Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Референс-противорожистая вакцина и ее использование для изучения гуморального иммунитета у трансгенных свиней

Российская академия сельскохозяйственных наук Министерство сельского хозяйства и продовольствия РФ

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт

биологической промышленности

Государственный Щелковский биокомбинат

Моисеева Наталья Анатольевна

РЕФЕРЕНС-ПРОТИВОРОЖИСТАЯ ВАКЦИНА И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У ТРАНСГЕННЫХ СВИНЕЙ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научные руководители: Доктор сельскохозяйственных наук, профессор заслуженный деятель науки РФ, лауреат Премии

Совета Министров СССР, академик РАСХН Л.К.Эрнст

Доктор ветеринарных наук Н.В.Мельник

Москва - 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................7

1.1. Биопрепараты для профилактики рожи свиней..............................................7

1.1.1. Общие сведения о заболевании....................................................................................7

1.1.2. Возбудитель рожи свиней Егз^реЬШпх гИшюраЙпае..............................7

1.1.3. Вакцины против рожи свиней.............................................11

1.1.4. Изучение гуморального иммунитета при роже свиней............................................................................................................................................................21

1.2. Биотехнология сельскохозяйственных животных........................................26

1.3. Заключение по обзору литературы..............................................................................27

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................................29

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................29

2.1. Производственные штаммы микроорганизмов, используемые в работе....................................................................................................................................................29

2.2. Питательные среды, используемые при промышленном культивировании бактерий..................................................................................................................30

2.3. Определение концентрации живых бактерий рожи свиней................30

2.3.1. Материалы и реактивы........................................................................................................30

2.3.2. Подготовка к испытанию........................................................................................30

2.3.3. Проведение испытания..........................................................................................................31

2.3.4. Среда высушивания..................................................................................................................31

2.3.5. Процессы и технологическое оборудование......................................................32

2.4. Технологический контроль...................................................................33

2.4.1. Определение безвредности вакцины.....................................................................40

2.4.2. Определение иммуногенной активности противорожистой вакцины ........................................................................................40

2.4.2.1. Определение иммуногенной активности на белых мышах..................40

2.4.2.2. Определение иммуногенной активности противорожистой вакцины на свиньях..........................................................................................................................40

2.4.2.3. Требования к сухому стандартному заражающему штамму №149 возбудителя рожи свиней и порядок работы с ним....................41

2.5. Статистические методы обработки экспериментальных данных............................................................................................................................................................42

3. Технические и технологические основы для создания референс-вакцины................................................................................................................................................42

3.1. Правила безопасности, производственной санитарии, охрана карантинного и ветеринарно-санитарного режимов на предприятиях биологической промышленности................................................................42

3.1.1. Правила устройства и содержания проиводственных помещений............................................................................................................................................................42

3.2. Требования к оборудованию, измерительным приборам, средствам автоматизации, сырью и материалам, испольуемым в производстве вакцины............................................................................................................54

3.3. Технологические параметры и результаты биологического контроля, позволяющие получать стандартную вакцину............... 60

3.3.1. Исследования по оптимизации посевной дозы инокулята при глубинном культивировании в реакторах.............................. 62

3.3.2. Оценка результатов промышленного культивирования микроорганизмов штамма ВР-2 рожи свиней................................. 62

3.3.3. Оценка результатов промышленной технологии изготовления живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2...... 63

3.3.4. Характеристика готового продукта. Сухая живая вакцина против рожи свиней из штамма Егуз1ре1оШг1х гЬшюраЙиае ВР-2........................................................................... 64

3.3.5. Изучение стабильности промышленных серий живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Егуз1ре1о1:11пх г1ш-эюрайиае ВР-2............................................................... 65

3.4. Разработка рекомендаций, характеризующих референс-вакцину против рожи свиней из штамма Егуз1ре1о1:1тх ЮпшораЙпае ВР-2............................................................................. 66

3.5. Изучение гуморального иммунитета у трансгенных и нетрансгенных свиней, вакцинированных живой сухой рефе-ренс-вакциной против рожи свиней из штамма Егу81ре1о1:1шх гЬшюраЙиае ВР-2.......................................................... 67

3.5.1. Сравнительное изучение гуморального иммунитета у трансгенных и нетрансгенных свиней, вакцинированных живой сухой референс-вакциной против рожи свиней из штамма Егу-81ре1оЙтх йшвюрайцае ВР-2 с помощью метода пробы роста.... 68

3.5.2. Сравнительное изучение гуморального иммунитета у трансгенных и нетрансгенных свиней, вакцинированных живой сухой референс-вакциной против рожи свиней из штамма Егу-з1ре1оЙ1пх гИшюраЙцае ВР-2 с помощью ИФА....................... 69

3.5.3. Сравнительный анализ гуморального иммунитета у трансгенных и нетрансгенных свиней, вакцинированных живой сухой референс-вакциной против рожи свиней из штамма Егу-з1ре1о111г1х АшюраЙнае ВР-2, полученных методами пробы

роста и ИФА.................................................................. 70

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ............... 72

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.................................... 77

ВЫВОДЫ..................................................................... 77

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................. 80

ПРИЛОЖЕНИЯ............................................................. 105

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Биологической основой интенсификации и повышения эффективности свиноводства является вакцинопрофилактика и получение новых высокопродуктивных пород свиней за счет современной селекции и создания трансгенных свиней (Л.К.Эрнст, Г.Брем В.В.Устин, 1995; Рахманин П.П. и др. 1996 г.) (46, 129). Вопросами промышленной технологии производства вакцины против одной из самых распространенных болезней свиней - рожи (Е.С.Воронин и др., 1987; В.И.Геведзе и др., 1982; П.С.Рогожин и др., 1986; В.П.Урбан, 1981; И.А.Бакулов, 1998)(1, 15, 16, 96, 118), посвящены работы Луи Пастера, 1882; Т.Леффлера, 1886, Д.Ф.Конева 1904-1908; В.П.Меркулова и др., 1970-1972; О.Б.Дьяконова и др., 1972; Н.Т.Татаринцева, 1975; А.А.Воробьева, 1986; М.Я.Ярцева и др., 1990-1996; Н.Д.Скичко, 1996; А.Н.Панина, Р.В. Душу-ка, 1998; Н.В.Мельника, 1997, 1998 (15, 39, 67798, 107, 131).

Получение трансгенных животных является мощным рычагом селекции XXI века. Наряду с исследовательскими целями преследует решение важных народнохозяйственных задач, среди которых создание новых пород сельскохозяйственных животных, отличающихся высоким уровнем продуктивности, приспособленных к неблагоприятным условиям окружающей среды, устойчивых к стресс-факторам, невосприимчивых к инфекционным заболеваниям, продуцентов биологически активных белков - гормонов и ферментов, используемых в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности (Л.К.Эрнст и др., 19931996 гг.)(128, 129, 130).

Получение трансгенных свиней вызывает особый интерес, если учесть, что органы этих животных являются наиболее перспективными моделями органов донора для трансплантации их человеку (145).

Последние достижения в области генной инженерии вселяют надежду, что может быть создана такая генно-инженерная свинья, которая не будет стимулировать сверхострое отторжение у человеческих реципиентов. (Тоневицкий А.Г. и др., 1996).

Проведение исследований по изучению состояния иммунной системы у трансгенных свиней, вакцинированных противорожистой референс-вакциной, важно еще потому, что возбудитель рожи свиней вызывает заболевание и у человека. А это представляет не только научный, но и практический интерес для животноводства, ветеринарии и трансплантологии.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилось создание референс-противорожистой вакцины и использование ее для изучения гуморального иммунитета у трансгенных свиней.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- проанализировать этапы промышленного производства живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Егу81ре1о1;11пх гИшюраЙиае ВР-2;

- усовершенствовать промышленную технологию производства сухой живой вакцины против рожи свиней из штамма Егуз1ре1о1:11Пх гЫшораЙиае ВР-2;

- разработать рекомендации по требованиям к производству референс-вакцины и создать живую сухую референс-вакцину против рожи свиней из штамма Егуз1ре1о1:Ьпх гЫшораЙмае ВР-2;

- изучить стабильность референс-вакцины при хранении;

- изучить гуморальный иммунитет у трансгенных и нетрансгенных свиней, вакцинированных живой сухой референс-вакциной против рожи свиней из штамма Егуз1ре1оШпх гИшюраЙпае ВР-2;

- сравнить показатели гуморального иммунитета у свиней, определяемые методом проб роста с таковыми, полученными при использовании ИФА.

Научная новизна. Впервые создана живая сухая референс-вакцина против рожи свиней из штамма Егуз1ре1о1Ьг1х гЫшораЙиае ВР-2. Разработаны рекомендации по техническим и технологическим основам создания референс-вакцины. Определены основные параметры, характеризующие референс-вакцину. Впервые изучен в сравнении уровень гуморального иммунитета у трансгенных и нетрансгенных свиней, вакцинированных референс-вакциной.

Выявлена существенная зависимость показателя гуморального иммунного ответа, полученная методом проб роста с таковыми, определенных в ИФА.

Практическая значимость работы. Создание живой сухой референс-вакцины против рожи свиней из штамма Егу81ре1о1Ьг1х гЫшораЙиае ВР-2 и определенные ее основные параметры делают более стабильным промышленную технологию изготовления противорожистой вакцины. Использование референс-вакцины для изучения гуморального иммунитета повышает объективность оценки состояния иммунной системы у вакцинированных свиней и является дополнительным методом получения информации по трансгенным животным.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Биопрепараты для профилактики рожи свиней

1.1.1. Общие сведения о заболевании

Рожа свиней - септическая антропозоонозная инфекционная болезнь, протекающая остро и хронически в форме энзоотических вспышек (7,15, 97, 114, 116). Заболевание известно также под названием эризипелоид Розенбаха, свиная краснуха, эризипеллос, мышиная септицемия, краснуха натуралистов, эритема Бейкера (15).

Болезнь широко распространена во многих странах мира и вызывает большие потери свиней (15, 132). В Европе регистрируется повсеместно, часто встречается в странах Северной и Южной Америки. Заболевание нередко регистрируется в Турции, Индии, Индонезии, КНР, Японии (74). В США рожа свиней впервые установлена в 1885 г., в последние годы заболеваемость свиней рожей низкая, однако отмечается тенденция к ее повышению каждые 4-5 лет (222).

Первые сведения о роже свиней в России относятся к 1883 г. В настоящее время это заболевание распространено в стране повсеместно, его регистрируют в виде спорадических случаев или энзоотических вспышек (7, 79, 94).

1.1.2. Возбудитель рожи свиней Erysipelothrix rhusiopathiae

(E.insidiosa, E.rhusiopathiae suis) впервые был выделен и идентифицирован Р.Кохом (1878), затем описан Л.Пастером и Думасом (1882) во Франции и Леффлером (1881) в Германии (15, 45). E.rhusiopathiae - полиморфные, короткие палочки размером 0,25 ± 0,05 х 1,0 ± 0,5 мкм; располагаются одиночно или цепочками, неподвижных спор и капсул не образуют, хорошо окрашиваются обычными анилиновыми красками, грамположительные (15, 97). По данным электронно-микроскопических исследований в лизирующихся клетках видны протоспоры (4, 7, 74, 97, 114).

Эризипелотриксы размножаются перешнуровыванием с образованием ге-тероморфных клеток (71) Е.гЬшюраНиае - микроаэрофил. Хорошо растет в аэробных условиях на обычном или полужидком мясопептонном бульоне, среде Хоттингера и некоторых других питательных средах при температуре 37°С и рН 7,2 - 7,6. На МПА через 16-24 ч выращивания имеет вид мельчайших прозрачных росинчатых колоний (Б - форма). В старых культурах колонии имеют сероватый оттенок и шероховатую грубоволокнистую поверхность (Я - форма). На сывороточном агаре наблюдается более пышный рост (4, 7, 16, 60, 94, 101, 114).

Добавление в питательные среды углеводов: глюкозы, фруктозы, галактозы и лактозы обеспечивает максимальный рост эризипелотриксов (113). Оптимальная концентрация глюкозы в среде для их выращивания составляет 0,1% (115). При концентрации глюкозы более чем 1,25%, подавляется рост микроорганизмов. Ионы железа, введенные в среды в виде различных органических и неорганических солей, стимулируют рост бактерий, такое же действие оказывают соли марганца, меди, цинка (115).

В процессе роста бактерии, как правило, потребляют аргинин (112, 164, 166), интенсивно используют гистидин, триптофан, фенилаланин, метионин и лейцин, тогда как аспарагин, глицин, глютаминовую кислоту и аланин поглощают замедленно (166). Различий в метаболизме аминокислот микроорганизмами серологических типов А, В и N не выявлено (112). Отмечено, что все штаммы в процессе роста продуцируют какой-либо пептид, состоящий из аргинина, лизина, треонина, глицина и аспарагиновой кислоты. Продуцируемые пептиды задерживают рост эризипелотриксов. При исследовании путей катаболизма и анаэробной диссимиляции глюкозы Е.гИшюраЙиае установлено, что основным продуктом диссимиляции была молочная кислота и в меньшей степени - этиловый спирт, уксусная и муравьиная кислоты, а также двуокись углерода (195).

В.Гирард и Э.Снелл (18) рекомендуют для выращивания эризипелотриксов питательную среду, включающую кислотный гидролизат казеина,

дрожжевой экстракт, глюкозу, витамины (рибофлавин, тиамин и пантотенат кальция), фосфорнокислые соли натрия и калия, сернокислый магний рН - 7,8 -8,1. Оптимальная температура при культивировании 36°С. Дрожжевой аутолизат, пептон и триптон в составе питательных сред стимулируют рост этих бактерий (164).

Эризипелотриксы образуют сероводород, желатин не разжижают, индола не образуют; ферментируют с образованием кислоты лактозу, глюкозу, левулезу, галактозу, в слабой степени ксилозу, а иногда арабинозу, мальтозу и рамиозу; не ферментируют салицин (4, 97, 101). Весьма устойчивы к внешним воздействиям (7, 397).

Антигенную структуру эризипелотриксов изучали многие исследователи (82, 117, 155, 172, 175, 180, 211). По сообщениям (82, 107) первым на антигенное различие E.rhusiopathiae обратил внимание А.И.Похил в 1939 г., который установил, что все штаммы одинаково агглютинируются сывороткой, полученной при гипериммунизации кроликов одним из штаммов.

Впоследствии П.Уоттс в 1940 г. и Н.Аткинсон в 1941 г. на основании результатов реакции агглютинации (РА), связывания комплемента (РСК) и преципитации (РП) штаммы возбудителя рожи свиней впервые подразделили на две основные серологические группы (А и В). Штаммы, не реагирующие с ти-поспецифическими А- и В-антисыворотками, были отнесены к промежуточной N-rpynne (155).

G.Kucsera (180), G.Kucsera и A.Gimesi 1976 с помощью реакции преципитации в агаровом геле методом двойной диффузии выделили 18 серотипов эризипелотриксов.

К.Hashimoto, V.Yoshida, Y.Sugawara (172) при дифференциации культур эризипелотриксов, выделенных от больных свиней, 49 из них отнесли к сероти-пу А и 44 - к серотипу В. Из миндалин клинически здоровых свиней выделяли культуры серотипов В и N.

G.Kucsera (180), K.Hashimoto et al (172) считают необходимым уточнить серологическую классификацию возбудителя эризипелоида и предлагает обо-

значать серотипы арабскими цифрами вместо букв алфавита, а разницу в антигенной структуре у штаммов, относящихся к одному серотипу, отмечать индексами внутри серотипа. Этого же мнения придерживаются G.Gross и P.Claxton (153), которые обозначают субтипы, выделенные внутри серотипов, как 1а, 16 и т.д.

По данным M.Aagaard (132) всего описано 22 различных серотипа эризи-пелотриксов.

От больных рожей свиней чаще выделяют штаммы эризипелотриксов, относящихся преимущественно к типу А, реже - к типу В и очень редко к типу N (82, 107, 127, 219). По мнению R.L.Wood, R.Harrington (225) острую форму рожи у свиней вызывают серотипы А и В.

В зависимости от среды обитания наблюдается значительная изменчивость морфологических, культуральных и антигенных свойств эризипелотриксов (7, 78).

Н.Т.Татаринцев (107) при исследовании вакцинных, лабораторных, эпизоотических штаммов возбудителя рожи свиней методами перекрестной РА и РП в геле с типоспецифическими сыворотками подтвердил, что штаммы РС