоретического разделения мы смогли определить условия, обеспечивающие оптимальную картину, пригодную для микроденситометрии (рис. 4). На приведенной фотографии можно выделить несколько зон содержащих ДНК.

Рисунок 4 Электрофореграмма лизатов исследуемых штаммов.

'-♦"--Л S - " " >ШЩ~ 'г.\.7' •

1- соответствует плазмидной ДНК большой молекулярной массы превышающей или равной ЗОмД

2- зона соответствует хромосомной ДНК

3- зона содержит так называемую легкую плазмиду.

Для определения копийности плазмид, изображение геля с помощью системы "Umege scanner" фирмы "Литекс" (состоит из трансъиллюминатора с длиной волны излучаемого света Х=200 нм и аналоговой камеры фирмы "Samsung") выводили на экран компьютера и используя программу IQ рассчитывали интенсивность свечения каждого трека. Программа позволяла определить количество пикселей, необходимых на построение видимых полос и треков и количество пикселей фонового значения. Истинные значения получили путем выражения разницы значений полос с фоновыми значениями. Используя X ДНК известной концентрации в геле, количественное определение содержания ДНК в других треках. Полученные с помощью программы IQ данные мы использовали для получения численных отношений плазмидной ДНК к хромосомной, которые и использовали для вычисления числа копий плазмид по отношению к хромосомному эквиваленту, считая, что молекулярная масса хромосомной

ДНК Е. coli составляла 106 . Количество копий плазмид на клетку (Ср) рассчитывается по формуле:

Cp=Dp*Mc/(Dc*Mp)

Где:

Dp и De - значения интенсивности свечения плазмидной и хромосомной ДНК в геле,

Мр - молекулярный вес плазмиды,

Мс - молекулярный вес тотальной хромосомной ДНК.

Данные, полученные при определении копийности, приведены в таблице 5.

Таблица 5 Молекулярно-генетические характеристики плазмид, кодирующих, токсинообразование.

№ п/п Плазмиды Ферменты рестрикции Кол-во фрагментов Размер фрагментов (тыс. пар оснований) Мол. масса плазмид х106Д Кол-во копий на 1 кл.

1 2 3 4 5 6 7

1 р34 Hindlll 16 12004, 10322, 4514, 2668, 2128, 1698, 1461, 1358, 1081, 931, 742, 689, 593, 549,473,325 27,4 7

2 р39 Hindin 16 12693,11040,10060,9603, 9167, 8353, 7612, 6936, 6320, 5759, 4782, 3970, 3147,3004,1887,1567 69,9 1

3 р102 Hindlll 8 12693,11040,10060,9167, 7974,6936,5497,3434 44,1 6

4 р108 Hindlll 12 12004, 8884, 7646, 5250, 4514, 2475, 1974, 1698, 1356,867,742,593 31,7 11

5 pill Eel 136 4 21658, 15749, 12735, 10297 39,9 1

6 pi 14 Ecll36 4 21658, 12735,6055,3560 29,0 2

7 р121 EcoRI 9 11719, 5193, 5177, 5173, 5167, 5161, 5141, 3419, 2022 31,7 4

8 р123 EcoRI 8 11719, 10280, 8553, 7911, 6940,6248,5773,4184 40,7 2

9 р124 Hindin 12 12693,11566,10060,9167, 7612, 6736, 6320, 5759, 5248,4782,4357,3454 58,0 4

1 2 3 4 5 6 7

10 р125 Hindlll 9 9167, 8751, 7974, 7612, 6936, 6320, 6033, 5497, 3970 40,9 4

И р12б Hindlll 9 12693, 11566, 11040,9603, 8751, 6621, 5759, 5248, 3454 49,3 10

12 р130 Eel 136 9 12735, 11451, 10859, 10297, 9765, 7100, 6733, 4175,3036 50,3 5

13 р135 SalGI 3 12128,1490,1213 9,79 2

14 р136 EcoRI 8 11719, 9500, 8333, 7708, 5625,3328,2774,1728 33,5 20

15 р160 Xhol 7 15259, 14524, 13158,9311, 8435,6589,5969 48,8 8

16 р168 Hindlll 7 12004,11137,10322,7646, 6575,5250,4514 37,9 17

Как видно из таблицы, копийность tox-плазмид, как и их молекулярный вес варьировали в широких пределах. Однако большинство из них были низкокопийны и относились к группе так называемых со строгим контролем репликации. Только у трех из них р108, р136 и р168 количество копий на клетку было более 10. В таких опытах мы не обнаружили корреляции между числом копий и молекулярной массой изучаемых плазмид. Так плазмиды р39 с молекулярной массой 69,9 MD находилась в клетках несущего ее штамма в единственной копии. В то же время однокопийная плазмида pill обладала массой 39.9MD, а мультикопийная плазмида р136-массой 33,5.

Поскольку, в данном случае, мы имели дело с плазмидами в составе которых находились гены, кодирующие токсинообразование, логично было бы предположить, что копийность каким-то образом должна отразиться на уровне токсинообразования. Поэтому, следующим этапом нашего исследования стало изучение влияния дозы гена на уровень токсинообразования.

3.6. Изучение влияния дозы гена на уровень продукции токсинов.

Исходя из имеющихся в нашем распоряжении возможностей для изучения уровня продукции токсинов, мы вынуждены ограничиться двумя

методами. Реакцией двойной радиальной диффузной преципитации в агарозном геле по методу Ухтерлони, для определения уровня продукции термолабильного токсина и биопробой на мышах- сосунках для определения термостабильного токсина I типа (STa). Используемая для определения термостабильного токсина II типа модель с использованием 1 внутригастальной пробы на новорожденных поросятах была нам по

понятным причинам недоступна. Поскольку, подавляющая часть синтезируемого бактериальной клеткой термолабильного токсина локализована в периплазматическом пространстве, для его определения мы использовали грубые экстракты клеток токсигенных эшерихий, полученные посредством их обработки ультразвуком. В качестве положительного контроля мы использовали рекомбинантный штамм С600 несущий плазмиды pLT701 с клонированным elt опероном, продуцирующий термолабильный токсин человеческого типа. Копийность плазмиды pLT701 определена ранее ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия Ю.Е.Козловским и была равна 56 копиям на клетку. В качестве антигена использовали препараты IgG, полученные путем иммунизации кроликов очищенными препаратами LT.

Всего в этом опыте было изучено 9 клинических изолятов Е. coli, > продуцирующие, термолабильный токсин, причем копийность плазмид,

кодирующих токсинообразование колебалась в широких пределах от 1 до 20 t копий на клетку.

Таблица 6 Соотношение копийности плазмид с уровнем продукции токсинов

№ № Кол-во копий Тип Уровень продукции

п/п штамма плазмид на продуцируемого токсина

1 кл. токсина LT STa

1 2 3 4 5 6

1 34 7 LT 1:8 -

2 39 1 LT 1:2 -

3 102 6 STb н.о. н.о.

4 108 11 LT 1:16 -

1 2 3 4 5 6

5 111 1 LT, STa, STb 1:2 0,980

6 114 2 LT 1:2 -

7 121 4 LT, STa, STb 1:2 0,109

8 123 2 LT, STa, STb 1:2 0,100

9 124 4 STa - 0,107

10 125 4 LT, STa, STb 1:2 0,091

11 126 8 STb и.о. и.о.

12 130 5 STa, STb - 0,091

13 135 2 STa - 0,090

14 136 20 LT, STa 1:32 0,119

15 160 8 STa, STb - 0,090

16 168 17 STa, STb - 0,129

17 С600К- - - - 0,600

18 С600К* pLT701 56 LT 1:128 -

При рассмотрении данных, приведенных в таблице №8, становится очевидной положительная корреляция между количеством плазмид, содержащихся в клетке, и ее токсичностью. Так у штаммов № № 39, 111, 114, 121, 123, 125 содержащих токсигенные плазмиды в количестве 1- 4 копий, токсин обнаруживался лишь в минимальном разведении 1:2. У остальных 3 штаммов №№ 34,108 и 134 содержащих токсигенные плазмиды в количестве 7, 11 и 20 копий, токсин обнаруживался в разведении 1:8, 1:16 и 1:32 соответственно. Отсутствие разницы в продукции LT штаммами содержащими 1, 2 и 4 копии на клетку взаимосвязано как с недостаточной чувствительностью метода, так и с особенностью роста этих штаммов на жидких питательных средах.

Сходная картина наблюдалась и в случае с STa. Поскольку, термостабильные токсины эшерихий относятся к группе, так называемых, секретируемых белков и практически не обнаруживаются в клеточных лизатах, для определения уровня продукции термостабильного токсина I мы использовали освобожденную от клеток культуральную среду. Из таблицы 8

видно, что увеличение копийности плазмид от 1 до 17 копий на клетку также приводимого к увеличению выпота жидкости в просвет кишечника мышей-сосунков. Однако неоднозначность биологического метода тестирования делает невозможной более точной оценку эффекта дозы гена.

3.7. Изучение переноса генов токсинообразования между различными штаммами Е.соН в опытах по конъюгации.

Еще одной задачей, стоящей перед нами, было изучение возможности переноса генов токсинообразования между различными штаммами в популяциях Е.соН.

Как было показано рядом исследований, плазмиды, кодирующие, токсинообразование не обладают способностью к самостоятельному переносу в процессе конъюгации, но могут быть мобилизованы и перенесены посредством трансмиссивных плазмид, т.н. Р и II факторов.

Для обнаружения штаммов, обладающих такими факторами, мы проверили 274 штамма нашей коллекции на чувствительность к бактериофагу М13, специфическому к так называемым "мужским" штаммам кишечной палочки. В результате было установлено, что только 12 штаммов были чувствительны к этому фагу и имели в составе генома трансмиссивные плазмиды. Для удобства анализа коньюгационных скрещиваний необходимо было, чтобы как мобилизующие, так и мобилизуемые плазмиды обладали удобными селективными маркерами, позволяющими вести прямой отбор трансконьюгантов. Наиболее приемлемым в данном случае было использование признака антибиотикорезистентности. С этой целью мы провели анализ 12 обнаруженных Р+ и 16 токсигенных штаммов на устойчивость к 6 наиболее распространенным антибиотикам. В результате для дальнейшей работы нами были отобраны 2 Р+ штамма № 57 и 129 устойчивые к действию тетрациклина и стрептомицина соответственно. К сожалению, среди 16 токсигенных штаммов мы не обнаружили ни одного антибиотикорезистентного. Это заставило нас прибегнуть к маркированию токсигенных плазмид при помощи транспозона Тп5, сообщающего

23

устойчивость к канамицину. Таким образом, нами были помечены токсигенные плазмиды из штаммов № 39,111,123.

На следующем этапе мы осуществили так называемое триродительское коньюгационное скрещивание между F+ штаммами, штаммами несущими маркированные Тп5 токсигенные плазмиды и реципиентным штаммом, устойчивым к действию антибиотика рифампицина.

Как оказалось, перенос детерминант токсигенности в реципиентные штаммы осуществлялся с высокой частотой достигавшей lx 10'2 для плазмид из штаммов № 111 и 123. Наличие генов токсинообразования в штаммах трансконьюгантов посредством полимеразной цепной реакции.

Таким образом, бала подтверждена возможность горизонтального переноса генов токсинообразования между различными штаммами E.coli, что может служить одним из механизмов распространения генов токсинообразования в популяциях энтеробактерий.

4. ВЫВОДЫ

1.Проведенное нами изучение генетических детерминант токсинообразования у штаммов E.coli изолированных от пушных зверей, показало, что продукция всех трех известных цитотонических токсинов, связано с наличием в клетках токсигенных штаммов плазмид.

2.Изучение молекулярно-генетических особенностей этих плазмид, показало их гетерогенность как по молекулярной массе (от 9,8 до 69,9 kD), копийности (от 1 до 22 копий на клетку) и физическому строению, изученному посредством рестрикционного анализа, так и по спектру кодируемых ими токсинов. Такая их гетерогенность говорит о различном . происхождении и подтверждает транспозонную теорию их происхождения

3.Установлено, что копийность плазмид является одним из определяющих факторов уровня токсинообразования энтеротоксигенных штаммов E.coli, что связано с эффектом дозы гена.

4.Показана возможность переноса генов, кодирующих

токсинообразование между различными штаммами E.coli посредством

24

конъюгации, что может служить одним из механизмов их распространения в популяциях энтеробактерий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Серебряков С.Н., Барановская О.П., Матевосян К. ILL, Тихонова Н.Б., Плугина И. В., Ефимов Б. А., Козловский Ю. Е. Генетико-иммунологические особенности LT-подобных токсинов энтеробактерий./Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии. Сб. тр./ НИИ морфологии человека РАМН, - 2002, с. 100-102.

2. Козловский Ю. Е., Серебряков С.Н., Плугина И. В., Барановская О.П., Тихонова Н.Б. Анализ токсигенности штаммов энтеробактерий, изолированных в зверохозяйствах России.// Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, №3, - 2002, с. 44-46.

3. Kozlovsky Yu. Е., Plugina I. V., Baranovskaya О. P. Test-sistems on the basis of PCR for diagnostics of toxicoinfection of fur animals.//3-rd International Veterinary Vaccines and Diagnostics Conference./ Toronto, Canada,-2003, p. 107.

4. Плугина И. В., Барановская О.П., Серебряков С.Н., Козловский Ю. Е., Тинаева Е. А. Молекулярная диагностика токсикоинфекций.// II Московский международный Конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития 7 10-14 ноября 2003, с.256.

5.Плугина И. В., Барановская О.П., Матевосян К. ILL, . Серебряков С.Н., Козловский Ю. Е. ПЦР анализ для обнаружения токсигенной микрофлоры.// Международная научно- практическая конференция "Ветеринарная медицина - 2004" , Феодосия. Меж. тематический науч.

сборник, - 2004, с. 845.

Практические предложения

1, Материалы диссертационной работы могут быть использованы в научных целях, при составлении учебных и справочных пособий, чтении лекций и ведении лабораторных занятий по курсу микробиологии

2. Результаты проведенных исследований целесообразно использовать при создании диагностических и лечебно-профилактических средств для борьбы с токсикоинфекциями, обусловленными энтеротоксигенными эшерихиями.

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им Н.Н Блохина РАМН Подписано в печать 2 ? Ц. Ц 4 Заказ № ? 14. Тираж 100 экз

Щ

РНБ Русский фонд

2006-4

2574 12— 98 ©

i

t¡

í*

Актуальность темы:

Во многих районах земного шара острые диарейные заболевания до сих пор остаются нерешенной проблемой ветеринарии и медицины. Они являются причиной высокой смертности у людей, сельскохозяйственных животных, в том числе и пушных зверей. При этом большинство вспышек токсикоинфекций обусловлено энтеротоксигенными штаммами Е. coli (ЕТЕС), которые продуцируют токсины, вызывающие диарейный синдром.

В большинстве случаев жертвами токсикоинфекции становятся дети младшего возраста и молодняк сельскохозяйственных животных. По данным ВОЗ, из 1млрд. ежегодно заболевающих детей умирает более 3-х млн.

Серьезную проблему представляют диареи, вызываемые ЕТЕС и в сельском хозяйстве; так даже в хорошо налаженных свиноводческих хозяйствах США от 2,5 до 5% новорожденных поросят погибают от диарейного токсикоза.

В отечественном пушном звероводстве токсикоинфекции являются основной причиной дорегистрационного отхода новорожденных щенков и гибель молодняка в период отсадки.

Многочисленными исследованиями было установлено, что ведущую роль в патогенезе диарейных заболеваний играют так называемые цитотонические токсины: термолабильный (LT) и термостабильные (STI, STII).

Этот факт, по-видимому, явился причиной своеобразного перекоса в их изучении, так как длительное время основное внимание уделялось изучению химической структуры самых токсинов и различных аспектов их взаимодействия с макроорганизмом. Значительно меньше освещены вопросы, связанные с изучением структуры и локализации кодирующих их генов. Первые же работы в этом направлении показали большое сходство как в строении самих токсинов, продуцируемых таксономически отдаленными группами микроорганизмов, так и в первичной структуре их генов (Смирнов, 1984). Было установлено, что в большинстве случаев гены, кодирующие токсинообразование, локализованы на плазмидах -внехромосомных генетических элементах, способных к автономной репликации с варьирующими размерами и числом копий. Однако имеющиеся данные о таких плазмидах носят далеко не полный характер и относятся в основном к плазмидам, изолированным из штаммов, выделенных от людей. Значительно меньше изучены плазмиды, кодирующие токсинообразование в штаммах, ведущих происхождение от сельскохозяйственных животных, и полностью отсутствуют данные о генетических детерминантах токсигенности штаммов, поражающих пушных зверей.

Наблюдаемое в последние 10-15 лет бурное развитие биотехнологии и генной инженерии дает возможность не только изучения, но и использования генетических детерминант токсигенности при создании диагностических и лечебно-профилактических препаратов.

Исходя из вышесказанного, изучение генетических детерминант токсинообразования в штаммах, изолированных из патологического материала, полученного от пушных зверей, представляется весьма актуальными своевременным.

Цель исследования:

Целью нашей работы стало изучение генетических детерминант токсинообразования, их физико-химических и молекулярно-генетических свойств у штаммов эшерихий, изолированных от пушных зверей.

Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить наличие внехромосомных элементов в клетках токсигенных штаммов, изолированных от пушных зверей.

2. Изучить плазмидные профили токсигенных штаммов и локализовать гены, кодирующие токсинообразование.

3. Провести анализ молекулярно-генетических характеристик плазмид, кодирующих токсинообразование, и определить: а) физическое строение; б) молекулярную массу; в) копийность.

4. Установить наличие корреляции между копийностью плазмид и уровнем токсинообразования.

5. Изучить возможность горизонтального переноса генов токсинообразования в популяции энтеробактерий посредством конъюгации.

Объектом исследования являлась коллекция штаммов энтеробактерий, выделенная из патологического материала, полученного от пушных зверей. Была выделена плазмидная ДНК, проведен анализ плазмидных профилей, установлены пггаммы, содержащие tox-плазмиды, получены рестрикционные карты, определена устойчивость к антибиотикам, определена молекулярная масса и копийность, определено наличие в геноме F-фактора.

Научная новизна исследования:

В представленной работе впервые изучены молекулярно-генетические особенности детерминант токсинообразования у энтеробактерий, изолированных от пушных зверей в зверохозяйствах РФ.

Данная работа является одной из первых, посвященной изучению внехромосомных факторов инфекционной наследственности токсигенных штаммов Е. coli, выделенных от пушных зверей в зверохозяйствах РФ.

В ходе работы был проведен анализ плазмидных профилей и установлена локализация генов, кодирующих токсинообразование, изучены молекулярно-генетические характеристики плазмид, кодирующих продукцию цитотонических токсинов (физическое строение, молекулярная масса, копийность) и установлена корреляция между копийностыо и уровнем токсинообразования. Также изучена возможность горизонтального переноса генов токсинообразования в популяции энтеробактерий посредством конъюгации.

Практическая ценность работы:

Результаты диссертационных исследований могут служить методологической основой для создания комплекса диагностических и лечебно-профилактических средств для борьбы с токсикоинфекциями, обусловленными энтеротоксигенными эшерихиями.

Материалы настоящего исследования могут быть использованы при написании методических рекомендаций, а также в лекционном курсе по микробиологии.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

Изучение молекулярно-генетических характеристик внехромосомных факторов наследственности, кодирующих токсинообразование у ЕТЕС.

Определение корреляции между копийностыо токсигенных плазмид и уровнем продукции энтеротоксинов.

Исследование возможности горизонтального переноса генов токсинообразования посредством конъюгации в популяции энтеробактерий.

6. Выводы

1 .Проведенное нами изучение генетических детерминант токсинообразования у штаммов E.coli, изолированных от пушных зверей, показало, что продукция всех трех известных цитотонических токсинов связано с наличием в клетках токсигенных штаммов плазмид.

2.Изучение молекулярно-генетических особенностей этих плазмид показало их гетерогенность как по молекулярной массе (от 9,8 до 69,9 MD), копийности (от 1 до 22 копий на клетку) и физическому строению, изученному посредством рестрикционного анализа, так и по спектру кодируемых ими токсинов. Такая их гетерогенность говорит о различном происхождении и подтверждает транспозонную теорию плазмид.

3.Установлено, что копийность плазмид является одним из определяющих факторов уровня токсинообразования энтеротоксигенных штаммов E.coli, что связано с эффектом дозы гена.

4.Показана возможность переноса генов, кодирующих токсинообразование между различными штаммами E.coli, посредством конъюгации, что может служить одним из механизмов их распространения в популяциях энтеробактерий.

7. Практические предложения

1. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в научных целях, при составлении учебных и справочных пособий, чтении лекций и ведении лабораторных занятий по курсу микробиологии.

2. Результаты проведенных исследований целесообразно использовать при создании диагностических и лечебно-профилактических средств для борьбы с токсикоинфекциями, обусловленными энтеротоксигенными эшерихиями.