Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ДИНАМИКА ОБРАЗОВАНИЯ И РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ КЛАССОВ АНТИТЕЛ У СВИНЕЙ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ ПРОТИВ РОЖИ ВАКЦИНОЙ ИЗ ШТАММА ВР-2 РАЗНЫМИ СПОСОБАМИ

с'

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ , ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ .> Всесоюзной ордена Ленина академии сельскохозяйственных

наук имени В. И. Ленина _. - ■

__На правах рукописи

Аспирант ВАРГАНОВ

• Виталий Иванович

' ДИНАМИКА ОБРАЗОВАНИЯ И- РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ КЛАССОВ АНТИТЕЛ У СВИНЕЙ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ ПРОТИВ РОЖИ ВАКЦИНОИ ИЗ ШТАММА ВР-2 РАЗНЫМИ СПОСОБАМИ

<16.00,03 — ветеринарная микробиология)

> АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук *

; ■■■ :' - ■ ' ■ ' ' Москва — 1974 I

t

\ -

■v

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ Всесоюзной ордена Ленина академии сельскохозяйственных _наук имени В. И. Ленина

На правах рукописи

Аспирант ВАРГАНОВ Виталий Иванович

ДИНАМИКА ОБРАЗОВАНИЯ И РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ КЛАССОВ АНТИТЕЛ У СВИНЕЙ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ ПРОТИВ РОЖИ ВАКЦИНОИ ИЗ ШТАММА ВР-2 РАЗНЫМИ СПОСОБАМИ

(16.00.03 — ветеринарная микробиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва — 1974

Работа выполнена в лаборатории иммунитета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринария (директор—заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных наук, академик ВАСХНИЛ, профессор Я. Р. КОВАЛЕНКО) .

Материалы диссертации изложены на 136 страницах машинописного текста, ¡иллюстрированы 23 таблицами и 10 рисунками. Список .использованной литературы включает 285 работ,в том числе 168 отечественных и 117 иностранных.

Научный 'руководитель — заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных наук, академик ВАСХНИЛ, профессор Я. Р. КОВАЛЕНКО.

Официальный оппоненты

Заслуженный' деятель науки РСФСР, доктор биологических наук, профессор П. И. ПРИТУЛИН.

Кандидат ветеринарных наук Н. М. НИКИФОРОВА.

Ведущее научное учреждение — Московская ордена Трудового Красного Знамени ветеринарная академия имени К. И. Скрябина.

Автореферат разослан «24 »апреле 1974 г.

Защита диссертации состоится •<» иК>КЛ 1974 г, в 14 часов на заседании Ученого Совета Всесоюзного ордена Ленина .института экспериментальной ветеринарии (Москва, 109472, В-ИЗкВ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

виэв.

Ученый секретарь Совета, кандидат биологических наук В. В. КАЛУГИН.

Решения XXIV съезда КПСС и декабрьского 1973 года Пленума ЦК КПСС о специализации и интенсификации животноводства предусматривают создание крупных животноводческих комплексов и специализированных хозяйств. Переход животноводства на промышленную основу и сосредоточение большого количества животных на ограниченной территории повышает ответственность ветеринарной науки за разработку падежных мер специфической профилактики инфекционных болезней сельскохозяйственных животных.

Одним из методов предупреждения инфекционных болезней является иммунопрофилактика. Несмотря на достигнутые успели в этой области, продолжаются поиски новых эффективных биопрепаратов и разработка наиболее рациональных методов их .применения. Вместе с этим, совершенствование мер борьбы с инфекционными болезнями путем применения вакцин требует расшифровки тех механизмов, благодаря которым организм становится невосприимчивым к заболеванию.

Одним из проявлений иммунной реакции является синтез в организме антител, способных вступать во взаимодействие с агентом, вызвавшем их образование. В настоящее время в достаточной мере изучен химический состав и структура антител. R. R. Porter (1959, 1962) впервые предложил схему строения молекулы иммуноглобулина. Метод иммуноэлек-трофореза, разработанный Р. Grabar, С. A. Williams (1953) позволил идентифицировать иммуноглобулины по антигенным свойствам. Установлено, что антигенная однородность коррелирует с однородностью многих химических, структурных и функциональных свойств антител. На этой основе комиссией Всемирной организации здравоохранения была принята международная ¡классификация, согласно которой различают пять классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, îgE, №

Многими исследователями показано, что различия антител по физико-химическим свойствам определяют их функциональные и биологические особенности (М. С. Freeman, А. В. Stavitski, 1965; D. Stanworth, G. Pardoe, 1967; P. Porter, D. E. Noakes, 1970).

В свою очередь, на синтез различных в иммуиохимичес-

ком отношении антител влияют такие фаюторы, как пр,ирода антигена, доза, длительность и место приложения антигенного воздействия, физиологические особенности подвергающегося иммунизации организма (У. Бойд, 1958; Л. Б. Богоявленская, 1968; В. Н. Кузнецов, 1968 и др.).

Из приведенного следует, что изучение качественного состава антител 'становится необходимым при иммунизации против каждой отдельной инфекции с учетом вида животных, их возраста и физиологического состояния.

Учитывая недостаточную мзучешгость этих вопросов при рожистой .инфекции у свиней, перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Изучить динамику образования и угасания антител отдельных классов у свийей, иммуншировашшх .ва,кциной против рожи .¡13 штамма ВР-2 подкожным, внутрикожпым и внутримышечным методами.

2. Установить связь серологической и (Превентивной активности сыворотки крови иммунизированных против рожм свиней с содержанием в ней антител ^М— и — класса.

3. Выяснить зависимость напряженности иммунитета от содержания в сыворотке крови свиней антител различной иммунохимической характеристики.

4. Изучить соотношение и функциональные особенности макро- и микроглобулиновых антител противорожистой гипериммунной сыворотки.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Материалы н методы исследования

Исследования проводили в лаборатории иммунитета и на опытной базе ВИЭБ. В опытах было использовано: 48 подсвинков, 12 кроликов и 1070 белых мышей.

В качестве антигена использовали полужидкую вакцину против рожи свиней из штамма ВР-2. Дозу вакцины расчитывали по количеству живых бактериальных клеток в 1 мл вакцины. Подсвинкам вводили вакцину однократно, в дозе 1 млрд. микробных клеток внутрикожно, подкожно и внутримышечно в области верхней трети шеи. Кроликам инъецировали вакцину дважды, с интервалом 25 дней, в дозе 160 млн. и 1 млрд. микробных клеток подкожно и внутрикожно в области верхней трети шеи.

Кровь от свиней брали из передней полой вены по методу, описанному М. А. Сидоровым (1967). Кровь от кроликов получали из краевой вены уха.

Наличие антител в сыворотке крови животных и иммуно-

.[ лобулиновых.фракциях определяли с помощью реакции агглютинации и пробок роста. Сущность пробы роста, предложенной в. и^еПшапп, К Неипег (1957) состоит в агглютинирующем и задерживающем рост бактерий действия испытуемой сыворотки.

Уровень общего белка в исследуемых пробах сыворотки крови определяли путем рефрактометрии с пересчетом в г%.

Для разделения сыворотки крови на белковые фракции разной физико-химической характеристики применили метод гельфильтрации на сефадексе Г-200 в колонках размером 1,5x55 см. Белковые фракции элюировали трис-буферным раствором со скоростью тока 2 мл в 30 минут. Для отбора фракции пользовались коллектором марки ЭР*-62. Содержание белка во фракциях измеряли при помощи спектрофотометра СФ-4А (по поглощению при 280 им.). Показатели экстинкцди спектрофотометра переводили в мг% по формуле О. Н. Ьои<ту е! а1. (¡951). Для оценки уровня той или иной фракции в сыворотке крови брали относительную величину, характеризующую среднее содержание белка в порциях элюата, составляющих пик этой фракции. ,

Параллельно с гельфильтрацией на сефадексе Г-200 определяли белковые фракции сыворотки крови методом электрофореза на бумаге.

Превентивные свойства сыворотки и белковых фракций изучали в опытах на белых мышах. Различные дозы сыворотки вводили мышам подкожно, в области спины. Через 24 часа мышей заражали одной минимальной летальной дозой вирулентного возбудителя рожи, штамм № 1329.

Состояние противорожистого иммунитета у свиней определяли путем их заражения вирулентной культурой возбудителя рожи по методу, отработанному и принятому в лаборатории иммунитета ВИЭВ (Я. Р. Коваленко, М. А. Сидоров, Н. Т. Та-таринцев, 1970),

Для изучения уровня иммуноглобулиновых фракций, серологической и превентивной активности антител использовали противорожистые гипериммунные сыворотки от свиней серий №№ 7, 29, 30, 31, 32, изготовленные Приволжской биофабрикой и серии № 47, изготовленной Армавирской биофабрикой.

Всего проведено 2178 биологических, серологических и биохимических исследований. Цифровой материал обработан методом вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Динамика общего белка и белковых фракций сыворотки -крови животных, иммунизированных вакциной из штамма ВР-2

Фракционирование сыворотки крови кроликов. Для предварительных исследований в качестве модели мы избрали кроликов, поскольку от этих животных можно получить достаточно большое количество сыворотки крови, необходимое для гельфильтрацни. На каждый метод введения вакцины взяли по 4 кролика. Группу из 4 животных оставили в качестве контроля. Гельфильтрацию сыворотки крови на сефадексе Г-200 провели до иммунизации и через 15 дней после введения кроликам вакцины из штамма ВР-2. На столбик сефадекса наносили 2,5 мл кроличьей сыворотки. Белковые фракции элюирова-ли трис-буферным раствором следующего состава: ОД М трис —НС1 в 1 М N301, при рН—7,0.

В результате проведенных исследований было установлено, что в сыворотке крови кроликов ,которым вакцину вводили подкожно и внутрикожно, через 15 суток уровень 19Б— иммуноглобулинов 1ш повысился. Вместе с этим в обеих группах животных отмечено увеличение 7 Э — иммуноглобулиновой фракции. Причем, у кроликов, вакцинированных внутрикожно, разница по сравнению с исходной концентрацией была наиболее выражена и составила 50,0 мг%. (Р < 0,05).

Несмотря на повышение содержания 7 Б—иммуноглобулиновой фракции, результаты исследования сыворотки крови кроликов в пробе роста продолжали оставаться отрицательными, в связи с чем была проведена ревакцинация кроликов теми же методами.

Фракционирование сыворотки крови жнвотных показало, что уже на 7 день после ревакцинации у кроликов, привитых внутрикожно, уровень 19$ —иммуноглобулинов повысился на 42 мг%, (Р<0,05). В последующем, через 15 дней, он снизился до первоначального, оставаясь на этом уровне до 30 дня (окончание срока наблюдения). В группе кроликов, иммунизированных подкожно, увеличения макроглобулиновой фракции не наблюдалось в течение всех сроков исследований.

Содержание 7 Э— иммуноглобулинов в сыворотке крови продолжало нарастать после ревакцинации у всех жнвотных независимо от способа иммунизации, достигнув максимальной величины к 30 дню, В это время показатель уровня микроглобулинов в группе кроликов, привитых подкожно, достиг 421 ± ^г49 против исходного 316±20 мг%, и в группе кроликов, привитых внутрикожно, составил 405±26 против 311 ±17 мг% до 6

введения вакцины. Однако достоверность разницы отмечена только у животных, вакцинированных внутрикожно.

С целью изу^^ия динамики общего белка и электрофоре-тнческих белковых фракций сыворотку крови иммунизированных кроликов исследовали через 7, 10, 15, 25 дней после вакцинации и через 7, 15, 30 дней после ревакцинации. Повышение о(%|ц?го белка в обеих группах животных отмечено на 7 день после введения вакцины, В этот период содержание его увеличилось у животных, привитых подкожно, с 6,У9±0,2й до 7,57:±0,25 г% и у животных, привитых внутрикожно, с 7,093: ± 0,06 до 7,?8±0,13 г%.. В последующем количество общего белка приблизилось к первоначальному и оставалось на таком уровне даже после ревакцинации.

Уровень альбуминов повысился на 10 день после введения вакцины среди кроликов, иммунизированных подкожно, с 4,02±0,15 до 4,34±0,23 т%, а у кроликов, иммунизированных внутрикожно —с 4,28±0,15 до 4,78±0,08 г%, (Р < 0,05). В последующие сроки исследований количество альбуминов в сыворотке крови было близким к исходному уровню.

Колебания глобулнновых фракций были слабо выражены при низком уровне достоверности (Р > 0,2) на протяжения всего срока наблюдения.

Результаты, полученные в предварительном опыте на кроликах, свидетельствовали о том, что метод гельфильтрации сыворотки крови на сефадексе Г-200 являлся более чувствительным по сравнению с электрофорезом на бумаге. Кроме того, фракционирование сыворотки крови на сефадексе Г-200 позволило выявить более интенсивную иммунологическую реакцию у кроликов, привитых внутрикожно.

Фракционирование сыворотки крови подсвинков. Гель-фильтрация на сефадексе Г-200. Опыт на кроликах показал, что метод гельфильтрации дает возможность проследить за динамикой иммуноглобулиновых фракций сыворотки крови при формировании иммунитета. Поэтому мы использовали данный метод для изучения фракционного состава сыворотки крови у иммунизированных свиней. Исследования провели в двух идентичных по условиям опытах. На каждый метод введения вакцины брали группу из 4 животных. В качестве контроля оставляли илтактными 4 подсвинков. Сыворотку крови животных исследовали до иммунизации и через 7, 15, 25, 40, 60, 90 дней после введения вакцины. В первом опыте проводили гельфпльтрацию индивидуальных проб сыворотки,'во втором—фракционировали групповые сыворотки. Следует отметить, что режим гельфильтрации сыворотки крови свиней имел некоторые особенности. На столбик сефадекса мы наносили

!,5 мл сыворотки, а белковые фракции элюировади трис-бу--ферным раствором, содержащим 0,5 М Ь'аС1 и 0,05 М трнс-НС1, рН —7,0.

Результаты фракционирования сыворотки крови в первом опыте показали, что увеличение количества макроглобулинов наблюдалось уже на 7 день после иммунизации животных. Так, в группе подсвинков, которым вакцину вводили подкожно, уровень 19 Б — иммуноглобулинов повысился от 218 до 266 мг%., при внутрикожном введении вакцины —от 222 до 240 мг%, при внутримышечном введении вакцины — от 243 до 282 мг%,. Однако, наиболее равномерное увеличение этой фракции отмечено в группе подсвинков, иммунизированных вну-трикожно (Р < 0,02) На 15 день после вакцинации макрогло-булиновая фракция была увеличена во всех группах (Р<0,05),. сохраняясь приблизительно на этом уровне до 90 дня у подсвинков, привитых подкожно н внутрикожно. У части животных, иммунизированных внутримышечно, наблюдалось снижение ее уровня с 40 дня после вакцинации.

Повышение содержания 7 Б—иммуноглобулнновой фракции в крови вакцинированных свиней отставало по времени от макроглобул и нов. На 15 день после введения вакцины уровень этой фракции возрос в группе животных, иммунизированных внутрикожно, на 87 мг%. (Р < 0,05), а у подсвинков, иммунизированных внутримышечно, — на 148 мг% (Р < 0,002), При подкожной иммунизации существенное увеличение количества

7 Б — иммуноглобулинов наблюдали лишь на 25 день после прививки. Их уровень повысился на 99 мг%, (Р<0,05). Однако максимальное значение уровня этой фракции в данной группе животных было отмечено на 40 день поствакцинального периода. К 60 дню после вакцинации у животных всех опытных; трупп наблюдалось снижение количества 7 Э — иммуноглобулинов, а через 90 дней их уровень не превышал исходного.

Со втором опыте изменения иммуноглобулиновых фракций в поствакцинальном периоде у животных проходили менее интенсивно. Нарастание 19 8 — иммуноглобулинов отмечалось на 7 и 15 день после вакцинации. Повышенный уровень этой фракции в более отдаленные сроки после иммунизации сохранился только у подсвинков, привитых внутрикожно. Через 7 дней после введения вакцины содержание 7 5 — иммуноглобулинов увеличилось в группе подсвинков, иммунизированных внутрикожно на 87 мг%. Менее значительно возрос уровень этой фракции в группе животных, привитых внутримышечно, У подсвинков, вакцинированных подкожно, увеличение концентрации 7 Э—иммуноглобулинов на 50 мг% наблюдали только через 25 дней после введения вакцины.

Как видно из результатов опытов, повышенное содержание

7 3 — иммуноглобулиновой фракции в крови привитых животных сохраняется не более 2-х месяцев. В связи с этим необходимо было выяснить существует ли коррелятивная зависимость количества антител определенного класса от уровня соответствующей иммуноглобулиновой фракции сыворотки кровн. С этой целью фракционировали на сефадексе Г-200 пробы 6 серий противорожистой гипериммунной сыворотки, полученной от свиней и 16 проб сыворотки крови интактных подсвинков, Результаты проведенных исследований показали, что количество 7 5 — иммуноглобулинов в гипериммунных и нормальных сыворотках почти одинаково (463 и 458 мг% соответственно). Однако с 7 Б — иммуноглобулиновой фракцией гипериммунных сывороток связана большая часть специфических антител, в то время как в микроглобулиновой фракции нормальной сыворотки антитела отсутствовали.

Уровень 19 Э — иммуноглобулинов гипериммунных сывороток оказался выше последнего в сыворотках неиммунных животных на 32% при Р < 0,05, хотя эта фракция по титру антител в пробе роста и реакции агглютинации уступала микроглобулиновой фракции.

Таким образом, результаты проведенных опытов свидетельствуют о возможных случаях несоответствия уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови с содержанием в пей специфи-. ческих антител,

Э л е ктр оф орет нч ее ко е разделение белков сыворотки крови подсвинков. Динамика общего белка и электрофоретических белковых фракций в сыворотке крови иммунизированных животных характеризовалась следующими показателями: на 7 день после введения вакцины у всех опытных животных снизился общий белок. Причем, наиболее равномерное снижение отмечено в группах свиней, привитых подкожно и внутрикож-но: с 6,65 до 6,28 г% и с 7,34 до 6,75 г% соответственно (Р<0,06). В последующие дни количество общего белка незначительно превышало исходный уровень у всех опытных животных. Уменьшению содержания в сыворотке крови общего белка соответствовало снижение уровня альбуминовой фракции, К 15 дню концентрация альбуминов повысилась и до 90 дня оставалась близкой к исходному уровню.

На 15 день после вакцинации животных наблюдали увеличение альфа-глобулиновой фракции. У свиней, иммунизированных подкожно, она возросла на 0,18 г%, внутрнкожно — 0,10 г-%, и внутримышечно —0,25 г%. В дальнейшем, в течение всего срока наблюдения, уровень альфа-глобулинов оставался незначительно повышенным у животных, привитых подкожно. При внутрикожной и внутримышечной иммунизации через

2 месяца после введения вакцины содержание ее снизилось до исходного уровня.

Изменения гамма-глобулиновой фракции наблюдали у подсвинков всех опытных групп. У животных, привитых внутрикожно и внутримышечно, наиболее высокое содержание указанной фракции отмечено на 25 день после вакцинации, В этот период разница по сравнению с исходным количеством гамма-глобулинов составила 0,16 и 0,23 г% соответственно. У подсвинков, привитых подкожно, уровень гамм а-глобулинов достиг максимального значения только через 40 днеГ( после введения вакцины, когда содержание этого белка равнялось 1,66 против 1,37 г% до иммунизации.

Однако, изменения альфа- и бета-глобулиновых фракций ни в одном случае не достигали достоверных значений. Показатели бета-глобулиновон фракции сыворотки крови животных на протяжении всего опыта существенно не изменялись.

Во втором опыте на подсвинках содержание общего белка и белковых компонентов сыворотки крови животных было подвержено меньшим изменениям. Незначительное повышение общего белка на 15 день после инъекции вакцины отмечали у подсвинков, привитых подкожно и внутрикожно. Однако, в группе животных, привитых внутримышечно, в этот период наблюдали тенденцию к снижению общего белка. При подкож-лой и внутрикожной иммунизации отмечено незначительное, ниже достоверного, увеличение содержания альфа-глобулинов на 15 день после введения яакшшы {на 0,08 и 0,05 г% соответственно). Количество гамма-глобулинов сыворотки крови животных при всех способах вакцинации оставалось неизменным и даже несколько понизилось к концу опыта.

Таким образом при помощи фракционирования сыворотки крови на сефадексе Г-200 удается наиболее четко выявить изменения белковых фракций по сравнению с электрофорезом на бумаге. С помощью гельфильтрацпи нами установлена более ранняя и преобладающая по интенсивности иммунобиологическая перестройка организма свиней, иммунизированных против рожи внутрнкожным способом.

2. Нарастание и угасание антител в сыворотке крови и отдельных белковых фракциях иммунизированных животных.

Изменения активности сыворотки крови в пробе роста.

В предварительном опыте на кроликах было установлено, что специфические антитела, выявляемые пробой роста, появились в сыворотке крови животных на 5 день после ревакцинации. Особенно четко это былп выражено у кроликов, приви-10

тых внутри кож но. Причем, нарастание антител совпадало с увеличением в сыворотке крови кроликов 193 — иммуноглобу-лкновон фракции. Такая корреляция дает основание предполагать о связи антител, выявляемых пробой роста, с макро-глобулиновой фракцией сыворотки крови.

При исследовании сыворотки крови свиней в первом опыте было установлено, что до вакцинации антитела не обнаружи-ьались или их титр не превышал 10%. Подъем титров антител отмечен через 7 дней после иммунизации подсвинков. Однако у части животных проба роста в этот период оставалась отрицательной. Необходимо заметить, что отрицательно реагировали те подсвинки, у которых еше не повысилось содержание в крови м акр оглоб ул и н о вой фракции или увеличение ее было незначительным.

На 15 день после вакцинации отмечено резкое увеличение содержания антител в сыворотке крови всех опытных групп животных, когда титр у подавляющего большинства подсвинков составлял 2,5—1,25%. На этом уровне концентрация антител в сыворотке крови животных при подкожной и внутри-кожной иммунизации оставалась до 90 дня. В группе животных, привитых внутримышечно, к СО дню с момента введения вшцикы наблюдали незначительное снижение титра антител.

Таким образом, использованные нами методы введения вакцины в одинаковой мере стимулировали у животных синтез антител, выявляемых в пробе роста, титр которых достигал 5,0—1,25%. на 15 день после вакцинации и удерживался на этом уровне в подавляющем большинстве случаев в течение ДО дней.

В повторном опыте на свиньях нарастание антител в сыворотке крови вакцинированных разными способами животных проходило аналогично первому опыту. Следует только отметить, что в этом опыте связь между активностью сыворотки в пробе роста и уровнем иммуноглобулиновых фракций была менее четко выражена.

Содержание агглютининов в сыворотке крови и ее имму-ноглобулиновых фракциях. Для суждения о принадлежности антител к определенному классу необходимо было ыяснить количественное их содержание в отдельных иммуноглобулиновых фракциях сыворотки вакцинированных против рожи свиней.

Эти исследования мы провели во втором опыте на подсвинках. Иммуноглобулиновые фракции получали путем гельфиль-трации на сефадексе Г-200 групповых сывороток (смесь равных объемов сыворотки кровн'животных, составляющих группу по методу введения антигена). Степень разведения полученных фракций рассчитывали по отношению их объема к коН

личеству наносимой для гельфильтрации сыворотки. Для, определения количества антител использовали реакцию агглютинации. Параллельно с иммуноглобулиновыми фракциями определяли титр антител в исходной сыворотке.

В результате проведенных исследований было установлено, что до вакцинации в сыворотке крови опытных подсвинков содержались нормальные антитела в титре 1 :40, связанные с ОБ—иммунноглобулиновой фракцией. Нарастание антител происходило только в 19 Э—иммунноглобулиновой фракции. Так, на 7 день после введения вакцины титр этой фракции возрос до! : 160 во всех группах подсвинков, оставаясь на таком уровне до 25 дня. На 40 день в группах животных, привитых подкожно и внутримышечно, и на 60 день у животных, привитых вну-трикожно, содержание антител 19 Э — фракции снизилось до титра 1 :80 .который сохранился до окончания срока наблюдения (90 дней).

Иммуноглобулиновая фракция с константой седиментации: 7 5 и белковая фракция третьего пика гельфильтрации (5 5) в реакции агглютинации на протяжении всех сроков исследования оказались неактивными.

Титр антител цельной сыворотки па одно разведение превышал титр 19 Э —иммуноглобулнновой фракции. Например, до иммунизации подсвинков он равнялся 1 :80, в период наивысшего подъема уровня антител достигал разведения сыворотки 1 : 320, а у подсвинков, привитых внутрикожно, — даже 1:640. Снижение титра цельной сыворотки соответствовало-уменьшению количества антител в макроглобулиновой фракции и было более поздним в группе животных, вакцинированных внутрикожно.

Необходимо отметить, что сыворотка крови подсвинков контрольной группы содержала агглютинины на протяжении1 всего опыта в титре 1 :80, которые были связаны с 19 Я—иммуногл обулиновой фракцией.

Полученные данные свидетельствуют о том, что агглютинины связаны с 19 5 — иммуногл обул иновой фракцией сыворотки крови животных независимо от способа вакцинации. Вну-трикожный метод введения вакцины иызывал более интенсивный и длительный синтез агглютининов по сравнению с подкожной и внутримышечной иммунлзаацией.

Антитела гипериммунной противорожистой сыворотки,-В проведенных нами исследованиях выяснилось, что 7 Э — иммуноглобулиновая фракция сыворотки крови вакцинированных подсвинков ие обладает активностью в реакции агглютинации даже в то время, когда уровень ее повышен, а титр исходной сыворотки достигает своих максимальных значений. С целью определения возможности синтеза противорожистых. 12

антител, относящихся к igG — классу мы провели исследование гипериммунной сыворотки.

Противорожистую гипернммунную сыворотку серии № 29 фракционировали на сефадексе Г-200. Отдельные иммуногло-булиновые фракции параллельно с исходной сывороткой исследовали в реакции агглютинации. В результате было установлено, что титр суммарных антител равнялся 1 :20480, а титр 7 S — антител в значительной степени превышал активность 19S — антител (1:2560 против 1:640).

Кроме того мы изучили 6 серий производственной гипериммунной сыворотки с целью определения активности имму-ноглобулиновых фракций в пробе роста. Фракционирование указанных сывороток провели на сефадексе Г-200. При исследовании иммуноглобулиновых фракций выяснилось, что агглютинирующая способность разных классов антител в пробе роста проявлялась аналогично таковой в реакции агглютинации. Титр 7 S — антител достигал в разных сыворотках 0,31 — 0,076%. Активность 19 S — антител была ниже на одно—-два разведения (1,25—0,31 %). Исходные сыворотки содержали антитела в титре 0,019—0,0095%.

Проведенные исследования показали ,что формирование противорожистого иммунитета сопровождается синтезом не только 19 S — но и 7 S — антител. Однако в реакции агглютинации антитела 7 S — класса выявляются при соответствующем уровне их содержания в исследуемой сыворотке крови. Вследствие этого, по титрам агглютининов при однократной вакцинации не представляется возможным судить о наличии в сыворотке крови иммунных свиней антител IgG — класса,

3. Превентивные свойства белковых фракций и нативнои сыворотки вакцинированных свиней

Защитная активность сыворотки крови иммунизированных подсвинков. Превентивные свойства сыворотки крови свиней изучали через 15, 40 и 90 дней после введения вакцины. Проведенные исследования показали, что сыворотка крови всех опытных подсвинков, полученная через 15 диен после вакцинации, обладает хорошо выраженными защитными свойствами. Наиболее отчетливо они проявлялись при дозе сыворотки 0,3— 0,5 мл. Так, сыворотка крови подсвинков, иммунизированных внутримышечно, обеспечила защиту от гибели 36% мышей. Выживаемость мышей, привитых сывороткой крови подкожно иммунизированных животных, составила 33%. Менее высокими превентивными свойствами обладала сыворотка крови подсвинков, иммунизированных внутрикожно. Она предохранила от гибели 26% мышей. Однако разница по сравнению с дру-

гимн группами опытных животных не была достоверной (Р > 0,5).

При исследовании сыворотки крови, взятой у подсвинков через 40 дней после введения вакцины, отмечено резкое снижение ее превентивных свойств у всех животных. Например, сыворотка крови подсвинков, привитых внутримышечно, предохранила от гибели 2 мышей из 64. Сыворотка крови подсвинков, привитых подкожно, защитила от гибели 3 мышей из. 64, а сыворотка крови внутрикожно иммунизированных животных не предохранила ни одной мыши.

Через 90 дней после иммунизации испытание защитных сзойств сыворотки крови подсвинков всех опытных групп показало аналогичные результаты.

Таким образом, данные опыта свидетельствуют о том, что через 15 дней после вакцинации наблюдается наиболее высокая концентрация защитных антител в сыворотке крови подсвинков. В более поздние сроки содержание их резко снижается. Использованные нами методы введения вакцины не вызывали существенных различий в стимуляции синтеза защитных антител у животных.

Защитная активность иммуноглобулиновых фракций про--тиворожистой гипериммунной сыворотки. В связи с тем, что иммунная активность сыворотки крови однократно вакцинированных свиней была сравнительно невысокой, мы исследовали превентивные свойства иммуноглобулиновых фракций проти-ворожистой гипериммунной сыворотки, полученной от свиней. Для этой цели использовали сыворотку серии 29, контроль 29, изготовленную 20. VIII. 1971 г. Приволжской биофабрикой.

Испытуемую сыворотку в дозе 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,012; н 0,006 мл, доведенной физиологическим раствором до объема 0,5 мл, вводили внутрибрюшинно мышам за 2 часа до их заражения одной минимальной летальной дозой вирулентного возбудителя рожи, В результате было установлено, что сыворотка в дозе 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 и 0,012 мл обеспечивала пассивную защиту всех мышей в течение срока наблюдения (10 суток). В соответствии с этим мы приняли 0,012 мл сыворотки за одну протектнвную дозу, т. е. минимальное ее количество, которое обеспечивало 100%-ную защиту мышей от гибели.

Гипериммунную сыворотку указанной выше серии фракционировали на сефадексе Г-200. Полученные фракции испытывали в опыте на белых мышах. С этой целью исследуемые фракции в количестве, соотвтствующем содержанию их в 0,5; 1,0; 2,0 и 8,0 протективных дозах исходной сыворотки, вводили внутрибрюшинно белым мышам в объеме 0,5 мл (объем дозы фракции доводили до 0,5 мл трис-буферным раствором, который использовали для элюировання последних при гельфиль-14

трации сыворотки). Параллельно ,с целью контроля, мышам еводили гипериммунную сыворотку в этих же дозах. На каждую дозу фракции и сыворотки брали по 10 мышей. Через 2 часа после инъекции фракций и сыворотки мышей заражали подкожно 1 ДЛМ возбудителя рожи. Наблюдение за мышами вели в течение 10 суток с момента их заражения. На отдельных группах мышей проверили трис-буферный раствор на токсичность и отсутствие защитных свойств.

В результате проведенных исследований было установлено, что 19 5 — иммуноглобулиновая фракция на обладала защитными свойствами даже в количестве, соответствующем содержанию ее в 8 протектнвных дозах нативной сыворотки. Защитные антитела не содержались и в альбуминовой фракции (5 Э). В,то время как 7 Э— иммуноглобулиновая фракция в 8 протектнвных дозах предохраняла 100% мышей от гибели. Две протективные дозы этой фракции обеспечили сохранность 50%. мышей. Результаты защитной активности цельной сыворотки соответствовали предварительной лодтитровке. Тряс-буфер-ный раствор, в котором были растворены белковые фракции, оказался нндеферентным и не влиял на результаты опыта.

Таким образом, результаты исследований показали, что защитные свойства противорожистой гипериммуинон сыворотки обусловлены антителами 1й6 — класса. Исходя из этого можно полагать, что в сыворотке крови однократно иммунизированных подсвинков к 15 дню после введения вакцины накапливается максимальное количество антител — класса. Через 40 дней уровень их снижается, о чем свидетельствует полная утрата превентивной активности сывороткой кроэа вакцинированных животных.

4. Испытание напряженности иммунитета у вакцинированных подсвинков

Исходя из того, что серологические реакции, биохимические показатели и даже иммунные свойства сыворотки крови не всегда в полной мере отражают состояние напряженности иммунитета, мы считали необходимым провести контрольное заражение вакцинированных животных вирулентным возбудителем рожи. Экспериментальное заражение подсвинков в обоих опытах провели через 90 дней после вакцинации. С этой целью использовали дерматропний штамм возбудителя рожи

В результате заражения в первом опыте слабая кожная реакция проявлялась у одного подсвинка, привитого подкожно, одного — внутрикожно и у двух животных, вакцинированных внутримышечно. Учитывая отсутствие лихорадки и хоро-

:шее общее состояние подсвинков, мы имели основание полагать, что'данные животные не утратили иммунитет. Однако степень напряженности иммунитета у них, по-видимому, была более низкой по сравнению с остальными опытными животными, которые-вообще не реагировали на заражение.

При испытании напряженности иммунитета во втором опыте, из 12 вакцинированных различными методами подсвинков незначительная кожная реакция наблюдалась у двух животных, привитых подкожно. Общее состояние этих животных оставалось удовлетворительным, температура тела не превышала физиологическую норму.

Контрольные животные в обоих опытах переболевали с ярко выраженной общей и местной реакцией организма. У большинства из них наблюдалась генерализация инфекции.

Полученные результаты позволили нам полагать, что все использованные методы введения вакцины обеспечили формирование прочного иммунитета у животных. Кожная реакция у отдельных подсвинков, вероятно, в большей степени связана с индивидуальными особенностями, чем с методами введения антигена.

Необходимо отметить, что титр антител в пробе роста у реагирующих на заражение животных был одинаковым с теми, которые не проявили никакой реакции.

Влияние методов введения вакцины на скорость формирования иммунитета у свиней. В связи с тем, чго в предыдущих опытах не было установлено существенных различий в напряженности иммунитета у подсвинков в зависимости от способов вакцинации, мы изучили влияние метода введения вакцины на скорость формирования иммунитета. С этой целью провели опыт на подсвинках в условиях, аналогичных первым двум опытам, с той лишь разницей, что напряженность иммунитета путем заражения вакцинированных животных испытали через 9 дней после иммунизации.

В результате экспериментального заражения у всех подсвинков, вакцинированных разными способами ,не было отмечено кожной реакции, повышения температуры тела и других признаков болезни. Контрольные животные заболели рожей в тяжелой форме, с повышением температуры тела до 41,5— 42,(Г и четко выраженной кожной реакцией. Из органов павшего животного выделили исходную культуру.

Таким образом, результаты проведенного опыта свидетельствуют об отсутствии различий в скорости формирования иммунитета у подсвинков в зависимости от способа вакцинации.

Необходимо отметить, что отдельные животные оказались устойчивыми к заражению даже при 10,0%-ном титре сыво-1«

ротки или отрицательных показателях пробы роста. Это подтверждает наблюдения, сделанные нами в предыдущих опытах, о случаях отсутствия прямой зависимости между титрами антител в пробе роста и состоянием иммунитета у вакцинированных подсвинков.

ВЫВОДЫ

1. Формирование противорожистого иммунитета у свиней в ответ на введение вакцины из штамма ВР-2 сопровождается продукцией антител и накоплением их в сыворотке крови животных. Появление антител отмечается с 7-го дня после введения вакцины, а максимальное содержание — в период с 15 до 25 дня с последующим постепенным снижением их уровня.

2. Независимо от метода введения вакцины из штамма ВР-2 в организме свиней синтезируются антитела, относящиеся к ^М — и ^<3 — классу.

3. Количественное соотношение микро- и макроглобулино-вых антител изменяется в процессе формирования и угасания иммунитета. Оба класса антител достигают максимального уровня в сыворотке крови свиней на ]5—25 день после вакцинации. Количество 1§0 — антител уменьшается быстрее по сравнению с антителами ^М—-класса. Через 40 дней после введения вакцины в сыворотке крови животных обнаруживаются только 1еМ — антитела,

4. У иммунных подсвинков защитную роль выполняют антитела —класса, ^М—антитела, по-видимому, выполняют роль фактора, обусловливающего готовность организма к вторичному иммунологическому ответу. Невосприимчивость вакцинированных свиней к роже зависит от концентрации в их сыворотке крови антител — класса и степени развития иммунологической «памяти».

5. В отдаленные сроки после иммунизации в сыворотке крови свиней происходит резкое снижение уровня антител

— класса. Состояние иммунитета у животных в этот период характеризуется готовностью организма к интенсивному образованию антител данного класса.

6. Агглютинины у вакцинированных животных связаны с антителами —класса. Случаи несовпадения показателей пробы роста и реакции агглютинации с напряженностью иммунитета объясняются тем, что указанные реакции не выявляют — антитела, обладающие защитными свойствами. Показателем концентрации антител 1^0 —класса может служить превентивная активность сыворотки крови свиней.

7. Внутрикожный метод введения вакцины по силе антигенного раздражения в сравнении с подкожной и внутримы-

шечной иммунизацией более эффективен. Но это различие не оказывает существенного влияния на напряженность иммунитета у свиней.

Список работ по теме диссертации:

1. Изучение 19 Б—и 7 в — иммуноглобулинов противоро-жнстой гипериммунной сыворотки. Доклады ВАСХНИЛ, 1973,. 7, 37—39.

2. Влияние способов вакцинации на уровень глобулиновых фракций и напряженность противорожистого иммунитета у свиней. Бюллетень ВИЭВ, 1973, вып. XVI, 43—47.

Материалы диссертации доложены на заседании Ученого Совета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии, 1973, декабрь.

Ответственный за выпуск — заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных наук, академик ВАСХНИЛ,. профессор Я. Р. Коваленко.

Заказ 515 Тираж 200 Тип. МВА