Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.08) на тему:Реактивность организма животных при использовании синтетического препарата-анандин

РГ6 од

министерство сельского хозяйства и продовольствия

1 3 НОЙ 1995 российской федерации

санкт-петербургская государственная академия ветешнарной медицины

На правах рукописи

бешюшжий АЛЕКСАНДР ЕГОРОШЧ

РЕАКТИВНОСТЬ ОРГАНИЗМ ЖИВОТНЫХ ПШ ИСПОЛЬЗОВАНИИ СИНТЕТИЧЕСКСГО ПРЕПАРАТА - АНАВДИН

Специальность: 16.00.08 - гигиена сельскохозяйственных животных (зоогигиена)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание- ученой степени кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург, 1995

Работа выполнена, на кафедре гигиены сельскохозяйственных животных Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент ААО КУЗНЕЦОВ А.4 доктор ветеринарных наук, ■ профессор МУХИНА Н.В.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

профессор РОДИН В.И.; кандидат биологических наук, доцент УЗЮМОВА О.В.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательа

ветеринарный институт птицеводства

Защита диссертации состоится "_"_ 1995

оо

в II часов на заседании диссертационного совета К 120.20.02 в Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной ме, цнны. Адрес: 196084, Санкт-Петербург, Черниговская ул., 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Пет бургской государственной академии ветеринарной медицины.

Автореферат разослан "_"_ 1995

Ученый секретарь диссертационного совета ,

доцент САФРОНОВ Е

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы Загрязнение окружающей среды, действие различных стресс-факторов, нарушение зоогигиенических условий содержания и кормления, воздействие антигенов, обуславливает возникновение ряда новых проблем в ветеринарии.

В этих условиях значительно снижается реактивность организма животных, повышается восприимчивость к различным микроорганизмам, приобретающих патогенность и вирулентность. Организм животных в такой ситуации оказывается неспособным к полноценному ответу. Таким образом, разработка эффективных химиоте-рапевтических средств поддержания высокого уровня здоровья и физиологической реактивности организма, а также для профилактики и лечения инфекций, вызванных микроорганизмами и вирусами, безусловно является актуальной задачей современной ветеринарии.

Решение этих проблем может быть достигнуто разработкой препаратов влияющих на укрепление естественной резистентности организма животных, на усиление реактивности иммунокомпетент-ных клеток. Такие препараты носят название - иммуномодуляторов ( Д.Н.Лазарева, Е.К.Алехин, 1985).

Из класса низкомолекулярных соединений особый интерес представляют акридонуксусная кислота (АУК) и некоторые ее производные (Я.В, Ап^ел, У, ^¿¿^¿аы аЦ , 1983). Эту группу веществ принято называть супериндукторами интерферона, так как парентеральное введение таких препаратов индуцирует образование чрезвычайно высоких титров эндогенного интерферона ( до 400000 ед/мл) С^ее^а^ , 1976).

В последние годы на основании определения активности акридонуксусной кислоты, был синтезирован и получен совершенно новый препарат анандин. Испытание его активности, влияние его

на организм лабораторных животных, перед использованием анан-дина на домашних животных была для нас крайней необходимостью.

Цель и задачи исследований. Исследования были направлены на изучение влияния препарата анандин на клинические, биохимические и иммунобиологические показатели организма лабораторных животных. В процессе проводимых исследований необходимо было решить следующие задачи :

1. Изучение влияния анандина на клиническое состояние организма лабораторных животных (белые крысы).

2. Определение показателей пирогенности, острой и хронической токсичности при различных способах введения анандина (кролики, белые мыши).

3. Изучение влияния анандина на биохимические показатели сыворотки крови (белые крысы).

4. Изучение влияния анандина на факторы неспецифической защиты организма лабораторных животных (белые мыли и крысы) .

5. Изучение влияния анавдина на иммунобиологическую реактивность Т- и В-лимфоцитов (белые мыши и крысы).

Научная новизна. В результате выполненых экспериментов получены следующие данные, составляющие научную новизну исследований:

- впервые проведены комплексные исследования по влиянию синтетического препарата - анандин при парентеральном введении на организм лабораторных животных: белые мыши, крысы, кролики;

- впервые были установлены летальные и переносимые дозы изучаемого препарата на белых мышах. Определена ДД^д при различных способах введения анандина;

- изучены некоторые клинические , гематологические и

биохимические показатели организма лабораторных животных при инъецировании анандина;

- впервые представлены данные по влиянию аканцина на факторы неспецифической защиты организма у крыс;

- изучены и представлены практически новые данные по воздействию анандина на иммунобиологическую реактивность лимфоцитов: количественные и функциональные характеристики Т- и В-лимфоцитов.

Практическое значение работы. Данные по влиянию анандина на организм лабораторных животных явились основой для клинических испытаний данного препарата на других видах животных. Полученные материалы могут быть использованы в учебном процессе л при издании учебной,и монографической литературы.

Экспериментальные данные по влиянию анандина на бактерицидную, лизоцимную и комплементарную активность сыворотки крови, |©гоцитарную активность нейтронов, содержание и функцию Т- и В-лимфоцитов организма животных, включены в материалы по применению препарата анандина (Инструкция по применению ТУ 10 РФ 29 -150 - 94).

Апробация работы. Основные положения диссертации доло-кены на международном симпозиуме "Проблемы моделирования патологических процессов у человека и животных; иммунодефицита, их [щагностика и коррекция." (Санкт-Петербург, 1994 г.); Научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (Санкт-Петербург, 1995 г.); Научно-трактическом семинаре "Новые препараты для лечения вирусных и зочетанных инфекций у животных и опыт их практического примене-пия." (Санкт-Петербург, 1995г.)

Публикация научных исследований. Основные положения

диссертации опубликованы в четырех печатных работах.

Вопросы, выносимые на защиту.

1. Характеристика клинических, гематологических и биохимических показателей реактивности организма лабораторных животных при использовании анандина.

2. Определение летальных и переносимых доз анандина при его парентеральном введении.

3. Определение уровня активности факторов естественной резистентности лабораторных животных и иммунобиологической реактивности лимфоцитов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на ПО страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами. Список литературы включает 257 источников, в том числе 67 зарубежных исследователей-

МАТЕШАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в течении 1994-1995 годах на базе кафедры гигиены сельскохозяйственных животных Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины. Биохимические и иммунологические исследования проводили в лабораториях Военно-Медицинской академии им. С.М.Кирова.

Наши опыты бьли поставлены на белых мышах и крысах (сам цах) линии Шстар, также в опытах были использованы кролики. Животные были доставлены из питомника "Рапполово" Ленинградско области. В течении месяца проходила их адаптация к условиям ви вария, где проводили эксперименты. Крысы и мыши были маркированы пикриновой кислотой и размещены в стандартных

металлических клетках по 10 животных в каждой клетке. Кролики были размещены в виварии в клетках. Условия содержания и рацион кормления животных соответствовали существующим зоо-гигиеническим нормативам. Всего в опытах было использовано 18 кроликов, 1008 мышей и 140 крыс.

Клиническое состояние лабораторных животных исследовали путем визуального наблюдения после введения анандина в течении II суток. КроЕь для морфологических и биохимических исследований брали из хвостовой вены утром до кормления. Стабилизировали кровь гепарином производства фирмы "Реанал" (Венгрия) с концентрацией 5000 м.Е. в I мл. Количество эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов определяли в счетной камере Горяева, а также кондуктометрическим методом с помощью счетчика микрочастиц Пикоскель - Р - 4 (Венгрия). Содержание гемоглобина крови определяли гемоглобин-цианидным методом по М.Л.Пименовой и Г.В.Дер-виза (1974).

Определение общего белка проводили с помощью прибора "Анализатор фореграмм" (АФ-I), методом электрофореза на ацетат-целлюлозной пленке. Биохимические исследования осуществляли с помощью прибора "Техникон № 0I7-0I3I-0I8" (автоматический биохимический анализатор) (США).

Бактерицидную активность сыворотки крови (БАСК) определяли нефелометрическим методом по О.В.Смирновой и Т.А.Кузьминой (1966), основанному на изменении оптической плотности МПБ при росте в ней тест-микроба с добавлением и без добавления испытуемой сыворотки, в наших исследованиях БАСК определялась к кишечной палочке Ё. Colt . В 2 пробирки вносили по 0,1 мл испытуемой сыворотки, в 3-ю и 4-ю (контрольные) пробирки 1,1 мл бульона Хотингера. В первую и вторую пробирки добавили

по 1,0 мл бульона Хотингера. В первую и третью пробирки добавили по 0,1 мл, а во вторую и четвертую - 0,2 мл суточной агаровой культуры кишечной палочки. Оптическая плотность по ФЭК-Н-57 (светофильтр зеленый, кювета 3 мм) для кишечной палочки 0,20 ( I млрд. микробных тел/мл). Определяли оптическую плотность приготовленных смесей, пользуясь стерильными (стерилизация сухим жаром) кюветами сечением 3,0 мм. Смесь переливали в стериль ные пробирки и помещали в термостат при 37°С на 3 часа. Вновь определяли оптическую плотность содержимого опытных пробирок. Учет реакции проводили по формуле:

, (Д1 - Да> * 100 . где

(Д3 - Д4)

А - процент роста микробной культуры в опытной пробе по отношению к контролю; Д2 - оптическая плотность пробирки после 3-х часовой инкубации в термостате;

Д2 - оптическая плотность той же пробирки сразу после прибавления культуры;

Дд - оптическая плотность контрольной пробирки через 3 часа; Д4 - то же, сразу после прибавления культуры.

При наличии бактерицидного действия нарастания оптической плотности в опытных пробирках было меньше, чем в контрольных. Полученную величину (А), характеризующую процент раз множения микробов, вычитали из 100% и получали процент угнетения размножения микробов (кишечной палочки), которая и характеризует бактерицидную активность сыворотки крови.

Уровень бета-лизинов определяли по той же методике, что и при определении БАСК, но в качестве питательной среды бьш взят бульон Мартена. Бета-лизины проявляют свое избиратель ное действие в отношении спорообразующих бацилл (О.В.Бухарин,

Н.В.Васильев, 1977). Поэтому в качестве тест-культуры для определения их активности наш была использована сенная палочка (Вас ).

Лизоцимную активность сыворотки крови (ЛАСК) исследовали модифицированным нефелометричесним методом. На 0,5$ растворе поваренной соли готовили взвесь суточной агаровой культуры лизирующегося микрококка Ь/зсс(еЫ1а/5). Конце-трацию определяли колориметрически на ФЭК-Н-57, светофильтр зеленый, кювета сечением 5 мм, оптическая плотность порядка 0,60 ед. экстинкции. К 0,1 мл исследуемого субстрата (сыворотка) добавляли 0,4 мл 0,5%-го раствора поваренной соли и 2 мл взвеси в том же растворе микрококка. На фотоколориметре определяли оптическую плотность полученной взвеси и ставили её на 30 минут в термостат при 37°С, после чего вновь определяли оптическую плотность; по разнице двух определений путем оценки изменения оптической плотности рассчитывали процент лизирован-ной в течение получаса культуры, которая и характеризует активность лизоцима.

Определяли комплементарную активность сыворотки крови по полному 100/5-му гемолизу бараньих Эритроцитов. Сыворотку животных разливали в пробирки в количествах 0,01 - 0,02 -0,04 - 0,06 - 0,08 мл и т.д. В пробирки добавляли ||изиологи-ческий раствор до объема 0,2 мл. В каждую пробирку прибавляли по 0,4 мл физиологического раствора и 0,4 мл гемолитической системы (3% бараньи эритроциты пополам с гемолитической сывороткой в тройном титре). Пробирки помещали на 30 минут в термостат при 37°С. Учитывали реакцию, принимая за титр комплемента минимальное количество испытуемой сыворотки, вызывающее полный гемолиз бараньих эритроцитов.

Для определения фагоцитарной активности нейтро<|илов

использовали клетки перитонального экссудата белых мышей в конечной концентрации 12,5 млн.клеток/мл. Экссудат получали через 2,5 часа после введения 10 % раствора пептона. Объектом фагоцитоза служила взвесь суточной культуры В.staphy&coceus аи&еив , штамм 9198 в концентрации 250 млн.т/мл. Интенсивность фагоцитоза оценивали по двум параметрам: фагоцитарный показатель (индекс) - процент клеток, участвующих в фагоцитозе; фагоцитарное число - среднее число микробов, захваченных каждой участвующей в фагоцитозе клеткой.

Постановка реакции. В пробирки последовательно добавляем 0,05 мл раствора Хэнкса, 0,1 мл клеточной взвеси соответствующей концентрации, 0,05 мл микробной взвеси (соответствующей концентрации). Пробирки инкубировали на водяной бане при 37°С в течении 30 минут. Затем из каждой пробирки делали мазки, окрашивали по Паппенгейму. На каждом стекле подсчитывали около 300 клеток. Подсчет фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа производили по В.В.Меньшикову.

Для определения содержания Т- и B-лимфоцитов в крови применяют в настоящее время большое количество методов и их модификаций, основанных на розеткообразовании с различными эритроцитами (бараньими, мышиными, бычьими и др.), выявлении поверхностных антигенов, оценке ответа на митогены цитотокси-ческих реакций и т.д. (^ufiamejr 1978). Однако, прежде чем проводить дифференцировку лимфоцитов необходимо их выделить в чистом виде.

Для выделения лимфоцитов наиболее употребительным является метод выделения этих клеток в градиенте плотности фи-колверографш (Л.Б.Хейфец и В.А.Абалакин, 1973; Böyum, 1968). Смешиванием фикола и верографина получаем раствор плотностью 1,077. В центрифужные пробирки наливаем по 5 мл этой смеси.

Осторожно по стенкам наслаиваем 3-5 мл плазмы, отстоявшейся от гепаринизированной крови. Полученную смесь центрифугируем при 1500 об/мин в течение 30 минут. Лимфоцитарнор кольцо на границе сред отсасываем в центрифужную пробирку с охлажденным до 4°С раствором Хэнкса. Лимфоциты дважды отмываем раствором Хэнкса и ресуспендируем В 0,80 мл того же раствора или среды 199.

Содержание лимфоцитов подсчитываем в камере Горяева, для дальнейшей работы берем лимфоциты концентрацией 2x10 клеток/мл.

Работами как отечественных (Х.М.Векслер, 1975; Т.И. Гришина, С. Мюллер, 1978), так и зарубежных (Сewan.tese.ei, 1978) показана возможность использования для вцделения лимфоцитов только верографина. Эта моди(|якация выделения указанных клеток также была использована в части наших исследований.

Одним из наиболее распространенных методов оценки функции Т- и В-лимфоцитов (и определения содержания этих клеток в крови) является реакция бласттрансформации лимфоцитов -РБТЛ (Э.М.Ншгден, 1980; фоос(,СЦ1977; КазаЫа е.а., 1979).

Мы ставили эту реакцию в модификации П.Г.Назарова и В.И.Пуринь (1975).

Во флаконы со средой 199 (2,0 мл) вносим 0,1 мл гегта-

5

ринизированной крови (содержание лимфоцитов порядка 5x10 клеток/мм"^ и 0,1 ФГА в разведении 0,5 мкг/мл среды (Т-митоген) или липополисахарид кишечных бактерий (ЛПС) в концентрации 10 мкг/мл (В-митоген) в том же объеме. На каждую пробу крови берем б флаконов для ФГА и б - для ЛПС. Смесь инкубируем 48 часов при 37°С, после чего в половину флаконов (по 3 для ФГА и ЛПС) добавляем тимидин из расчета I мкКи/мл в объеме 0,1 мл и продолжаем инку-

бацию до 72 часов. То есть в одинаковых условиях выращиваем опытные пробирки с тимидином и контрольные без него. После 72 часовой инкубации содержимое флакона взбалтываем и добавляем туда 3$-ную уксусную кислоту объемом примерно 4-6 мл для лизиса эритроцитов. Содержимое ресуспендируем и переливаем в центрифужные пробирки. Пробирки центрифугируем 3-5 минут при 1500 об/мин, надосадочную жидкость удаляем, осажденные клетки вновь ресуспендируем в 3$-ной уксусной кислоте и снова центрифугируем. К осадку добавляем 5 мл холодной 5%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и пробирки выдерживаем в течение 30 минут при 40°С до полного выделения из клеток кислорастворимых фракций. Центрифугируем пробирки при 1500 об/мин 3-5 минут. Надосадочную жидкость сливаем, а пробирки оставляем в перевернутом виде на фильтровальной бумаге на 2-3 часа до полного высушивания осадка. Проводим выделение ДНК посредством гидролиза в 5%-ной ТХУ (0,5 мл) при 90°С в течение 30-45 минут. В гидролизат добавляем 1,5 мл абсолютного этанола или метанола, центрифугируем, надосадочную жидкость переливаем в счетные флаконы. В гидролизат добавляем 10 мл сцинтилляционной жидкости. Пробы подсчитываем в сцитилляционном счетчике С/и£й^о ), результаты выражаем числом импульсов в минуту и через индекс бласттрансформации (отношение числа импульсов в опытных и контрольных пробирках).

Все проведенные нами исследования представлены ниже в соответствующей схеме.

Схема проведенных исследований по определению влияния анандина на организм лабораторных животных

рия Характеристика Bifl

ытов показателя животного

Показатель

Клинические и

гематологические Крысы исследования Мыши

Общее состояние животных

Особенности поведения

Координация движения

Интенсивность и характер двигательной активности

Реакция на тактильные, ззу> ковые и световые раздражители и др.

Количество эритроцитов

Содержание гемоглобина

Количество тромбоцитов

Количество лейкоцитов

Лейкоцитарная формула

ьиохимические показатели сыворотки крови

ACT

(аспартатаминотрансфераза) АЛТ

Крысы (аланинаминотрансфераза)

Билирубин

Креатинин

Азотистая мочевина

Глюкоза

Общий белок и его фракции

Калий

Натрий

Определение

пирогенности, Кпп1ш„и Температурная

острой и хрони- кролики реакция

ческой токсичности Мыши Летальная доза (ДД50)

при различных способах введения

4

Факторы

неспецифической

защиты

организма

Бактерицидная активност: сыворотки крови

Крысы Лизоцимная активность Мыши сыворотки крови

Уровень бета-лизинов

Общая комплементарная а: тивность сыворотки кров;

Фагоцитарная активность нейтрофилов крови

3

I

2

4

Определение иммунобиологической реактивности лимфоцитов

Количество Т-лимфоцитов

Крысы функция Т-лимфоцитов

Мыши (с ФГА в РБТЛ)

(с КоН-А в РБТЛ)

Количество В-лимфоцитов

Функция В-лимфоцитов

(с ЛПС в РБТЛ)

Циркулирующие иммунные комплексы

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние анандина на гематологические показатели у крыс Для исследования влияния анандина на гематологические пока затели, такие как, содержание гемоглобина, количества эритроцито тромбоцитов и лейкоцитов, были отобраны 18 белых крыс (самцов) средней живой массой 195,3 + 6,8 г. Крысам однократно, внутримышечно вводили анандин в рекомендуемой дозе 15 мг/кг массы тела. Кровь исследовали через 3 часа и через сутки после инъецирования анандина. Эти данные представлены в таблице I.

Таблица I

Показатели крови у крыс

Показатели Единица Исходные пока- 3 ц ?4 ч

показатели измерения затели до введе- й 4' й 4

_ния препарата_

Продолжение таблицы I

I 2 3 4 5

ритроциты млн/мкл 7,5+0,15 7,6+0,2 7,6+0,11

»моглобин т/% 13,3+0,15 13,6+0,25 13,7+0,05

эомбоциты тыс/мкл 457+2 8 461+12 465+8,8

гйкоциты тыс/мкл 12,63+0,69 13,2+0,2 13,4+0,5

Как бидно из данных таблицы, количество эритроцитов в опытных группах увеличилось незначительно по сравнению с контрольной группой. Более значительным зарегистрировано увеличение уровня гемоглобина в крови. Количество тромбоцитов в наших исследованиях практически не изменилось. По литературным данным известно, что причиной этому являются изменения функций костного мозга, его мегакариоцитов, от которых происходят тромбоциты.Количество лейкоцитов в крови может изменяться под влиянием различных внешних факторов: сезонных, климатических, а также при разных физиологических состояниях организма. В опытной группе животных мы наблюдали достаточно значительное увеличение количества лейкоцитов с 12,63+0,69 до 13,4+0,5 тыс/мкл, т.е. на 6,1 %.

Влияние анандина на биохимические показатели сыворотки крови у крыс. Вторая серия опытов была проведена на 27 белых крысах породы "Вютар" с живой массой 214-231 грамм с целью изучения воздействия препарата анандин на биохимические показатели сыворотки крови лабораторных животных.

В таблице 2 представлены результаты биохимического анализа сыворотки крови подопытных крыс.

Таблица 2

Биохимические показатели крови у крыс при использовании анандина

Показатели в™* Опытные группы

измерения группа через 3 часа через ¿4 часа

Количество д д д

животных *ил- г у

Продолжение таблицы 2

I 2 3 4 5

Живая масса г 216,5+6,1 230,8+7,9 214,4+4,8

ACT MIE 61,8+2,1 64,3+2,4 67,5+1,0

АЛТ MIE 59,2+1,8 60,8+5,0 63,1+1,3

Креатинин иг% 1,2+0,02 1,2+0,03 1,2+0,02

Билирубин мг% 0,233+0,04 0,266+0,04 0,187+0,02

Азот.мочевина мг% 20,2+2,0 15,7+0,7 12,7+1,0

Глюкоза uv% 105,2+8,9 127,0+4,8 98,8+4,3

Общий белок г% 6,6+0,3 7,1+0,1 6,6+0,4

Калий ммоль/л 6,4+0,1 6,0+0,2 5,9+0,1

Натрий ммоль/л 143,1+1,1 142,6+1,1 143,8+1,1

В контрольных пробах сыворотки крови (таблица 2) количество АЛТ составляло 59,2+1,8 MIE, ACT - 61,8+2,1 MIE. Чере 3 часа после инъекции анандина уровни этих ферментов в сыворот практически не изменялись, то есть составляли: АЛТ - 60,8; ACT - 64,3 MIE. Спустя 24 часа количество АЛТ достигало 63,1+] MIE, a ACT - 67,5+1,0 MIE. Анализируя полученные данные можно констатировать: препарат не оказывает ярко выраженного эффекте на печень и сердце.

Креатинин и мочевина являются ценными диагностически показателями почечной недостаточности, декомпенсации сердца и острой атрофии печени. Инъекция анандина не повлияла на урове! креатинина в сыворотке крови подопытных крыс. Этот показатель оставался стабильным по сравнению с контрольным значением, ка; через 3 часа, так и спустя сутки - 1,2 мг%. У контрольных жив( ных содержание мочевины в крови было 20,2+2,0, в то время как у подопытных отмечали снижение этого параметра на 22,3$ и на 37,1% последовательно.

Данные таблицы 2 указывают, что уровень содержания глюкозы и белка в сыворотке крови несколько повышается через 3 часа после воздействия анандина - на 21,8 мг% и 0,5 соответственно. А через 24 часа эти показатели были практически одинаковы.

Достоверных отличий по уровню калия и натрия в сыворотке крови у контрольных и опытных животных не наблюдали. Колебания этих показателей минерального обмена находились в пределах физиологических нормативов.

Таким образом, проведенные исследования крови крыс позволяют сделать вывод о том, что испытуемый препарат в рекомендуемой дозе (15 мг/кг) не обладает выраженным токсическим эффектом, как на отдельные органы и ткани, так и на организм б целом.

Содержание общего белка и его фракций У подопытных животных. Опыт проводили на белых крысах(самцах) средней массой 168 - 174 г. Опытной группе вводили внутримышечно знандин в рекомендуемой дозе 15 мг/кг один раз в сутки 3 дня подряд. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3

Содержание общего белка и его фракций при введении анандина

Показатели Контроль,% Опыт, %

Общий белок 62,3+0,25 62,5+0,29

Альбумины 49,3+0,18 46,9+0,2

Глобулины 50,7+0,38 53,1+0,4

/ , I 5,7+0,22 6,0+0,25

с/ 2 6,0+0,38 6,1+0,35

27,6+0,29 23,5+0,33

¡Г 11,4+0,27 17,5+0,3

Отношение /Г 0,97 0,88

Как видно из таблицы введение анандина существенным образом сказалось на протеинограмме, а именно:снизился уровень альбумино В-глобулинов, но увеличилось суммарное содержание глобулинов, в основном за счет гамма-глобулинов. Это свидетельствует о достато но активном воздействии анандина на белковые фракции, и на их за щитные функции.

Изучение острой токсичности анандина на белых мышах. При изучении острой токсичности определяли переносимые, токсичес кие и летальные дозы анандина при различных способах введения. В таблице 4 представлены результаты экспериментального определения ДЦзд при применении препарата анандина.

Таблица 4

Результаты определения ДД^д при различных способах введения анандина белым мышам

Способы введения препарата Камедон, мг/кг Анандин, мг/кг

I. Внутрибрюшинный 408+11,2 2308+22

2. Внутривенный 457+18 1013+12

3. Подкожный 729+23 4121+28

4. Оральный 3750+25 10130+87

При внутримышечном введении препарата, анандин даже в дозировках В 125 раз превышающих рекомендуемую (15 мг/кг) ЛД^ не выявлялось. Таким образом, исследования по изучению острой тока ности анандина показали, что препарат менее токсичен и его пере: симые дозы для лабораторных животных гораздо выше, чем у камедо Изучение влияния анандина на гвакторы неспепиДической защ ты организма животных. Опыты были проведены на 20 белых крысах (самцах) со средней живой массой 216,4+9,1 г. Животным внутримы шечно вводили анандин в дозе 15 мг на 1кг массы тела, I раз в с ки 3 дня подряд. Результаты исследований приведены в таблице 5.

Таблица 5 Показатели неспецифической защиты организма

Показатели Контрольная группа Опытная гвуппа

терицидная активность оротки крови,% 64,36+2,7 74,8+2,2

оцимная активность,% 73,7+6,51 86,63+5,15

вень бета-лизинов,% 40,3+1,77 40,6+1,35

вень комплемента в оротке крови 5,3+0,2 6,3+0,1

оцитарный индекс 22,6+0,78 33,4+1,01

оцитарное число 2,4+0,14 2,65+0,07

Анализируя полученные данные можно сделать вывод, что анан-повышает уровень лизоцимной активности сыворотки крови на 1Ж сравнению с контролем. Под действием препарата увеличивается про-г клеток, участвующих в фагоцитозе (фагоцитарный индекс), и на-дается тенденция к увеличению фагоцитарного числа. Также в сыво-ке крови наблюдается повышение уровня комплемента в опытной груп-кивотных. Уровень ^лизинов практически не изменился. Увеличение азателя бактерицидной активности сыворотки крови было на 10,5% но обусловлено повышением факторов гуморальной неспецифической лты в целом. Активизация факторов неспеци(|ической защиты способ-ует повышению естественной резистентности организма животных.

Изучение влияния анандина на иммунобиологическую реактив-гь лимфоцитов у белых крыс и мышей. Исследования проводили на белых крысах (самцах) средней живой массой 205,2+2,4 г. Опытным отным вводили анандин в дозе 15 мг/кг массы тела I раз в сутки йя подряд. Контрольной гркппе вводили внутримышечно дистиллиро-ую воду в том же объеме. Результаты действия анандина на коли-гво и функцию Т- и В-лимфоцитов опытной группы сравнительно с гролем представлены в таблицах 6-7.

Таблица б

Определение количества Т- и В-лимфоцитов

Лимфоциты Контроль Опыт

Т 34,21+2,48 В 14,81+0,44 39,66+2,23 16,73+0,61

Таблица 7 Влияние анандина на хелперные и супрессорные функции Т- и В-лимфоцитов

Показатели Единица Контроль измерения ^ Опыт

ФГА число им-

(фитогемагглютинин) пульсов в 3925,51+564,22 7423,53+245,41 I минуту

КоН-А

(конканавалин-А) ч.и.в 1мин. 2684,51+265,71 6919,41+250,53 ЛПС

(липополисахарид) ч.и.в 1мин. 1959,31+308,99 3292,86+235,43

СО

(спонтанная су- и „ „ Тш.н

прессия) ч,и,в 1шн>

ИС

14,01+1,94 5,73+0,53

25,81+2,92 16,01+0,92

Как можно видеть, относительное количество Т- и В-лимфоцит под влиянием сравнительно с контролем существенно не изменилось, против, функциональные свойства Т-лимфоцитов, характеризующие акт ность функционирования в РБТЛ зрелых форм Т-лимфоцитов (тест спон тайного включения и с ФГА) и молодых форм Т-лимфоцитов (тест с Кс возрастали в 2,3-2,6 раза по сравнению с контролем. Активизировал также функция В-лимфоцитов более чем в 1,5 раза в тесте с ЛПС сра нительно с контролем. То есть препарат анандин значительно повыша функциональную активность клеточного и гуморального звена иммунит Однако, как следует из таблицы 7, функция Т-лимфоцитов-суп соров в тесте спонтанной и индуцированной супрессии под влиянием парата анандина значительно снижалась. По сравнению с контролем е снижение растянуто по времени в 2,5-1,6 раза. При этом следует от тигь, что Т-лимфоциты-супрессоры блокируют развитие гуморального клеточного иммунитета, способствуя тем самым становлению иммунолс

еской толерантности, поскольку на долю Т-лимфоцитов-супрессо-ов приходится и функция регуляции численного состава различных опуляций лимфоцитов, поддерживая их постоянное соотношение. Крое того, Т-лимфоциты-супрессоры контролируют и активацию аутоим-унных реакций, которые как известно, являются производными В-си-темы иммунитета.

ШВОДЫ

1. Анандин при парентеральном введении лабораторным животным белые мыши и крысы, кролики) не оказывал негативного влияния на

< клиническое состояние. Это подтверждалось отсутствием температурных, аллергических и местнораздражающих реакций.

2. Анандин по своей токсичности можно отнести к малотоксич-ам препаратам, ДЦе^ которого для белых мышей при внутрибрюшинном

внутривенном введении составляет соответственно 2308 и 1013мг/кг,

3. Биохимические показатели сыворотки крови у крыс при вве-знии анандина в дозе 15 мг/кг массы тела претерпевали определение изменения во временном аспекте,Так, в меньшей степени он ока-ал воздействие на содержание калия, натрия, креатинина и общего элка. Ферменты ACT и AJIT имели незначительную тенденцию к увели-энию через 24 часа. Билирубин и азот мочевины снижались соответ-гвенно, с 0,233+0,04 до 0,187+0,02 ит% и с 20,2+2,0 до 12,7+1,0 ■•%. Уровень глюкозы несколько повышался в первые 3 часа и стаби-13ИрОБаЛСЯ к исходу суток.

4. Анандин активизирует факторы неспецифической защиты оргазма посредством повышения уровня бактерицидной и лизоцимной ак-iвности сыворотки крови, а также за счет увеличения уровня ком-темента и фагоцитарной активности нейтрофилов.

5. Положительное влияние анандина на состояние естественной эзистентности организма белых мышей и крыс подтверждается повы-знием иммунобиологической реактивности Т- и В-лимфоцитов.

Отмечено достоверное увеличение хелперных и снижение супрессор-ных функций Т-лимфоцитов.

б. Аутоиммунные сдвиги,возникающие при действии анандина не достигают значений, позволяющих говорить об аутоиммунной агрессии, а носят приспособительный , компенсаторный характер.

Практические предложения

1. Исходя из результатов наших исследований, препарат ана! дин рекомендуется в первую очередь как спецефический ветеринарш препарат для повышения естественной резистентности организма животных, а также для профилактики их иммунодефицитных состояний.

2. Анандин может быть рекомендован также в качестве профилактического средства для сохранения и повышения продуктивности животных.

3. Для успешного применения препарата анандин , рекомендовать его использование в дозе 15 мг/кг массы тела и в комплексе с другими лекарственными веществами (антибиотики, сульфаниламид] ферментативные препараты и др.)

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кузнецов А.Ф., Мухина Н.В., Белопольский А.Е., Травкин О.В., Буянова Е.В.»Яковлева Е.Я. Камедон - эффективный противовирусный препарат // Международ, симпоз."Проблемы моделирования патологических процессов у человека и животных; Иммунодефициты, их диагностика и коррекция":Тез.докл.- СПб.,1994.-С.30.

2. Кузнецов А.Ф.,Мухина Н.В..Белопольский А.Е.,Травкин 0. Буянова Е.В..Яковлева Е.Я.Токсикологическая экспертиза "Анандин нового иммуностимулятора широкого спектра действия//Международ. симпоз."Проблемы моделирования патологических процессов у челов ка и животных; Иммунодес|яциты, их диагностика и коррекция": Тез докл.- СПб., 1994.- С.31.

3. Кузнецов А.Ф.,Мухина Н.В..Белопольский А.Е. Влияние

анандина на некоторые биохимические показатели крови лабораторных животных // Сб.науч.тр./ Санкт-Петербург.гос.академ.вет. мед.- 19Э5.-Вып.123,- С.54-56.

4. Кузнецов А.Ф.,Мухина Н.В..Белопольский А.Е. Определение острой токсичности анандина на лабораторных животных //Сб. науч.тр./ Санкт-Петербург.гос.академ.вет.мед.- 1995.-Вып.123.-С.56-59.