Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Эпидемиологический надзор за менингитами, вызванными Haemophilus influenzae типа b, и оценка приоритетных путей борьбы с ними

На правах рукописи

НИКОЛАЕВ Михаил Константинович

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ НАДЗОР ЗА МЕНИНГИТАМИ, ВЫЗВАННЫМИ HAEMOPHILUS INFLUENZAE ТИПА В, И ОЦЕНКА ПРИОРИТЕТНЫХ ПУТЕЙ БОРЬБЫ С НИМИ.

14.00.30 - Эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

/А/

vr

Москва-2009 г.

003464946

003464946

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека»

Научный руководитель: доктор биологических наук

Платонов Александр Евгеньевич

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор, Брико Николай Иванович.

заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор, Костюкова Наталья Николаевна.

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека»

Защита состоится «24» апреля 2009 г. в 11.30 часов на заседании диссертационного совета Д.208.114.01 в Федеральном государственном учреждении науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека» по адресу: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, За.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека».

Автореферат разослан Л март 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Горелов Александр Васильевич

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Haemophilus influenzae типа Ъ (Hib) - является возбудителем целого ряда заболеваний у детей, среди которых особое место занимают менингит, пневмония, эпиглотгат, остеомиелит, септический артрит и др.

По оценкам ВОЗ в мире ежегодно имеют место не менее 250000 случаев Hib менингита, обусловливающих около 40000 смертей (Bennett J.V. et al., 2002). Наиболее часто Hib менингиты развиваются у детей в возрасте от 4 до 18 месяцев жизни. Дети младше 1 месяца и старше 5 лет страдают этим заболеванием достаточно редко. Hib не является типичным возбудителем менингитов у взрослых.

Заболеваемость Hib менингитом у детей до 5 лет на территории РФ изучена недостаточно. Основной причиной этого является неэффективная лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов (ГБМ) в большинстве регионов РФ и отсутствие до настоящего времени официальной регистрации случаев ГБМ.

Проспективное популяционное исследование заболеваемости Hib менингитами среди детей младше 5 лет было проведено в Москве в 1999-2001 годах. Было установлено, что Hib вызывает 16% всех случаев бактериального менингита, при этом показатель заболеваемости составляет 5.7 на 100000 детей младше 5 лет (Платонов А.Е. и др., 2006). Это ниже, чем в большинстве европейских стран и стран американского континента до начала вакцинации.

Примечательно, что молекулярно-генетические исследования показали, что за Hib менингиты в Москве ответственен тот же геновариант Haemophilus influenzae типа b, что и в странах с ранее высокой заболеваемостью Hib менингитами до введения вакцинации (США, Нидерланды, Великобритания), то есть возбудитель с высоким потенциалом патогенности, который вполне способен проявиться в другое время, в другом месте или условиях (Миронов К.О.; 2004).

Чрезвычайное разнообразие географических и экологических условий, уровня социально-экономического развития в России не допускает механического применения результатов и выводов, полученных в ходе исследования проведенного в 1999-2001 годах в Москве, (Платонов А.Е. и др., 2006), для оценки перспектив НШ вакцинации в других регионах России. В силу высокой стоимости и трудоемкости проведение популяционного изучения заболеваемости, вызываемой ШЬ, в достаточном количестве регионов представляется делом не ближайшего будущего.

В сложившийся ситуации, альтернативным выходом может явиться оценка заболеваемости НЛ менингитом с помощью механизма экспресс-оценки НШ по методике ВОЗ, называемой НШ-КАТ. Методика была испытана и её работоспособность была подтверждена в 18 странах Азии, Африки, Европы и СНГ.

Цель работы. Выявить заболеваемость ШЬ менингитом на территории РФ и обосновать с помощью современных эпидемиологических, микробиологических и молекулярно-биологических методов необходимость усовершенствования эпидемиологического надзора за НШ инфекцией. Задачи исследования:

1. Ретроспективно изучить заболеваемость ШЬ менингитом в 16 городах России с помощью механизма экспресс-оценки НШ (ШЬ-ЯАТ).

2. Выяснить имеющиеся проблемы с лабораторной расшифровкой ГБМ в этих . городах.

3. Усовершенствовать эпидемиологический надзор и лабораторную диагностику ГБМ в Иркутске, Улан-Удэ, Якутске и Владивостоке.

4. Провести сравнительный анализ вклада различных диагностических методов в лабораторную расшифровку ГБМ на территории, где ранее они не применялись.

5. Установить реальную заболеваемость ГБМ различной этиологии в Иркутске, Улан-Удэ, Якутске и Владивостоке.

6. Генетически охарактеризовать выделенные штаммы НШ, изолированные от больных ГБМ на территории РФ, с использованием метода мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ).

Научная новизна исследования. Впервые на территории РФ для изучения заболеваемости ШЬ менингитом применен механизм экспресс-оценки ШЬ. Полученные оценки позволили определить ориентировочные уровни заболеваемости ШЬ менингитом в городах с низкой лабораторной расшифровкой ГБМ.

Впервые в проспективном исследовании заболеваемости ШЬ менингитом на территории 4-х городов Дальнего Востока и Сибири (Иркутск, Улан-Удэ, Якутск и Владивосток) были получены достоверные данные о заболеваемости ГБМ различной этиологии у детей до 5 лет и сопоставлены с полученными ранее оценками уровня заболеваемости ШЬ менингитом.

С помощью метода МЛСТ проведена генетическая характеристика выборки штаммов ШЬ, изолированных от больных ГБМ на территории РФ. Сопоставление полученных результатов с данными, содержащимися в международной базе данных, позволили впервые охарактеризовать штаммы, циркулирующие на территории РФ.

Получены данные для обоснования необходимости и перспектив использования в РФ конъюгированных вакцин против ШЬ.

Практическая значимость работы. В условиях недостаточно эффективной лабораторной расшифровки ГБМ в изученных городах заболеваемость ШЬ менингитом была оценена с использованием рекомендованного ВОЗ метода корректирующей экспресс-оценки заболеваемости ШЬ. Проведенное проспективное изучение заболеваемости ШЬ менингитом в 4-х городах Дальнего Востока и Сибири показало, что результаты экспресс-оценки отличались от окончательных не более чем на 30%, что свидетельствует о пользе применения метода ШЬ-ЯАТ в российских условиях.

Определены основные алгоритмы усовершенствования лабораторной диагностики ШЬ менингитов: 1) применение для посева СМЖ шоколадного

агара, приготовленного из бараньей крови и обогащенного факторами роста; 2) взятие и посев образца СМЖ как можно раньше, до начала антибиотикотерапии; при необходимости (в часы, когда бактериологическая лаборатория не работает) - взятие и посев СМЖ "у постели больного" лечащим персоналом; 3) широкое внедрение некультуральных методов (реакция латекс-агглютинации (PJ1A) и особенно ПЦР); 4) регулярный контроль качества диагностических процедур.

Доказана необходимость применения комплексного подхода к лабораторной диагностике ГБМ на примере 4-х городов Дальнего Востока и Сибири где исключительно за счет применения надлежащих питательных сред и некультуральных методов диагностики удалось повысить лабораторную расшифровку ГБМ до 80%.

Внедрения в практику. Материалы диссертации внедрены в работу Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Ярославской области, Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Мурманской области и Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Республике Бурятия.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на V Российском конгрессе детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей» (Москва, 6 декабря 2006 г.); Конгрессе Европейского общества по изучению детских инфекционных болезней (г. Порту, Португалия, 30 апреля - 5 мая 2007.); 9й Meeting of The European Monitoring Group on Meningococci. Rome (Italy), 2007, (Рим-Сиена. 30 мая - 5 июня.); XI Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии». (Москва, 5-8 февраля 2007 г.); XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». (Москва 16-20 апреля 2007г.); Научно-практической конференции педиатров России "Фармакотерапия в педиатрии" (Москва 17-19 октября 2007г.); II Российской конференции

"Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов". (Москва, 20-21 октября 2008 г.); Рабочих совещаниях региональных ТУ Роспотребнадзора, в городах, где проводились исследования.

Публикации. По теме работы опубликовано 10 печатных работ. В том числе 2 работы в журналах, рекомендованных ВАК к опубликованию основных научных результатов диссертации.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя (58 источников на русском языке и 62 - на английском). Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц и 14 рисунков.

Материалы и методы

Основные этапы проведения работы. Исследование проводилось в два основных этапа.

На первом этапе было проведено ретроспективное изучение заболеваемости №Ь менингитом на территории 16 городов РФ. При проведении работы по изучению заболеваемости НШ менингитом с использованием методики экспресс-оценки НШ-ИАТ был принципиально важен выбор территории. Для применения методики необходимо наличие достаточно большой популяции детей на территории; при наличии подозрения на менингит дети должны были госпитализироваться в заранее известное и небольшое число стационаров, обладающих возможностями диагностики и учета ГБМ. Было решено выбрать по 2-3 города из каждого федерального округа РФ, разнообразных по географическому расположению, этническому составу, культурно-социальному развитию, сравнительно плотно заселенных и удаленных от Москвы и Петербурга.

Были выбраны следующие города: в Центральном федеральном округе -Ярославль и Тула, в Приволжском федеральном округе - Казань, Чебоксары и Нижний Новгород, в Южном федеральном округе - Краснодар и Астрахань, в Северо-Западном федеральном округе - Мурманск, в Уральском федеральном

округе - Екатеринбург и Тюмень, в Сибирском федеральном округе - Улан-Удэ, Иркутск и Новосибирск, и в Дальневосточном федеральном округе -Хабаровск, Якутск и Владивосток.

Для проведения исследования выбирались дети, проживающие на территории исследуемых городов в возрасте до 5 лет. Данные по детскому населению были предоставлены ТУ Роспотребнадзора и приведены в таблице №1.

За период с 2001 по 2006 год были проанализированы истории болезни детей, поступивших с подозрением на менингит, материалы журналов клинико-диагностических и бактериологических лабораторий. Всего во всех изученных городах было выявлено 1585 случаев поступления детей до 5 лет с подозрением на менингит, из которых 1100 проживали на территории изучаемых городов, в свою очередь у 608 детей наблюдался гнойный тип ликвора (Таблица № 1).

Таблица № 1. Число выявленных случаев заболевания среди детей до 5 лет.

Города на территории которых проводилось только изучение ГБМ методикой №Ь-ЯАТ. Период сбора информации Дети до 5 лет (город) Всего изучено случаев заболевания детей до 5 лет Проживающих в городе Число выявленных вероятных случаев ГБМ (среди детей, | проживающих в городе) )

Ярославль 2003-2006 гг. 28 455 86 60 42

Тула 2004-2006 гг. 19 812 53 27 13

Мурманск 2001-2005 гг. 15 608 83 59 37

Нижний Новгород 2004-2006гг. 58293 82 68 47

Чебоксары 2001-2005 гг. 21 046 161 96 58

Казань 2003-2005 гг. 49 543 64 4$ 33

Астрахань 2001-2005 гг. 27 939 146 98 70

Краснодар 2003-2005 гг. 34 316 145 57 43

Екатеринбург 2005 год 61879 216 180 39

Тюмень 2001-2006 гг. 29 395 95 77 54

Новосибирск 2004-2005 гг. 60 247 71 63 35

Иркутск 2005-2006 гг. 31561 27 14 12

Улан-Удэ 2001-2005 гг. 19379 63 39 31

Хабаровск 2003-2005 гг. 23 645 214 154 56

Якутск 2004-2006 гг. 18 253 34 24 13

Владивосток 2004-2006 гг. 29 029 45 36 25

Всего 528 400 1585 1100 608

На втором этапе работы было проведено проспективное изучение заболеваемости Hib менингитом на территории 4-х городов Дальнего Востока и Сибири, потребовавшее улучшения лабораторной диагностики ГБМ в городах с ранее выявленной низкой лабораторной расшифровкой ГБМ и отсутствием подтвержденных случаев Hib менингита.

Для изучения были выбраны следующие города: в Сибирском федеральном округе - Улан-Удэ и Иркутск, и Дальневосточном федеральном округе - Якутск и Владивосток.

Работа по проведению проспективного популяционного исследования на Дальнем Востоке проводилась в соответствии с документом ВОЗ "Общий протокол для наблюдения за Haemophilus influenzae типа Ъ среди населения" и опытом выполнения аналогичного исследования в Москве.

В процессе работы за 18 месяцев (с марта 2007 г. по август 2008 г.) всего было выявлено 133 случая заболевания, из которых 85 детей проживали на территории изучаемых городов, в свою очередь у 41 ребенка наблюдался гнойный тип ликвора. Еще 3 случая заболевания были отнесены к ГБМ, поскольку при клинических признаках менингита, несмотря на «негнойный» тип ликвора, Hib был обнаружен в СМЖ у одного ребенка во Владивостоке, а менингококк был обнаружен в СМЖ у двух детей в Улан-Удэ и Владивостоке.

Помимо двух основных этапов исследования было проведено генотипирование штаммов Hib, доставленных из изученных регионов. Всего за время исследования нам удалось получить 25 штаммов Hib для дальнейшего генетического изучения. 20 штаммов Hib были получены от детей, проживающих как на территории городов, в которых проводились исследования, описанные в предыдущих главах, так и привезенные в городские стационары на лечение из области (района, края, республики). 5 штаммов Hib были получены во время проведения пилотного проекта по вакцинации детей против Hib в Ярославле в 2008 году.

Методы лабораторной диагностики. В период с 2001 по 2006 гг. в изученных городах работа по этиологической, расшифровке ГБМ проводилась в

соответствии с Приказом № МЗ № 375 «О мерах по усилению эпидемиологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» (от 23.12.98).

На этапе проспективного изучения заболеваемости Hib менингитом в 2007-2008 гг. на территории 4-х городов Дальнего Востока и Сибири проводилась лабораторная диагностика ГБМ следующими методами:

1. Культивирование бактерий из образцов СМЖ проводили на шоколадном агаре, приготовленном из бараньей крови с добавкой ростовых X и V факторов.

2. Для проведения реакции латекс-агглютинации с 1 марта 2007 года использовались наборы Slidex Kit-5 фирмы BioMerieux, а с сентября 2007 года Pastorex Meningitis фирмы BioRad.

3. Диагностика ГБМ с помощью ПЦР проводилась на базе ФГУН ЦНИИ эпидемиологии в Москве.

Выделение ДНК: Выделение бактериальной ДНК проводилось из доставленных образцов СМЖ, бактериальных смывов или лиофилизированной культуры бактерий сорбентным методом с использованием набора для выделения «ДНК-сорб-А» производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, Москва.

Реакция ПЦР: Расшифровка менингитов различной этиологии проводилась на основе специфической ПЦР производства ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора для выявления в образцах СМЖ ДНК основных возбудителей ГБМ, N. meningitidis, Hib и S.pneumoniae, и РНК энтеровируса.

Использовали следующие варианты и комбинации ПЦР-тестов: 1)"Амплисенс® NHS Flu" с флуоресцентной детекцией продуктов амплификации с праймерами и зондами к гену капсулярного транспортного белка ctrA менингококка, гену ply пневмолизина пневмококка, гену ЬехА, ответственному за экспорт полисахарида Hib, и

"Амплисенс® Enterovirus" с праймерами и зондами к 5-нетранслируемой области патогенных энтеровирусов.

2) При необходимости, тест-системы с электрофоретической детекцией "Амплисенс® Neisseria meningitidis А,В,С" на основе праймеров к генам тупА и siaD для специфического выявления ДНК менингококков cepoipynn А, В и С.

Генотипирование возбудителей проводилось в соответствии с общепринятой схемой MJICT для [[.influenzae (Meats Е. et al., 2003) и методикой, адаптированной к российским условиям (Миронов К.О., 2004).

Хранение информации и ее анализ. Для изучения заболеваемости Hib менингитом в 16 городах РФ с помощью Hib-RAT, запись и учет каждого случая заболевания, и хранение информации производили в базе данных по исследованию с помощью программы Access. Анализ полученной информации по методике Hib-RAT производился в соответствии с Рабочими листами, предложенными в методике экспресс-оценки Hib-RAT. Дополнительно, для оптимизации работы, рабочие листы были несколько доработаны, что позволило одновременно провести расчет заболеваемости менингококковым менингитом.

В качестве примера применения методики Hib-RAT можно рассмотреть следующую схему (рисунок №1). Допустим, на территории с населением в 100000 детей до 5 лет зарегистрировано 60 вероятных случаев ГБМ. Из них 20 лабораторно подтверждены; из них 6 Hib (30%), 10 менингококки (50%) и 4. другие возбудители (20%). В соответствии с методикой Hib-RAT выявленное соотношение лабораторно подтвержденных возбудителей «Hib: менингококк» (30%: 50%) переносится на оставшиеся неподтвержденные случаи ГБМ. Следовательно, предполагается, что среди неподтвержденных случаев 12 Hib, 20 менингококки, 8 другие возбудители. Таким образом, скорректированная заболеваемость Hib менингитом составляет 18 случаев на 100000 детей до 5 лет, а менингококковым менингитом 30 случаев на 100000 детей до 5 лет.

Выявленная заболеваемость Hib менингитом равна 6/100000 детей до 5 лет

Зарегистрировано 60 вероятных случаев ГБМ

20 подтвержденных случаев ГБМ

Выявленная заболеваемость менингококковым менингитом равна 10/100000 детей до 5 лет

гхз

л

Население 100000 детей до 5 лет

6 Hib (30%)

10 NM

(50%)

4 другие (20%)

В соответствии с методикой Н|Ь-ЯАТ предполагается что среди 40 оставшихся неподтвержденных ГБМ

гха

Скорректированная заболеваемость Hib менингитом равна 18/100000 детей до 5 лет

12 Hib 20 NM 8 другие

(30%) (50%) (20%)

Скорректированная заболеваемость менингококковым менингитом равна 30/100000 детей до 5 лет

J

Рисунок №1. Схема применения методики Hib-RAT.

В случае, когда Hib в изученных городах не выявлялся, мы брали соотношение «Hib: менингококк» (32% к 40%). Данное соотношение, в первую очередь, основано на анализе результатов систематических популяционных исследований заболеваемости ГБМ у детей в Москве, а также результатов лабораторной расшифровки в Новосибирске, Нижнем Новгороде, Туле и Мурманске, в которых уровень лабораторной расшифровки ГБМ, в период проведения усиленной лабораторной диагностики, достигал 80-90%.

Для проекта по эпидемиологическому мониторингу за Hib менингитами на территории Дальнего Востока и Сибири, проводилась регистрация по стандартизованной форме всех случаев: а) подозрения на ГБМ (проявления клинических признаков и симптомов менингита); б) вероятного ГБМ (на основании типичных характеристик СМЖ, изучаемой и анализируемой по утвержденной схеме); в) подтвержденного ГБМ (на основании посева, реакции латекс-агглютинации и/или ПЦР). Были разработаны учетные карты: Помесячной отчетности и индивидуальной отчетности по каждому случаю менингита. Индивидуальный учет каждого случая заболевания и хранение информации производи с помощью программы Access в базе данных по исследованию, включающей более 50 индивидуальных эпидемиологических и

клинико-лабораторных показателей по каждому случаю заболевания, а также в качестве индивидуальных карт и помесячных отчетов в текстовом редакторе Word. Расчет заболеваемости ГБМ различной этиологии также производился в соответствии с модифицированными нами Рабочими листами программы Excel, предложенными в методике экспресс-оценки Hib-RAT.

Результаты и обсуждение Ретроспективный анализ заболеваемости Hib менингитом.

Анализ первичных материалов позволил выявить заболеваемость ГБМ, которая варьировала в диапазоне от 19 в Иркутске до 78.9 в Хабаровске, равняясь в среднем (медиана) в изученных городах 31.3 случаям на 100000 детей моложе 5 лет в год (Таблица № 2).

Были выявлены города с высокой заболеваемостью ГБМ у детей, такие как Мурманск, Астрахань, Чебоксары, Екатеринбург и Хабаровск, и достаточно благополучные в этом отношении Казань, Якутск, Иркутск и Нижний Новгород. В остальных изученных регионах заболеваемость укладывается, как правило, в диапазон от 30 до 40 случаев на 100000 детей моложе 5 лет в год.

Посещение бактериологических лабораторий и анализ историй болезни позволил выявить процент лабораторной расшифровки ГБМ, определяемый качеством лабораторной диагностики, который составлял в среднем 46%. Можно выделить группу городов (Иркутск, Владивосток, Хабаровск, Улан-Удэ, Чебоксары, Якутск), где уровень расшифровки невысок (ниже 25%) и группу городов, где диагностику ГБМ можно признать удовлетворительной (Краснодар, Тюмень, Казань, Ярославль и Астрахань). В городах (Тула, Мурманск, Н.Новгород, Новосибирск) в условиях проведения усиленной лабораторной диагностики в 2004-2005 гг., уровень лабораторной расшифровки ГБМ в среднем составлял 81%.

В группе городов (Иркутск, Владивосток, Хабаровск, Улан-Удэ, Чебоксары, Якутск), где имелись проблемы с лабораторной диагностикой, Hib, как этиологический агент ГБМ у детей, не был выявлен; в основном из СМЖ высевался менингококк (66-100% из всех выявленных возбудителей).

НШ выявлялся в Астрахани, Тюмени, Краснодаре, Казани, Екатеринбурге, Ярославле, Туле, Мурманске, Нижнем Новгороде и Новосибирске. Однако в Астрахани был выявлен только 1 случай НШ за 5 лет, что следует полагать заниженным и ненадежным результатом. Более достоверны данные по последним 9 городам, то есть доля №Ь среди всех ГБМ известной этиологии у детей моложе 5 лет составляет в среднем около 31%, а доля менингококкового менингита - около 66%.

Случаи выявления пневмококков в СМЖ детей до 5 лет наблюдались в Екатеринбурге, Казани, Чебоксарах, Краснодаре, Астрахани, Тюмени, Ярославле, Новосибирске и Нижнем Новгороде; доля пневмококкового менингита среди всех ГБМ известной этиологии составила в среднем 14%.

Выявленная заболеваемость НПэ менингитом варьировала от 0 до 17.3 случаев на 100000 детей до 5 лет (Таблица № 2). Выявленная заболеваемость менингококковым менингитом варьировала от 3.2 случаев в Иркутске до 26.5 случаев в Астрахани, в среднем (медиана) равнялась 9.6 случаям на 100000 детей до 5 лет в год (Таблица № 2).

Использование в работе метода экспресс-оценки ШЬ-ЛАТ позволило получить как скорректированные показатели заболеваемости ШЬ-менингитом, так и скорректированную заболеваемость менингококковым менингитом, учитывая при этом клиническую диагностику случаев ГБМ.

Скорректированная заболеваемость Нй> менингитом варьировала от 2.9 в Новосибирске до 29.5 в Екатеринбурге; средняя заболеваемость (медиана) по всем изученным регионам составила 8.9 случая на 100000 детей до 5 лет в год (Таблица №2). Скорректированная заболеваемость менингококковым менингитом варьировала от 8.9 в Иркутске до 36.7 в Хабаровске; средняя заболеваемость (медиана) по всем изученным регионам равнялась 17.5 случая на 100000 детей до 5 лет в год (Таблица № 2).

Таблица № 2. Выявленная и скорректированная заболеваемость ГБМ

различной этиологии в 16 городах РФ.

Города на территории которых проводилось только изучение ГБМ методикой НШ-ЯАТ. Выявленная заболеваемость ГБМ (на 100000 детей до 5 лет) Показатель заболеваемости №Ь менингитом на 100000 детей моложе 5 лет, в год, ВЫЯВЛЕНО Показатель заболеваемости менингококковым менингитом на 100000 детей | моложе 5 лет, в год, ВЫЯВЛЕНО (с учетом выявления возбудителя в негнойных образцах СМЖ) Показатель заболеваемости Н& менингитом на 100000 детей моложе 5 лет, ОЦЕНКА КИЬ-ЯАТ Показатель заболеваемости менингококковым менингитом на 100000 детей моложе 5 лет, в год, ОЦЕНКА ШЬ-11АТ

Ярославль 36,9 9,7 9,7 16,2 15,6

Тула 28,1 17,3* 17,3 17,3 17,3

Мурманск 47,4 10,3 19,2 15,5 28,8

Нижний Новгород 26,9 2,9 10,3 3,6 13,1

Чебоксары 55,1 0 И,4 13,7 28,5

Казань 22Д 5,4 6,7 8,8 11,0

Астрахань 50,1 0,7 26,5 6.4 34,5

Краснодар 41,8 5,8 9,7 13,9 20,5

Екатеринбург 63,0 8,1 4,8 29,5 17,7

Тюмень 30,6 4,5 9,6 9,0 17,9

Новосибирск 29,0 2,5 16,6 2,9 19,4

Иркутск 19,0 0 3,2 4,6 8,9

Улан-Удэ 32,0 0 6,2 8,3 16,5

Хабаровск 78,9 0 8,5 22,6 36,7

Якутск 25Д 0 5,8 6,2 13,5

Владивосток 28,7 0 1,1 8,8 12,2

Всего (Медиана) 31.3 5.6** 9,6 8,9 17,5

* с учетом выявления НгЬ в негнойных образцах СМЖ.

** по городам, где был выявлен ШЬ.

Проспективное изучение заболеваемости ШЬ менингитом на территории 4-х городов Дальнего Востока и Сибири.

На основании полученных данных по заболеваемости ГБМ и уровню лабораторной расшифровки ГБМ на территории 4-х городов Дальнего Востока и Сибири (Владивосток, Якутск, Улан-Удэ, Иркутск), при поддержке фонда Вишневской-Ростроповича, было решено провести усиленный надзор за ГБМ и в частности за ШЬ-менингитами.

Выявленная заболеваемость ГБМ находилась в диапазоне от 21.9 в Якутске до 34.4 в Улан-Удэ, в среднем (медиана) в изученных городах составила 30.7 случаям на 100000 детей моложе 5 лет в год (Таблица №3).

Благодаря предпринятым усилиям всего среди 41 случая «вероятного» ГБМ и" 25 случаев с формально негнойным ликвором было выявлено: 11 случаев Hib менингитов (1 случай в негнойном ликворе), доля Hib среди всех ГБМ варьировала от 15% в Иркутске до 55% во Владивостоке, составляя в среднем 27%; 19 случаев менингита, вызванных N.meningitidis (2 случая в негнойиом ликворе), доля менингококкового менингита варьировала в пределах 45% во Владивостоке до 62% в Иркутске, составляя в среднем 52%; 6 случаев менингита, вызванных S.pneumoniae, доля пневмококкового менингита варьировала в пределах от 12% в Улан-Удэ до 50% в Якутске, составляя в среднем 21%.

Уровень лабораторной расшифровки в исследуемых городах составил в среднем (медиана) 80%, что превышает 60%, т. е. уровень качественной диагностики по критериям ВОЗ.

Применение в лабораторной диагностике ГБМ комплексного подхода позволило оценить вклад различных диагностических методов в лабораторной расшифровке на территории, где ранее они не применялись.

В соответствии с протоколом исследования, посев СМЖ производился практически во всех случаях ГБМ (в 95%), за исключением 2-х детей которые умерли, СМЖ у них не сеяли. Произведенный посев СМЖ дал положительные результаты в 36% случаев, в том числе в 10% была высеяна бактерия Hib. 84% образцов СМЖ были исследованы методом JIA, антиген возбудителя был обнаружен в 46% случаях. 37 образцов СМЖ (84%) были изучены методом специфической ПЦР, в 86% исследованных образцах была обнаружена ДНК возбудителя. При этом применение ПЦР позволило подтвердить все результаты культивирования и РЛА, а также дополнительно выявить ДНК возбудителя в 40% образцов СМЖ, отрицательных при культивировании и РЛА.

Из 8-ми лабораторно нерасшифрованных случаев ГБМ, трем детям был поставлен диагноз «Менингококковая инфекция, смешанная форма» на клинических основаниях. Остальным 5 детям был поставлен диагноз «ГМНЭ».

Во Владивостоке, Улан-Удэ и Иркутске выявленная заболеваемость ШЬ менингитом составила 13.8, 10.3 и 4.2 случая на 100000 детей до 5 лет в год, соответственно, а в регионе в среднем составила 7.3 случая на 100000 детей до 5 лет в год (Таблица №3). Выявленная заболеваемость менингококковым менингитом на 100000 детей до 5 лет в год варьировала от 7.3 случаев в Якутске до 16.9 случаев в Иркутске, а в регионе в среднем равнялась 12.6 случаям на 100000 детей до 5 лет в год (Таблица №3).

Таблица №3. Выявленная заболеваемость ГБМ различной этиологии.

Города на территории, которых проводился проспективный надзор за ГБМ. Иркутск Улан-Удэ Якутск Владивосток j Всего (Медиана) |

Выявленная заболеваемость ГБМ (на 100000 детей до 5 лет) 33,8 34,4 21,9 27,6 30,7

Показатель заболеваемости Н№ менингитом на 100000 детей моложе 5 лет, в год, ВЫЯВЛЕНО 4,2 10,3 0 13,8 7,3

Показатель заболеваемости менингококковым менингитом на 100000 детей моложе 5 лет, в год, ВЫЯВЛЕНО (с учетом выявления возбудителя в негнойных образцах СМЖ) 16,9 13,8 7,3 11,5 12,6

Генетическая характеристика тшхированных штаммов Haemophilus influenzae типа b.

Результатом MJICT является определение аллельного профиля по 7 генным фрагментам и соответствующего ему сиквенс-типа.

Всего среди 25 изученных изолятов Hib (таблица №8 в диссертации) было выявлено 9 вариантов аллельных профилей. У двух штаммов найдены новые, не описанные ранее аллели. У штамма «BRV4» был обнаружен аллель adk-109, у штамма «BRYak3» - аллель mdh-164. Этим штаммам были присвоены новые сиквенс-типы: СТ-561 и СТ-563, соответственно. У штаммов «BRI1» и «BRYakl» были найдены новые аллельные профили, которым были присвоены

СТ-516 и СТ-562, соответственно. Среди изученных штаммов встречались СТ-92 у 10 штаммов (40%), СТ-6 у 4-х штаммов (16%), СТ-95 у 3-х штаммов (12%), СТ-78 и СТ-93 встречались однократно.

Используя алгоритм кластеризации «BURST» была охарактеризована клональная структура исследованных штаммов. Все штаммы принадлежали к известным клональным комплексам: 24 штамма (в том числе и штаммы с новыми сиквенс-типами) принадлежат к клональному комплексу «А1/А2», который соответствует клональному комплексу «СТ-6», выделенному при типировании московских штаммов, 1 штамм принадлежат к клональному комплексу «В 1Ь» в который входят московские штаммы с СТ-93 (рисунок № 2).

Рисунок №2 Клональная структура исследованных штаммов ШЬ, выделенных в этом исследовании, и охарактеризованных ранее московских

Обнаруженные штаммы Ш> с новыми сиквенс-типами (СТ-561 и СТ-563) отличаются от СТ-6 («центральный» сиквенс-тип клонального комплекса «СТ-6») по одному локусу. СТ-516 и СТ-562 отличаются от СТ-6 по двум локусам аллельного профиля, что позволяет включить штаммы с данными сиквенс-типами в клональный комплекс «СТ-6». В целом клональная структура исследованных штаммов повторяет клональную структуру изолятов ШЬ, выделенных в Москве (Миронов К.О., 2004). Выделение штаммов с не

»9

штаммов Hib.

описанными ранее сиквенс-типом не может быть свидетельством существенных генетических изменений в изученных штаммах, поскольку все они принадлежат к известному клональному комплексу «А1/А2» (Meats Е. et al., 2003), который включает в себя большинство охарактеризованных штаммов Hib, выделенных в России и большинстве зарубежных странах за последние несколько десятилетий.

Эпидемиологическая обстановка по заболеваемости ГБМ во всех исследованных городах различна.

Еще более заметны региональные различия в этиологии ГБМ. Менингококковые менингиты в целом представляют основную проблему в Хабаровске, Мурманске, Чебоксарах, Астрахани и Новосибирске, в то время как в других городах заболеваемость ГФМИ в последние годы не превышает 30 случаев на 100000 детей в год.

Несмотря на выраженные региональные различия, причины которых неизвестны, при условии адекватной лабораторной диагностики Hib менингит выявляется практически на всей территории РФ. В ряде регионов (Мурманск, Тула, Владивосток, Улан-Удэ, Ярославль, возможно также Екатеринбург и Краснодар), заболеваемость Hib менингитом превышает 10 случаев на 100000 детей до 5 лет в год. С другой стороны, выявленная заболеваемость Hib менингитом была ниже 5 случаев на 100000 детей в год в Нижнем Новгороде, Новосибирске, Иркутске и Якутске. Можно отметить, что высокая заболеваемость Hib менингитом в Мурманске напоминает соответствующую заболеваемость в соседней Финляндии до введения вакцины против Hib в календарь прививок (Takala A. et al., 1989).

В целом выявленная и скорректированная заболеваемость Hib менингитом среди детей моложе 5 лет в изученных регионах РФ относительно невелика по сравнению с заболеваемостью, наблюдаемой или наблюдавшейся до введения массовой вакцинации против Hib в Африке, Америке, Австралии и других странах тихоокеанского бассейна, на севере и северо-западе Европы (Bennett J.V. et al., 2002). Даже в современной эпидемиологической обстановке,

достаточно благополучной по менингококковой инфекции, в РФ заболеваемость ГФМИ среди детей моложе 5 лет, как правило, в 3-4 раза выше, чем выявленная или предполагаемая заболеваемость Hib менингитом, занимающая в большинстве регионов второе место.

В изученных регионах РФ проживает более 35 миллионов человек, то есть около 25% населения страны, в том числе около 1500000 детей моложе 5 лет. Непосредственно в городах, где проводилось исследование, проживает более 500000 детей моложе 5 лет. Исходя из выявленной заболеваемости, можно предположить, что только в 16 изученных регионах ежегодно имеют место 200 - 210 случаев Hib менингита, что уже превышает отчетные цифры, поступающие в Российский центр по эпидемиологическому надзору за менингококковой инфекцией и гнойными бактериальными менингитами из 43 регионов РФ, или данные официальной регистрации по "Форме 2" гемофильной инфекции во всей РФ. Поскольку летальность при Hib-менингите в условиях адекватного лечения составляет от 3% до 10%, в этих регионах следует ожидать не менее 6-21 смертей от Hib-инфекции в год.

В последние годы в РФ насчитывается около 7000000 детей моложе 5 лет. Приняв в качестве оценки заболеваемости величину в 8 случаев на 100000 детей до 5 лет в год, получаем в целом по стране оценку около 560 случаев Hib менингита у детей до 5 лет, или около 600 случаев во всех возрастных группах в год.

Распространенность других клинических форм Hib инфекции с трудом поддается оценке. Высказывается мнение (Feikin D.R. et al., 2001; Feikin D.R. et al., 2004), что число рентгенологически подтвержденных Hib пневмоний, не сопровождающихся бактериемией, у детей может быть в пять раз больше, чем число Hib менингитов. Это мнение основано на так называемых vaccine-probe studies (эпидемиологических экспериментах), проведенных в Гамбии и Чили, какие-либо данные по близким к России странам Европы и Азии отсутствуют.

При летальности Hib менингита в 5% и Hib пневмонии в 0.5% такая заболеваемость должна приводить не менее чем к 45 летальным исходам от Hib

инфекции в год. Таким образом, в современных российских условиях ШЬ инфекция занимает одно из первых мест среди причин смерти детей (до 17 лет) от инфекционных заболеваний, уступая только туберкулезу, ВИЧ инфекции, менингококковой инфекции, острым кишечным инфекциям и вирусному гепатиту.

Выводы.

1. На основании полученных данных, в РФ отмечено широкое распространение ШЬ менингитов, которые занимают, как правило, второе место после менингококкового менингита в структуре ГБМ.

2. В половине из 16 изученных городов нами была выявлена низкая лабораторная расшифровка ГБМ, не превышающая 40%. Необходимо улучшение диагностики ГБМ в РФ на основе применения надлежащих сред для посева СМЖ и крови, а также внедрения "некультуральных" методов выявления бактериальных антигенов и ДНК, таких как латекс-агглютинация и ПЦР.

3. Применение в анализе заболеваемости НЛэ менингитов метода коррекции ШЬ-11АТ позволило получить оценку уровней заболеваемости среди детей до 5 лет в 16 городах РФ. Выявленная заболеваемость ШЬ менингитом варьировала от 0 до 17.3 случаев на 100000 детей до 5 лет. Скорректированная методом НШ-ЯАТ заболеваемость ШЬ менингитом варьировала от 2.9 в Новосибирске до 29.5 в Екатеринбурге, составляя в среднем (медиана) 8.9 случаев на 100000 детей до 5 лет.

4. В результате работы по улучшению диагностики ГБМ в Якутске, Улан-Удэ, Иркутске и Владивостоке, путем применения надлежащих питательных сред для культивирования бактерий и применения некультуральных методов, таких как РЛА и ПЦР, нам удалось улучшить расшифровку ГБМ в среднем до 80%. Метод ПЦР позволил подтвердить все результаты культивирования и РЛА, а так же дополнительно выявить

возбудитель в 40% образцов СМЖ, отрицательных при культивировании иРЛА.

5. Выявленная заболеваемость №Ь менингитом в 4-х изученных городах Дальнего Востока и Сибири с улучшенной лабораторной диагностикой ГБМ, варьирует от 0 в Якутске до 13.8 во Владивостоке, составляя в среднем (медиана) 7 случаев на 100000 детей до 5 лет.

6. Анализ заболеваемости Нй> менингитом на территории России показал различия в уровне заболеваемости. Были выявлены города с высокой заболеваемостью ШЬ менингитом (Мурманск, Тула, Владивосток, Улан-Удэ, Ярославль, Екатеринбург, Краснодар, Тюмень и Казань), превышающей 8 случаев на 100000 детей до 5 лет в год и относительно благополучные (Нижний Новгород, Новосибирск, Иркутск и Якутск), заболеваемость в которых составляла менее 5 случаев на 100000 детей до

5 лет в год.

7. Клональная структура изученных штаммов №Ь в целом аналогична структуре популяции штаммов ШЬ, циркулирующих в Москве и за рубежом (СТ-92 - 40%, СТ-6 - 16% и СТ-95 - 12%). Это свидетельствует

06 отсутствии генетических изменений в популяции ДО>, циркулирующих на территории России, и не объясняет различия в уровнях заболеваемости НЛ менингитом среди детей до 5 лет в изученных городах.

Практические рекомендации

1) Необходимо улучшение диагностики ГБМ в РФ на основе применения для культивирования бактерий шоколадного агара, приготовленного из бараньей крови с добавлением ростовых X и V факторов, а так же внедрения некультуральных методов выявления бактериальных антигенов и ДНК, таких как латекс-агглютинация и ПЦР.

2) В силу значительных различий эпидемиологической обстановки, экологических и социально-экономических условий в регионах РФ следует рассмотреть сценарий, при котором НШ вакцинация вводится поэтапно,

начиная с административных единиц (республик, краев, областей), в которых проблема НЛ инфекции наиболее актуальна.

3) Выявленная заболеваемость НШ менингитом в рамках определенной административной единицы выше 10 случаев №Ь менингита на 100000 детей моложе 5 лет в год подтверждает существенное распространение ШЬ инфекции на территории республики (края, области) и желательность введения ШЬ вакцинации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Платонов А.Е., Николаев М.К. Изучение роли Haemophilus influenzae типа b в структуре заболеваемости гнойными бактериальными менингитами (ГБМ) на территории Российской Федерации. // Материалы V Российского конгресса детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей». - Москва. - 2006. - С. 126127.

2) Николаев М.К., Платонов А.Е. Изучение заболеваемости гнойных бактериальных менингитов вызванных Haemophilus influenzae типа b на территории России. // Материалы XIV Российского национального конгресса «Человек и Лекарство». - Москва. - 2007. - С. 572.

3) Platonov А.Е., Nikolaev M.K. and The Russian Hib Study Team. The burden of meningitis caused by Haemophilus influenzae type b (Hib) and other bacterial meningitis in children in Russia. // 25 th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases - ESPID. Porto, Portugal. - 2007. - P. 123.

4) Платонов A.E., Николаев M.K. Роль Haemophilus influenzae типа b в структуре заболеваемости гнойными бактериальными менингитами на территории 6 крупных городов Российской Федерации. // Материалы IX Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -Москва. - 2007. Т.1-С. 184.

5) Платонов А.Е., Николаев М.К. Заболеваемость гнойными менингитами у детей в возрасте до 5 лет в регионах России: изучение методом Hib-RAT. // Эпидемиология и инфекционные болезни - 2007. - № 3. - С. 10-18.

6) Генотипирование бактерий вида Haemophilus influenzae серотипа b, выделенных в регионах России. / Миронов К.О., Платонов А.Е., Николаев М.К., Королева И.С., Демин С.И., Дружинина Т.А., Орлов М.Д., Честнова Т.В., Браславская С.И., Шипулин Г.А. // Материалы 6-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" - Москва. - 2007. Т.2 - С. 392-394.

7) Николаев М.К., Платонов А.Е. Результаты изучения заболеваемости гнойными бактериальными менингитами, вызванными Haemophilus

influenzae типа b на территории России. // Материалы XV Российского национ. конгресса «Человек и лекарство». - Москва. - 2008 - С. 437-438.

8) Николаев М.К., Платонов А.Е. Изучение заболеваемости Hib менингитами на территории Российской Федерации. Вестник Российской военно-медицинской академии. - Санкт-Петербург. - 2008. - Приложение №2(22). -С. 384-385.

9) Мультилокусное секвенирование-типирование штаммов Haemophilus influenzae серотипа b, выделенных в регионах России. / Миронов К.О., Платонов А.Е., Николаев М.К., Королева И.С., Демин С.И., Дружинина Т.А., Орлов М.Д., Честнова Т.В., Кириллова Т.А., Тарасов М.Ю., Ибрагимова Е.М., Браславская С.И., Шипулин Г.А. // Материалы II Российской конференции "Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов" - Москва. - 2008. - С. 36.

10) Николаев М.К., Платонов А.Е., Королева И.С., Яковенко М.Л. Эпидемиологический мониторинг Hib менингита в четырех городах Дальнего Востока и Сибири. // Материалы II Российской конференции "Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов" - Москва. - 2008. - С. 38.

Заказ №367. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Haemophilus influenzae типа b (Hib) - является возбудителем целого ряда заболеваний у детей, среди которых особое место занимают менингит, пневмония, эпиглоттит, остеомиелит, септический артрит и др. [12, 40, 117]. Ежегодно в мире регистрируется не менее 250 — 300 тысяч случаев Hib менингитов, которые приводят к 40 - 50 тысячам смертей [2, 60]. Наиболее часто Hib-менингиты развиваются у детей в возрасте от 4 до 18 месяцев жизни. Дети младше 1 месяца и старше 5 лет страдают этим заболеванием достаточно редко. Hib не является типичным возбудителем менингитов у взрослых [2, 117].

Заболеваемость менингитом, вызванным Hib, у детей до 5 лет на территории РФ недостаточно изучена. Основной причиной является неэффективная лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов (ГБМ) в большинстве регионах РФ и отсутствие официальной регистрации случаев ГБМ, в отличие, например, от заболеваемости генерализованными формами менингококковой инфекции (ГФМИ) [15]. При этом на федеральном уровне не существует раздельной регистрации клинических форм ГФМИ, а именно менингита, менингококцемии и смешанной формы ГФМИ, включающей в себя менингит и менингококцемию. Все это привело к тому, что выяснить только по официальной отчетности заболеваемость ГБМ менингококковой этиологии без учета остальных клинических форм, также невозможно.

Аналогично, несмотря на начатую в 2006 г. регистрацию заболеваемости гемофильной инфекцией в целом, невозможно вычленить из неё заболеваемость Hib менингитом.

Все это затрудняет оценку необходимости и перспектив использования в РФ вакцин нового поколения: конъюгированных вакцин против Hib (широко используемых в мире и разрешенных к применению в РФ), пневмококковых вакцин, конъюгированных вакцин против менингококка серогруппы С, серогрупп А и С, серогрупп A/C/W135/Y (проходят или прошли клинические испытания, используются в ряде стран) [117].

Известно, что вакцины нового поколения иммуногенны и обладают t протективным эффектом с первых месяцев жизни ребенка. А поскольку .более 90% Hib менингитов и около 50% случаев ГФМИ имеют место среди детей до 5 лет, принципиально важно знать уровни заболеваемости Hib менингитом и менингококковым менингитом в этой возрастной группе [2, 117].

Наиболее масштабное проспективное популяционное исследование заболеваемости Hib менингитами среди детей младше 5 лет было проведено в Москве в 1999-2001 годах. Было установлено, что Hib вызывает 16% всех случаев бактериального менингита в этой возрастной группе, при этом показатель заболеваемости составляет 5.7 на 100000 детей младше 5 лет и занимает второе место после заболеваемости менингококковым менингитом (18 на 100000 в год) [36].

В последние годы Российским центром по эпидемиологическому надзору за менингококковой инфекцией и гнойными бактериальными менингитами проводится надзор за ГБМ и ГФМИ в сотрудничающих регионах России (43 региона в 2007 году), в соответствии с разработанными учетными формами. Однако низкий уровень лабораторного подтверждения диагноза в стране (в среднем 30-40%) и ограниченное число сотрудничающих регионов не позволяют в полной мере оценить эпидемиологическую обстановку по ГФМИ и ГБМ не менингококковой этиологии [16, 31].

Молекулярно-генетические исследования показали, что за Hib менингиты в Москве ответственен тот же геновариант Haemophilus influenzae типа b, что и в странах с ранее высокой заболеваемостью Hib менингитами до введения вакцинации (США, Нидерланды, Великобритания) [32, 33, 34, 85, 87, 107], то есть бактерия с высоким потенциалом патогенности, который вполне способен проявиться в другое время, в другом месте или условиях.

Чрезвычайное разнообразие географических и экологических условий, уровня социально-экономического развития в России не допускает механического применения результатов и выводов, полученных в ходе московских исследований [36, 97], для оценки перспектив и последствий Hib вакцинации в других регионах России. Однако, в силу высокой стоимости и трудоемкости проведение популяционного изучения заболеваемости, вызываемой Hib, в достаточном количестве регионов представляется делом не ближайшего будущего. В сложившийся ситуации, альтернативным выходом может явиться оценка бремени болезней, вызываемых Haemophilus influenzae типа b с помощью механизма экспресс-оценки Hib по методике ВОЗ, называемой Hib-RAT (Hib - Rapid Assessment Tool) [72]. Оценка основана на ретроспективном выявлении числа случаев ГБМ среди детей в возрасте до 5 лет на определенной территории, подсчете заболеваемости на основе лабораторно подтвержденных случаев и её коррекции в сторону увеличения за счет учета возможных случаев Hib менингита и менингитов иной этиологии, которых не удалось расшифровать лабораторно [71, 72]. Методика была испытана и её работоспособность была подтверждена в 13 странах Азии, Африки и Европы с низким уровнем лабораторной диагностики ГБМ [69, 71,105].

Подобная оценка заболеваемости Hib менингитами также проводилась по заданию ВОЗ группой консультантов ВОЗ, под руководством А.Е.Платонова в Узбекистане, Киргизии, Украине, Молдове и Армении [2, 37].

Цель работы.

Выявить заболеваемость Hib менингитом на территории РФ и обосновать с помощью современных эпидемиологических, микробиологических и молекулярно-биологических методов необходимость усовершенствования эпидемиологического надзора за Hib инфекцией.

Задачи исследования:

1. Ретроспективно изучить заболеваемость Hib менингитом в 16 городах России с помощью механизма экспресс-оценки Hib (Hib-RAT).

2. Выяснить имеющиеся проблемы с лабораторной расшифровкой ГБМ в этих городах.

3. Усовершенствовать эпидемиологический надзор и лабораторную диагностику ГБМ в Иркутске, Улан-Удэ, Якутске и Владивостоке.

4. Провести сравнительный анализ вклада различных диагностических методов в лабораторную расшифровку ГБМ на территории, где ранее они не применялись.

5. Установить реальную заболеваемость ГБМ различной этиологии в Иркутске, Улан-Удэ, Якутске и Владивостоке.

6. Генетически охарактеризовать выделенные штаммы Hib, изолированные от больных ГБМ на территории РФ, с использованием метода мультилокусного секвенирования-типирования (MJICT).

Научная новизна исследования.

Впервые на территории РФ для изучения заболеваемости Hib менингитом применен механизм экспресс-оценки Hib. Полученные оценки позволили определить ориентировочные уровни заболеваемости Hib менингитом в городах с низкой лабораторной расшифровкой ГБМ.

Впервые в проспективном исследовании заболеваемости Hib менингитом на территории 4-х городов Дальнего Востока и Сибири (Иркутск, Улан-Удэ, Якутск и Владивосток) были получены достоверные данные о заболеваемости ГБМ различной этиологии у детей до 5 лет и сопоставлены с полученными ранее оценками уровня заболеваемости Hib менингитом.

С помощью метода MJICT проведена генетическая характеристика выборки штаммов Hib, изолированных от больных ГБМ на территории РФ. Сопоставление полученных результатов с данными, содержащимися в международной базе данных, позволили впервые охарактеризовать штаммы, циркулирующие на территории РФ.

Получены данные для обоснования необходимости и перспектив использования в РФ конъюгированных вакцин против Hib.

Практическая значимость работы.

В условиях недостаточно эффективной лабораторной расшифровки ГБМ в изученных городах заболеваемость Hib менингитом была оценена с использованием рекомендованного ВОЗ метода корректирующей экспресс-оценки заболеваемости Hib. Проведенное проспективное изучение заболеваемости Hib менингитом в 4-х городах Дальнего Востока и Сибири показало, что результаты (ранее проведенной) экспресс-оценки отличались от окончательных не более чем на 30%, что свидетельствует о пользе применения метода Hib-RAT в российских условиях.

Испытаны и показали высокую эффективность основные алгоритмы усовершенствования лабораторной диагностики Hib менингитов: 1) применение для посева СМЖ шоколадного агара, приготовленного из бараньей крови и обогащенного факторами роста; 2) взятие и посев образца СМЖ как можно раньше, до начала антибиотикотерапии; при необходимости (в часы, когда бактериологическая лаборатория не работает) - взятие и посев СМЖ "у постели больного" лечащим персоналом; 3) широкое внедрение некультуральных методов (реакция латекс-агглютинации (PJIA) и особенно ПНР); 4) регулярный контроль качества диагностических процедур.

Доказана необходимость применения комплексного подхода к лабораторной диагностике ГБМ за счет применения надлежащих питательных сред и некультуральных методов диагностики, что позволило повысить лабораторную расшифровку ГБМ до 80%.

Внедрения в практику.

Материалы диссертации внедрены в работу Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Ярославской области, по Мурманской области и по Республике Бурятия, а также используются в учебном процессе на кафедре эпидемиологии медико-профилактического факультета послевузовского профессионального образования ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова.

Апробация работы.

Основные результаты работы были представлены на V Российском конгрессе детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей» (Москва, 6 декабря 2006 г.);

Конгрессе Европейского общества по изучению детских инфекционных th болезней (г. Порту, Португалия, 30 апреля - 5 мая 2007.); 9 Meeting of The European Monitoring Group on Meningococci. Rome (Italy), 2007, (Рим-Сиена. 30 мая - 5 июня.); XI Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии». (Москва, 5-8 февраля 2007 г.); XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». (Москва 16-20 апреля 2007г.); Научно-практической конференции педиатров России "Фармакотерапия в педиатрии" (Москва 17-19 октября 2007г.); II Российской конференции "Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов". (Москва, 20-21 октября 2008 г.); Рабочих совещаниях региональных ТУ Роспотребнадзора, в городах, где проводились исследования.

Публикации.

По теме работы опубликовано 10 печатных работ. В том числе 2 работы в журналах, рекомендованных ВАК к опубликованию основных научных результатов диссертации.

7. Выводы.

1. На основании полученных данных, в РФ отмечено широкое распространение Hib менингитов, которые занимают, как правило, второе место после менингококкового менингита в структуре ГБМ.

2. В половине из 16 изученных городов нами была выявлена низкая лабораторная расшифровка ГБМ, не превышающая 40%. Необходимо улучшение диагностики ГБМ в РФ на основе применения надлежащих сред для посева СМЖ и крови, а также внедрения "некультуральных" методов выявления бактериальных антигенов и ДНК, таких как латекс-агглютинация и ПЦР.

3. Применение в анализе заболеваемости Hib менингитов метода коррекции Hib-RAT позволило получить оценку уровней заболеваемости среди детей до 5 лет в 16 городах РФ. Выявленная заболеваемость Hib менингитом варьировала от 0 до 17.3 случаев на 100000 детей до 5 лет. Скорректированная методом Hib-RAT заболеваемость Hib менингитом варьировала от 2.9 в Новосибирске до 29.5 в Екатеринбурге, составляя в среднем (медиана) 8.9 случаев на 100000 детей до 5 лет.

4. Благодаря углубленной диагностике ГБМ, включающей применение надлежащих питательных сред, посев материала от больных, использование культуральных и некудьтуральных методов (PJIA, ПЦР), лабораторная расшифровка ГБМ была доведена до уровня 80%. Метод ПЦР позволил подтвердить все результаты культивирования и PJIA, а также дополнительно выявить возбудитель в 40% образцов СМЖ, отрицательных при культивировании и PJIA.

5. Выявленная заболеваемость Hib менингитом в 4-х изученных городах Дальнего Востока и Сибири с улучшенной лабораторной диагностикой ГБМ, варьирует от 0 в Якутске до 13.8 во Владивостоке, составляя в среднем (медиана) 7 случаев на 100000 детей до 5 лет.

6. Анализ заболеваемости Hib менингитом на территории России показал различия в уровне заболеваемости. Были выявлены города с высокой заболеваемостью Hib менингитом (Мурманск, Тула, Владивосток, Улан-Удэ, Ярославль, Екатеринбург, Краснодар, Тюмень и Казань), превышающей 8 случаев на 100000 детей до 5 лет в год и относительно благополучные (Нижний Новгород, Новосибирск, Иркутск и Якутск), заболеваемость в которых составляла менее 5 случаев на 100000 детей до 5 лет в год.

7. Клональная структура изученных штаммов Hib в целом аналогична структуре популяции штаммов Hib, циркулирующих в Москве и за рубежом (СТ-92 - 40%, СТ-6 - 16% и СТ-95 - 12%). Это свидетельствует об отсутствии генетических изменений в популяции Hib, циркулирующих а территории России, и не объясняет различия в уровнях заболеваемости Hib менингитом среди детей до 5 лет в изученных городах.

Я выражаю глубокую благодарность и признательность за помощь в выполнении работы научному руководителю доктору биологических наук. Платонову Александру Евгеньевичу; академику РАМН, доктору медицинских наук, профессору Малееву Виктору Васильевичу; заслуженному деятелю науки Российской Федерации; доктору медицинских наук, профессору, Ющенко Галине Васильевне; доктору медицинских наук, профессору, Горелову Александру Васильевичу; доктору медицинских наук, Королевой Ирине Станиславовне; кандидату медицинских наук, Миронову Константину Олеговичу; Платоновой Ольге Владимировне; десяткам региональных специалистов, работников лечебных стационаров, департаментов здравоохранения, ТУ Роспотребнадзора, а также родным, близким и друзьям за внимание и поддержку.

6. Заключение.

Проблема ГБМ, вызываемых Hib, на территории нашей страны до настоящего времени оставалась практически неизученной. Проспективное популяционное исследование, проведенное в 2000-2001 гг. в Москве, выявило низкую заболеваемость Hib менингитом, которая составила 5.7 на 100000 детей до 5 лет. Тогда как чрезвычайное разнообразие географических и экологических условий, уровня социально-экономического развития в России не допускает механического применения результатов и выводов, полученных в ходе московских исследований [36, 97], для оценки перспектив и последствий Hib вакцинации в других регионах России.

Основной целью данной работы являлось изучение уровня заболеваемости Hib-менингитом в 16 административных центрах областей (республик, краев).

На материале 2001-2006 гг. заболеваемость ГБМ среди детей моложе 5 лет была изучена в 16 городах России. В некоторых регионах качество лабораторной диагностики ГБМ, хотя и недостаточное, позволило сделать определенные выводы о распространенности Hib менингита, основанные на ретроспективном анализе регистрационных материалов специализированных стационаров. Возбудитель был идентифицирован приблизительно в 46% из 608 случаев "вероятного" бактериального менингита. При этом доля Hib менингитов среди всех лабораторно подтвержденных случаев составляла 21%, а выявленная заболеваемость Hib менингитом варьировалась от 0 до 10.8 случаев в год на 100000 детей моложе 5 лет. Доля менингококкового менингита равнялась в среднем 59%.

Разработанный ВОЗ Метод Экспресс-Оценки Hib-RAT был использован для получения скорректированных оценок заболеваемости, учитывающих недостаточный уровень лабораторной диагностики. Скорректированный уровень заболеваемости Hib менингитом варьировал от 2.6 (в Новосибирске) до 23.2 случаев (в Екатеринбурге) на 100000 детей моложе 5 лет, среднее медианное значение равнялось 8.2. Заболеваемость генерализованными формами менингококковой инфекции в той же популяции находилась в диапазоне от 12 до 145 случаев на 100000 детей, среднее медианное значение по всем изученным регионам равнялось 25.4.

В соответствии с документом ВОЗ "Общий протокол для наблюдения за Haemophilus influenzae типа b среди населения" и опыту выполнения аналогичного исследования в Москве [36] было проведено исследование в 2007-2008 гг. в Сибири и на Дальнем Востоке (в Иркутске, Улан-Удэ, Якутске и Владивостоке). Возбудитель был идентифицирован приблизительно в 80% из 44 случаев «вероятного» бактериального менингита. Доля менингитов, вызванных Hib, составляла от 15% до 55% от всех бактериальных менингитов известной этиологии (в среднем 26.8%), а доля менингококкового менингита — около 52%. Заболеваемость Hib менингитом варьировалась от 0 случая (в Якутске) до 13.8 случаев (во Владивостоке) на 100000 детей моложе 5 лет в год. Средняя заболеваемость' Hib менингитом в этих городах равнялась 7.3 на 100000" детей моложе 5 лет в год. Заболеваемость генерализованными формами менингококковой инфекции в той же популяции находилась в диапазоне от 17 (в Улан-Удэ) до 27.6 случаев (во Владивостоке) на 100000 детей, среднее медианное значение равнялось 19.7.

Примечательно, что ранее, в условиях неэффективной лабораторной диагностики в этих городах заболеваемость Hib менингитом была оценена с использованием рекомендованного ВОЗ метода корректирующей экспресс-оценки заболеваемости Hib [72]. Результаты экспресс-оценки отличались от окончательных, лабораторно подтвержденных данных по заболеваемости Hib менингитом- не более чем на 30%, что свидетельствует о полезности применения метода Hib-RAT в российских условиях.

Как и следовало ожидать, эпидемиологическая обстановка по заболеваемости ГБМ в исследованных городах различна. Можно выделить города с высокой заболеваемостью ГБМ у детей, такие как Мурманск, Астрахань, Чебоксары, Екатеринбург и Хабаровск, и достаточно благополучные в этом отношении Казань, Якутск, Улан-Удэ, Иркутск и

Нижний Новгород. В остальных изученных регионах заболеваемость укладывается, как правило, в диапазон от 30 до 40 случаев на 100000 детей в год.

Еще более заметны региональные различия в этиологии ГБМ. Менингококковые менингиты и ГФМИ в целом представляют основную проблему в Хабаровске, Мурманске, Чебоксарах, Астрахани и Новосибирске, в то время как в других городах заболеваемость ГФМИ в последние годы не превышает 30 случаев на 100000 детей в год. В Хабаровске отмечена чрезвычайно высокая заболеваемость ГФМИ и не исключена высокая заболеваемость Hib менингитом.

Достаточно высока заболеваемость Hib менингитом в Туле, Мурманске, Владивостоке, Улан-Удэ, Ярославле, Екатеринбурге и Краснодаре. С другой стороны, выявленная заболеваемость Hib менингитом была ниже 5 случаев на 100000 детей в год в Нижнем Новгороде, Новосибирске, Иркутске и Якутске. Можно отметить, что высокая заболеваемость Hib менингитом в Мурманске напоминает соответствующую заболеваемость в соседней Финляндии до введения вакцины против Hib в календарь прививок.

В целом выявленная и скорректированная заболеваемость Hib менингитом среди детей моложе 5 лет в изученных регионах РФ относительно невелика по сравнению с заболеваемостью, наблюдаемой или наблюдавшейся до введения массовой вакцинации против Hib в Африке, Америке, Австралии и других странах тихоокеанского бассейна, на севере и северо-западе Европы [2, 60, 94]. Даже в современной эпидемиологической обстановке, достаточно благополучной по менингококковой инфекции, в РФ заболеваемость ГФМИ среди детей моложе 5 лет, как правило, в 3-4 раза выше, чем выявленная или предполагаемая заболеваемость Hib менингитом, занимающая в большинстве регионов второе место.

Однако, несмотря на выраженные региональные различия, причины которых неизвестны, при условии адекватной лабораторной диагностики Hib менингит выявляется повсеместно в РФ. В ряде регионов (Мурманск, Тула,

Владивосток, Улан-Удэ, Ярославль, возможно также Екатеринбург и Краснодар), заболеваемость Hib менингитом превышает 10 случаев на 100000 детей до 5 лет в год.

Охарактеризованная клональная структура выделенных из регионов штаммов в целом повторяет клональную структуру изолятов Hib, выделенных в Москве. Все изученные штаммы принадлежат к известному клональному комплексу «А1/А2», включающему в себя большинство охарактеризованных штаммов Hib, выделенных в России и большинстве зарубежных странах за последние несколько десятилетий, что свидетельствует об отсутствии существенных генетических изменений в популяции Hib [32, 34, 85].

Исследования последних лет показывают, что сравнительно невысокая заболеваемость Hib менингитом характерна для Центральной и Восточной Европы и многих стран Азии, а также крупных городов РФ (Москва, Санкт-Петербург) [2, 36, 37]. Наиболее низкая заболеваемость Hib-менингитом была выявлена в этом исследовании также в крупных городах, Н.Новгороде и Новосибирске.

Непосредственно в городах, где проводилось исследование, проживает более 500000 детей моложе 5 лет. В регионах РФ, где проводилось исследование, проживает более 35 миллионов человек, то есть около 25% населения страны, в том числе около 1500000 детей моложе 5 лет. Исходя из выявленной заболеваемости, можно предположить, что только в этих 16 регионах ежегодно имеют место 200 - 210 случаев Hib менингита, что уже превышает отчетные цифры, поступающие в Российский центр по эпидемиологическому надзору за менингококковой инфекцией и гнойными бактериальными менингитами из 43 регионов РФ [31, 48], или данные официальной регистрации по "Форме 2" гемофильной инфекции во всей РФ. Поскольку летальность при Hib менингите составляет от 3% до 10% [7, 36, 117], в этих регионах следует ожидать не менее 6-21 смертей от Hib-инфекции в год.

На самом деле, в последние годы в РФ насчитывается около 7000000 детей моложе 5 лет. Приняв в качестве оценки заболеваемости величину в 8 случаев на 100000 детей до 5 лет в год, получаем в целом по стране оценку около 560 случаев Hib менингита у детей до 5 лет, или около 600 случаев во всех возрастных группах в год (поскольку 5-7% от всех случаев Hib менингита наблюдается среди лиц старше 5 лет) [8].

Распространенность других клинических форм Hib инфекции с трудом поддается оценке. Данные проведенного Peltola [94] мета-анализа 21 исследования 3931 больного, показывают, что суммарная выявляемая заболеваемость так называемыми инвазивными формами, при которых Hib обнаруживается в исходно стерильных жидкостях организма, приблизительно в 2 раза больше заболеваемости собственно Hib менингитом. (К инвазивным формам Hib-инфекции относят, кроме менингита, еще и бактериемическую пневмонию, эпиглоттит, остеомиелит, перикардит, септический артрит и септицемию.) Высказывается мнение [71, 72], что число рентгенологически подтвержденных Hib пневмоний, не сопровождающихся бактериемией, у детей может быть в пять раз больше, чем число Hib менингитов. Это мнение основано на так называемых vaccine-probe studies (эпидемиологических экспериментах), проведенных в Гамбии и Чили, какие-либо данные по близким к России странам Европы и Азии отсутствуют [71].

При летальности Hib менингита в 5% и Hib пневмонии в 0.5% такая заболеваемость должна приводить не менее чем к 45 летальным исходам от Hib инфекции в год. Таким образом, в современных российских условиях Hib инфекция занимает одно из первых мест среди причин смерти детей (до 17 лет) от инфекционных заболеваний, уступая только туберкулезу, ВИЧ инфекции, менингококковой инфекции, острым кишечным инфекциям и вирусному гепатиту (см. данные по зарегистрированным случаям смерти у детей до 17 лет в "Сведениях об инфекционных и паразитарных заболеваниях (Форма 2)" Федерального центра гигиены и эпидемиологии).

Система эпиднадзора за ГБМ в Российской федерации только налаживается. Даже в тех регионах, которые собирают информацию по ГБМ для Российского центра по эпидемиологическому надзору за менингококковой инфекцией и гнойными бактериальными менингитами, нами были отмечены некоторые различия между отчетными материалами и реальной заболеваемостью у детей, выявленной по регистрационным материалам стационаров. Наши выездные исследования подтвердили данные пассивного эпиднадзора о недостаточном уровне (менее 40%) и неравномерном уровне лабораторной диагностики ГБМ. Следует отметить снижение бактериологической расшифровки ГБМ в зависимости от удаления от столицы. В большинстве городов применялись исключительно бактериологическая диагностика СМЖ, тогда как некультуральные методы, такие как ДА, в изученный период применялись на территории Ярославля, Екатеринбурга, Казани и Краснодара, причем в недостаточном объеме, практически не влияющем на качество диагностики. На территории Тулы, Мурманска, Нижнего Новгорода и Новосибирска, PJIA применялась в полном объеме за счет поддержки фонда Вишневской-Ростроповича в 2004-2005 гг., что отчасти и определило более высокий процент лабораторной расшифровки в этих городах за весь исследуемый период.

Ранее были сформулированы и представлены в методических указаниях «Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» МУ 4.2.1887-04 [26] и других публикациях [18, 36] основные принципы улучшения лабораторной диагностики ГБМ: 1) применение для посева СМЖ шоколадного агара, приготовленного из бараньей крови и обогащенного факторами роста; 2) взятие и посев образца СМЖ как можно раньше, до начала антибиотикотерапии; при необходимости (в часы, когда бактериологическая лаборатория не работает) - взятие и посев СМЖ "у постели больного" лечащим персоналом; 3) широкое внедрение некультуральных методов (JIA и особенно ПЦР); 4) регулярный контроль качества диагностических процедур.

Последовательное применение этих принципов в кратчайшие сроки позволяет выйти на уровень лабораторной расшифровки ГБМ - 60 и более процентов случаев, превышающий уровень качественной диагностики по критериям ВОЗ [82], что было показано на примере Якутска, Владивостока, Иркутска и Улан-Удэ. Уровень лабораторной расшифровки в этих городах составил 80%, в то время как до начала данного проекта процент лабораторной расшифровки ГБМ в этих городах составлял всего 5%-25%.

Следует рассмотреть возможность включения в систему эпиднадзора за Hib инфекцией, наряду с применением современных методов лабораторной диагностики, изучения серологической структуры заболеваний ГБМ, годовой заболеваемости Hib менингитом, её сезонности, возрастной структуры, летальности, слежения за носительством Hib в организованных коллективах. Для оценки факторов риска развития Hib инфекции можно рекомендовать раздельный учет заболеваемости в однодетных и многодетных семьях, где старшие дети являются основными источником инфекции для младших детей.

Согласно рекомендациям Всемирной Организации Здравоохранения конъюгированная Hib вакцина должна быть введена в календарь прививок всех стран [117, 74]. К настоящему моменту 119 стран мира пошли по этому пути, в том числе 38 из 52 европейских стран - членов ВОЗ [89]. В результате было достигнуто 90%-99% снижение заболеваемости генерализованными (инвазивными) формами Hib инфекции в этих странах [89, 94, 97]. Объективными препятствиями внедрению Hib-вакцины являются недостаточная изученность заболеваемости Hib инфекции и экономические затруднения. К 2007 году вакцина была введена в календарь прививок 65 (82%) из 79 стран с валовым национальным доходом (GNI-ВНД) на душу населения выше $3465 и только 36 (32%) из 113 стран с ВНД на душу населения ниже $3465 [94]. Однако необходимость внедрения должна быть и эпидемиологически обоснована. Большинство исследований (74 из 83, или 89%), проведенных в странах, которые впоследствии ввели Hib вакцинацию, указывали на заболеваемость Hib менингитом выше 10 случаев на 100000 детей моложе 5 лет в год. Напротив, в 55% (11 из 20) исследований, проведенных в странах, которыми не принято решение о массовой Hib вакцинации, была выявлена заболеваемость Hib менингитом ниже 10 случаев на 100000 детей моложе 5 лет [94].

Действующие рекомендации ВОЗ предусматривают введение Hib-вакцины в календарь прививок вне зависимости от выявленной заболеваемости Hib инфекцией в конкретной стране, особенно если эта заболеваемость недостаточно изучена [117, 74]. Однако в силу значительных различий эпидемиологической обстановки, экологических и социально-экономических условий в регионах РФ следует рассмотреть также сценарий, при котором Hib вакцинация вводится поэтапно, начиная с административных единиц (республик, краев, областей), в которых проблема Hib инфекции наиболее актуальна. Уровень заболеваемости Hib менингитом в рамках определенной административной единицы выше 10 случаев Hib менингита на 100000 детей моложе 5 лет в год подтверждает существенное распространение Hib инфекции на территории республики (края, области) и желательность введения Hib вакцинации. При этом размер популяции детей, в которой проводится надзор за Hib менингитом, и число лет наблюдения должны быть достаточны для достоверной оценки заболеваемости. Дополнительным косвенным указанием на распространенность Hib инфекции может служить значительно повышенная заболеваемость рентгенологически подтвержденной пневмонией (неясной этиологии) на определенной территории.

В настоящее время пилотные проекты массовой вакцинопрофилактики гемофильной инфекции у детей раннего возраста проводятся региональными органами здравоохранения и Роспотребнадзора в сотрудничестве с Фондом Вишневской-Ростроповича в Мурманской и Ярославской областях [13, 27] и во Владивостоке [52].