Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Роль аллельной вариабельности генов цитокинов в формировании резистентности крупного рогатого скота к лейкозу
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 16.00.03
Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Роль аллельной вариабельности генов цитокинов в формировании резистентности крупного рогатого скота к лейкозу
На правах рукописи
ЧИЧИНИНА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА
РОЛЬ АЛЛЕЛЫЮЙ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ В ФОРМИРОВАНИИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА К ЛЕЙКОЗУ
16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология; 03.00.23 - биотехнология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Новосибирск - 2005
Работа выполнена в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН и государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор
Храмцов Виктор Викторович,
доктор биологических наук, старший научный сотрудник Белявская Валентина Александровна
Официальные оппоненты:
доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник Глотов Александр Гаврилович,
кандидат биологических наук Шестопалов Александр Михайлович
Ведущая организация:
Новосибирский государственный аграрный университет
Защита состоится « » ¿¿^¿¿^ 2005 г. в
ч. на заседании
диссертационного совета Д. 006.045.01 в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский р-н, п. Красно-обск, ИЭВСиДВ
С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН Автореферат разослан « ЛРу> а^у^г^М 2005г.
Ученый секретарь диссертационного совета
С.И. Логинов
6553
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. К числу широко распространенных хронических вирусных заболеваний, ежегодно наносящих ощутимый ущерб животноводческим хозяйствам, относится лейкоз крупного рогатого скота (Т.П. Кудрявцева, 1980; В.М. Нахмансон, 1980, 1986; В.П. Шишков, 1986; В.Н. Сюрин и соавт., 1998; М.И. Гулюкин и со-авт., 1999).
Рост показателей заболеваемости, экономические издержки и социальная значимость проблемы определяют необходимость поиска новых, эффективных подходов решению проблемы отбора и производства крупного рогатого скота с пониженной восприимчивостью к данной инфекции (А.Б. Прохватилова и соавт., 1998; JI.K. Эрнст и соавт., 1998, 2000; Б.Г. Орлякин и соавт., 2000; М.И. Гулюкин и соавт., 2002).
В настоящее время перспективным и своевременным является выяснение механизмов генетической резистентности к инфекционным заболеваниям в популяции сельскохозяйственных животных. Наиболее информативным представляется метод, основанный на анализе ассоциаций между полиморфизмом генов-кандидатов и характерных фенотипических проявлений у животного с использованием однонуклеотидных полиморфных маркеров (ОНП) (W.M. Grosse 1999; M P. Heaton et al., 1999, 2001; H. Zimdahl et al., 2004; K. Zhang et al., 2004).
На сегодняшний день гены, кодирующие наиболее важные белки и участвующие в реакции организма на внедрение инфекционных агентов у разных видов млекопитающих, могут вызывать изменения клинической картины и исходов инфекционного процесса (С. Симбирцев, 1999; И.С. Фрейдлин и соавт., 1999; H.H. Носик, 2000; В.И. Коненков и соавт., 2002; R.G. Keefe et al., 1997; F. Altere et al., 1998; J.C. Knight et al., 1999; T. Krakauer et al., 1999; H. Shin et al., 2000; S.J.H. Van Deventer et al., 2000; B.R. Lane et al., 2001; K. Ozaki et al., 2002).
Во многих научных центрах мира ведется интенсивный поиск различных вариантов генов, разрабатываются конкретные приемы, позволяющие предотвратить распространение среди животных болезней, наследуемых генетически, и повысить эффективность селекции. 1 ■ " —
юс. национальная БИБЛИОТЕКА
В организме восприимчивого животного хронически перси-стирующий вирус может претерпевать мутационные изменения, направленные на увеличение патогенности и преодоление защитных сил организма. Поэтому, наряду с генетическим статусом хозяина необходимо изучать и генетическую изменчивость самого патогена (L. Willems et al., 1993, 1995; Н. Fechner et al., 1997; M. Licursi et al., 2002).
Изучение полиморфизма генов хозяина и патогена в их комбинациях на уровне индивидуальных геномов открывает новые возможности в понимании молекулярно-генетических механизмов развития патологий.
Цель работы: изучить полиморфизм некоторых генов цитоки-новой сети в связи с предрасположенностью крупного рогатого скота к лейкозу и оценить влияние на полиморфизм различных факторов, включая генотипы вируса лейкоза. Задачи исследований:
1. Сформировать группы животных и создать панель ДНК для дальнейшего выявления и изучения молекулярно-генетических маркеров, отвечающих за резистентность к лейкозу.
2. Оптимизировать условия постановки методов для ОНИ - гено-типирования (постановка локус-специфической ПЦР, AS-ПЦР, ПДРФ).
3. Идентифицировать вариабельность цитокиновых и функционально связанных с ними генов в популяции крупного рогатого скота (GROX(2), GR03, IL8R, iNOS2).
4. Охарактеризовать группы животных, отличающиеся степенью предрасположенности к инфицированию вирусом лейкоза в популяциях различных пород крупного рогатого скота, по разнообразию аллелей и их частотам.
5. Изучить гетерогенность популяции и ассоциации полиморфных вариантов исследуемых генов с вариантами генетического полиморфизма вируса лейкоза крупного рогатого скота. Научная новизна работы. В результате проведенных исследований получены новые данные, свидетельствующие о влиянии полиморфных вариантов генов цитокиновой сети на предрасположенность к лейкозу крупного рогатого скота. Впервые в Р.Ф. получены данные о характере распределения ОНП - маркеров в зависимости от породной принадлежносрг крупного рогатого скота.
■ 14 а«.- .» „ ^ '»< ЯП f .
Проведено генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота и изучена взаимосвязь полиморфизма ключевых генов цитоки-нов хозяина с генетическим полиморфизмом патогена.
Практическое значение работы. Результаты исследований использованы при разработке методических рекомендаций «Выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью полиме-разной цепной реакции (ПЦР)», утвержденных ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол № 4 от 17.07.04г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 15 от 17.07.04г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Оптимальные условия постановки методов для ОНП - генотипи-рования (постановка локус-специфической ПЦР, АБ-ПЦР, ПДРФ) генов цитокиновой сети (С1ЮХ(2), ОЯОЗ, 1Ь8Я, ¡N082).
2. Результаты анализа ассоциаций изученных полиморфных вариантов с породной принадлежностью и степенью предрасположенности к инфицированию вирусом лейкоза в популяции крупного рогатого скота.
3. Степень гетерогенности популяции вируса лейкоза крупного рогатого скота.
4. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов исследуемых генов с вариантами генетического полиморфизма вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья с-х. животных» (Ставрополь, 2003); международном конгрессе «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (Кара-Даг, Феодосия, 2003); международной научно-практической конференции НГАУ «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2004); международной научной конференции «Современные проблемы эпизоотологии» (Новосибирск, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 111 страницах и состоит из введения, обзора литературы,
заключения по обзору литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 19 рисунками. Список использованной литературы включает 192 источника, в том числе 101 зарубежный.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работа выполнена на базе лаборатории лейкозов ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН и Института биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор» в 20012004 гг.
Объектом исследования являлся крупный рогатый скот распространенных пород (симментальской, красной степной, черно-пестрой голштинизированной с разной долей голштинизации), принадлежащий хозяйствам Новосибирской области и отличающийся по литературным данным различиями в генетической восприимчивости к лейкозу.
Предмет исследования составляли пробы крови и сыворотки крови, инфицированных ВЛКРС, больных лейкозом и интактных животных, а также ДНК, гены цитокиновой сети (GR02(X), GR03, DL8R, iNOS2).
Всего исследовано 8 полиморфных вариантов четырех генов-кандидатов: 4 ОНП гена, кодирующего белок GR02(X) (АНЗ-1, АНЗ-2, АНЗ-З, АНЗ-5); 2 полиморфных варианта гена, кодирующего белок IL8R (АН6-1, АН6-2); полиморфизм гена белка iNOS2 (АН13-1) и полиморфизм АН5-3 гена белка GR03.
Диагностические исследования крупного рогатого скота на лейкоз и инфекцию ВЛКРС проводили в соответствии с Методическими указаниями по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, утвержденными ДВ МСХ РФ (М, 2000).
Препараты ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови по методу К Смита и соавт (1990) с небольшими модификациями.
Генотипирование осуществляли с помощью ПДРФ-анализа продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и соответствующие ферменты рестрикции Для амплификации использовали прибор Eppendorf "Mastercycler Gradient".
Олигонуклеотидные праймеры синтезировали с помощью компьютерной программы Oligo version 3.0 на автоматическом синтезаторе ASM 102 (фирма «Биосет»). Структуру праймеров выбирали из базы данных ДНК последовательностей, представленных в National Center for Biotechnology Information databases. Структуру локус-специфических фрагментов ДНК анализируемых генов выбирали из Genbank database: accession nos.: GROX(2) (AF140660-64); GR03 (AF140644-47); iNOS2 (AF465168); IL8R (AF140648-52).
Структура олигонуклеотидных праймеров для изучения области gp51 гена env BJTKPC взята из статьи М. Licursi et al. (2002).
Все ампликоны (по 5-10 мкл от пробы) анализировали с помощью электрофореза в 4% полиакриламидном (вертикальный) или в 1,5-2 % агарозном (горизонтальный) геле (AGAROSE, ICN Biomedicals inc) с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия с концентрацией 1 мг/мл (Т. Маниатис и соавт., 1984). В качестве маркера молекулярного веса использовали 100 bp («СибЭн-зим» г. Новосибирск).
Рестрикционный анализ (ПДРФ) проводили в стандартных условиях (Т. Маниатис и соавт., 1984). Продукты рестрикции анализировали электрофоретически в 6-8% полиакриламидном или 1,5-2 % агарозном геле и тестировали в УФ-свете с помощью прибора УФ -трансиллюминатора УВТ-1 («Biokom», г. Москва).
Для проведения производственных экспериментов была подвергнута лабораторным исследованиям 121 проба крови и сыворотки от крупного рогатого скота, в том числе: серологически - 121; гематологически - 57; выделению геномной ДНК - 121; локус-специфической ПЦР - 121; ПДРФ гена GR02(X) - 97, гена IL8R (АН6-1) - 121, гена IL8R (АН6-2) - 115; AS-ПЦР гена iNOS2 - 104, гена GR03 - 108; генотипированию BJTKPC - 62.
Для сравнения частот встречаемости аллелей и генотипов между различными группами использовали критерий X2 Фишера с помощью компьютерной программы Statistica v. 6.0. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие ожидаемым при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ).
Для изучения ассоциаций полиморфных вариантов исследуемых генов с вариантами генетического полиморфизма вируса лейкоза крупного рогатого скота были взяты дополнительные данные о распределении ОНП в изучаемых генах от животных (59 голов), инфици-
рованных вирусом лейкоза крупного рогатого скота первого генотипа. Данные взяты из отчета по гранту МНТЦ 1883 ГНЦ ВБ «Вектор».
Диссертант и научные руководители выражают благодарность сотрудникам Института биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор» за оказанную помощь в работе.
2.1 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Постановка методов и оптимизация условий для ОНП - генотипирования
Идентификация ОНП - маркеров в генах цитокиновой сети у различных пород КРС мясного и мясомолочного направления была проведена ранее американскими учеными (W.M. Grosse, 1999; М.Р. Heaton, 2000, 2001). В многочисленных экспериментах показана вовлеченность этих генов в ключевые процессы иммунитета как у человека, так и КРС, которые могут быть использованы для анализа ассоциаций с заболеваниями. Всего было идентифицировано 55 ОНП - маркеров в ДНК - фрагментах девяти цитокиновых генов (М Р. Heaton, 2001).
Выбор известных ОНП для анализа в настоящей работе проводили исходя из критерия контрастности значений их информативности (табл. 1). Выбранные ОНП показали высокую степень вариабельности, имели последовательность, совпадающую с сайтами рестрикции доступных рестриктаз. Кроме того, принималось во внимание потенциальная вовлеченность их белковых продуктов в патологические процессы, вызываемые вирусными, в частности ретровирусными инфекциями (H.H. Носик, 2000; В.И. Коненков и соавт., 2002; R.G. Keefe et al., 1997; Н. Shin et al., 2000; В. Homey et al., 2002).
Для повышения производительности анализа по временным и ресурсным показателям с целью экономии геномной ДНК, а также благодаря высокой плотности распределения ОНП - маркеров на анализируемых локусах, генотипирование проводили в две стадии. Первая стадия была общей, и ампликон, полученный в этой стадии, мог быть использован для оценки нескольких ОНП во второй стадии двумя методами, как ПДРФ, так и аллель-специфической ПЦР (AS-ПЦР).
Таблица 1 - Гены цитокиновой сети
Локус Семейст- Ориентация Последовательность Фрагмент Маркер
во праимера ампликона
етЮ2(Х) хемокин прямой 5'-СССАТСОТТААСААААТСАТС-3' 451
обратный 5' -ССС ААСАСТТТТАССТСТСА-З'
ОЮЗ хемокин прямой 5'-СССАТСОТТААСААААТСАТСС АТ-3' 409
обратный 5'- ААТСОАСАТСАСТТТОСОТАААСТ-З'
1Ь8Л хемокин прямой 5'-АСОСАС<ЗСТСАСССАОАА-3' 523
рецептор обратный 5'-САОСАСТСССТООСОАААСТ-3' 114082 цитокин прямой 5-ТСТССАСАСАССТСССТТАТС-З' 425 __обратный 5 - СОООТССОТАТОАТСАОСАОТО-З'_
Таблица 2 - Олигонуклеотидные праймеры для АБ-ПЦР
Локус Полиморфный маркер Ориентация праймера Последовательность Фрагмент ампликона
ПМСШ АН13-1 прямой прямой обратный общий 5' 5' 5' АССГГСССТТСТТС АОвС АОТС-З' АССГГСОСТТСТТС АвОС АСГТ-З' -СОССТССОТАТОАТСАССАОТС-З' 245
СЯОЗ АН5-3 прямой 5' -ААТСТСЮОТТАААСТССТТТСАТТ 3' 160
прямой 5' -ААТСТСССТТАААСТССТТТСАТС ■3'
обратный 5' -ААТСХ}АСАТСАОТТГССОТАААСТ -3'
общий
АНЗ-1, АНЗ-2 АНЗ-З, АНЗ-5 АН5-3
АН6-1, АН6-2
АН13-1
> INOS2
При изучении гена ¡NOS2 для получения общего ампликона синтезировали фрагмент длиной 425 п.н., содержащий 3 полиморфных маркера АН13-1, АН13-2, АН13-3 в третьем интроне. Нами был изучен маркер АН 13-1 как наиболее информативный.
Постановку локус-специфической ПЦР поводили с 30 циклами. Температуру отжига (65 °С) подобрали опытным путем. Компьютерный анализ не выявил рестриктаз, сайты рестрикции которых совпадали с исследуемым ОНП данного гена. Для анализа ОНП была осуществлена постановка метода AS-ПЦР. Синтезировали фрагмент длиной 245 п.н.
Реакцию проводили параллельно с каждым из праймеров при оптимальных условиях (Т отж = 67,5°С) в паре с локус-специфическим праймером (табл. 2).
В процессе постановки реакций были подобраны условия с минимальным проведением циклов (7). В результате были устранены ложноположительные гетерозиготы.
Таким образом, оптимизацией AS-ПЦР по количеству циклов было достигнуто улучшение качества генотипирования при одновременном уменьшении времени амплификации.
> GR03
У крупного рогатого скота в гене хемокина GR03 обнаружены 3 ОНП (АН5-1, АН5-2, АН5-3) в третьем интроне вблизи укороченного фрагмента элемента SINE, сходного с Bov-2 (J.A. Lenstra et al., 1993). Нами изучен маркер АН5-3. С помощью температурного градиента подобрали температуру отжига (60°С) для проведения локус-специфической ПЦР с 30 циклами.
Для анализа ОНП была осуществлена постановка метода AS-ПЦР. Синтезировали фрагмент длиной 160 п.н. Реакцию проводили параллельно с каждым из праймеров при оптимальных условиях (Т отж = 53,7°С) в паре с локус-специфическим праймером с 20 циклами (табл. 2).
> GR02(X)
Семейство GRO - гены - хемокины, расположенные на хромосоме ВТА 6 (S.M. Kappes et al., 1997). Тесно сцеплены с другими генами хемокинов IL8 и ECIP. Гены этого семейства имеют значительную гомологию, и каждый имеет по нескольку псевдогенов. Уникальные последовательности для анализа ОНП были выбраны с учетом этой особенности (М.Р. Heaton, 1999). При изучении гена GR02(X) синтезировали фрагмент, содержащий 6 сайтов полимор-
физма в третьем интроне с плотностью 1 ОНП на 83 н.п. (АНЗ-1 -АНЗ-6). Нами изучены четыре полиморфных маркера (АНЗ-1, АНЗ-2, АНЗ-З, АНЗ-5) как наиболее информативные.
Для получения общего ампликона провели амплификацию (35 циклов) с оптимальной температурой отжига 56 °С, которую подобрали опытным путем.
Гидролиз фрагмента гена белка GR02(X) эндонуклеазами рестрикции проводили в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл ампликона, эндонуклеазу рестрикции - 10 ед. активности фермента (0,5 мкл), сответствующий буферный раствор (1 мкл) и бидистилиро-ванную воду (8,5 мкл). С рестриктазами Hinfl, MspR9I, Vspl реакцию инкубировали при 37°С в течение 1,5 часов, с Sse9I - при 55°С в течение часа. В табл. 3 представлены фрагменты, ожидаемые при проведении анализа ампликона GR02(X) по методу ПДРФ.
В нашем исследовании ПДРФ - анализ по маркерам АНЗ-1,3,5 соответствовал ожидаемым результатам. При анализе маркера АНЗ-2 оказалось, что все анализируемые варианты являются гомозиготными по Б - аллелю. Другие варианты не обнаружены. Таким образом, полиморфизм по данному маркеру в изучаемой группе животных отсутствует.
> IL8RB
Рецепторы гена интерлейкина А и В (CXCR1 и CXCR2 соответственно) - два различных рецептора, содержащих 7 трансмембранных доменов, сопряженных с G - белком. Рецепторы взаимодействуют с различными СХС хемокинами, индуцируя хемотаксис и миграцию иммунокомпетентных клеток (P.M. Murphy, 1997). У человека и КРС гены обоих рецепторов и нескольких псевдогенов расположены на хромосоме 2 (W.E. Holmes et al., 1991; W.M. Grosse et al., 1999).
В ампликоне 523 н.п. экзона 3 гена IL8RB обнаружены три ОНП. Нами изучены маркеры АН6-1, АН6-2 как наиболее информативные.
Подобрали оптимальную температуру отжига праймеров (63,3°С), используемых для проведения локус-специфической ПЦР (табл. 1). Реакцию проводили с 30 циклами.
Гидролиз фрагмента гена белка IL8R с рестриктазой Mspl проводили в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл амплифици-рованной ДНК, 15 ед. эндонуклеазы рестрикции (0,5 мкл), соответствующего буферного раствора (1 мкл) и бидистиллированной воды. Инкубировали при температуре 37°С в течение 2 часов. Гидролиз с рестриктазой Kzo91 проводили в 30 мкл реакционной смеси, содер-
жащей 10 мкл амплифицированной ДНК, 1,5 ед. эндонуклеазы рестрикции (1,5 мкл), соответствующего буферного раствора (2 мкл) и бидистиллированной воды. Смесь помещали в термостат на 12 часов при температуре 37°С.
Таблица 3 - Фрагменты, ожидаемые при гидролизе ампликонов генов СЯ02(Х) и 1Ь8Я
Локус Полиморфный Гапло- Рестрик- Ожидаемые
маркер тип ампликона таза фрагменты, п н (по метолу ПДРФ)
GR02(X) АНЗ-1 Т-тип Hmfl 272, 148, 31
(ОАСТА-К-АСТСА) G-тип Hinfl 201, 148,71,31
АНЗ-2 С-тип Sse9I 155,296
(ААССТ-М-АТТАЮ А-тип Sse9I 155, 280, 16
АНЗ-З G-тип Vspl 451
(МАТТА-Ы-ТСССС) А-тип Vspl 174, 277
АНЗ-5 С-тип MspR9I 268, 183
(СТССТ-8-ССТСТ) G-тип MspR9I 221, 183,47
IL8R АН6-1 А-тип Sau3Al 378, 78, 67
(СТОАТ-М-ОУКОА) С-тип Sau3Al 291, 87, 78, 67
АН6-2 А-тип Hpall 426, 97
(АвСАС-М-ССССС) С-тип Hpall 287,139, 97
Примечание фермент Мчр1 (изошизомер Нра II) и Кго91 (изошизомер 5аиЗА1)
В табл. 3 представлены фрагменты, ожидаемые при проведении анализа ампликона 1Ь8Я по методу ПДРФ. В нашем исследовании ПДРФ - анализ по маркерам АН6-1 и АН6-2 соответствовал ожидаемым результатам.
2.2.2. Оценка вариабельности генов цитокиновой сети в популяциях крупного рогатого скота
При проведении ОНП - генотипирования оказалось, что геномы исследуемых животных отличаются вариабельностью, причем степень вариабельности зависит от нескольких факторов: анализируемого локуса и ОНП - маркера; породной принадлежности и кровно-сти; степени восприимчивости к инфекции ВЛКРС.
Для оценки функциональной значимости изучаемых ОНП - маркеров подсчитаны частоты встречаемости аллелей и генотипов данных генов.
Принимая во внимание литературные данные о межпородных различиях в степени восприимчивости к лейкозу, провели оценку влияния породной принадлежности на распределение полиморфных вариантов.
2.2.2.1. Влияние породной принадлежности на распределение частот встречаемости аллелей и генотипов
Распределение частот встречаемости аллелей и генотипов в анализируемых генах у крупного рогатого скота, отличающегося породной принадлежностью, представлено в табл. 4, из которой видно, что в гене, кодирующем белок GR02(X) у всех четырех пород наблюдается снижение частого аллеля А. Его доля в 1,3 раза у черно-пестрой голштинизированной породы (кровность 7/8) и в 2,4 раза у остальных пород ниже содержания аллеля Б. Среди генотипов менее распространен гомозиготный вариант АА. Статистически значимые различия выявлены между животными черно-пестрой голштинизированной (кровность 7/8) и красной степной породы (Р<0,05).
В гене GR03, в отличие от GROX(2), преобладает аллель А и гомозиготный вариант АА. Выявлены различия как по частоте встречаемости аллелей (Р<0,01), так и по частоте встречаемости генотипов (Р<0,05) между животными черно-пестрой голштинизированной (кровность 1 /2) и красной степной породы.
В гене IL8R (АН6-1) наблюдается незначительное увеличение аллеля А. Его доля в 1,7 раза у красной степной и в 1,2 раза у черно-пестрой голштинизированной (кровность 1/2) превышает содержание аллеля Б. Среди генотипов преобладает гетерозиготный вариант АБ. В маркере АН6-2 гена белка IL8R, в отличие от АН6-1, отмечено значительное увеличение аллеля А и гомозиготы АА. Выявлены статистически значимые различия между группами животных черно-пестрой породы с разной степенью голштинизации (Р<0,05).
В гене ¡NOS2 аллель А преобладает у животных трех пород: черно-пестрая голштинизированная (7/8), симментальской и красной степной. В популяции черно-пестрой голштинизированной породы (кровность 1/2) присутствует незначительное увеличение аллеля Б. Такое же распределение отмечено и среди генотипов. Статистически значимые различия выявлены между популяциями крупного рогатого скота черно-пестрой голштинизированной породы с разной степенью кровности по
гомозиготе А А (Р<0,01) и по гомозиготе ББ (Р<0,05), между животными красной степной и симментальской породы (Р<0,05), между группами черно-пестрой (кровность 1/2) и красной степной пород по гомозиготе АА (Р<0,001) и гомозиготному варианту ББ (Р<0,05).
Таблица 4 - Распределение частот встречаемости аллелей и генотипов в генах в связи с породной принадлежностью
Ген N Порода Аллель Генотип
(маркер) животных А В АА АБ ББ
28 Черно-пестрая голшт (кров 7/8)0,43 0,57 0,18*
21 Черно-пестрая голшт (кров. Vi) 0,29 0,71 0,04
23 Симментальская 0,30 0,70 0,09
25 Красная степная 0,30 0,70 0,01*
21 Черно-пестрая голшт (кров 7/8)0,95 0,05 0,90
31 Черно-пестрая голшт (кров Vi) 0,98** 0,02** 0,97*
27 Симментальская 0,95 0,05 0,93
26 Красная степная 0,88** 0,12** 0,77*
30 Симментальская 30 Красная степная
0,50 0,48 0,43 0,60
0,10 0,03* 0,07 0,23*
26 Симментальская 30 Красная степная
25 Симментальская 27 Красная степная
0,32 0,48 0,48 0,40
(кров 7/8)0,60 0,40 0,20 0,80 -
(кров Vi) 0,54 0,45 0,13 0,87 -
0,58 0,42 0,17 0,83 -
0,63 0,37 0,27 0,73 -
(кров 7/8)0,95 0,05 0,90* 0,10*
(кров Vi) 0,84 0,16 0,69* 0,3 И -
0,93 0,06 0,88 0,12 -
0,85 0,15 0,70 0,30 -
(кров 7/8)0,77* 0,23 0,67# 0,20 0,13*
(кров Vi) 0,48* 0,52# 0,33#л 0,29 ож
0,60 0,40* 0,52* 0,16 0,32
0,86 0,14*# 0,82* Л 0,07 0,11*
Примечание N - число исследованных животных, А - частый аллель Б - редкий аллель (М НеаШп е! а1 , 2001) Сравнительное распределение частот варечаемости
аллелей и генотипов **Р<0,01, л- Р<0,001
в группах проведено по критерию X Фишера *# 05.
В двух генах (GR03, IL8R) отсутствует гомозиготный вариант ББ. Возможно, этот вариант сцеплен с какой-то летальной или снижающей жизнеспособность особи мутацией в самих генах GR03 или IL8R, либо в других генах.
ен GROX(2)
Шчерно-пестрая(~/8) □ симментальская
I черно-пестрая (1/2) I красная степная
Ген IL8R (АНб-2)
генотипы АБ
■пестрая("78) □ симментальская
i черно-пестрая( 1 '2) I красная степная
Ген 0*03
120
Шчерно-пестрая (7/8) В черно-пестрая (1/2) □ симментальская_И красная степная
Ген 11М052
Ш черно-пестрая (7/8) □ симментальская
Iчерно-пестрая (1/2) I красная степная
Рис.1 Частоты генотипов (Ж02(Х). ОКОЗ. 1Ь8Я, ¡N082 в популяции крчпного рогатого скота, отличающейся по породной принадлежности * -Р <0,05, # -Р<0,01. Л - Р<0,001
Результаты табл. 4 проанализированы и представлены на рисунке 1. Таким образом, из вышеизложенного следует, что существуют различия в частотах встречаемости аллелей и генотипов с различной степенью достоверности между группами животных, отличающимися по породной принадлежности.
На следующем этапе проведен поиск генетических маркеров, ассоциированных с восприимчивостью /устойчивостью к лейкозу, независимо от породной принадлежности животных.
2.2.2.2. Влияние инфицированности вирусом лейкоза на распределение частот встречаемости аллелей и генотипов
Для поиска функционально значимых при лейкозе ОНП - маркеров провели сравнительный анализ характера полиморфизма в зависимости от восприимчивости к инфицированию. Для этого всех животных разбили на две группы по результатам серологического анализа: серонегативные (РИД-) и серопозитивные (РИД+). Группу больных лейкозом животных, выделенную на основании гематологического анализа, отнесли к группе серопозитивных в связи с ограниченностью выборки.
Сравнительные данные по ОНП - генотипированию двух групп представлены в табл. 5.
Таблица 5 - Распределение частот встречаемости аллелей и генотипов в генах в зависимости от инфицированности вирусом лейкоза
Ген (маркер) Статус животных N Аллель Генотип
А Б АА АБ ББ
ОИОХ РИД- 50 0,38 0,62 0,10 0,52 0,38
(АНЗ-1,3,5) РИД+ 47 0,30 0,70 0,06 0,49 0,45
оюз РИД- 48 0,93 0,07 0,86 0,14 -
(АН5-3) РИД+ 55 0,96 0,04 0,92 0 08 -
РИД- 55 0,54 0,46 0,18 0,82 -
(АН6-1) РИД+ 66 0,61 0,39 0,21 0,79 -
РИД- 54 0,92 0,08 0,84 0,16 -
(АН6-2) РИД+ 60 0,88 0,12 0,75 0,25 -
114082 РИД- 50 0,73 0,27 0,63 0,22 0,15*
(АН13-1) РИД+ 54 0,66 0,34 0,59 0,13 0,28*
Примечание. Сравнительное распределение частот алеллей и генотипов в группах проведено по критерию X2 Фишера *Р<0,05
Из таблицы 5 видно, что в генах GR02(X) (AH3-1,3,5), IL8R (АН6-2), iNOS2 (АН13-1) в отличие от генов GR03 (АН5-3) и IL8R (АН6-1) в группах инфицированных животных по сравнению с ин-тактными отмечается увеличение редкого аллеля Б на фоне снижения встречаемости частого аллеля А.
Такие же изменения прослеживаются и в частотах встречаемости генотипов ББ: у вирусоносителей, в отличие от здоровых животных, повышено содержание гомозигот ББ в генах GR02(X) (0,45 против 0,38) и ¡NOS2 (0,28 против 0,15; Р<0,05). Т. е. наличие в геноме животных аллельного варианта Б в этих генах повышает риск инфицирования вирусом лейкоза.
Следует отметить, что у изученных нами животных в генах GR03 и IL8R отсутствовал генотип ББ в обоих группах.
Прослеживается снижение уровня гетерозиготности АБ у инфицированных животных во всех генах, кроме IL8R (АН6-2), но эти различия не достоверны. Однако одинаковая тенденция снижения уровня гетерозиготности у инфицированных животных в изучаемых генах позволяет предположить, что снижение гетерозиготности ассоциировано с восприимчивостью к лейкозу.
Таким образом, распределение частот встречаемости аллелей и генотипов по маркеру АН 13-1 гена iNOS2 между группами серопо-зитивных и серонегативных животных статистически отличается, т.е. можно предположить функциональную значимость данного маркера для оценки восприимчивости /устойчивости к инфицированию вирусом лейкоза, а также к развитию заболевания.
Рассматривая полученные результаты в таблицах 4 и 5, провели анализ влияния двух факторов (породной принадлежности и инфицированное™ вирусом лейкоза) на примере гена ¡NOS2 как наиболее информативного. При сравнении двух групп, представленных в таблице 5, выявили, что в гене iNOS2 за устойчивость к инфицированию BJIKPC отвечает аллель А и гомозиготный вариант АА, а за восприимчивость -аллель Б и генотип ББ. При сравнении популяций крупного рогатого скота черно-пестрой породы с разной долей голштинизации (табл. 4) отметили, что черно-пестрой порода (кровность 7/8) наиболее устойчива, по сравнению с черно-пестрой породой (кровность 1/2) (Р<0,05). Популяция красной степной породы более устойчива к инфицированию, чем группы животных симментальской (Р<0,05) и черно-пестрой пород с низкой долей голштинизации (Р<0,001).
Важным фактором, влияющим на восприимчивость к заболеванию особей в популяции, является генетическая вариабельность самого вирусного патогена. Следующим этапом наших исследований явилось изучение генетической гетерогенности популяции вируса как потенциального фактора, влияющего на распределение частот встречаемости аллелей и генотипов анализируемых генов в популяции КРС.
2.2.2.3. Оценка связи между генотипами вируса лейкоза крупного рогатого скота и распределением частот встречаемости аллелей
и генотипов
Для анализа ассоциаций полиморфных вариантов у животных с проявлениями генетического полиморфизма вируса лейкоза провели генотипирование популяции вируса, циркулирующего у крупного рогатого скота в двух районах Новосибирской области.
Вирус лейкоза крупного рогатого скота выявляли с помощью метода гнездовой «Nested» - ПЦР области гена env. Для этого использовали геномную ДНК, выделенную ранее из периферической крови животных для ОНП-генотипирования.
При проведении «Nested» - ПЦР в 62 образцах из 121 был получен фрагмент гена env BJIKPC, равный 444 п.н.
По результатам РИД, проведенной ранее, животные были разделены на две группы: РИД-отрицательные (условно-здоровые) и РИД-положительные (инфицированные). В группе инфицированных животных в трех образцах отмечена слабоположительная реакция в РИД.
Результаты РИД и ПЦР проанализированы и представлены в табл. 6.
Таблица б - Распределение групп животных по результатам РИД и ПЦР
Район Кол-во жив-х, голов Из них
РИДН РИД (+)
ПЦР (-) ПЦР (+) ПЦР (+) ПЦР (-)
Новосибирский 30 17 5 6 2
Карасукский 91 27 6 45 13
Всего 121 44 11 51 15
При сравнении результатов РИД и ПЦР отмечены случаи обнаружения провируса у серонегативных животных, а также отрицательные случаи в ПЦР у животных, имеющих антитела к BJIKPC.
Определение гетерогенности популяции ВЛКРС проводили у 62 животных, у которых с помощью ПЦР обнаружили фрагмент гена env. Для этого применяли метод ПДРФ с помощью рестриктных ферментов (Нае III, Bel I, Pvu И) в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл ампликона, 0,5 мкл эндонуклеазы рестрикции, соответствующего буферного раствора (1 мкл) и бидистиллированной воды. Реакция проходила при температуре 37°С в течение 2 часов.
Распределение размеров рестриктных фрагментов показано в табл. 7.
В нашем иследовании сайты 225 и 220 обнаружены во всех образцах с помощью эндонуклеазы Bell, а фрагменты 200, 100 и 85 получены при помощи фермента НаеШ. Фермент PvuII образовал фрагмент 444 п.н. в 3 образцах, а у 59 животных возник рестриктный сайт и образовались фрагменты 280 и 165 п.н.
Таблица 1 - Продукты рестрикционного анализа фрагмента 444 п.н.гена env
Генотип Bel I Нае III Pvu 11
1 225, 220 200, 100, 85 444
2 220, 120, 105 315,95 444
3 220, 120, 105 285, 95 444
4 220, 120, 105 200, 100, 85 444
5 225, 220 285, 95 444
6 225, 220 200, 100, 85 280, 165
При анализе полученных данных оказалось, что в популяции крупного рогатого скота циркулируют 2 генотипа ВЛКРС - 1 и 6. Наиболее распространенным оказался 6 генотип (95 %). Отмечен также и генотип 1 (5 %). Другие генотипы в нашем исследовании не обнаружены.
Полученные нами результаты генотипирования были сопоставлены с серологическими результатами (табл. 8).
Таблица 8 - Распределение генотипов ВЛКРС в зависимости от иммунного ответа
Район Количество образцов РИД Генотип
1 | 2 | 3 4 | 5 | 6
Новосибирский Карасукский Всего 11 ++ 1 2 ± ----- з 5 51 ++ 2 43 ± -----6 62 3 - - - - 59
Отмечено, что у трех животных со слабым иммунным ответом, а также у 11 животных, не имеющих антител к ВЛКРС, но давших положительный результата в ПЦР, обнаружен провирус, отнесенный нами к 6 генотипу. Ни каких других ассоциаций между генотипами вируса и иммунным ответом животного в нашем исследовании не выявлено.
Для анализа связи генотипов вируса лейкоза крупного рогатого скота и распределения в генах частот встречаемости аллелей и генотипов сравнили полиморфные варианты исследуемых генов у животных, инфицированных вирусом 1 и 6 генотипов (табл. 9).
Таблица 9 - Распределение частот встречаемости генотипов в генах у животных, инфицированных вирусом 1 и 6 генотипов
Ген (маркер) Генотип вируса Генотип животного
АА АБ ББ
оюх 1 0 05 0.40 0.55
(АНЗ-1,3,5) 6 0.06 0.47 0.47
ОИОЗ (АН5-3) 1 0.70 0.30 -
6 0.88 0.12 -
11,811 (АН6-1) 1 0.60* 0 25* 0.15
6 0.19* 0.81* -
1Ь8Я (АН6-2) 1 0 65 0 30 0.05
6 0.84 0.16 -
1Ы082 (АН13-1) 1 0.65 0.25 0.10
6 0 56 0.16 0.27
* - разница между группами достоверна (Р<0,001)
При сравнении распределений частот встречаемости генотипов в группах животных, инфицированных различными генотипами вируса лейкоза, статистически значимые различия выявлены только по маркеру АН6-1 гена 1Ь8Я (Р<0,001).
Распределение генотипов по исследованным полиморфным ло-кусам проверяли на соответствие ожидаемым при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ). Из табл. 10 видно, что для большинства изученных полиморфных вариантов распределение соответствовало ожидаемому. Отклонение было показано лишь для вариантов АН6-1 гена 11,811 (х2=54,149, Р<0,001) и АН13-1 гена ¡N082 (х2=36,664, Р<0,001).
Таблица 10- Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам при равновесии Харди-Вайнберга
I ен (маркер) X2 Р
С1ЮХ(2) (АНЗ-1,3,5) 1,734 0,244
ОЮЗ (АН5-3) 0,394 1,0
1Ь8Я (АН6-1) 54,149* 0,0001
1Ь8Я (АН6-2) 1,578 0,338
114052 (АН 13-1) 36,664* 0,0001
* - достоверно не согласуются (Р<0,001)
Нарушение равновесия в соотношении генотипов и частот в генах произошло, вероятно, в результате влияния какого либо фактора (заболеваемость, породный фактор, мутации и другие).
Проведение такого рода исследований выглядит перспективным как с научной, так и с практической точки зрения. Определение ассоциаций полиморфных вариантов различных генов-кандидатов к инфицированию вирусом лейкоза крупного рогатого скота, изучение полиморфизма ключевых генов цитокинов хозяина наряду с вариантами генетического полиморфизма патогена дает возможность глубже проникнуть в основы патогенеза, выявить роль тех или иных факторов в развитии заболевания.
В дальнейшем необходимо провести расширенные исследования в данном направлении. В будущем, полученные данные могут лечь в основу решения актуальных задач в ветеринарии и могут быть непосредственно внедрены в практику селекционной работы.
выводы
1. Оптимизированы условия постановки методов генотипирова-ния ОНП - маркеров (AH3-l,3,5;AH5-3; АН6-1,2; АН13-1) в генах цитокиновой сети (GROX; GR03; IL8R; iNOS2), ассоциированных с восприимчивостью к вирусу лейкоза крупного рогатого скота.
2. Наличие в геноме животных аллеля Б ОНП - маркеров АНЗ-1,3,5 гена GR02(X), АН6-2 гена IL8R, АН13-1 гена iNOS2 (Р<0,05), а также аллеля А ОНП - маркеров АН5-3 гена GR03 и АН6-1 гена IL8R ассоциировано с маркерами инфицированное™.
3. Выявлены различия между группами животных, отличающихся по породной принадлежности: черно-пестрой голштинизиро-ванной (кровность 7/8) и красной степной по частотам встречаемости генотипов всех ОНП - маркеров гена GROX (Р<0,05); черно-пестрой голштинизированной (кровность 1/2) и красной степной по генам GR03 (АН5-3) (Р<0,05) и iNOS2 (АН13-1) (Р<0,05), а также черно-пестрой с различной степенью голштинизации по ОНП - маркерам АН6-2 гена IL8R (Р<0,05) и АН 13-1 гена iNOS2 (Р<0,01) и красной степной и симментальской по гену iNOS2 (АН 13-1) (Р<0,05).
4. С увеличением кровности по голштинской породе до 7/8 у черно-пестрого скота возрастает устойчивость к инфицированию ВЛКРС по ОНП - маркеру АН13-1 гена iNOS2 (Р<0,05). Животные красной степной породы более устойчивы к инфицированию, чем группы животных симментальской (Р<0,05) и черно-пестрой пород с низкой долей голштинизации (Р<0,001).
5. В популяции крупного рогатого скота Новосибирской области из 6-ти известных для ВЛКРС генотипов циркулируют два - 1 и 6. Доминирующим оказался 6-й генотип (95 %). Отмечен также и генотип 1 (5 %). Другие генотипы вируса в нашем исследовании не обнаружены.
6. Обнаружена связь между генотипами вируса лейкоза крупного рогатого скота и наличием в геноме животных определенных аллелей гена IL8R по маркеру АН6-1 (Р<0,001).
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Методические рекомендации «Выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)». Утверждены ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №4 от 17.07.04г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №15 от 17.07.04г.).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Технология олигонуклеотидных полиморфных (ОНП) маркеров и предрасположенность к инфекциям крупного рогатого скота (КРС) / Соавт.: В.А. Белявская, Е.А. Дурыманова, П.В. Юдин, J1.A. Васильева, П.Н. Смирнов, В.В. Храмцов, М.И. Воевода // Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья с-х. животных: Материалы II Междунар. науч.-практ. конф. (Ставрополь, 22-24 окт. 2003 г.). -Ставрополь, 2003. -С. 271-275.
2. Возможности и ограничения использования ПЦР в диагностике и генотипировании вируса лейкоза крупного рогатого скота / Соавт.: В.А. Белявская, Е.А. Дурыманова, П.Н. Смирнов, В.В. Храмцов // Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья с-х. животных' Материалы II междунар. науч.-практ. конф. (Ставрополь, 22-24 окт. 2003 г.). -Ставрополь, 2003. -С. 275-278.
3. Анализ SNP гена IL-8R в группах здоровых и больных лейкозом животных / Соавт.: П.В Юдин, Е.А. Дурыманова, В А Белявская, О.И Серпинский, М.И. Воевода // Прогрессивные научные технологии для здоровья человека: Материалы Междунар конгр (Кара-Даг, Феодосия, 8-19 июня 2003 г.). -Феодосия, 2003. -С. 146-147.
4. Возможности и ограничения использования полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) / Соавт.: В.В. Храмцов, П.Н. Смирнов, Е.А. Дурыманова, В.А. Белявская // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: Материалы сиб. междунар. науч.-практ конф. НГАУ (Новосибирск, 12-13 февраля 2004 г ). -Новосибирск, 2004. -С 93-94.
5. Результаты сравнительных диагностических исследований лейкоза крупного рогатого скота при использовании ПЦР / Соавт. Н.Г. Двоеглазов // Современные проблемы эпизоотологии: Материалы междунар. науч. конф. (Краснообск, 30 июня 2004 г.). -Новосибирск, 2004.-С.282-283.
Подписано в печать 01 03 2005 г Формат 60x84/16 Объем 1 п л Заказ № 61 Тираж 100 экз
Отпечатано в ИПЦ «Юпитер» 630501, НСО, п Краснообск
?
?
f 9
РЫБ Русский фонд
2006-4 6553
Оглавление диссертации Чичинина, Светлана Викторовна :: 2005 :: Новосибирск
ВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вирусологические аспекты лейкоза крупного рогатого скота
2. Методы выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота
3. Сравнительный анализ методов оценки устойчивости и восприимчивости животных к лейкозу
4. Сравнительный анализ методов оценки полиморфизма ДНК
5. Гены иммунного ответа как кандидатные гены предрасположенности к инфекционным патологиям
6. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота 32 Заключение по обзору литературы
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Материалы и методы исследований
2. Результаты исследований
2.1. Формирование групп животных и создание панели геномной ДНК крупного рогатого скота
2.2. Отработка оптимальных условий постановки методов для
ОНП - генотипирования
2.3. Оценка вариабельности генов цитокиновой сети в популяциях крупного рогатого скота
2.3.1. Влияние породной принадлежности на распределение частот встречаемости аллелей и генотипов
2.3.2. Влияние инфицированности вирусом лейкоза на распределение частот встречаемости аллелей и генотипов 66 2.3.3. Оценка связи между генотипами вируса лейкоза крупного рогатого скота и распределением частот встречаемости аллелей и генотипов
Обсуждение результатов исследований
Выводы
Практические предложения
Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Чичинина, Светлана Викторовна, автореферат
Актуальность проблемы.
К числу широко распространенных хронических вирусных заболеваний, ежегодно наносящих ощутимый ущерб животноводческим хозяйствам, относится лейкоз крупного рогатого скота (Т.П. Кудрявцева, 1980; В.М. Нахмансон, 1980, 1986; В.П. Шишков, 1986; В.Н. Сюрин и соавт., 1998; М.И. Гулюкин и со-авт., 1999).
Рост показателей заболеваемости, экономические издержки и социальная значимость проблемы определяют необходимость поиска новых, эффективных подходов решению проблемы отбора и производства крупного рогатого скота с пониженной восприимчивостью к данной инфекции (А.Б. Прохватилова и соавт., 1998; JI.K. Эрнст и соавт., 1998, 2000; Б.Г. Орлякин и соавт., 2000; М.И. Гулюкин и соавт., 2002).
В настоящее время перспективным и своевременным является выяснение механизмов генетической резистентности к инфекционным заболеваниям в популяции сельскохозяйственных животных. Наиболее информативным представляется метод, основанный на анализе ассоциаций между полиморфизмом генов-кандидатов и характерных фенотипических проявлений у животного с использованием однонуклеотидных полиморфных маркеров (ОНП) (W.M. Grosse 1999; М.Р. Heaton et al., 1999, 2001; Н. Zimdahl et al., 2004; К. Zhang et al., 2004).
На сегодняшний день гены, кодирующие наиболее важные белки и участвующие в реакции организма на внедрение инфекционных агентов у разных видов млекопитающих, могут вызывать изменения клинической картины и исходов инфекционного процесса (С. Симбирцев, 1999; И.С. Фрейдлин и соавт., 1999; Н.Н. Носик, 2000; В.И. Коненков и соавт., 2002; R.G. Keefe et al., 1997; F. Altere et al., 1998; J.C. Knight et al., 1999; T. Krakauer et al., 1999; H. Shin et al., 2000; SJ.H. Van Deventer et al., 2000; B.R. Lane et al., 2001; K. Ozaki et al., 2002).
Во многих научных центрах мира ведется интенсивный поиск различных вариантов генов, разрабатываются конкретные приемы, позволяющие предотвратить распространение среди животных болезней, наследуемых генетически, и повысить эффективность селекции.
В организме восприимчивого животного хронически персистирующий вирус может претерпевать мутационные изменения, направленные на увеличение патогенности и преодоление защитных сил организма. Поэтому, наряду с генетическим статусом хозяина необходимо изучать и генетическую изменчивость самого патогена (L. Willems et al., 1993, 1995; Н. Fechner et al., 1997; M. Licursi et al., 2002).
Изучение полиморфизма генов хозяина и патогена в их комбинациях на уровне индивидуальных геномов открывает новые возможности в понимании молекулярно-генетических механизмов развития патологий.
Цель работы: изучить полиморфизм некоторых генов цитокиновой сети в связи с предрасположенностью крупного рогатого скота к лейкозу и оценить влияние на полиморфизм различных факторов, включая генотипы вируса лейкоза.
Задачи исследований:
1. Сформировать группы животных и создать панель геномной ДНК КРС для дальнейшего выявления и изучения молекулярно-генетических маркеров, отвечающих за резистентность к лейкозу.
2. Оптимизировать условия постановки методов для ОНП - генотипирования (постановка локус-специфической ПЦР, AS-ПЦР, ПДРФ).
3. Идентифицировать вариабельность цитокиновых и функционально связанных с ними генов в популяции крупного рогатого скота (GROX(2), GR03, IL8R, iNOS2).
4. Охарактеризовать группы животных, отличающиеся степенью предрасположенности к инфицированию вирусом лейкоза в популяциях различных пород крупного рогатого скота, по разнообразию аллелей и их частотам.
5. Изучить гетерогенность популяции и ассоциации полиморфных вариантов, исследуемых генов с вариантами генетического полиморфизма вируса лейкоза крупного рогатого скота. Научная новизна работы. В результате проведенных исследований получены новые данные, свидетельствующие о влиянии полиморфных вариантов генов цитокиновой сети на предрасположенность к лейкозу крупного рогатого скота. Впервые в РФ получены данные о характере распределения ОНП - маркеров в зависимости от породной принадлежности крупного рогатого скота.
Проведено генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота и изучена взаимосвязь полиморфизма ключевых генов цитокинов хозяина с генетическим полиморфизмом патогена.
Практическое значение работы. Результаты исследований использованы при разработке методических рекомендаций «Выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)», утвержденных ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол № 4 от 17.07.04г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 15 от 17.07.04г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Оптимальные условия постановки методов для ОНП - генотипирования (постановка локус-специфической ПЦР, AS-ПЦР, ПДРФ) генов цитокиновой сети (GROX(2), GR03, IL8R, iNOS2).
2. Результаты анализа ассоциаций изученных полиморфных вариантов с породной принадлежностью и степенью предрасположенности к инфицированию вирусом лейкоза в популяции крупного рогатого скота.
3. Степень гетерогенности популяции вируса лейкоза крупного рогатого скота.
4. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов исследуемых генов с вариантами генетического полиморфизма вируса лейкоза крупного рогатого скота.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных» (Ставрополь, 2003); международном конгрессе «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (Кара-Даг, Феодосия, 2003); международной научно-практической конференции НГАУ «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2004); международной научной конференции «Современные проблемы эпизоотологии» (Новосибирск, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 111 страницах и состоит из введения, обзора литературы, заключения по обзору литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 19 рисунками. Список использованной литературы включает 192 источника, в том числе 101 зарубежный.
Заключение диссертационного исследования на тему "Роль аллельной вариабельности генов цитокинов в формировании резистентности крупного рогатого скота к лейкозу"
ВЫВОДЫ
1. Оптимизированы условия постановки методов генотипирования ОНП - маркеров (AH3-l,3,5;AH5-3; АН6-1,2; АН 13-1) в генах цитокиновой сети (GROX; GR03; IL8R; iNOS2), ассоциированных с восприимчивостью к вирусу лейкоза крупного рогатого скота.
2. Наличие в геноме животных аллеля Б ОНП - маркеров AH3-1,3,5 гена GR02(X), АН6-2 гена IL8R, АН13-1 гена iNOS2 (Р<0,05), а также аллеля А ОНП - маркеров АН5-3 гена GR03 и АН6-1 гена IL8R ассоциировано с маркерами инфицированности.
3. Выявлены различия между группами животных, отличающихся по породной принадлежности: черно-пестрой голштинизированной (кровность 7/8) и красной степной по частотам встречаемости генотипов всех ОНП - маркеров гена GROX (Р<0,05); черно-пестрой голштинизированной (кровность 1/2) и красной степной по генам GR03 (АН5-3) (Р<0,05) и iNOS2 (АН13-1) (Р<0,05), а также черно-пестрой с различной степенью голштинизации по ОНП - маркерам АН6-2 гена IL8R (Р<0,05) и АН13-1 гена iNOS2 (Р<0,01) и красной степной и симментальской по гену iNOS2 (АН13-1) (Р<0,05).
4. Популяция черно-пестрого скота с 7/8 доли кровности по голштинам характеризуется более высокой устойчивостью к инфицированию BJIKPC по ОНП - маркеру АН 13-1 гена iNOS2, чем с 1/2 долей кровности (Р<0,05). Животные красной степной породы более устойчивы к инфицированию, чем группы животных симментальской (Р<0,05) и черно-пестрой пород с низкой долей голштинизации (Р<0,001).
5. В популяции крупного рогатого скота Новосибирской области из 6-ти известных для BJIKPC генотипов циркулируют два - 1 и 6. Доминирующим оказался 6-й генотип (95 %). Отмечен также и генотип 1 (5 %). Другие генотипы вируса в нашем исследовании не обнаружены.
6. Обнаружена связь между генотипами вируса лейкоза крупного рогатого скота и наличием в геноме животных определенных аллелей гена IL8R по маркеру АН6-1 (Р<0,001).
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Методические рекомендации «Выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)». Утверждены ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ (протокол №4 от 17.07.04г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №15 от 17.07.04г.).
Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2005 года, Чичинина, Светлана Викторовна
1. Азимова Г.В. Влияние технологических факторов на устойчивость к маститу и лейкозу помесей коров черно-пестрого скота с голштинским: Автореф. дис. . канд. ветеринар, наук. -М., 1999. -19с.
2. Алтухов Ю.П. Генетический мономорфизм видов и его возможное биологическое значение. / Ю.П. Алтухов, Ю.Г. Рычков. // Журн. общ. биологии. -1972.-Т. 33.-С. 281-300.
3. Алтухов Ю.П. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике. / Ю.П. Алтухов, Е.А. Салменкова. // Генетика. -2002. -Т. 38. -№ 9. -С. 1173-1195.
4. Бурба Л.Г. Основные результаты научных исследований по проблеме лейкозов сельскохозяйственных животных и птиц, проводимых странами-членами СЭВ / Л.Г. Бурба. // Бюл. ВИЭВ. -М., 1977. -Вып.30. -С. 12-14.
5. Бурба Л.Г. Экспериментальное воспроизведение лейкоза у сельскохозяйственных животных / Л.Г. Бурба. // Этиология и иммунодиагностика лейкоза крупного рогатого скота. -Рига, 1979. -С. 62-66.
6. Бурба Л.Г. Современные принципы профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота / Л.Г. Бурба. // Оздоровление промышленных ферм от лейкоза крупного рогатого скота: Сб. науч. тр. -Вып. 25. -Новосибирск, 1985.-С. 8-13.
7. Бусол В.А. Тест-система для выявления ВЛКРС полимеразной цепной реакцией. / В.А. Бусол, О.Ю. Лиманская, А.П. Лиманский, В.И. Цымбал. // Ветеринария. -1999. №6. -С. 27-30.
8. Валихов А.Ф. Распространение онковируса крупного рогатого скота в неблагополучных по лейкозу хозяйствах / А.Ф. Валихов, Л.Г. Бурба, В.М. На-хмансон. // Ветеринария. -1978. -№3. -С. 40-43.
9. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. / Б. Глик, Дж. Пастернак. -М.: Мир, 2002. -589с.
10. Грачева J1.A. Цитокины в онкогематологии: Автореф. дис. .д-ра ветеринар, наук. —Москва. -1997. -49с.
11. И. Гулюкин М.И. Пути передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота. / М.И. Гулюкин, А.В. Васин, Н.В. Замараева. // Ветеринария. -1990. -№1. -С. 27-31.
12. Гулюкин М.И. Эпизоотологическая оценка методов прижизненной диагностики лейкоза КРС. / М.И. Гулюкин, Е.А. Дун, Н.В. Замараева, Н.В. Баркова, Н.И. Петров. // Вестник РАСХН. -2000. -№3. -С. 60-62.
13. Дун Е.А. Иммунологическая характеристика семейств коров в неблагополучных по лейкозу хозяйствах / Е.А. Дун. // Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных. Ташкент, 1984. - С. 47-48.
14. Дун Е.А. Цитогенетические и эпизоотологические аспекты лейкоза крупного рогатого скота: Автореф. дис.д-ра ветеринар, наук. -Москва, -1991. -42с.
15. Карликов Д.В. Генетический анализ распространения лейкоза в популяциях крупного рогатого скота и разработка методов селекции на устойчивость к этой болезни: Автореф. дис. .д-ра с.-х. наук. -Персияновка. -1983. -47с.
16. Кудрявцева Т.П. Лейкоз животных. / Т.П. Кудрявцева. -М.: Россельхозиздат, 1980.-158с.
17. Кукайн Р.А. Выявление онкорнавируса типа С у крупного рогатого скота со спонтанным и экспериментально производимым лимфолейкозом / Р.А. Кукайн, Л.И. Нагаева, С.В. Чапоненко // Вопросы онкологии. —1973. —Т. 19. -С. 44-49.
18. Кукайн Р.А. Вирус лейкоза крупного рогатого скота. / Р.А. Кукайн, Л.И. Нагаева, В.П. Ложа и др. -Рига: Зинатне, 1982. -175с.
19. Кукайн Р.А. Особенности клеток при экспериментальном и спонтанном лейкозе крупного рогатого скота / Р.А. Кукайн, Л.И. Нагаева, О.И. Брацслав-ская, Я.С. Ильина. // Стволовые клетки и опухолевый рост. —Киев: Наукова Думка, 1985.-С. 41-43.
20. Левашев А.Т. Ягнята как модельные животные при изучении онкорнавирус-ной инфекции и лейкоза крупного рогатого скота / А.Т. Левашев, П.Н. Смирнов. // Науч.-техн. бюл.: ВАСХНИЛ, Сиб-е отделение. -1982. -Вып. 10.-С. 13-16.
21. Лиманский А.П. Молекулярно-генетические методы основа программ по искоренению лейкоза крупного рогатого скота. / А.П. Лиманский, О.Ю. Ли-манская // Биотехнология. -2001. -№3. -С. 40-50.
22. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. -М.: Мир, -1984. -112с.
23. Нахмансон В.М. Лейкоз крупного рогатого скота. / В.М. Нахмансон. -М.: Россельхозиздат, 1986. -221с.
24. Нахмансон В.М. Наследственная передача предрасположенности к лейкозу крупного рогатого скота. / В.М. Нахмансон. // Ветеринария. -1973. -№11. -С. 52-53.
25. Нахмансон В.М. Перспективы профилактики лейкозов в связи с онкорнави-русной инфекцией крупного рогатого скота. / В.М. Нахмансон. // Изучение лейкозов крупного рогатого скота: Сб. статей. -Персиановка, -1980. -Т. XV. -Вып. 4. -С. 28-30.
26. Нахмансон В.М. Лейкозы сельскохозяйственных животных / В.М. Нахмансон, Е.А. Дун, М.И. Гулюкин, Д.В. Карликов, С.М. Федорова, В.А. Бусол. // Тр. ВИЭВ. -М., 1983. -Т. 59. -С. 36-40.
27. Нахмансон В.М. Современная концепция эпизоотического процесса лейкоза крупного рогатого скота. / В.М. Нахмансон. // Вестник РАСХН. —1993. -№3. -С. 48-53.
28. Незавитин А.Г. Генеалогическая характеристика стад КРС в Новосибирской области по устойчивости к лейкозу. / А.Г. Незавитин. // Проблема оздоровления хозяйств от лейкоза КРС: Тезисы докладов Всесоюз. науч.-производ.конф. -Новосибирск, 1990. -С. 37-38.
29. Незавитин А.Г. Научно-практические основы борьбы с лейкозом крупного рогатого скота. / А.Г. Незавитин. -Новосибирск, 1992. -110с.
30. Незавитин А.Г. Наследственная обусловленность устойчивости к инфекции BJIKPC, лейкозу и влияние некоторых экологических факторов на интерьер-ные показатели крупного рогатого скота: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. — Новосибирск, 1995. -43с.
31. Павленко С.П. Генетический полиморфизм по BOLA-антигенам в генеалогических группах черно-пестрого скота. / С.П. Павленко, С.А.
32. Ларцева. // Пробл. лейкоза и инфекц. заболеваний сельскохозяйственных животных.-М., 1988.-С. 39-43.
33. Панов Б.Л. Проблемы сельскохозяйственных животных. / Б.Л. Панов, В.Л. Петухов. -Новосибирск, 1997. -283с.
34. Паракин В.К. О горизонтальных путях передачи лейкозов крупного рогатого скота / В.К. Паракин. // Проблемы экспериментальной онкологии и лейкозов человека и животных. -М.: Колос, 1979. -С. 238-340.
35. Паракин В.К. Экспериментальный лейкоз овец / В.К. Паракин, Л.Ф. Силкин, Н.Н. Котлярова// Тр. ВИЭВ. -М., 1981. -Т.54. -С. 19-23.
36. Петухов В.Л. Генетика лейкоза крупного рогатого скота. / В.Л. Петухов, А.Г. Незавитин, А.А. Григорьев, О.С. Короткевич, П.Н. Смирнов. -Новосибирск, 1992.-64с.
37. Прохватилова Л.Б. Диагностика лейкоза КРС методом полимеразной цепной реакции. / Л.Б. Прохватилова, А.И. Ломакин, С.Н. Колосов, В.В. Дрыгин, С.С. Рыбаков, А.А. Гусев. // Вестник РАСХН. -1998. -№ 5. -С. 65-68.
38. Рожков Ю.И. Генетический полиморфизм животных, его адаптационное значение и использование в селекции. / Ю.И. Рожков, С.К. Охапкин. // С.-х. биология. -1986. -№1. -С. 14-24.
39. Романов В.И. Предрасположенность к заболеванию лейкозами дочерей от ВоЬА-фенотипа матерей. / В.И. Романов. -М., 1996. -12 С.
40. Симбирцев А.С. Интерлейкин-8 и другие хемокины. / А.С. Симбирцев. // Иммунология. -1999. -№4. -С. 9-14.
41. Слепченко А.Р. Генетический анализ популяций холмогорского и черно-пестрого скота в связи с устойчивостью к лейкозам. / А.Р. Слепченко, З.Ф. Радугина, О.А. Трофимов. // Лейкозы крупного рогатого скота. -Новочеркасск, 1976. -С. 42-44.
42. Слепченко А.Р. Генетические аспекты лейкозов крупного рогатого скота. / А.Р. Слепченко, Т.М. Билль. // Проблемы лейкоза и инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. -М., 1988. -С. 44-49.
43. Смирнов П.Н. Пути передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота. / П.Н. Смирнов, А.В. Кисилев, А.Т. Левашев и соавт. // Диагностика лейкоза крупного рогатого скота. -НТБ ВАСХНИЛ, сиб. отд-ние. -Вып. 2, 1988. -С. 3-10.
44. Смирнов П.Н. Проблемы лейкоза животных. / П.Н. Смирнов, А.Г. Незави-тин, В.В. Смирнова, В.В. Храмцов. // Под ред. П.Н. Смирнова. -Новосибирск, 1992. -468с.
45. Смирнов П.Н. Научное обоснование и реализация в условиях производства комплексной системы противолейкозных мероприятий в Сибири. / П.Н. Смирнов, В.В. Храмцов, В.В. Смирнова. // Ветеринария Сибири. -2001. -№5. -С. 47-50.
46. Смирнов Ю.П. Развитие лейкозного процесса у инфицированных ВЛКРС коров в зависимости от их возраста. / Ю.П. Смирнов. // Ветеринария. -1999. -№12. -С. 15-17.
47. Смирнов Ю.П. К вопросу о вирусе лейкоза крупного рогатого скота. / Ю.П. Смирнов. // Молочное и мясное скотоводство. —2000. -№3. —С. 25-28.
48. Смит К. Анализ генома. / К. Смит, Ф. Коллинз, Ч. Кантор. -М., 1990. -58с.
49. Сулимова Г.Е. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК у сельскохозяйственных животных: методы изучения и перспективы использования. / Г.Е. Сулимова. // Успехи современной генетики. -М., 1993. -Вып. 18.-С. 3-35.
50. Сулимова Г.Е. Главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота. / Г.Е. Сулимова, И.Г. Удина, Э.К. Бороздин, А.Н. Завада, С.С. Соколова, Э.К. Бороздина. -М.: ВНИИплем, 1993. -120с.
51. Сулимова Г.Е. ДНК-полиморфизм гена BoLa-DRB3 у крупного рогатого скота в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу. / Г.Е. Сулимова, И.Г. Удина, Г.О. Шайхаев, И.А. Захаров. // Генетика. -1995. -Т. 31. -№9.-С. 1294-1299.
52. Сулимова Г.Е. Молекулярно генетический анализ генома животных и человека с использованием ДНК-маркеров: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -М., 1998.-50с.
53. Сюрин В.Н. Вирусные болезни животных. / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. -М.: ВНИТИБП, 1998. -928с.
54. Тимофеева А.В. Оценка экспрессии генов рецепторов к цитокинам в тканях человека с помощью полимеразной цепной реакции. / А.В. Тимофеева, Н.А. Скрыпина, Л.П. Савочкина, Р.Ш. Бибилашвили. // Иммунология. -2000. -№2. -С. 8-10.
55. Удина И.Г. Сравнительный анализ айрширской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота по маркерам гистосовместимости. / И.Г. Удина, Е.Е. Карамышева, Г.Е. Сулимова и соавт. // Генетика. -1998. -Т. 34. -№ 12. -С. 1668-1674.
56. Усенбеков Е.С. Генотипирование крупного рогатого скота по локусам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и мутации Blad Оценка быков черно-пестрой и голштинской пород.: Автореф. дис.канд. биол. наук. -Пушкин, 1995.-16с.
57. Федоров Н.А. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Методическое пособие для начинающих. / Н.А. Федоров, Ю.С. Суханов, А.Х. Асади Мобархан, М.И. Артемьев. -М., 1996. -33с.
58. Федорова С.М. Генетический контроль предрасположенности к лейкозам крупного рогатого скота. / С.М. Федорова, Т.М. Билль, Т.П. Сторожилова. // Распространение и меры борьбы с лейкозом человека и животных. -М., 1982.-С. 200-201.
59. Федорова С.М. Влияние генетических факторов на возникновение и развитие лейкозов крупного рогатого скота. / С.М. Федорова, Т.М. Вилль, Т.П. Сторожилова, Е.М. Прохорова. // Генетические методы оценки сельскохозяйственных животных. -Л., 1985. -С. 99-104.
60. Фрейдлин И.С. Иммунные комплексы и цитокины. / И.С. Фрейдлин, С.А. Кузнецова. // Медицинская иммунология. -1999. -№ 1-2. -С. 27-36.
61. Шиков А.Т. Изучение лейкозогенных свойств молока и крови больных лейкозом коров. / А.Т. Шиков, В.А. Андриян, Р.Н. Аванесон. // Матер. 9-го Межд. Симпозиума по сравн. изуч. лейкоза и родственных заболеваний. —М., 1979.-С. 230-234.
62. Шишков В.П., Коромыслов Г.Ф., Бурба Л.Г. Основные итоги научных исследований по проблеме лейкоза с.-х. животных за 10 пятилетку и задачи на 1981-1985гг. / В.П. Шишков, Г.Ф. Коромыслов, Л.Г. Бурба. // Тр. ВИЭВ. -М, 1981.-С. 3-10.
63. Шишков В.П. Иммунологические аспекты ветеринарной лейкозологии. / В.П. Шишков. // Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных: Тез. Всесоюзн. конф. —Ташкент, 1984. -С. 3-5.
64. Шишков В.П. Использование микроносителей для получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота. / В.П. Шишков, Е.А. Михалева, М.А. Завальный. // Вестник с.-х. науки. -1986. -№ 11. -С. 118-121.
65. Шишков В.П. Наступление на лейкозы животных. / В.П. Шишков. // Наука и человечество.-М.: Знание, 1988.-С. 103-113.
66. Шишков В.П. Лейкозы и злокачественные опухоли животных. / В.П. Шишков, Л.Г. Бурба. -М.: Агропромиздат, 1988. -301с.
67. Шукель А.А. Сравнительная характеристика иммунологических методов диагностики инфекции ВЛКРС в системе противолейкозных мероприятий: Автореф. дис. канд. ветеринар, наук. -Барнаул, 1998. -18с.
68. Эрнст Л.К. Некоторые вопросы селекции крупного рогатого скота на резистентность к болезням. / Л.К. Эрнст, А.А. Цалитис. // Животноводство. — 1970. -№7. -С. 55-58.
69. Эрнст Л.К. Наследование устойчивости к лейкозу животных бурой латвийской породы. / Л.К. Эрнст, А.А. Палитис, P.O. Гринберг. // Вестник с.-х. науки.-1971.-№11.-С. 8-18.
70. Эрнст J1.K. Генетический анализ популяций бурого латвийского скота в связи с устойчивостью к лейкозу. / J1.K. Эрнст, П.Г. Кпабуков, Д.В. Карликов. // Исследования по генетической устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу.-Дубовицы, 1973.-С. 19-21.
71. Эрнст JT.K. Проблемы устойчивости сельскохозяйственных животных к болезням и пути их решения. / J1.K. Эрнст. // Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России. -М., 1999. -Т.1. -С. 25-36.
72. Яковлев А.Ф. Развитие методов оценки генотипа сельскохозяйственных животных. / А.Ф. Яковлев. // Цитогенетика и молекулярная генетика сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр. -Д.: ВНИИРГЖ, 1987. -С. 5-17.
73. Anon. SNP attack on complex traits. / Anon. // Nat. Genet. -1998. -V. 2. -P. 217218.
74. Bederke G. Zup Placentaren Ubertragbarkeit der Rinderleukose / G. Bederke, A. Tolle, F.W. Schmidt. // Zbl. Vet. Med. -1968. -Bd.15. -H. 7. -S. 782-793.
75. Beier D. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA seguencing. / D. Beier, P. Blankenstein, O. Marguardi, J. Kuzmak. // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. -2001. -V. 114. -P. 252-256.
76. Bogdan С. Leishmaniasis: principles of the immune response and function of nitric oxide. / C. Bogdan. // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. —1998. —V. 111. -№ 11-12.-P. 409-414.
77. Bolstein D. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. / D. Bolstein, R.L. White, M. Skolnick, R.W. Davis. //Amer. J. Hum. Genet. -1980. -Vol. 32. -P. 314-331.
78. Bredt D.S. Nitric oxide: a physiologic messenger molecule. / D.S. Bredt, S.H. Snyder. // Annu. Rev. Biochem. -1994. -V. 63. -P. 175-195.
79. Camper S.A. Characterization of the bovine prolactin gene / S.A. Camper, D.N. Luk, Y. Yao. // DNA. -1984. -Vol. 3. -P. 237-249.
80. Chardon P. Molecular genetic analysis of the major histocompatibility complex in pig families and recombinants / P. Chardon, Ch. Renard, M. Kirszenbaum. // J. Immunogenet.-1985.-Vol. 12.-P. 139-149.
81. Denicola A. Peroxynitrite-mediated cytotoxicity to Trypanosoma cruzi. / A. Denicola, H. Rubbo, D. Rodriguez, R. Radi. // Arch. Biochem. Biophys. -1993. — V. 304. -P. 279-286.
82. Dube S. The complete genomic seguence of a BLV strain from a Holstein cow from Argentina. / S. Dube, G. Dolcini, L. Abbott, S. Menta, D. Dube, S. Gutierrez, C. Ceriani, E. Esteban, J. Ferrer and B. Poiesz. // Virology. -2000. -V. 277. -P. 379-386.
83. Eaves F.W. A field evaluation of the polymerase chain reaction procedure for the detection of bovine leukaemia virus proviral DNA in cattle. / F.W. Eaves, J.B. Molloy, C.K. Dimmock, L.E. Eaves. //Vet. Microbiol. -1994.-V. 39. -P. 313-321.
84. Fechner H. Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation to the serological status of naturally infected cattle. / H. Fechner, P. Blankenstein,
85. A.C. Looman, J. Elwert, L. Geue, C. Albrecht, A. Kurg, D. Beier, O. Marguardt, D. Ebner. // Virology. -1997. -V. 273. -P. 261-269.
86. Ferrer J.F. Relationship between lymphosarcoma and persistent lymphocytosis in catties a review. / J.F. Ferrer, R.R. Marshac, D.A. Abt //-J. Amer. Vet. Med. Assoc. -1979. -Vol. 175. -P. 705-708.
87. Fries R. The bovine gene map. / R. Fries, J.S. Beckmann, M. Georges // Anim. Genet. -1989. -Vol. 20. -P. 3-29.
88. Ghysdael J. Bovine leukemia virus. / J. Ghysdael, C. Bruck, R. Kettmann, A. Burny. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. -1984. -V. 112. -P. 1-19.
89. Glegg J.B. Genetic organization of the polimorphic eguine a-globin locus and seguence of the BHal gene. / J.B. Glegg, S.E.Y. Goodbourn, M. Braend. // Nucl. Acids. Res. -1984. -Vol. 12. -P. 7847-7858.
90. Grosse W.M. Single nucleotide polymorphism (SNP) discovery and linkage mapping of bovine cytokine genes. / W.M. Grosse, S.M. Kappes, W.W. Laegreid, J.W. Keele, C.G. Chitko-MeKown, M.P. Heaton. // Mammalian Genome. -1999. -V. 10.-P. 1062-1069.
91. Heaton M.P. Identification and genetic mapping of bovine chemokine genes expressed in epithelial cell. / M.P. Heaton, W.W. Laegreid, W.W. Beattie, T.P.L. Smith, S.M. Kappes. // Mamm Genome. -1999. -V. 10. -P. 128-133.
92. Heaton M.P. Estimation of DNA seguence diversity in bovine cytokine genes. / M.P. Heaton, W.M. Grosse, S.M. Kappes, J.W. Keele, C.G. Chitko-MeKown, L.V. Cundiff, A. Braun, D.P. Little, W.W. Leagreid. // Mammalian Genome. -2001.-V. 12.-P. 32-37.
93. Holmes W.E. Structure and functional expression of a human interleukin-8 receptor. / W.E. Holmes, J. Lee, W.J. Kuang, G.C. Rice, W.I. Wood. // Science. -1991.-V. 253.-P. 1278-1280.
94. Homey B. Chemokines: agents for the immunotherapy of cancer. / B. Homey, A. Muller, A. Zlotnik. // Nature Reviews Immunology. -2002. -V. 2. -P. 175-184.
95. Horvath V. The releability of the immunodiffusionprecipitation test in enzootic bovine leucosis. / V. Horvath, L. Zaak. // Acta Veter. Acad. Scient. Hung. -1979. -V. 27.-P. 145-150.
96. Hoss H.E. Infectivity of bovine C-type (leukemia) virus for sheep and goats. / H.E. Hoss, C. Olson. // Amer. J. Veterinary Research. -1974. -Vol. 35. -№5. -P. 633-637.
97. Jimenez J.L. Regulation of human immunodeficiency virus type 1 replication in human T lymphocytes by nitric oxide. / J.L. Jimenez, J. Gonzalez-Nicolas, S. Alvarez. // Journal of Virology. -2001. -V. 75. -№ 10. -P. 4655-4663.
98. Jung Y.C. Association of restriction fragments length polymorphisms of swine leucocyte antigen class I genes with production trains of Duroc and Hampshire boars. / Y.C. Jung, M.F. Flanagan. // Anim. Genet. -1989. -Vol. 20. -P. 79-91.
99. Kabeya H. Host immune responses in the course of bovine leukemia virus infection. / H. Kabeya, K. Ohashi, M. Onuma. // J. Vet. Med. Sci. -2001. -V. 63. -N. 7. -P. 703-708.
100. Kaminski S. Identification of bovine kappa-casein genotypes by the PCR-SSCP method. / S. Kaminski // Anim. Sc. Papers Rep. -Warszawa, 1998. -Vol. 16. -№1.-P. 13-17.
101. Kaminski S. Simultaneous SSCP genotyping of two bovine casein loci. / S. Kaminski. //Anim. Sc. Papers Rep. -Warszawa, 1999. -Vol. 17. -№ 1. -P. 29-33.
102. Kappes S.M. A second-generation linkage map of bovine genome. / S.M. Kap-pes, J.W. Keele, R.T. Stone, R.A. McGraw, T.S. Sonstegard. // Genome Res. -1997.-V. 7.-P. 235-249.
103. Keane M.P. Depletion of CXCR2 Inhibits Tumor Growth and Angiogenesis in a Murine Model of Lung Cancer. / M.P. Keane, John A. Belperio, Ying Y. Xue, Marie D. Burdick and Robert M. Strieter. // The Journal of Immunology. —2004. -V. 172.-P. 2853-2860.
104. Keefe R.G. Cytokine transcription in lymph nodes of cattle in different stages of bovine leukemia virus infection. / R.G. Keefe, D.A. Ferrick, J.L. Stoff. // Veter. Immunol. Immunopathol. -1997. -Vol. 59. -N 3/4. -P.271-283.
105. Kelly E.J. Early detection of bovine leukemia virus in cattle by use of the polymerase chain reaction. / E.J. Kelly, M.K. Jackson, G. Marsolais, J.D. Morrey, R.J. Callan. // Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. -1998. -V. 105. -№11. -P. 408-411.
106. Kettmann R. Restriction endonuclease mapping of linear unintegrated proviral DNA of bovine leukemia virus. / R. Kettmann, D. Couez, A. Burny. // J. Virol. -1981.-V. 38.-P. 27-33.
107. Kettmann R. Bovine leukemia virus. / R. Kettmann, A.R. Burny, I. Callebaut, L. Droogmans, M. Mammerickx, L. Willems, D. Portetelle. // The Retroviridae. -New York, 1994. -V. 3. -P. 39-81.
108. Knight J.C. A polymorphism that affects OCT-1 binding to the TNF promoter region is associated with severe malaria. / J.C. Knight, I. Udalova, A.V. Hill, B.M. Greenwood, N. Peshu. //Nat. Genet. -1999. -V. 22. -P. 145-150.
109. Krakauer T. Proinflammatory cytokines. / T. Krakauer, J. Vilcek, J.J. Oppen-heim. // In Fundamental Immunology. Philadelphia, 1999. -P. 775-811.
110. Lagziel A. DNA sequence of SSCP haplotypes at the bovine grouth hormone (bGH) gene. / A. Lagziel, M. Soller. // Anim. Genet. -1999. -V. 30. -№ 5. -P. 362-365.
111. Landegren U. Reading bits of genetic information: methods for single-nucleotide polymorphism analysis. / U. Landegren, M. Nilsson, P.Y. Kwok. // Genome Res. -1998. -V. 8. -P. 769-776.
112. Landry B.S. Methods and applications of restriction fragments length poly-morphisn analysis to plant. / B.S. Landry, R.W. Michelmore. // Tailoring genes for crop improvement. -N.Y.:Plenum Press, 1987. -P. 25-44.
113. Lenstra J. A. Short interspersed nuclear element (SINE) seguences of the Bovi-dae. / J.A. Lenstra, J.A. van Boxtel, K.A. Zwaagstra, M. Schwerin. // Anim Genet. -1993.-V. 24.-P. 33-39.
114. Licursi M. Genetic heterogeneiti among bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts. / M. Licursi, Y. Inoshima, D. Wu, T. Yokoyama, E. Gonzalez, H. Sentsui. // Virus Research. -2002. -V. 86. -P. 101110.
115. Licursi M. Provirus variants of bovine leukemia virus in naturally infected cattle from Argentina and Japan. / M. Licursi, Y. Inoshima, D. Wu, T. Yokoyama, E.T. Gonzalez, H. Sentsui. // Veter. Microbiology. -2003, -V.96. -I. 1. -P. 17-23.
116. Lindberg P.G. Close association between DNA polymorphism of bovine major histocompatibility complex class 1 genes and serological BoLa-A-A cpecificities. / P.G. Lindberg, L. Andersson. // Anim. Genet. -1988. -T. 19. -N 3. -P. 245-255.
117. Maeda N. Molecular genetics of the apolipoprotein В gene in pigs in relation to atherosclerosis. /N. Maeda, D.L. Edert, T.M. Doers. // Gene. -1988. -Vol. 70. -P. 213-229.
118. Mammerickx M. Sur fa transmission naturelle de la leukose bovine onzo-otigue. / M. Mammerickx, E. Derzelle. // Ann. Med. Vet. -1969. -V. 113. -P. 114-122.
119. Mammerickx M. Experimental cross-transmissions of bovine leukemia virus (BLV) betveen several animal species. / M. Mammerickx, D. Portetelle, A. Burny. //Zbl. Veterinarmed. -1981. -V. 28. -N. 1. -P. 69-81.
120. Mamoun R.Z. Seuguense variability of bovine leukemia virus env gene and its relevance to the structure and antigenicity of the glycoproteins. / R.Z. Mamoun,
121. M. Morisson, N. Rebeyrotte, В. Busetta, D. Couez, R. R. Kettmann, M. Hospital,
122. B. Guillemain. //J. Virol. -1990. -V. 64. -P. 4180-4188.
123. Miller J.M. Virus-like particles in phytohemagglutinin-stimulated lymphocyte culteres with referenct to bovine lymphosarcoma. / J.M. Miller. L.D. Miller, C. Olson, K.G. Gillette. // J. Natl. Cancer Inst. -1969-V. 43. -P. 1297-1305.
124. Miller I.M. Precipitaing antibodi to an internal antigen of the C-type virus associated with bovine lymfosarcoma. / I.M. Miller, C. Olson. //1. Natl. Cancer Inst. -1972.- Vol. 49. -N 5. -P. 1459-1462.
125. Miretti M.M. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) in exon 2 of the BoLA-DRB3 gene in South American cattle. / M.M. Miretti, J.A. Ferro, M.A. Lara, M.A. Contel. // Biochem. Genet. -2001. -V. 39. -N. 9-10. -P. 311-324.
126. Mitra A. Kappa-casein polymorphism in Indian dairy cattle and buffalo: a new genetic variant in buffalo. / A. Mitra, P. Schlee, R. Krause, J. Blusch, T. Werner,
127. C. R. Balacrishnan, F. Pirchner. // Anim. Biotechnol. -1998. -V. 9. -N. 2. -P. 8187.
128. Molteni E. Molecular characterization of a variant of proviral bovine leukaemia virus (BLV). / E. Molteni, A. Agresti, R. Meneveri, A. Marozzi, M. Malco-vati, L. Bonizzi, G. Poli and E. Genelli. //J. Vet. Med. B. -1996. -V. 43. -P. 201211.
129. Murphy P.M. Neutrophil receptors for interleukin-8 and related CXC chemo-kines. / P.M. Murphy. // Semin Hematol. -1997. -V. 34. -P. 311-318.
130. Murtaugh M.P. Detection of bovine leukemia virus in cattle by the polymerase chain reaction. / M.P. Murtaugh, G.F. Lin, D.L. Haggard, A.F. Weber, J.C. Meiske. // J. of Virological Methods. -1991. -V. 33. -P. 73-85.
131. Nagy D.W. Use of a polymerase chain reaction assay to detect bovine leukosis virus in dairy cattle. / D.W. Nagy, J.W. Tyler, S.B. Kleiboeker, A. Stoker. // J. Am. Vet. Med. Assoc. -2003. -V. 222. -N. 7. -P. 985-988.
132. Nathan C. Inducible Nitric Oxide Synthase in the Tuberculous Human Lung. / C. Nathan // Am. J. Respir. Crit. Care Med. -2002. -V. 166. -P. 130-131.
133. Schulz A.M. The envelope proteins of bovine leukemia virus: purification and sequence analis. / A.M. Schulz, T.D. Copeland, S. Oroszlan. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. -1985. -V. 82. -N. 3. -P. 677-681.
134. Sommerfelt M.A. Retrovirus receptors. / M.A. Sommerfelt. // J. Gen. Virol. -1999. -V. 80. -P. 3049-3064.
135. Stam P. Biochemical polymorphisms as markers in selection for guantitative traits / P. Stam. // Anim. Genet. -1987. -Vol. 18. -Suppl. 1. -P. 97-99.
136. Stranzinger G.F. Gene mapping and gene homologies in farm animals: Tech-nigues and present status of gene maps / G.F. Stranzinger. // Anim. Genet. -1987. -Vol. 18.-Suppl. 1.-P. 111-116.
137. Straub O.C. Versuche uber die verticale Ubertragung der Rindeleukose / O.C. Straub. // Dtsch. Tierarzt. Wacher. -1969. -Bh. 76. -S. 365-392.
138. Tajima S. Complete bovine leukemia virus (BLV) provirus is conserved in BLV-infected cattle throughout the course of B-cell lymphosarcoma development. / S. Tajima, Y. Ikawa, Y. Aida. // Journal of Virology. -1998. -V. 72. -N. 9. -P. 7569-7576.
139. Van Deventer S.J.H. Cytokine and cytokine receptor polymorphism in infectious disease. / S.J.H. Van Deventer. // Intensive Care Med. -2000. -V. 26. -P. 98103.
140. Van Eijk M. Extensive polimorphism of the BOLA-DRB3 gene distinguished by PCR-RFLP. / M. Van Eijk, J.A. Stewart Haynes, H.A. Lewin. // Animal. Genetics. - 1992. -Vol.23. -P. 483-496.
141. Van der Maaten M.J. Isolation of a virus from cattle with persistent lymphocytosis. / M.J. Van der Maaten, A. Boothe, S. Seger. // J. Nat. Cancer Inst. -1972. -V.49.-P. 1649-1657.
142. Weber J.L. Mutation of human short tandem repeats. / J.L. Weber, C. Wong. // Hum Mol. Genet -1993. -V. 2. -P. 1123-1128.
143. Willems L. In vivo infection of sheep by bovine leukosis virus mutants. / L. Willems, R. R. Kettmann et al. R., F. Deguiedt, D. Portetelle, V. Voneche, I. Cornil, P. Kerkhofs, A. Burny, M. Mammerickx. // J. Virol. -1993. -V. 67. -P. 4078-4085.
144. Willems L. Lack of LTR and env genetic variation during bovine leukosis virus-induced leukemogenesis. / L. Willems, P. Kerkhofs, A. Burny, M. Mammerickx, R. R. Kettmann et al. R. // Virologi. -1995. -V. 206. -P. 769-772.
145. Womack J.E. Molecular cytogenetics of cattle: A genomic approach to disease resistance and productivity. / J.E. Womack. // J. Dairy Sc. -1988. —T. 71. -N. 4. -P. 1116-1123.
146. Xu A. Polymorphism in BoLa-DRB3 exon 2 correlates with resistance to persistent lymphocytosis by bovine leukemia virus. / A. Xu, M. J. Van Eijk, C. Park, H.A. Lewin. / J. of Immunol. -1993. -Vol. 151. -P. 6977-6985.
147. Xu A. Polymorphism in BoLa-DRB3 exon 2 correlates with resistant to persistent lymphocytosis caused by bovine leukemia virus. / A. Xu, M. J. Eijk. / J. of Immunology-Baltimore. -1994. -Vol. 15. № 12. -P. 6977-6985.
148. Yang D. Milk and fat yields decline in bovine leukemia virus-infected Holstein cattle with persistant lumphocytosis. / D. Yang, R.D. Snanks, J.A. Stewart, H.A. Lewin. // PNAS. -1993. -V. 90. -P. 6538-6541.
149. Zhang K. Haplotype Block Partitioning and Tag SNP Selection Using Genotype Data and Their Applications to Association Studies. / K. Zhang, Z.S. Qin, J.S. Liu. // Genome Res. -2004. -V. 14. -P. 908-916.
150. Zimdahl H. A SNP Map of the Rat Genome Generated from cDNA Sequences. / H. Zimdahl, G. Nyakatura, B. Brandt et al. // Science. -2004. -V. 303. -P. 807.