Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка, усовершенствование и оптимизацияпромышленных технологий производства диагностикумов и противобактериальных вакцин

л р.

На правах рукописи

Мельник Николай Васильевич

Разработка, усовершенствование и оптимизация промышленных технологий производства диагностикумов и противобактериальных вакцин

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунологоия 03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Диссертационная работа выполнена на Государственном Щелковском биокомбш Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России

Научные консультанты:

Доктор биологических наук, профессор, Лауреат Государственной премии С( Николай Данилович Скичко.

Доктор ветеринарных наук, профессор, член-корреспондент РАСХН Анатолий Яковлевич Самуйленко.

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук, профессор Э.А. Шегидевич (ВИЭВ)

Доктор ветеринарных наук, профессор М. А. Сидоров (МГУПБ) >

Доктор ветеринарных наук, профессор В.А. Гаврилов (Покровский биозавод)

Ведущее учреждение:

Всероссийский Государственный научно-исследовательский институт контро стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ)

<Г

Защита состоится МУслЬМЯ997 г в 14 ^ на заседании диссертацио! совета Д 020.28,01 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментш ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке инстит;

Автореферат разослан "_"_1997г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат ветеринарных наук

На правах рукописи

Мельник Николай Васильевич

Разработка, усовершенствование и оптимизация промышленных технологий производства диагностикумов и противобактериальных вакцин

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунологом 03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

1.0бщая характеристика работы.

1.1 Актуальность проблемы. Основными задачами ветеринарной науки и практики является улучшение качества продуктов питания и животного сырья , решение проблем диагностики и профилактики болезней животных , а также охрана страны от заноса возбудителей особо опасных болезней и защита внешней среды. Биологическая промышленность является старейшей отраслью агробиологического комплекса России и представлена биопредприятиями , расположенными в различных регионах страны . Основное направление в работе биопредприятий - производство ветеринарных препаратов . На предприятиях отрасли производится более 170 препаратов , в том числе противобактериальные , противовирусные и ассоциированные вакцины , диагностикумы , лечебные сыворотки и глобулины, бактериофаги, анатоксины и различные растворы для животноводства.

В связи со складывающимися экономическими отношениями в сфере производства и потребления, возрастающей конкуренцией зарубежных и отечественных производителей , перед учеными и практиками биологической промышленности стоят задачи от успешного решения которых зависит эффективность работы ветеринарной службы России и биопредприятий.

Обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными лечебно-профилактическими препаратами - одна из главных задач в экономике и экологии страны. Система программных мероприятий для обеспечения ветеринарной службы России высокоэффективными конкурентноспособны-ми отечественными препаратами предусматривает проведение работ по технологическому и техническому переоснащению их производств на основе достижений биотехнологии.

Общие концепции и принципы биотехнологии представлены в трудах отечественной и зарубежной ученых : M.J. Raulin, 1969; A.J. Kluyver , L.H.Perquin, 1933; В.Н. Шапошников, 1947; J. Monod,1950; А.И. Работнова, 1957; Н.Д. Иерусалимский 1949; Ш. Аиба, А.Ф. Хемфи, Н. Миллис, 1975; Э. Уэбб, 1966; 1969; М. Диксон, 1966; G.L.Solomons, 1969; S.J. Pirt, 1975; R.Y. Stanier , E.A. Adelberg, M. Doudoroff, 1975, 1979; Дж. Уотсон, 1978; И В. Березин, 1979, B.B. Кафаров, 1979; Д. Уонг, Ч. Кооней, А. Демайн, Р.Дунни, М. Лилли, 1983; В.В. Бирюков, В.М. Кантере, 1985; К.А. Калу-нянц, Л.И. Голгер, В.Е. Балашов, 1987; Дж. Бейли, Д. Оллис, 1989; С.Д. Варфоломеев, 1990; И.А. Баснакьян и др., 1983, 1992; ,Е.А. Рубан А.Я. Са-муйленко, 1971,1996; Н.Д. Скичко, 1990,1996.

Вопросам промышленной технологии производства вакцины против рожи свиней посвящены работы Луи Пастера, 1882; Т. Леффлера, 1886; Д.Ф. Конева, 1904-1908; В.П. Меркулова и др.,1970-1972; О.Б. Дьяконова и

др. , 1972; Н.Т. Татаринцева, П. Васильева, 1975; А. Воробьева, 1986. Однако создание высокоиммунногенной вакцины против рожи свиней в условиях современного промышленного производства требует новых технологических подходов к системам управления глубинного культивирования, оценке ростовых свойств питательных средств, биохимическим показателям сред высушивания.

Большое количество работ посвящено проблеме технологий производства антигенов и вакцин против бруцеллеза из различных штаммов: Брюс , 1887; П.Ф. Здродовский, 1927 ; Huddleson, 1929; П.А. Триленко, 1957; Е.С. Орлов, 1964; Н.П. Иванов, 1984; К.В. Шумилов и др., 1987.

Сохраняет актуальность проблема получения высокоэффективных эритроцитарных диагностикумов для диагностики пуллороза-тифа птиц.

Первым формалинизированные эритроциты в серодиагностике использовал R.A. Fleck, 1962. Данные о консервации эритроцитов формалином приведены также в работах Ю.А. Белой, 1984, 1996 и В.В. Зайцева, 1987. Различные методы формалинизации эритроцитов барана описаны в многочисленных работах отечественных и зарубежных авторов: J.M. Singer (1956); В. Smit (1960); М.И. Леви и др. (1962); S. Winblad (1960); U. Hammerlino (1967); И.В. Шур (1970); R.B. Bankert (1974); Ю.Я.Тендетник и др. (1975); H.R. Ling (1977); N.S. Wang (1984); N.A. Сох и др. (1990); В.Е. Ефремов и др. (1996); С.Н. Тимчук и др. (1996); Б.В. Каральник и др. (1996).

Процесс сенсибилизации эритроцитов сенситином является наиболее важным этапом при изготовлении пуллорного антигена и других диагностикумов. Механизм взаимодействия эритроцитов и сенситинов сложен, в нем принимают участие как физическая адсорбция, так и химическое взаимодействие (А.Т. Кравченко, М.И. Соколов, 1946; W.P. Havens и др., 1949 И.В.; Шур, 1970; Е. Wohfarth, 1971; E.H. Битная, A.C. Зайцев, Ф.Д. Любич, Ю.А. Малахов, B.C. Соловьев, 1978; Ф.С. Киржаев и др.,1975; Ю.Я. Тендетник и др.,1975; C.R. Parish и др.,1980; T.J. Humphrey и др.,1991; С.Е. Hormalche и др.,1992; Б.В. Каральник, Т.Г. Денисова, 1996).

В настоящее время в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота важное место занимает некробактериоз, получивший широкое распространение во многих регионах России.

Описание возбудителя некробактериоза и болезней, вызываемых у различных животных, даны в работах. J.D. Stovell (1969); H. Павловский, (1909); С.Н. Вышелесский, (1917); Г.Ф. Панин, (1930); П.Н. Андреев, П.В. Тавельский, (1931); А.Г. Ревнивых, (1932,1935,1940); Н.Х. Глебов, (1947); К.И. Вертинский, Н.Г. Нахлунин, (1956); Н.И. Писаренко, (1973); F.N. Johnson, (1969); А.Г. Санин, (1974); Н.С. Островский, (1977); Г.Н. Васин, (1983); С.И. Браттоха, (1985); R.B. Gupta, (1964);F.C. Wilkinson, (1970); Е.А. Lainq and J.R. Eqerton, (1978); R.B. Richards, (1980); B.L. Clark, (1985).

В течение длительного времени ведутся работы по созданию вакцин для иммунизации животных разных видов против некробактериоза. Разработкой их занимались В.Г. Попов, 1956; Н.Х. Глебов, 1957 ; П.И. Ребров, 1962; P.C. Simon, P.L. Stovell, 1969; A.A. Пилипенко и М.Н. Борисова, 1983; М. Turpin et.al., 1983; B.L. Clark et. al., 1986; Г.Ф. Коромыслов, Г.И. Устинова , Ю.Д. Караваев, A.A. Сидорчук , С.Д. Панасюк, 1987г.

Практически отсутствуют данные о промышленной технологии производства вакцин против некробактериоза сельскохозяйственных животных. До настоящего времени промышленным способом не получено эффективных специфических препаратов.

Решение задач совершенствования промышленной технологии производства ветеринарных препаратов потребовало научного обоснования и разработки основ промышленного производства оптимизации данных процессов с использованием современных методов исследований .

1.2 Цель работы - изучить процессы промышленного производства вакцин против рожи свиней и некробактериоза животных, единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в РА , РСК и РДСК, эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц, дать научное обоснование, разработать , усовершенствовать и оптимизировать эти процессы с использованием современных методов исследования , технологий и оборудования.

1.3 Основные задачи исследований.

1. Проанализировать и определить пути совершенствования промышленной технологии производства:

- живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2 ;

- вакцины против некробактериоза крупного рогатого инакгивиро-ванной эмульгированной из штамма Bacterium necrophoram (ВИЭВ);

- единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в РА, РСК и РДСК из штамма Brucella abortus 19;

- пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц из штамма Salmonella qallinarum-pullorum.

2. Научно обосновать методы усовершенствования и оптимизации промышленной технологии производства вакцин и диагностикумов.

3. Разработать или усовершенствовать и оптимизировать промышленную технологию производства:

- живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2 ;

- инаюгивированной эмульгированной вакцины против некробактериоза животных из штамма Bacterium necrophorum (ВИЭВ);

- единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в РА, РСК и РДСК из штамма Brucella abortus 19;

- пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц из штамма Salmonella qallinarum-pullorum.

4. Провести сравнительные испытания существующих, разработанных или усовершенствованных и оптимизированных технологий производства вакцин и диагностикумов и дать оценку эффективности полученных препаратов.

5. Изучить санитарные и экологические аспекты промышленного производства биопрепаратов и дать практические предложения по решению существующих проблем в этих областях.

6. Провести сравнительный экономический анализ существующих и предлагаемых промышленных технологий с точки зрения их экономической эффективности.

7. Сформулировать практические предложения по совершенствованию технологий промышленного производства вакцин и диагностикумов на предприятиях агробиологического комплекса России.

1.4. Научная новизна. Впервые в ветеринарной биотехнологии с использованием современных научных методов исследований:

1. Усовершенствована и оптимизирована промышленная технология производства живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2:

- разработан и испытан с положительными результатами новый состав питательной среды с улучшенными ростовыми свойствами для глубинного периодического культивирования штамма Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2 при промышленном производстве живой сухой вакцины против рожи свиней;

- разработана и проверена в условиях промышленного производства, новая рецептура среды высушивания для лиофшгазации при производстве вакцины против рожи свиней ;

2. Разработана и оптимизирована промышленная технология производства вакцины против некробактериоза животных инактивированной эмульгированной из штамма Bacterium necrophorum (ВНЭВ):

- метод разрушения микроорганизмов с использованием ультразвука заменен на метод замораживания-оттаивания для получения внутриклеточных эндотоксинов (антигенов);

- процесс концентрирования экзотоксинов (внеклеточных антигенов) осуществлен с использованием метода ультрафильтрации ;

3. Усовершенствована и оптимизирована технология промышленного производства единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных в РА, РСК и РДСК:

- изучен , предложен и апробирован в условиях промышленного производства метод холодной стерилизации питательных сред при изго-

товлении вакцины против рожи свиней и единого бруцеллезного антигена в РА, РСК и РДСК;

- разработана и испытана бессывороточная питательная среда для культивирования штамма Brucella abortus 19;

- исследован и внедрен метод суспензионного глубинного культивирования штамма Brucella abortus 19 с целью получения максимального количества жизнеспособных бактерий на стадии логарифмического роста;

- исследован и апробирован в условиях производства метод концентрирования ультрафильтрацией культуральной жидкости Brucella abortus шт.19 при производстве единого бруцеллезного антигена в РА, РСК и РДСК;

4. Усовершенствована и оптимизирована технология промышленного производства пуллорного эритроцитарного антигена из штамма Salmonella qallinarum-pullorum для диагностики пуллороза-тифа птиц:

- теоретически обоснован и апробирован в условиях производства новый метод ресуспендирования , экстрагирования , осветления бактериальной массы Salmonella qallinarum-pullorum при производстве пуллорного эритроцитарного антигена с использованием поверхностно-активного вещества ( ПАВ ), с добавлением двууглекислого натрия или раствора щелочи с последующим экстрагированием и сенсибилизацией эритроцитов по-липептидно-полисахаридной фракцией ( бесспиртовый метод);

- теоретически обоснован и апробирован метод осветления сенсибилизированных эритроцитов в фосфатно-буферном растворе .

1.5. Научная новизна работы подтверждена авторскими свидетельствами на изобретения и патентами:

1. Авторское свидетельство № 1725904 " Способ получения бруцеллезной вакцины из шт. 82".

2. Патент № 2085211 " Способ изготовления вакцины живой сухой из штамма ВР-2 против рожи свиней " .

3. Положительное решение о выдачи патента № 97108391 на " Способ изготовления инактивированной, эмульгированной вакцины против некробактериоза животных " .

4. Патент № 2085212 " Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных в РА, РСК и РДСК".

5. Патент № 2085949 " Способ изготовления пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц ".

1.6. Практическая значимость. На основе теоретических исследований и практической апробации в условиях промышленного производства разработаны или усовершенствованы и оптимизированы следующие технологии :

- технология производства вакцины живой сухой из штамма ВР-2 против рожи свиней;

- технология производства инакгивированной эмульгированной вакцины против некробактериоза животных ;

- технология производства единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных в РА, РСК и РДСК;

- технология производства пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц.

1.7. Материалы исследований включены в следующие нормативно-технические документы:

1. Инструкция по приготовлению и контролю вакцины живой сухой из штамма ВР-2 против рожи свиней.

2. Временная инструкция по изготовлению и контролю инакгивированной эмульгированной вакцины против некробактериоза животных.

3. Изменения и дополнения к инструкции по изготовлению и контролю единого бруцеллезного антигена для диагностики сельскохозяйственных животных в РА, РСК и РДСК.

4. Регламент производства пуллорного эритроцитарного антигена.

5. Методика использования ультрафильтрации для осветвления и концентрирования бактериальной суспензии и антигенов при производстве диагностикумов и противобактериальных вакцин .

Указанная нормативная документация согласована и утверждена в установленном порядке.

1.8. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- Всесоюзной конференции "Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем", г. Велигож, 1990 г.

- Всесоюзной научно-технической конференции "Современные проблемы иммунологии , биотехнологии , генной и клеточной инженерш в ветеринарной медицине", г. Нижний Новгород, 1990 г.

- V Всероссийской конференции "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных препаратов", Щелково, 1996г.

- Научно-производственной конференции, "100-лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России", г Курск, 1996 г.

По материалам диссертации опубликовано 2$£ работы, в том числе одно авторское свидетельство и четыре патента на изобретения.

s

1.9. Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1.Результаты изучения существующей промышленной технологии производства:

- живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2;

- вакцины против некробактериоза животных инактивированной эмульгированной из штамма Bacterium necrophorum (ВИЭВ);

- единого бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в РА , РСК и РДСК;

- пуллорного эритроцитарного антигена из штамма Salmonella qallinarum-pullorum для диагностики пуллороза-тифа птиц.

2. Теоретическое обоснование методов разработки , усовершенствования и оптимизации промышленных технологий производства вакцин и диагносгикумов для ветеринарии.

3. Разработка или усовершенствование и оптимизация промышленной технологии производства:

- живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2;

- инактивированной эмульгированной вакцины из штамма Bacterium necrophorum (ВИЭВ) против некробактериоза животных;

- единого бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в РА, РСК и РДСК;

- пуллорного эритроциггарного антигена из штамма Salmonella qallinarum-pullorum для диагностики пуллороза-тифа птиц.

4. Результаты сравнительных испытаний вакцин и диагностикумов, полученных по оптимизированным и ранее существующим технологиям производства.

5. Санитарные и экологические требования к производству биопрепаратов и практические предложения по решению существующих проблем в этих областях.

6. Сравнительный экономический анализ существующих и предлагаемых оптимизированных технологий.

7. Данные анализа по экономической эффективности оптимизированных технологий промышленного производства вакцин и диагностикумов для ветеринарии.

8. Практические предложения по усовершенствованию технологий промышленного производства вакцин , диагностикумов на биологических предприятиях агробиологического комплекса России.

1.10. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 298 страницах машинописного текста , содержит 44 таблицы , 45 рисунков, 12 фотографий и состоит из разделов : введение , литературный обзор , собственных исследований , санитарных и экологических требований к производству биопрепаратов , экономического анализа усовершенствованных и оптимизированных промышленных производств биопрепаратов , выводов , практических предложений , списка литературы и приложений .

Список литературы включает 706 источников отечественных и зарубежных авторов.

Приложения к диссертации в объеме 83 страницы содержат документацию, подтверждающую диссертационный материал.

2. Материалы и методы.

Основной объем исследований выполнен в 1990-1996 гг. на Государственном Щелковском биокомбинате при участии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ), Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных биологических препаратов (ВГНКИ) и Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИиТИБП).

При проведении исследований были использованы следующие штаммы: Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2, Bacterium necrophorum (ВИЭВ), Brucella abortus 19, Salmonella qallinarum-pullorum.

Культивирование бактериальных культур осуществлялось глубинным периодическим способом в биореакторах емкостью от 100 до 500 литров. Для проведения экспериментов по совершенствованию и оптимизации перечисленных выше промышленных технологий было использовано оборудование: рамный фильтр типа ЕКО-А-40/28 фирма "Кофрам" (Франция), ферментационная установка емкостью от 300 до 500 л. Фирма "Electrolux" (Швеция), биореактор емкостью 350 л. фирма "Ets. Lieqe" (Франция), опытная блочно-модульная установка ВНИТИБП для культивирования емкостью 100 л. с модулем автоматического управления, ультрафильтрационная установка ВПК-6, суперцентрифуга ОТР-102К-01, коллоидная мельница "Prodst class" (Германия), линия Штрунк фирмы "Бош" (Германия), морозильная установка НС-700/50 (Германия), сублиматор ТГ-50 (Германия).

При приготовлении питательных сред, культивировании и сублимационном высушивании использовались следующие методы биологического

контроля: чистота роста, стерильность, содержание аминного азота, морфология клеток, концентрация микробных клеток, определение количества живых микробных клеток в 1 мл. биомассы, степень инактивации, стерильность и выживаемость после лиофилизации, определение содержания белка по методу Лоури, специфичность, активность, диссоциация.

При проведении работ по совершенствованию и оптимизации рассматриваемых промышленных технологий производства биопрепаратов были использованы методы математического планирования экспериментов и статистическая обработка результатов.

3. Результаты исследования.

3.1. Усовершенствование и оптимизация технологического процесса изготовления живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2.

Анализ ранее существующей промышленной технологии изготовления живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 показал, что эта технология имеет ряд существенных недостатков:

- глубинное культивирование проводится на дорогостоящей, сложной в изготовлении питательной среде;

- стерилизация питательной среды осуществляется термическим способом (паром), что снижает ее ростовые свойства из-за денатурации белков и аминокислот повышенной температурой ;

- концентрирование осуществляется методом центрифугирования, что приводит к частичному механическому повреждению культуры микроорганизмов, а следовательно, к снижению выживаемости, возможности контакта обслуживающего персонала с возбудителем рожи и контаминации культуры посторонней микрофлорой;

- гомогенизация и фильтрация бакмассы после концентрирования на центрифугах также приводит к снижению качества продукта, возможности контаминации посторонней микрофлорой и контакта обслуживающего персонала с возбудителем.

При этом накопление культуры бактерий рожи составляло не более 3-5 млрд./мл и получение соответственно 3 тыс. доз с 1-го литра питательной среды.

В результате проведенных исследований предложена усовершенствованная и оптимизированная технология изготовления живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2, которая представлена на рисунке 1. Новая технология получения вакцины включает следующие этапы.

(ТПцс), (ТП2К) - питательная среда , штамм, (ТПзк) - посевная культура, посевную культуру (ТГЦк) высевают в простерилизованный биореактор (ТПек), в который предварительно подаётся приготовленная по новой, разработанной нами, рецептуре питательная среда на основе перевара Хот-тингера (ТПпк): перевар Хоттингера - 25 -30 %, печеночный экстракт - 5%,

пептон - 5% , сухой дрожжевой экстракт - 0,5%, №С1 - 0,2%, КН2Р04 -0,3%, Ка2НР04 - 1,8%, Твин-80 - 0,05%, глюкоза - 0,2% , нормальная сыворотка крупного рогатого скота - 2%, Ь - аргинин - 0,05%, дистиллированная вода до 100%.

Рисунок 1. Усовершенствованная и оптимизированная технология изготовления живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2. (ТП- технологические процессы)

Концентрация пептона в предлагаемой среде увеличено с 0,5 до 5%, что позволило увеличить обеспечение бактерий рожи источником азота, который необходим для синтеза белковых соединений и формирования протоплазмы.

В состав среды, в качестве источника углерода, введено 0,2 % глюкозы, которая при расщеплении в виде АТФ - используется микроорганизмами как источник энергии.

Кроме того, для улучшения ростовых свойств питательной среды введены аминокислота Ь-аргинин - 0,05 % и нормальная сыворотка крови крупного рогатого скота - 2%.

Для сохранения ростовых свойств питательной среды нами апробирован и внедрен метод холодной стерилизующей фильтрации с использованием рамного фильтра с пластинами СФ1.

Холодную стерилизацию питательной среды осуществляют через фильтр-пластины СФ (ТТЬк). В биореактор загружают питательную среду из расчета 2/3 к рабочему объему, засевная - 3-5% к объему питательной среды.

Глубинное культивирование проводят при температуре 36±0,5°С в течение 20-22 часов при постоянном перемешивании 100-150 об/мин (ТП6к). После окончания культивирования, в отдельно взятой пробе из биореактора, определяют оптическую концентрацию микробных тел, которая должна находится в пределах 7±2 млрд./мл. В биореактор с культу-ральной жидкостью добавляют среду высушивания из расчета 1:4, приго-

товленную по новой, разработанной нами , рецептуре на основе фосфатно-буферного раствора (ТП-ж): желатина - 4%, пептона -15%, сахарозы - 20%.

Для повышения качества и сроков хранения сублимационно высушенной противорожистой вакцины в предложенной рецептуре, концентрация пептона, как одного из наиболее термозащищающих веществ, увеличена с 5 до 15%. Концентрация желатина, обладающего меньшими защитными свойствами, с целью снижения количества балластных веществ уменьшена с 15 до 4 % . Для повышения стабильности вакцины при высушивании и хранении концентрация сахарозы увеличена с 10 до 20%.

Применение предложенной среды высушивания позволило повысить выживаемость бактерий при сушке ( не ниже 70-75% ) и увеличить сроки хранения вакцины с 6 месяцев до 1 года.

Среду высушивания перемешивают с культуральной жидкостью при 200-300 об/мин в течение 15 минут. После этого бактериальную суспензию перекачивают в емкость для расфасовки, выдерживают при температуре 6±2°С в течение 1-3 суток до получения предварительных результатов исследований на чистоту культуры (ТЩк). После этого ее фасуют в 20 мл флаконы (ТПж), а затем лиофилизируют (ТПюк)- Сравнительные данные по технологиям изготовления вакцины представленны в таблице 1.

Таблица 1

Сравнительные данные по технологии изготовления живой су__хой вакцины из штамма ВР-2 _ _

Существующая технология -производства Предлагаемая технология производства

I. По составу и способу питательной среды

по инструкции, утвержденной 8 сентября 1987 года (состав питательной среды). Новый состав питательной среды и способ приготовления

2. По составу среды высушивания

по инструкции, утвержденной 8 сентября 1987 года (состав среды высушивания). новая среда высушивания

3. По технологическому процессу

3.1 термическая (паровая) стерилизация при 120±1°С в течение 1-го часа питательной среды холодная стерилизация через фильтр-пластины СФ

3.2 концентрирование способом центрифугирования отсутствует

3.3 гомогенизация отсутствует

3.4 фильтрация отсутствует

3.5 количество доз с 1-го литра питательной среды - 3 тыс. доз вьрсод с 1-го литра питательной среды 10 тыс. доз.

3.6 срок хранения - 6 мес. по ТУ 10-19-503-87, 1990 г. срок хранения -12 мес. по ТУ 08064-19-37-95, 1995 г.

Статистические результаты промышленного производства и характеристика готового продукта сухой живой вакцины против рожи свиней из штамма £>уфе/огга гНшюраШае ВР-2 представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2 (а, б, в, г)

Статистические результаты промышленного производства сухой живой вакцины против рожи свиней из штамма Егу^реШт тЫтораШае

ВР-2 (по 30 сериям )

Питательная среда (а)

рН ■. (ед. рН) Лмннный азот (мг %)

7,5±1 175+5

Посевной материал (б)

- . ; РНг (ед. рН) Оптическая концентрация

6,8±1 6,0±1

Культивирование (в,

Характери- Характеристика Кулыу- Исходный про-

стика культу- культур альнои сус- ральнзя дукт перед лио-

ральной суспен- Время культи- пензии по оконча- суспензия. филизацией

зии вирования нию культивирова- Среда

НИЯ : высушива-

ния

рН оптиче оптическая оптичес

екая (час) рн концент- РН кая кон-

(ед. концен рация (объем) центра-

рН) трация (млрд/мл) ция,

млрд/мл

7,5±1 0,2±0,5 2« -< 1 6,8±1 6,0±1 1:4 6.8+0,5 4+1,0

Сухая живая вакцина после сублимационного высушивания (г)

Серия, объем Количество флаконов В продукте Доз во флаконе Доз

(л) (в 20мл по 10 мл) РН количество живых клеток (в 1 м3)

50 б,5±0,5 3+1,0 150+50

Примечание: температура культивирования поддерживалась автоматически 36 ± 0,5 °С.

Таблица 3

Контроль вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 живой сухой по ТУ 08064-19-37-95

Внешний ВИД Цвет Наличие посторонней примеси, следов оттаивания, трещин : флаконов Растворимость Массовая доля влаги,% Контамин ацня посторонней микрофло рой и типичность роста Количест во доз во флаконе Массовая доля кислорода,% не более

1 2 3 4 5 6 7 8

Сухая мелкопористая Беловат 0- желтый Нет Растворимость в физиологи ческом растворе в течение 3 минут 1,5 - 4,0 Не конта-минирована, рост типичный 100-200 0,5 - 1,0

Безвредность (на белых мышах) Нммуногснная активность (на белых мышах)

Количество животных Доза Исход Вакцинация Контрольное заражение (через 11-12 суток)

Количество животных Доза Количест во животных Доза Исход

9 10 11 12 13 14 15 16

20 100 млн. в 0,2 см3 Все белые мыши живы в течение 10 суток 10 100 млн. 0,2 см3 10 вакцинированных; 10 кон-грольных штамм№ 149, ЮОЛЛо в 0,1см3 8-10 вакцинированных - живые, 10 контрольных пали в течение 4 суток

Заключение; Серии вакцин не контаминированы, безвредны, имму-ногенны. Соответствуют ТУ 08064-19-37-95.

Итого было выпущено вакцины за период с 1994 по 1997 гг. -20.921.900 доз. Рекламаций на вакцину нет.

3.2. Разработка и оптимизация технологического процесса изготовления вакцины инактивированной эмульгированной против некро-бактерноза животных.

Теоретический и практический анализ лабораторной технологии по производству инактивированной эмульгированной вакцины против некро-бактериоза крупного рогатого скота позволил сделать следующие выводы и предложения по разработке и оптимизации промышленной технологии:

- из-за больших энергетических затрат отсутствия в наличии у производства высокопроизводительных промышленных установок для дезинтеграции микроорганизмов нами выбран метод Грассе ( замораживание -оттаивание);

- выбор концентрации 120 млрд/мл ресуспендированной бакмассы обусловлен тем, что в результате экспериментальных исследований, установлено наилучшее разрушение микроорганизмов достигается в процессе многократного замораживания и оттаивания;

- отсутствует освобождение эндотоксина от клеточного дейтрита, что снижает гомогенность и качество вакцины при применении;

- необходима замена непрерывной инактивации на более щадящий режим для исключения коагуляции ;

- необходима замена химического метода выделения экзотоксина из жидкой фазы на более современный, биологически нейтральный;

- для повышения технологичности вакцины необходимо, по возможности, сократить количество промежуточных операций, связанных с выделением и очисткой антигенов;

- приготовление вакцины целесообразно вести из расчета, что в 1мл антигена должно содержаться 20 млрд. бактериальных тел;

- необходимо более тщательное эмульгирование вакцины для исключения эффекта расслаивания вакцины .

Предлагаемая нами промышленная технология получения вакцины включает в себя следующие операции и стадии, приведенные на рисунке 2.

По окончании культивирования бактериальную суспензию контролировали чистоту роста и концентрацию микробных тел (Шю)-

Разделение бактериальной суспензии и концентрирование проводили на центрифуге ОТР-Ю1К при 15 тыс. об/мин (ТПо).

ТПк1

ТПк 3

ТПк4

ТПк 5

ТПк8

ТПк7

ТПкЮ

ТПк13

♦ ТПК14

ТПк9

ТПк15

ТПк17

ТПк2

ТПк18

ТПк 6

ТПкИ

ТПк12

ТПк16

Рис 2. Предлагаемая технология изготовления вакцины

против некробактериоза животных. (ГП - технологические процессы)

Жидкую фазу, полученную при разделении бактериальной суспензии, концентрировали на ультрафильтрационной установке в 10 раз (ТПки). Контроль концентрирования экзотоксина проводили по определению белка методом Лоури. Инактивацию проводили дробно : первые 24 часа вносили 0,3%-ный, а через сутки добавляли 0Д% - ный формалинизированный физиологический раствор. Длительность инактивации 15 суток в биореакгоре (ТПки).

Если концентрирование составляло меньше 10-ти кратного, то жидкую фазу для повторного концентрирования возвращали в ультрафильтрационную установку (ТПк11).

Для получения эндотоксина твердую фракцию (биомассу) ресус-пендировали физиологическим раствором до концентрации 120 млрд/мл бактериальных клеток и разрушали по методу Грассе (многократно чередующимися операциями замораживания и оттаивания) до полного разрушения бактериальных клеток (ТПкю). Отделение эндотоксина от клеточного дейтрита проводили на центрифуге К-70 (ТПкп) Далее проводился контроль наличия эндотоксина путем представления белка по методу Лоури. Инактивацию проводили дробно: первые 24 часа вносили 0,3%, а через сутки добавляли ОД % формалинизированного физиологического раствора и инактивировали в течение 15 суток в реакгоре(ТПк14).

Инактивированные эндотоксины и экзотоксины смешивали в реакторе (ТПки) из расчета чтобы в 1мл антигена содержалось 20 млрд бактериальных тел. После чего добавляли адьювант в соотношении 1:1 (ТПК1б). [Толученную смесь гомогенизировали с помощью коллоидной мельницы ;ТПКп) и фасовали в 100-200 см3 флаконы (ТПш).

Сравнительные данные по существующей и разработанной технологии промышленного производства вакцины против некробакгериоза жи-зотных из штамма Bact.necrophorum приведены в таблице 4.

Таблица 4

Сравнительные данные по технологии производства вакцины против некробактериоза животных

Существующая лабораторная технология Разработанная и оптимизированная промышленная технология

1 2 3

1 Приготовление питательной среды 'Го же

2 Приготовление посевного материала

3 культивирование с периодическим пропусканием азота

18 Продолжение таблицы 4

1 2 3

4 Разделение методом центрифугирования

5 Антиген из бактериальных клеток Полученную твердую фазу ( бак-массу ) извлекают из ротора, переносят в стерильную емкость и ресуспендируют физиологическим раствором до 100 млрд/мл Ресуспендируют до 120 млрд/мл физиологическим раствором

100 млрд/мл б. т. суспензию подвергают дезинтеграции на ультразвуковой установке в течение 25-30 мин. при амплитуде колебания 50-70 мкм Разрушение клеток по методу Трассе (замораживание - оттаивание)

6 Эндотокин не отделяется от дейт-рита . Разделение эндотоксина от клеточного дейтрита методом центрифугирования

7 Инактивация антигена Антиген , приготовленный из бактериальных клеток, инакти-вируется в течение 15 суток Антиген , приготовленный из бактериальных клеток, инактивиру-ется дробно в течение 15 суток

8 Антиген из надосадочной жидкости..8 жидкую фазу, находящуюся в стерильном реакторе, вносят 40 вес. частей сернокислого аммония, тщательно перемешивают. Затем оставляют на 2 суток при +4°С для осаждения белков Жидкую фазу, собранную в стерильном реакторе, пропускают через разделительные ультрафильтрационные колонки. Концентрируют в 10 раз, с последующим контролем белка по методу Лоури, концентрат эндотоксина инакти-вируют дробно, 15 дней.

9 Через 2-е суток жидкую фазу, содержащую сернокислый аммоний, подвергают разделительному центрифугированию. Центрифугат утилизируют, а осадок собирают в стерильную ёмкость; добавляют физраствор при рН 7,2-7,4; тщательно перемешивают и подвергают диализу Не проводится

1 2 3

против водопроводной воды в течение 1-2 суток. Полученный белок разводят физиологическим раствором в соотношении 1:2 и определяют по методу Лоури его концентрацию. Готовят белковую суспензию с концентрацией 22-24 мг/мл и используют как второй антиген Операции не проводятся

10 Составление вакцины Смешивают антиген из бактериальных тел, который должен содержать 5,5 -6,0 мг/мл белка. Указанное содержание белка каждого антигена должно содержаться в вакцине, как конечное разведение двух антигенов Инактивированные эндотоксины и экзотоксины смешивали в равных объемах из расчета содержания в 1 мл антигена 20 млрд бактериальных тел.

11 Приготовление адьюванта Для приготовления адьюванта используют минеральное масло 83%, ланолин 17% Для приготовления адьюванта используют масло ПЭС - 83%, ланолин 11%

12 Для приготовления эмульгированной вакцины против некробактериоза животных смешивается инакгивированная суспензия антигенов со стерильным адьювантом в равных соотношениях

а) Эмульгирование вакцины ведут перемешиванием инактивиро-ванных антигенов с адьювантом a) То же b) Для получения стойкой эмульсии проводят 2-кратное эмульгирование на коллоидной мельнице

Статистические результаты промышленного производства и контроль вакцины инактивированной эмульгированной против некробакгерио-за животных из штамма Bacterium necrophorum (ВИЭВ) представлены в таблицах 5 и б.

Таблица 5(a,6j

Статистические данные промышленного производства вакцины инак-тпвированной эмульгированной против некробактериоза животных из штамма Bacterium necrophorum (ВИЭВ) по 15 сериям

Штаммы Исходная оптическая рН

концентрация

(млрд/мл)

Bacterium necrophorum 1+0,5 7,6±0,2

(ВИЭВ)

Культивирование 5(6)

Время культивирования ,(ч) Аэрация Характеристика культу-ральной суспензии по окончании культивирования, (рН) Оптическая концентрация, (млрд/мл)

исходные конечные

35±1,0 чистым азотом по 40 мин. с интервалом 5ч. 7,7±1,0 6,5+0,5 3,0±0,5

Примечание: температура культивирования поддерживалась автоматичеси 37 ± 0,5 °С.

Таблица (

Контроль вакцины «»активированной эмульгированной против некробактериоза животных из штамма Bacterium necrophorum (ВИЭВ)

Внешний вид Цвет Наличие по- Контаминация Количество

сторонней посторонней доз во флакон!

.V • • примеси микрофлорой

1 2 3 4 5

Стойкая эмуль- от бело-

сия вязкой кон- желтого до нет Не контамини- 40

систенции светло-коричневого рована

Безвредность Количество животных Исход Оценка антигенной активности

Белые мыши Кроли ки Дозы Количество животных (кроликов) Доза Определение титра агглютининов в сыворотке крови вакцинированных кроликов

Мыши Кролики

б 7 8 9 10 11 12 13

¡0 4 0,2см3 1,0смэ Все животные живы в течение 10 суток б 0,5сма 1:64 -у 2 кроликов 1:128 и выше у 4-х кроликов

Опытно-промышленные серии вакцин стерильны, безвредны^ им-муногенны, соответствуют требованиям выпускаемых биологических препаратов.

3.3. Усовершенствованная и оптимизированная технология изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК .

Анализ существующей технологии производства единого бруцеллезного антигена для РА , РСК и РДСК позволил сделать следующие выводы:

- промышленное культивирование бактерий в больших количествах на твердой питательной среде является нетехнологичным, так как требует больших затрат ручного труда и времени, большого количества посуды при низком накоплении бактериальной массы при культивировании;

- возможен контакт с бруцеллами рабочего персонала;

- смыв и концентрирование бакмассы через марлевые фильтры являются трудоемкими и малоэффективными процессами.

В результате проведенных исследований предложена усовершенствованная технология изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК (рис. 3). ? - ?

«

ТП4К ТПш

ТП5К

ТПзк

ТП

9к

<ТПвк

ТПгк

ТПЖ

Рисунок 3. Усовершенствованная и оптимизированная технология изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК . (ТП- технологические процессы)

Выращенную культуру (ТПкз) засевают в биореактор (ТПК6), который предварительно стерилизуют путем подачи пара в рубашку при температуре 120±1°С в течение часа, и загружают питательную среду, приготовленную на основе бульона Хотгингера (ТПкД предварительно простерили-зованного через рамный фильтр с пластинами СФ (ТПК5). После контроля начистоту бактериальную культуру засевают в биореактор из расчета 150300 млрд/см3.

Для концентрирования различных биологических суспензий наиболее распространен метод ультрафильтрации с использованием серийно выпускаемой ультрафильтрацйонной установки УПВ-6 для концентрирования суспензии бруцелл после культивирования. Однако в процессе эксплуатации установки было выявлено ряд недостатков:

- из-за большого количества соединительных элементов и узлов в установке требуется значительное время на ее монтаж и пуск в эксплуатацию;

-неполная стерилизация установки из-за образования, так называемых, "мертвых зон" при холодной стерилизации;

-наблюдается частичное гидромеханическое повреждение бактериальных клеток при обработке.

Для более эффективного использования метода ультрафильтрации, установка УПВ-6 модернизирована нами по следующим показателям:

-уменьшены габаритные размеры установки примерно в 1,5 раза, что позволило использовать меньшие производственные площади для ее монтажа, а также повысить мобильность установки за счет более компактного размещения ее узлов на станине;

-конструктивно упрощены и изменены узлы приемного и выпускного устройства;

-для устранения образования воздушных пробок ( карманов ) в камере разделительных мембран манометров изменено их положение по отношению к потоку химического стерилизатора;

- для достижения полной стерилизации ультрафильтрационной установки устранены "мертвые зоны" и достигнуто высококачественное разделение суспензий, исключено гидродинамическое травмирование бактериальных клеток, устранены все механические сопротивления (резкие переходы в трубопроводах , штуцерах , уменьшено количество соединительных узлов и т.д.) потоку кулыуральной или другой биологической жидкости ( другим биологическим растворам);

-производительность установки УПВ-6 увеличена за счет использования разделительных колонок с большей фильтрующей поверхностью ( с 0,5 до 2,5 м2).

Принцип работы установки основан на разделении высокомолекулярных растворов и коллоидных систем методом ультрафильтрации, где движущей силой переноса вещества через полое волокно является перепад давления.

Рабочая жидкость ( бактериальная суспензия) циркулирует по замкнутому циклу. Из биореаетора жидкость подается насосом в разделительные колонки и после концентрирования, через шаровой кран поплавкового сифона, возвращается в биореактор.

Фильтрат из разделительных колонок по линии направляется в реактор-накопитель для сбора фильтрата. Культуральную жидкость концентрировали методом ультрафильтрации и отмывали в 0,5% фенолизирован-ном физрастворе от остатков питательной среды и вторично концентрировали в 3-4 раза на модернизированной УФ - установке УПВ-6 (ТЛю). Затем доводили оптическую концентрацию до 100-200 млрд/см3 фенолизирован-ным физраствором и одновременно проводили инактивацию при температуре 80±1°С в течение 1-го часа (ТПкб). Инактивированную культуру перекачивали в реактор и помещали в холодильник для стабилизации при температуре б±2°С в течение 7-10 суток (ТПкв). На всех стадиях культивирования проверяли культуру на чистоту роста методом микроскопии и высевами на МПБ, МПА, МППА, МППБ и среду Сабуро. После стабилизации и контроля качества антигена производилась расфасовка (ТЛю). Повторность каждого разведения антигена и сыворотки равна 12 (количество серий), что позволило достоверно оценить статистическую значимость результатов. Общее количество экспериментальных данных: п=220. Статистическая обработка частот повторения значения РА при различных разведениях антигена и сыворотки позволяет построить график, приведенный на рисунке4.

Проведено 12 серий экспериментов с б-ю разведениями сыворотки и 5-ю разведениями антигена, что позволило получить статистические значимые результаты их обработки. Общее количество экспериментальных

данных п=345. Обработаны экспериментальные данные по распределению частот РСК для единого бруцеллезного антигена в зависимости от разведений антигена и сыворотки. Определены виды распределений в каждой точке. Через точки с нулевым или близким к нулевому распределениям проведены две прямые, которые пересекаются в точке соответствующей разведению антигена 1:150 к разведению сыворотки 1:125.

Из-за незначительного колебания частот в точке, эти прямые охватывают некоторую зону, при этом наблюдается явно выраженная тенденция к изменению значения РСК в сторону увеличения от точки пересече--ния прямых в обе стороны и также ниже уровня зоны, причем это возрастание носит пропорциональный и монотонный характер. Этот вывод подтверждает адекватность ранее используемого иммунологами,так называемого метода треугольника для выделения достоверной рабочей зоны для РСК. В данной методике для построения номограммы он может быть назван "методом квадрата". " -

Сравнительные данные по существующей и усовершенствованной технологии производства единого бруцеллезного антигена для РА и РСК приведены в таблице 7.

Таблица 7

№ : п/п Существующая технология, способ получения Предлагаемая технология, способ получения

1 2 3

1 Пёченочно-мартеновский агар на переваре Хоттингера расфасованный в посевные четверти, стерилизация в автоклавах. Выход антигена с 1л питательной среды - 0,75л Жидкая питательная среда на основе перевара Хоттингера стерилизуется через пластины СФ. Выход антигена с 1л питательной среды 1,0 л

Культивирование в термостате 37°С - 72 часа Культивирование в биореакторе 20-24 часа • » ^

3 'Слив конденсата из четвертей Концентрирование и очистка бак-суспензий на ультрафильтрационной установке при помощи разделительных аппаратов с использованием 0,5% фенолизированногс физраствора

4 Смыв культуры 0,5% фенолизи-рованным "физраствором на смывных машинах Инактивация антигена в биореакторе при температуре 80°С - 6( минут

1 2 3

5 Сбор культуры в 10-ти литровые стеклянные емкости Слив антигена из биореактора в бутыли . .

6 Инактивация антигена на водяной бане или в реакторе при 80°С - 60 минут Время изготовления антигена сокращается с 14 дней до 12 дней

7 Слив антигена из биореактора в бутыли

РА

съюороша

Условные обозначения: Обозначение: • + <^аоЖ©<2>0':* ® Номер эксперимента: 123456? 89 10 11

Рис. 4. Зависимость разведения антигена и сыворотки в РА для единого бруцеллезного антигена.

Статистические результаты промышленного производства и контроль единого бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus-19 для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных в РЛ, РСК и РДСК представлены в таблицах 8 и 9. "'

Таблица 8(а,б,в,г) Статистические данные промышленного производства единого бруцеллезного антигена для сельскохозяйственных животных ю штамма Brucella abortus -19 в РА, РСК и РДСК

Питательные среды 8(a)

рН (ед. рН) Лмшшый азот (мг %)

6,8+0,5 150,0±5

Посевной материал 8(6)

(ед рН) Оптическая концентрация: (млрд/мл)

6,8+1 15,0±5

Культивирование 8(e)

Характеристика кулыуральной суспешии Время культивиро вания (час) Характеристика культуральной суспензии по окончании культивирования Концентрирование на улътрафильтра-цнонной установке

рн Оптическая концентрация (млрд/мл) Оптическ ая концентрация (млрд/мл) 1-ая отмывка (во сколько раз) 2-ая отмывка (во сколько раз)

6,8+0,5 0,15±5 25±1,0 7,0+0,5 35±5 5+1 3,5±0,5

Приготовление концентрата 8(г)

Концентрат Разведение концентрата (раз) Объем серии

оптическая концентрация (млрд/мл) количество литров

195±2 35±0,5 8±1 280±20,0

Примечание: Температура культивирования поддерживалась автоматически 37±0,5°С.

Контроль антигена бруцеллезного единого для РА, РСК и РДСК по

ТУ 10-19-009-88

1 Внешний вид

Непрозрачная жидкость серо-белого цвета

2 Наличие посторонней примеси, нарушение укупорки и трещин флаконов

Нет

3 Стерильность

Посевы антигена на питательные среды не дают роста микрофлоры

4

В мазках антигена наличие посторонней микрофлоры не обнаружено

5 Специфичность

РСК

Физиологический раствор Негативная сыворотка в разведении 1:25,1:50 Физиологический раствор Негативная сыворотка в разведении 1:5, 1:10

Антиген дает в РА и РСК отрицательную реакцию с ( раствором и негативной сывороткой шзиологическим

6 Активность со стандартной бруцеллезной сывороткой в:

РА РСК

Антиген в разведении 1:5 дает 50% агглютинации (++) с конечным разведением сыворотки 1:500 Наибольшая задержка гемолиза при разведении антигена 1:500

Заключение: Серии антигена стерильные, чистые, специфичные, активные: титр в РА- 1:10, РСК -1:75 соответствует ТУ 10-19-009-88.

Итого за период с 1994 по 1997 гг. было выпущено 17.499.2 литров антигена. Рекламаций на качество нет.

3. 4. Усовершенствованная и оптимизированная технология изготовления пуллорного эритроцитарного антигена (ПЭА) для диагностики пуллороза-тифа птиц.

Существующая технология изготовления эритроцитарного антигена обладает рядом недостатков. Изготовление антигена осуществлялось в течение 15 дней и включало одиннадцать операций. Для экстрагирования использовалась 0,2 Н уксусная кислота из расчета 1 кг на 0,6-0,8 кг сырой бакмассы и осаждение денотата этанолом из расчета 8-10 объема на объем гидролизата. Осуществлялось три операции центрифугирования для разделения биомассы, для получения ППФ и для удаления несоединивше-гося антигена, что требовало больших материальных и временных затрат (до 3-х суток).

Приготовление формалинизированных эритроцитов крови барана осуществлялось в течение 2 дней и включало десять операций, в том числе центрифугирование при отмывке, при этом происходит агригация эритроцитов в глобулы, которые плохо ресуспендируются и затрудняют получение их 10% концентрации во взвеси, что приводит к значительным потерям (до 50%). Сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов барана осуществляли в течение 2-х суток включая пять операций, в том числе две операции осветления способом центрифугирования.

Двойная отмывка удлиняет время необходимое для процесса, приводит к механическим повреждениям эритроцитов, образованию глобул и снижению качества конечного продукта.

Длительность и многооперационность процесса может привести к контаминации антигена посторонней микрофлорой, нарушению технологии отдельных стадий, а следовательно, к снижению качества конечного продукта по сравнению с требованиями технических условий на "Антиген пуллорный эритроцитарный" (ТУ 46-21-530-80).

Все указанное делает процесс изготовления пуллорного эритроцитарного антигена трудоемким и конечный продукт из-за высокой себестоимости производства является неконкурентноспособным.

В результате проведенных исследований предложена усовершенствованная и оптимизированная технология изготовления ПЭА для диагностики пуллороза-тифа птиц.

Выращенную в биореакгоре (ТПкб) культуру возбудителя пуллороза-тифа птиц ресуспендировали 1% раствором поверхностно-активного вещества (ПАВ) (ТУ 10 РСФСР 96492) и 1% раствором двууглекислого на» I, трия (ГОСТ -1078-78) или 0,2% раствором №ОН до концентрации 25 млрд/мл и экстрагировали в течение часа при температуре 93±2°С (ТПк7).

Использование ресуспендирования позволяет исключить механическое воздействие на бакмассу при центрифугировании и попадания белка в ППФ, который снижает скорость реакции с гемагглютинирующими сы-

воротками - О], О9- поливалентными: гр.З и гр.4 и моновалентными сыворотками.

Для освобождения экстракта от клеточного дейтрита используется метод центрифугирования (ТПкБ) . Затем экстракт ППФ нагревали до температуры 93±2°С в течение часа, с последующей фильтрацией через титановые и керамические фильтры для осветления (ТПк9).

По существующей технологии этап формалинизирования, осаждения, разделения и отмывки проводится в жестких условиях непосредственного контакта формалина с эритроцитами, что приводит к частичному обжигу эритроцитов, а следовательно, к значительному проценту их гибели (20%), кроме того, на этих стадиях происходит механическое воздействие на эритроциты, что ведет к значительному гемолизу (до 30%). Общий объем потерь составляет до 50%.

Нами предложена усовершенствованная и оптимизированная технология приготовления формалинизированных эритроцитов. Осадок отмытых эритроцитов ресуспендировали до 20% концентрации с содержанием 0,5% формальдегида в фосфатно-буферном растворе, путем диализа и выдерживанием 24 часа при температуре 37°С . По мере осаждения эритроцитов надосадочную жидкость сливали, а к осадку добавляли равный объем буфера с 0,3% формальдегида. Тщательно перемешивали и оставляли для отстоя. Операцию повторяли до полного просветления надосадочной жидкости и получали формалинизированные эритроциты барана (ТПэб).

На стадии сенсибилизации проводили наслоение экстракта антиген-синсетина на формалинизированные эритрсщиты (ТПс1).

С целью исключения возможного образования глобул эритроцитов из-за слипания, при центрифугировании и снижения потерь (до 10-15%), сокращения времени стадии сенсибилизации и повышения качества сенсибилизации, за счет щадящего режима осветления и ресуспендирования, нами предложено проведение данного этапа в следующем режиме.

По мере осаждения эритроцитов сенсибилизирующий раствор сливали, а к осадку доливали равный объем буфера с 0,15% формальдегида.

Операция повторялась 3-4 раза до полного осветления надосадочной жидкости. Сенсибилизированные эритроциты фильтровали и ресуспендировали в стерильном фосфатно-буферном растворе, с содержанием 0,15% формальдегида, до 10% концентрации (ТПс2) и выдерживали при температуре 37±1°С - 24 часа. Затем, после контроля 10% ПЭА проводилась фасовка антигена (ТПсЗ).

Сравнительные данные по существующей и предлагаемой технологии приведены в таблице 10.

а) стадия культивирования

ТПк1

ТПк2

X

ТПкЗ -ТШ5 -ТПкб

ПАВ + ИагСОз

-ТПк7 - ТПк8 -

ТПк9

- ППФ

ТПк4

б) стадия приготовления формалинизированных эритроцитов

ТПэ1

ТПэЗ — ТПэ4 -ТПэ5

Т1Ъ2

ТПэб

ФЭБ 20%

в)стадия сенсибилизаци

ТПс1 ТПс2 ПЭА ТПсЗ

10%

Рис. 6. Усовершенствованная и оптимизированная технология получения эрнтроцитарного антигена.

Сравнительные данные по используемому и предлагаемому способу производства пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики _пуллороза-тифа птиц _

№ Существующая технология (способ получения) Предлагаемая технология (способ получения) Примечание

1 2 3 4

1 Экстрагирование уксусной кислотой при +92-96 °С в течение 60 минут Ресуспендирование бакмассы ПАВ с добавлением КаСОЗ или ИаОН с последующим экстрагированием при -93-96 °С в течение 60 минут Количество операций сократилось с 26 до 18

2 Центрифугирование для разделения бак-массы и получения полипептидно-полисахаридной фракции Центрифугирование и фильтрация для получения экстракта анти-ген-сенситина

3 Осаждение деконтага этанолом для получения сенситина Наслоение экстракта антиген-сенситина на формалинизированные эритроциты Исключено из технологии использование уксусной кислоты и этанола

4 Центрифугирование для получения фугата-сенситина Осветление - сенсибилизированных эритроцитов барана методом осаждения и разведением их до 10% концентрации -

5 Приготовление 0,6% раствора полипептид-но-полисахаридной фракции

6 Наслоение раствора сенситина на форма-линизированные эритроциты Время изготовления сократилось с 15 до 5 суток

1 2 3 4

7 Центрифугирование для удаления несоеди-нившегося антигена

8 Разбавление формали-низированных и сенсибилизированных эритроцитов формали-низированным фосфатным буфером до 10% концентрации

Статистические результаты промышленного производства и контроль пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц из штамма Salmonella gallinarum-pullorum 24 КСТ, ЛБ, 10-Б представлены в таблицах И и 12.

Таблица 11

Статистические данные промышленного производства пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц из штамма Salmonella gallinarum-pullorum 24 КСТ, ЛБ, 10-Б.

Посевной материал

Штаммы Исходная оптическая

концентрация (OK) pH

(млрд/мл) (сд. РН)

24 КСТ 1,4-1,65 ±4% 6,79-6,81 ± 0,1%

ЛБ 1,3 - 1,4 6,77-6,93

10-В 1,5-1,65 6,43 - 6,53

Культивирование

Кол-во часов культиви ровання Скорость вращения мешалки (мин) рН (ед. рН) ОК (млрд/мл) Добавки

Глюкоза (мл) N8011 (мл) пеногаси-тель(про-пинол) (мл)

0 15 - - - 150 150

1 15 - - - - -

2 70 7,16 1,3 - - -

3 . 70 - - . - - -

4 90 6,54 3,65 100 200 250

5 90 - - - - -

6 100 6,84 7,9 - 200 250

7 100 - - - -

8 100 6,97 13,05 - 250 250

9 100 - - - -

10 100 6,76 14,55 - 250 250

11 100 7,07 15,0 - - - ' [

12 100 7,57 15,4 - - 1

Примечание: Расход воздуха на аэрацию в процессе производства составил 2 об. на объем культуральной жидкости в мин. Температура культивирования поддерживалась автоматически - 37 ± 0,5°С.

* Таблица 12

Контроль антигена пуллорного эритроцитарного по ТУ 46-21-530-80

1 Внешний вид

Гомогенная взвесь расслаивающаяся при хранении на светлую часть и осадок темно-коричневого цвета

2 Цвет

Темно-коричневый

3 Наличие посторонней примеси , плесени, не разбивающихся конгломератов

Нет

4 Концентрация водородных ионов (рН)

7,2

5 Стерильность

Посевы на питательные среды не дают роста в течение 10 дней при температуре 37° (Сабуро 22°)

6 Концентрация эритроцитов (%)

10

7 Самоагглютинация

Физиологический раствор

В течение 2 минут при 37° реакция отрицательная

8 Специфичность

РИГА с сыворотками Околи агглютинирующими ККРА с кровью 5 здоровых кур 6-месяцев

Поливале нтные четырех групп Моновалентные 30 се-рогрупп

В течение 2 минут при температуре 37° антиген не вступает в реакцию

9 Активность

РИГА с положительными сыворотками ККРА с кровью зараженных пуло- розом 16 кур 6-месяцев с титром антител в РА 1:40 -1:160 и выше

Нативная серогрупповая Д1 агглютинирующая с тит Монорецептррная сальмонеллезная ' 09

1:16 1:32 1:8

испытуемая ФК испытуемая ФК испыт. эталон

•-i' Т. " Реакция наступает с антигеном в разведении 1:16 до 30 сек, 1:32 в течение 2 минут с ФК до 2 мин. при 37° Реакция наступает с антигеном в течение 10 секунд, с ФК в течение 2 мин. при 37° С испытуемым антигеном эталоном положительная реакция у 16 кур в течение 2 мин. при 37°

10 Обозначения

ФК - формалинизированная взвесь Salmonella gallinarum-pullorum с концентрацией 15 млрд. в см3. Испыт.- испытуемая серия антигена. Эталон - эталонная серия антигена.

Заключение: серия стерильна, специфична, активна. Соответствует ТУ 4621-530-80.

Итого было выпущено антигена за период с 1995 по 1997 года -5548 литров, рекламаций нет.

3.5. Единая гибкая блочно-модульная схема технологических операций промышленного производства вакцин и антигенов.

Анализ усовершенствованных технологий производства живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 , единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных в РА, РСК и РДСК из штамма Brucella abortus 19, пуллорного эритроцитар-ного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц из штамма Salmonella qallinarum-pullorum и разработанной новой промышленной технологии изготовления вакцины инактивированной эмульгированной против некробак-териоза животных из штамма Bacterium necrophorum позволил разработать единую гибкую блочно-модульную схему технологических операций промышленного производства вакцин и антигенов представленную на рис. 7.

Из анализа предлагаемой гибкой производственной системы (ГПС) промышленного производства вакцин и антигенов сделаны следующие обобщающие выводы:

1. Выделяется ряд основных операций - приготовление питательных сред, культивирование , очистка, концентрирование, инакгавация, эмульгирование, стабилизация, сушка, изготовление полипептидной фракции и формалинизированных эритроцитов, сенсибилизация и расфасовка.

2. Общим для всех технологий являются стадии приготовления питательных сред и их холодная фильтрующая стерилизация, культивирование, расфасовка.

3. Ряд операций (центрифугирование , ультрафильтрация, инактивация, смешивание) является общим для производства вакцины против нек-робактериоза и антигенов.

4. Операции приготовления сред высушивания и сублимационного высушивания являются общими для приготовления сухих биопрепаратов.

5. Операции выделения экзотоксинов и эндотоксинов типичны для получения клеточных (микробных) антигенов.

6. Получение, выделение и очистка полипептидной фракции, формалинизированных эритроцитов и их сенсибилизация необходимы для получения эритроцитарных антигенов.

Следовательно, предложенная схема ГПС, монтажа оборудования и реализации основных операций, согласно гибкой блочно-модульной системы, позволит:

- повысить производительность труда за счет рационального использования технологического оборудования;

- обеспечить мобильность производства при переходе на технологии производства новых бактериальных препаратов;

- повысить рентабельность производства и ускорить окупаемость капитальных вложений;

- уменьшить себестоимость выпускаемой продукции за счет использования гибкой технологии;

- эффективно использовать сырье;

- эффективно применять высокопроизводительное оборудование, благодаря высоким удельным нагрузкам и коэффициентам движения;

- рационально использовать энергоносители и управляющие ресурсы за счет снижения удельных расходов;

- более успешно решать экологические проблемы.

Дальнейшее развитие ГПС должно идти по пути создания гибких

автоматизированных и механизированных многостадийных производств (ГПС МСП) включающие:

- использование биореакгоров - инокуляторов для механизации процессов разгонки матровой расплодки и приготовления посевного материала;

- полный переход на холодную стерилизующую фильтрацию жидких питательных сред для глубинного культивирования;

- автоматизация технологических операций по основным физико-химическим параметрам ( температура, рН, еН, рОг, рСОг, концентрация углеводов, оптическая плотность биологических жидкостей);

- перевод, по возможности, ряда операций на непрерывные.

Это позволит эффективно функционировать промышленному производству вакцин и антигенов в современных условиях, повысит конкурентную способность выпускаемых биопрепаратов при соответствий их Международным стандартам качества ОМР.

Рис. 7. Единая гибкая блочно-модульная схема

технологических операций промышленного производства вакцин и антигенов.

Условные обозначения: | | ■ операции общие доя всех технологий

^ - операции 1р производстве суш вакцин (рожа свиней)

О - операции общие при производстве вакцин (некробаетериоз) и антигенов единый бруцедаши антиген для РД РСК, РДСК, пушрный зригроцитарныи

Оантигш.

- операции только при ^02® одпве единого бруцеллезного атигена для РД РСК, РДСК

, ■ операции только при производсгеепушюркогозритроцитарного антигена

эмульгированной против некробактериоза

1 - штамм,

2 -ШБ;

3-4 - культивирование матровой расплодки,

5 - жидкая питательная среда;

6 -холодная фильтрующая стерилизация;

7 - культивирование в биореаеторе;

8 - среда высушивания

9 -расфасовка;

10 - сублимационная сушка,

11 - центрифугирование;

12 • ультрафильтрация,

13 -инактивация;

14 - ргсуспендированне физиологическим

раствором,а также при многократном замораживании-оттаивании;

15 • смешивание; - адьтнт,

17 - отмывка фенолизированным физраствором;

18 - эмульгирование и стабилизация,

19 - ресуспендирсванне ПАВ и ^СО^;

20 -нагрев;

21 - фильтрация;

22 - кровь;

23 - раствор Олсевера;

24 - фосфатво-буферный раствор,

25 - перемешивание;

26-диализ, - н:

27-осветление;

28 - сенсибилизация;

29 - фильтрование, ресуспендирование и

выдерживание; 30-гомогенизация.

4. Санитарные и экологические требования к производству биопрепаратов на предприятиях агробиологического комплекса.

В данной главе диссертации расмотрены следующие вопросы: защита готовой продукции биойредприятий, защита сырья, промежуточных и конечных продуктов, защита обслуживающего персонала, защита окружающей среды , требования к чистоте биологического производства, контроль аэрозольных загрязнений ,тип потока воздуха ,перепад давления,чистота помещений ,розлив растворов для инъекций .загрузка оборудования для. лиофильной сушки и стерилизации , розлив термобильных продуктов,виды устройств, комната переодевания, общие тенденции развития, очистка сточных вод биопредприятий.

5. Экономическая эффективность от усовершенствования и оптимизации промышленных процессов производства биопрепаратов.

В данном разделе рассмотрены общие экономические предпосылки функционирования биологических производств в условиях переходной и рыночной экономики, и приведен расчет экономической эффективности от разработанных, усовершенствованных и оптимизированных технологий промышленного производства вакцин и диагностикумов.

Определив общий объем затрат на технологию, включающий затраты на капитальное строительство ( если они предусмотрены), расходы на оплату труда производственных ИТР и рабочих, издержки производства, затраты на материалы, водо-, газо-, тепло- и энергоснабжение, можно оценить полученную или ожидаемую прибыль, т.е. выполнить анализ рентабельности.

В результате исследований разработанных усовершенствованных и оптимизированных технологий промышленного производства вакцин и диагностикумов получена годовая экономическая эффективность, представленная в таблице 13.

Таблица 13

Экономическая эффективность разработок

№ п/п Наименование промышленной технологии Годовая экономическая эффективность, млн.руб

1 2 3

1 Сухая живая вакцина против рожи свиней из штамма ВР-2 450,413

2 Единый бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК из штамма Br.abortus -19 152,616

3 Эритроцитарный пуллорный антиген из штамма Salmonella gallinarum-pullorum 579,216

4 Суммарная годовая экономическая эффективность 1182,245

1 2 3

5 Ожидаемая экономическая эффективность от внедрения новой технологии промышленного производства вакцины некробактериоза животных из штамма Вас.песгорЬогит 1810,5

6 Общая годовая экономическая эффективность 2980,0

ВЫВОДЫ

1. Проанализированы и определены пути усовершенствования промышленных технологий производства:

- живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2;

- вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота инак-тивированной эмульгированной из штамма Bact. necrophorum (ВИЭВ);

- единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в РА, РСК и РДСК из штамма Brucella abortus-19;

- пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллоро-за-тифа птиц из штамма Sal.qallmarum - pullorum.

2. Научно обоснованы методы разработки, усовершенствования и оптимизации промышленных технологий производства вакцин и диагно-стикумов:

- инактивированной эмульгированной вакцины против некробактериоза животных из штамма Bact. necrophorum (ВИЭВ);

- живой сухой вакцины прошв рожи свиней из штамма Eiysipelothrix rhusiopathiae ВР-2;

- единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза рогатого скота в РА, РСК и РДСК из штамма Brucella abortus-19;

- пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллоро-за-тифа птиц из штамма Sal.qallmarum - pullorum.

3. Разработана и оптимизирована промышленная технология производства инактивированной эмульгированной вакцины против некробактериоза животных из штамма Bact. necrophorum (ВИЭВ), включающая:

- экспериментальное определение оптимальной концентрации бактерий в суспензии (120 млрд./мл.) для дезинтеграции по методу Грассе;

- исключение эффекта коагуляции на стадии освобождения от клеточного дейтрита, методом центрифугирования;

- щадящий метод дробной инактивации культуры;

- химический метод получения экзотоксина при этом заменен на ультрафильтрацию;

- многократное эммульгирование для исключения эффекта расслаивания вакцины.

4. Усовершенствованы и оптимизированы промышленные технологии производства:

- живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2, включающая новый состав питательной среды, холодную её стерилизацию через фильтр-пластины и новый состав рецептуры среды высушивания; ,

- единого бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus-19 для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в РА, РСК и РДСК, включающая замену твердой питательной среды на жидкую с последующим глубинным культивированием, "холодную" стерилизующую фильтрацию питательной среды и концентрирование суспензии методом ультрафильтрации, на предварительно усовершенствованной промышленной установке УПВ-6;

- пуллорного эритроцитарного антигена из штамма Salmonella qallinarum - pullorum для диагностики пуллороза-тифа птиц , включающая замену спиртового метода осаждения полипептидно-полисахаридной фракции на ресуспендирование биомассы поверхностно-активными веществами (ПАВ) с добавлением Na^CCh или NaOH, и последующим экстрагированием при температуре +93-96 °С в течение часа, применение метода центрифугирования и фильтрации для получения экстракта антигена сен-ситина, с последующим наслоением на формалинизированные эритроциты и осветвлением сенсибилизированных 10% эритроцитов барана .

5. Проведены сравнительные испытания существующих разработанных или усовершенствованных и оптимизированных промышленных технологий производства вакцин и диагностикумов со следующими результатами:

- при производстве живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Erysipelothrix rhusiopathiae выход с 1 литра питательной среды составляет до 10 тыс.доз, снижена себестоимость вакцины в 4 раза и увеличен срок хранения вакцины с 6 до 12 месяцев, повышена производительность в 3,5 раза;

- при производстве инакгивированной эмульгированной вакцины против некробактериоза животных из штамма Bact. necrophorum, увеличен в шесть раз выход доз с 1-го литра питательной среды;

- при производстве единого бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus-19 для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в

РА, РСК и РДСК увеличен выход с 1-го литра питательной среды на 25%, снижена себестоимость в 4 раза, время изготовления сократилось с 14 до 12 дней и повысилась производительность труда за счет сокращения трудоемких ручных операций;

- при производстве пуллорного эритроцитарного антигена из штамма БаТяаНтагит - ри11огит для диагностики пуллороза-тифа птиц выход антигена увеличился в 7 раз, снижена себестоимость, увеличился срок годности антигена с 6 до 12 месяцев.

6. Биологический контроль биопрепаратов , выпущенных по разработанным, усовершенствованным и оптимизированными технологиями на мышах , кроликах, курах и в серологических реакциях показали , что полученные препараты безвредны, иммуногенны , специфичны и активны, полностью соответствуют ТУ.

7. По разработанным, усовершенствованным и оптимизированным промышленным технологиям производства вакцин против рожи свиней некробактериоза животных и единого бруцеллезного и пуллорного антигенов за период с 1994 по 1997 года выпущено и реализовано :

- противорожистой вакцины -21 млн. доз;

- вакцины против некробактериоза - 360 тыс. доз;

- единого бруцеллезного антигена -17,5 тыс. литров;

- пуллорного антигена - 5,5 тыс. литров.

Рекламаций на качество выпущенных биопрепаратов от потребителей (15 регионов РФ) нет.

8. На основании анализа технологий промышленного производства вакцин и антигенов разработана единая гибкая блочно-модульная схема технологических операций при данном производстве, позволяющая:

- обеспечить мобильность производства при переходе на технологии производства новых бакпрепаратов;

- эффективно использовать сырье;

- эффективно применять высокопроизводительное оборудование благодаря высоким удельным нагрузкам и коэффициентам движения;

- рационально использовать энергоносители и управляющие ресурсы за счет снижения удельных расходов;

- повысить производительность труда за счет рационального использования технологического оборудования;

- уменьшить себестоимость выпускаемой продукции за счет использования гибкой технологии;

- повысить рентабельность производства и ускорить окупаемость капитальных вложений;

- более успешно решать экологические проблемы.

9. Рассмотрены основные международные санитарные и экологические требования к производству биопрепаратов на предприятиях агробиологического комплекса включающие:

- защиту готовой продукции, сырья, промежуточных и конечных продуктов биопредприятий, защиту обслуживающего персонала и окружающей среды, основные требования к чистоте биологического производства и вопросы биологической очистки сточных вод биопредприятий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 .Теоретически обоснованы, разработаны и внедрены в биологическое производство ветеринарных препаратов:

- методика по использованию метода ультрафильтрации при производстве ряда бактериальных вакцин и диагностических препаратов.

2. Материалы исследований вошли в нормативно-техническую документацию:

- "Инструкция по изготовлению и контролю вакцины живой сухой из штамма ВР-2 против рожи свиней", утверждена 25 апреля 1995 года.

- "Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против нек-робактериоза животных инактивированной эмульгированной из штамма Bact. necrophorum (ВИЭВ)".

- " Изменение и дополнение к Инструкции по изготовлению и контролю единого бруцеллезного антигена в РА, РСК и РДСК " , утвержденной Главветупром МСХ СССР 14 февраля 1978 г. " , переутверждено 13 декабря 1994 года.

- "Регламент производства пуллорного эритроцитарного антигена", утвержден 15 февраля 1995 года.

3. Результаты исследований по теме диссертации вошли составной частью в Федеральную целевую научно-техническую программу "Ветеринарное благополучие 1992-1995 гг." , утвержденная Постановлением Коллегии МСХ РФ и Президиумом РАСХН.

Задание 06.01. Усовершенствование и разработка промышленных технологий и изготовления биопрепаратов :

- инакгавированной эмульгированной вакцины против некробак-териоза животных из штамма Bact. necrophorum (ВИЭВ);

- живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Erysipelothrix rhusiopathiae ВР-2;

- единого бруцеллезного антигена для диагностики бруцеллеза ро- -гатого скота в РА, РСК и РДСК из штамма Brucella abortus-19;

- пуллорного эритроцитарного антигена для диагностики пуллоро-за-тифа птцц из штамма Sal.qallinarpm - pullorum.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Н.В. Мельник, Н.Д. Скичко, Н.И. Зенов, Е.А. Рубан, A.C. Трой-нин. Опыт эксплуатации волоконно-оптического преобразователя при глубинном культивировании бруцелл. Тезисы докладов Всесоюзной конференции. "Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем", Велигож, 1990, с. 39.

2. Н.И. Зенов, Н.В. Мельник, Н.Д. Скичко, Е.А. Рубан, A.B. Каськов. Управляемое глубинное культивирование бруцелл штаммов 19 и 82 в биореакторах. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине". г.Нижний-Новгород, 1990, с. 55-57.

3. Н.Д.Скичко, Н.И.Зенов, Н.В.Мельник, А.С.Тройнин, Е.М, Му-рашкина, A.B. Каськов. Способ концентрирования бруцелл штамма 82. Авторское свидетельство №1725904,1991 г.

4. А.Я. Самуйленко, Н.В. Мельник и др. Установка для обеззараживания сточных вод. Авторское свидетельство №1570997.1/02., 1990 г.

5. Н.Д. Скичко, Н.В. Мельник, Н.И. Зенов, A.C. Тройнин, О.С. Алкеева, A.B. Каськов. Усовершенствование технологии производства сухой живой вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2. Тезисы докладов

V Всероссийской конференции: "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических прнпаратов". Щёлково, 1996 г. ,с. 105.

6. Н.Д. Скичко, Н.В. Мельник, Н.И. Зенов, В.И. Ерохин, E.H. Чукае-ва, Ю.Д. Караваев. Усовершенствование технологий изготовления вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота. Тезисы докладов V Все-росийской конференции: "Научные основы технологии промышленного -производства ветеринарных биологических препаратов". Щёлково, 1996, с. 190.

7. Н.Д. Скичко, Н.В. Мельник, Н.И. Зенов, В.В. Желгов, В.И. Ерохин, E.H. Чукаева, С.Н. Бурсова, С.Е. Пушкин. Бесспиртовый метод изготовления пуллорного эритроцитарного антигена. Тезисы докладов

V Всероссийской конференции: "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов". Щёлково, 1996, с. 188.

8. Н.В. Мельник, Н.Д. Скичко, Н.И. Зенов, В.И. Ерохин, E.H. Чукаева. Способ получения полисахаридно-полипептидной фракции при производстве пуллорного-эритроцитарного антигена (ПЭА). Тезисы докладов V Всероссийской конференции: "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарНьгс биологических препаратов". Щёлково, 1996, с. 189.

9. Н.В. Мельник, Н.Д. Скичко, Н.И. Зенов, В.И. Ерохин, Е.Н.Чукаева, Н.И. Спицина, Е.А. Орлов. Применение модуля с керамическими фильтрующими элементами для концентрирования баксуспензии. Тезисы докладов V Всероссийской конференции: "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов". Щёлково, 1996, с. 201.

10. Н.В. Мельник, Н.Д. Скичко, Н.И. Зенов, А.С. Тройнин, О.С. Алкеева, А.В. Каськов. Усовершенствование технологии производства единого бруцеллезного антигена для серологической диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных в РА, РСК и РДСК. Тезисы докладов научно-производственной конференции: "100 лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России". Курск, 1996, с. 199-200.

11. Н.В. Мельник, Н.Д. Скичко, Н.И. Зенов, А.С. Тройнин, А.В. Каськов, О.В. Голоненко. Концентрирование бруцеллезной культуры бру-целла абортус шт. 82 при помощи фильтрационной установки на основе керамических фильтрующих элементов. Тезисы докладов научно-производственной конференции."100 лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России". Курск, 1996, с. 200-202.

12.Н.А. Михайлов, К.В. Шумилов, Н.Д. Скичко, Н.И. Зенов, В.В. Желгов, В.В. Ольхов, А.С. Тройнин, О.С. Алкеева, Н.В. Мельник Использование биохимического (ускоренного) метода определения концентрации живых бруцелл в сухих вакцинах из штаммов 19 и 82. Тезисы докладов научно-производственной конференции: "100 лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России". Курск, 1996, с. 215.

13. Н.Д. Скичко, Н.В. Мельник, Н.И. Зенов, А.С. Тройнин, О.С. Алкеева, А.В. Каськов, Е.А. Рубан, А.А. Раевский: "Многолетний опыт разработки промышленных технологий изготовления сухих живых бруцеллезных вакцин из штаммов 19 и 82". Тезисы докладов научно-производственной конференции: "100 лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России". Курск, 1996, с. 286-287.

14. Н.В. Мельник. Заключительный отчет по НИР. Регистрационный номер 01.9.70003101. Наименование работы: "Усовершенствовать и оптимизировать промышленную технологию производства живой сухой вакцины против рожи свиней из штамма Erysipelotrix rhusiopathiae ВР-2"

15. Н.В. Мельник. Заключительный отчет по НИР. Регистрационный номер 01.9.70003100. Наименование работы: "Разработка промышленной технологии производства инактивированной, эмульгированной вакцины против' некробактериоза рогатого скота из штамма Bacterium necropfyorum (ВИЭВ)".

16. Н.В. Мельник, Е.А. Рубан, Заключительный отчет по НИР. РеТи-страционный номер 01.9.700Q3099. Наименование работы: "Усовершенствовать и оптимизировать промышленную технологию произ-

водства единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма Brucella abortus -19".

17. H.B. Мельник. Заключительный отчет по НИР. Регистрационный номер 01.9.70003102. Наименование работы: "Усовершенствовать и оптимизировать промышленную технологию производства пуллорного эритро-цитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц из штамма Salmonella qallmarum-pullorum. 24 КСТ, ЛБ, 10-В".

18.Н.Д. Скичко, Н.В. Мельник, Н.И. Зенов, A.C. Тройнин, О.С. Алкеева, A.B. Каськов "Способ изготовления вакцины живой сухой из штамма ВР-2 против рожи свиней". Патент № 2085211,1997 г.

19.Н.В. Мельник, Н.Д. Скичко, Ю.Д. Караваев, И.Н. Семенова. Положительное решение о выдаче патента № 97108391, 1997 г. "Способ изготовления вакцины против некробакгериоза животных, инакгивированной эмульгированной из штамма Bacterium necrophorum (ВИЭВ)".

20.Н.Д. Скичко, Н.В. Мельник, Н.И. Зенов, A.C. Тройнин, О.С. Алкеева, A.B. Каськов, К.В. Шумилов, А.И. Климанов "Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК для диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма Brucella abortus-19." Патент № 2085212,1997г.

21. Н.Д. Скичко, Н.В. Мельник, Н.И. Зенов, В.В. Желтов, В.И. Еро-хин, Е.Н Чукаева. "Способ изготовления пуллорного эртроцитарного антигена для диагностики пуллороза-тифа птиц из штамма Salmonella qallinarum-pullorum". Патент № 2085949,1997г.