Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка и внедрение универсальной технологии изготовления, контроля и применения вакцин против пастереллеза животных

" #

"с г Я1ИНИСТЕРСГВО сельского хозяйстл и продовольствия рф

. ^ "федеральное государственное унитарное предприятие v

"ставропольская биофабрика" всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов

На правах рукописи

ЗАЕРКО ВИКТОР ИВАНОВИЧ

РАЗРАБОТКА И ВНЕДРЕНИЕ УНИВЕРСАЛЬНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ, КОНТРОЛЯ II ПРИМЕНЕНИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Москва - 2000

Работа выполнена на ФГУП "Ставропольская биофабрика", Всероссийском государственном научно-исследовательском инсти контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препарато) хозяйствах региона Северного Кавказа и сопредельных областей.

Официальные оппоненты:

1. Доктор ветеринарных наук, Заслуженный деятель науки Заслуженный ветеринарный врач РФ, профессор Ипатенко Н.Г.

2. Доктор ветеринарных наук профессор Светоч Э.Н.

3. Доктор ветеринарных наук Белоусов В.И.

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательски! технологический институт биологической промышленности,

Защита диссертации состоится ///а^ооо г.

заседании диссертационного совета Д 120.85.01. при Всероссий государственном научно-исследовательском институте ' конт стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Минсельхозг России (123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, ВГНКИ).

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомить! библиотеке. Всероссийского государственного научно-исследователы института контроля, стандартизации и сертификации ветерина •препаратов Минсельхозпрода России.

Диссертация в виде научного доклада разослана У г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат ветеринарных нау Ю.А. Козырев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 .Актуальность проблемы

Пастереллез - контагиозная инфекционная болезнь домашних и диких животных, Характеризующаяся при остром течении признаками септицемии, крупозным воспалением и отеком легких, плевритом, а при хроническом течении гнойно-некротической пневмонией, артритом, маститом, керато-конъюнктивитом, эндометритом и иногда энтеритом.

Пастереллез (холера) птиц характеризуется септицемией, поражением суставов и сережек.

Возбудитель пастереллеза относится к семейству Pasteurellaceae, роду Pasteurella. Честь открытия возбудителя принадлежит Туссену (1879) и Пастеру (1880).

Род PasteuTella делится на 6 видов: Р. multocida, Р. haemolytica, Р. pneumo-tropica, Р. urea, Р. aerogenes, Р. gallinarum.

Р. multocida - возбудитель геморрагической септицемии животных, и так называемых "легочных пастереллезов", вторичных инфекций, осложняющих течение болезней вирусной и микоплазменной этиологии.

Р. haemolytica вызывает пневмонию у крупного рогатого скота и овец и в отличие от Р. multocida растет на среде Мак-Конки, не образует индол и уреазу, является.одним из возбудителей фибринозной плевропневмонии у крупного рогатого скота, овец и коз, мастита у овец, септицемии у ягнят.

»

Пастереллы других видов практически не патогенны для сельскохо-!яйственных животных.

Морфологические, культуральные и патогенные свойства пастерелл хо->ошо изучены. Можно считать, что пастереллы убиквитарны и паразитируют на кивотных многих видов; взаимоотношения паразита и хозяина сглажены, о чем :видетельствует широко распространенно? бессимптомное пастереллоноси-

тельство, при котором возбудитель паразитирует в организме, не вызывая клинических проявлений. Однако, в ряде случаев он вызывает энзоотии, охватывающие большое число животных, особенно у кур, или выступает как возбудитель вторичной инфекции.

Вирулентность пастерелл наиболее выражена для того вида животных, от которых они выделены.

Широкая распространенность, высокая заболеваемость и смертность делают необходимым проведение рпецифической профилактики пастереллеза.

Пастер на примере Р. гпикос1с1а впервые обосновал возможность направленной аттенуации патогенных микробов вообще и создал живую вакцину против холеры кур.

Созданию высокоиммуногенных вакцин препятствует недостаточная изученность антигенной структуры пастерелл. В отличие от микробов других видов, четко разделенных на подвиды, серогруппы, серовары, биовары и т.д., у пастерелл до сих пор нет общепризнанной номенклатуры, основанной на антигенной структуре.

Согласно Руководства по стандартам Международного эпизоотического бюро (1996), Р. пш1и)С1<1а по Картеру имеет 5 (А, В, Д, Е, И) капсульных (К), по Намиока - 12 (1-12) и по Хедлестоуну 16 (1-16) соматических сероваров. Р. 1шепю1уиса подразделяется на 2 биотипа (А, Т) и 16 сероваров.

Серовариантную принадлежность пастерелл определяют по капсульному антигену в реакции агглютинации (РА), РИГА, РИЭФ, а по соматическому - в РА и реакции иммунофлуоресценции (РИФ) в агаровом геле.

Кроме того, серовар Д образует в растворе акрифлавина крупнохлопчатый не разбивающийся флокулят. Рост штаммов серовара А подавляется гиалурони-дазой, и после чего и они растут медленнее других.

В настоящее время применяют две системы идентификации пастерелл: На-миока-Картера и Картера-Хедлестоуна.

Для профилактики пастереллеза животных применяют 13 инактивирован-ных и две живые вакцины из штаммов АВ и К (Краснодарская НИВС).

Общими недостатками в производстве вакцин против пастереллеза являются следующие:

- отсутствие стандартизованной питательной среды и отработанной технологии изготовления вакцин;

- недостаточная изученность антигенной структуры эпизоотических и вакцинных штаммов;

- отсутствие методов контроля, позволяющих дифференцировать достаточно иммуногенные серии вакцин от слабоиммуногенных.

Кроме того, для большинства вакцин схемы вакцинации против пастереллеза животных различных видов неудовлетворительные.

1.2. Цель исследований

Разработать биопогические основы универсальной технологии изготовления, контроля и применения некоторых вакцин против пастереллеза животных.

1.3. Основные задачи исследований

1. Разработать уни.. реальную питательную среду для культивирования пастерелл с использованием непищевого сырья.

2. Изучить свойства штаммов пастерелл, используемых для изготовления вакцин.

3. Изучить динамику роста популяции пастерелл на предложенной среде, определить оптимальные сроки культивирования, аэрации, перемешивания, рН среды и другие технологические параметры.

4. Разработать способ изготовления, контроля и применения следующих вакцин:

4.1. жчеок против пастереллеза кур;

4.2. инактивированной лиофюшзированной против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов;

4.3. ассоциированной против сальмонеллеза, пастереллеза и стрепто-коккоза поросят;

4.4. против пастереллеза и стрептококкоза нутрий;

5. Усовершенствовать способ изготовления, контроль и применение вакцин.

5.1. против пастереллеза птиц инактивированной сорбированной;'

5.2. против пастереллеза и эшерихиоза птиц;

5.3. против пастереллеза овец и свиней преципитированной;

5.4. против пастереллеза кроликов;

5.5. против пастереллеза норок эмульгированной;

5.6. против пастереллеза нутрий эмульгированной.

1.4. Научная новизна

Получен супрессорный ревертант штамма Р. multocida серовара А, несущий мутации в гене супрессоре и стрептомициновом локусе и использован для типов.теиия вакцины. Обоснована возможность получения аттенуированных ппаммов других видов микробов этим же методом.

Установлены индифферентные взаимоотношения in vitro и in vivo между aimirainuii Р. multocida сероваров А, В и Д, серовары S.clioleraesuis и S t\ plmiuiriuni. Slreptococcus серогрупп С и R. На этой основе разработана технология приготовления вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и стрептококки »а.

Раiработай способ изготовления сухой вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов с 25%-ным содержанием ГОА. а также методы контроля и применения.

Разработаны технологические условия приготовления ассоциированной вакцины против пастереллеза и стрептококкоза нутрий.

Установлена возможность добавления гидролизатов из куриных эмбрионов и кровяных сгустков в состав среды для культивирования пастерелл.

Дана оценка активности вакцины против пастереллеза птиц из капсульно-го компонента по содержанию белка в активной вакцине, количество белка должно быть не менее 1,2 мг/ %.

Обоснована целесообразность использования в качестве адъюванта 6%-ной гидроокиси алюминия вместо алюмокалиевых квасцов в преципитиро-ванной вакцине против пастереллеза овец, свиней и агара - в вакцине для кроликов. Научная новизна разработок подтверждена тремя патентами: № 161420] от24.03.1989г.; № 2030915 от 31.10.1990г.; № 2103375 от 27.01.1998г.

1.5. Практическая значимость

Предложена среда для культивирования пастерелл, в которой до 65% составляет непищевое сырье.

Разработаны и применяются в практике:- живая-сухая вакцина против пастереллеза кур, ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и стрептококкоза поросят, лиофшшзированная вакцина против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов, вакцина против пастереллеза и стрептококкоза нутрий.

' Усовершенствованы и также применяются в практике вакцины: против пастереллеза овец и свиней, кур, кроликов, нутрий и норок. На каждый препарат разработана нормативная документация.

1.6. Апробация

»

. Результаты исследований по диссертационной работе доложены и одобрены на следующих конференциях:

- Международной конференции по актуальным проблемам ветеринарии, г. Барнаул, 1995г.

- Всероссийской конференции РАН по современным достижениям биотехнологии, г. Ставрополь, 1996г.

б

- Научной конференции Краснодарской НИВС, 1996г.

- Всероссийской научно-производственной конференции, посвященной 100-летию биологической промышленности, г. Курск, 1996г.

- Международной конференции, посвященной 30-летию Прикаспийского Зонального НИВИ, г. Махачкала, 1997г.

- Научных конференция}» Ставропольской ГСХА, г.Ставрополь, 1997-99 г г.

- Региональной конференции по актуальным проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе, п. Персианов-ский, 1999г.

- Всероссийской конференции по современным достижениям биотехноло-1Ш! - вклад в науку и практику XXI века, г. Ставрополь, 1999г.

1.7. Основные положения, выносимые на защиту Па защиту выносятся.

- способ получения и применения универсальной питательной среды для настерелл:

- способ получения вакцины для кур из аттенуированного штамма пасте-рс.п.

- и и оюклсипс вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и стрептококком поросят (НПО;

- способ изготовления и применения лпофилизированной вакцины против пас1срс.1.'1с;а крупного рогатого скота и буйволов;

- способ получения вакцины против пастереллеза и стрептококкоза нутрий:

- усовершенствованы технологии изготовления и контроль вакцин против: пасгере.ие!« к\р инаюивированной сорбированной, против пастереллеза кроликов. н\ фий. норок.

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

2.1.1. В работе использованы следующие штаммы пастерелл^ Аттенуированньщ штамм Р. гпикоасЬ № 11.

Вирулентные штаммы Р. тиКоаск типа А: №№ 1231,712, 396, 1718 и 606 Вирулентные штаммы Р. тиЬоаск типа В: №№> 656, 116, 216, 796, 877, Ф, Д, 5, 15, 550, 6012, 2394, 2395, ГНКИ 71, 1015.

Вирулентный штамм Р. тикос1с1а типа Д: № 9. Основные свойства их представлены в таблице 1.

• Таблица I

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ Р. МШТОСЮА.

№п/п № штамма Серовар Источник выделения Степень диссоциации Вирулентность (ЬО^о) для

белых мышей кроликов

1 2 3 4 5 6 7

1 1231 А поросенок 5-форма 16 220

2 712 . А курица Б-форма 8

3 396 А утка 8-форма 3

4 606 А гусь Б-форма 5

5 1718 А утка Б-форма 4

6 656 В свиноматка Э-форма 6

7 116 В теленок Б-форма 3

8 216 В буйволенок Б-форма 5

9 796 В бык 8-форма 6 9

10 877 В свинья 8-форма 6 7

11 . Ф В буйволенок Э-форма 6 14

12 д В буйволенок Б-форма 4 16

13 5 В кролик 8-форма 3 6 .

14 15 В кролик 8-форма 10 8

15 550 В кролик 8-форма • 12 4

16 ГНКИ71 В нутрия Б-форма 20 90

17 1015 в нутрия Б-форма 7 15

18 6012 В норка Б-форма 3 7

19 2394 В норка Б-форма 5 13

20 2395 в норка Б-форма 2 6

21 9 д свинья 8-форма 15 39

Из данных таблицы 1 следует, что пастереллы, выделенные от животных различных видов, находятся в биологически активном состоянии, вирулентность соответствует паспортным данным.

2.1.2. Оборудование: реакторы емкостью 250-2000 л, центрифуги марки Т23, Т24, СГ0100, ОТР-Ю1К, торсионные весы типа Г802, сушильные аппараты КС-30, LZ-45, ТГ-50, стерилизуемый паром лиофилизатор "Бенчмарк-5000" и др., сепаратор АСГ-ЗМ, бытовые и шкафные холодильники, микроскопы МБИ-3, МБИ-6 и другое оборудование.

2.1.3. Лабораторная посуда: баллоны, пипетки, пробирки, флаконы,- мат-ры, чашки Петри, шприцы, иглы инъекционные, стекла покровные и предметные и т.д.

2.1.4. В опытах использованы следующие виды животных: овцы-доноры 1-5-летнего возраста - 10, кролики породы шиншилла массой 2,5-3,0 кг - 1270, куры - 2000, крупный рогатый скот - 340, свиньи - 1580, беспородные белые мыши - 8700, морские свинки - 160, цыплята одномесячные - 650, нутрии - 152 и голуби - 564.

Производственные испытания препаратов выполнены на 11000 животных.

2.1.5. В работе использованы бактериологические, серологические и биохимические методы исследований.

2.1.6. Питательные среды:

- бульон Хсттингера по ГОСТ 29730-75;

- мясо-пептонный агар по ТУ 46-12-252-78;

- среда Китг-Тароцци;.

- полужидкий агар Хоттингера с 0,15 - 0,18 %-ным содержанием агар-

агара;

- агар Хотингера с 120-180 мг% аминного азота и 1,5-2,0%-ным содержанием агар-агара;

- среда Сабуро;

- среды Гисса с индикатором Андраде;

- среды, изготовленные из непищевого сырья.

С момента открытия Р. Коха плотной, питательной среды «разработано большое число новых вариантов и прописей изготовления питательных сред. Питательные среды, являясь основой работы микробиолога, определяют успех исследований и поэтому прописи и технологические процессы их изготовления постоянно должны быть объектом особого внимания.

Питательные среды должны содержать углерод, водород, кислород, азот, фосфор, калий, серу, магний, железо, которые находятся в удобоусвояемом для данного вида микробов соединении. Кроме азотистых, углеродистых и минеральных соединений, для роста и размножения бактерий необходимо присутствие факторов роста (витамины или коэнзимы).

Микробы при периодическом культивировании в жидкой среде, включая и пастерелл, проходят ряд фаз развития.

Фазы роста пастерелл

Таблица 2.

| Участок кривой

Фаза

Скорость роста

А Б В Г

д

Е

Лаг-фаза Ускоренная Экспоненциальная Замедленная

Максимально-стационарная Падения_

Нулевая

Увеличивающая

Постоянная

Снижающаяся

Нулевая

Отрицательная

В фазе В клетки находятся в стабильном состоянии. С постоянной скоростью синтезируется клеточный материал, масса которого нарастает экспоненциально. В этой фазе клетки характеризуются наибольшей полноценностью, включая и иммуногенность. Фаза продолжается до истощения тех или иных питательных веществ или накопления токсических продуктов. Часто причиной замедленного роста является недостаток кислорода. Когда концентрация микробных клеток достигает 4-5x10'7см\ кислорода обычно бывает недостаточно даже в аэрируемой культуре.

В фазе Д отмечается равновесие отмирающих и вновь вырастающих клеток. Количество жизнеспособных клеток при таком процессе остается постоянным.

Пастереллы культивируют в бульоне и на агаре Хоттингера с добавлением триптического перевара казеина.

Для изготовления пептона мы использовали в качестве источника растительного белка отходы маслоэкстрактивного производства - жмыхи плодов тунгового дерева и семян хлопчатника, животного белка - бараньи туши после извлечения головного мозг? при изготовлении антирабической вакцины.

Оказалось, что используемые отходы по своим физико-химическим свойствам близки перевару Хоттингера со средней и высокой степенью расщепления белка.

Установлено, что содержание аминокислот в большей степени зависит от способа гидролиза и в меньшей от вида белкового сырья.

Высушенные гидролизаты имели более низкое содержание общего азота и в ряде случаев повышенное содержание золы. Пептоны,-полученные частичным панкреатическим гидролизом (гепатопептон, пептон Б, тунго- и коттопептоны), содержали меньшее количество полипептидов - 60-65% при минимальной норме 70%. Однако, эти отклонения не влияли на рост тест-микробов.

Накопление бактериальной массы тест-микробов на средах с гидролиза-тами вторичного сырья свидетельствует о том, что они пригодны для роста бактериальных культур. Наиболее обильный рост получен в питательных средах на основе ФГМ и лакгопептона, что можно объяснить наличием в них углеводов и факторов роста, поскольку по составу азотсодержащих компонентов все Испытанные гидролизаты близки между собой.

Таким образом, гидролизаты различного непищевого сырья могут заменять гидролизаты мяса, д также коммерческий пептон при изготовлении бактериальных питательных сред.

Добавление непищевого сырья в состав питательных сред обеспечивало рост всех тест микробов (по А.П. Простякову, П.Я. Телишевской), а также.пастерелл.

Мы поставили задачу изучить влияние на рост пастерелл при промышленном культивировании добавления к среде аминопептида и сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота, а также использовать для приготовления питательных сред непищевое сырье: гидролизаты из куриных эмбрионов, кровяных сгустков глобулина, фибрина и казеина.

. В таблице 3 приведено количество основных питательных субстратов в средах.

Таблица 3

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

№ Среды Общий азот, мг% Аминный азот, мг% Триптофан, мг% Пептон, %

1 Перевар Хоттингера (1984) 1000-1400 750-900 200-300 2,2

2 Перевар Хоттингера (1988). 800-1200 700-900 170-200 1,5

3 Гидролизат куриных эмбрионов 1000-1125 550-600 100 2,5-3,0

4 Гидролизат из кровяных сгуст- 1100-1200 600-800 180-190 2,3-2,75

5 Гидролизат из глобулина 560-760 80-90 80-90 1,75-3,2

6 Гидролизат из фибрина 610-720 500 100-110 3

7 Гидролизат из казеина 718-725 640-670 90-120 2-3

Из материалов таблицы 3 следует, что наибольшее количество питательных веществ содержит перевар Хоттингера. Следующие места занимают гидролизат куриных эмбрионов и гидролизат кровяных сгустков, которые по своему составу близки к мясным переварам Хоттингера.

О пригодности среды для культивирования пастерелл мы судили по общему количеству микробных клеток, которое определяли прямым подсчетом в счетной камере и по количеству'микробов, определяемых чашечным методом, а также по времени накопления бактериальной массы.

Количество жизнеспособных клеток в каждой среде в экспоненциальной фазе развития, определяли на штаммах пастерелл сероваров А, В, Д.

Установлено, что количество жизнеспособных микробных указанных сероваров клеток составляло в средах 1, 2, 3 - 2,1-3,5х109, в средах 5, 6, 7 - 1,7-2,2x107"8.

Гидролизаты из глобулина, фибрина и казеина давали хорошее накопление живых пастерелл, однако, во всех средах накопление было недостаточным для производства вакцины,

В последующей работе мы изучали следующие технологические вопросы: - оптимальный объем матровой расплодки при засеве пастерелл в произ-

водственные питательные среды;

- влияние на рост пастерелл добавления сыворотки крови в различных концентрациях;

- влияние на рост пастерелл интенсивности перемешивания; •

- оптимальная подача воздуха для ускоренного роста пастерелл.

Установлено, что продолжительность лаг-фазы находится в прямой зависимости от объема матровой расплодки и составляет при 1 % засеваемой культуры - б часов, 2% - 5, 3% - 4,5, 4% - 3,5, 5% - 3 часа и 8-10% - до одного часа.

В таблице 4 показана взаимосвязь концентрации выросших пастерелл от содержания сыворотки крови в питательной среде.

Таблица 4

ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА КОНЦЕНТРАЦИЮ ПАСТЕРЕЛЛ

Состав среды Количество живых пастерелл

1 .Перевар Хоттингера 2.Перевар Хоттингера с добавлением 1% сыворотки крови Перевар Хоттингера с добавлением 2% сыворотки крови Перевар Хоттингера с добавлением 3% сыворотки крови Перевар Хоттингера с добавлением 4% сыворотки крови 3.Подача воздуха была оптимальной при 2 объемах в минуту, сокращение подачи воздуха сопровождалось замедлением роста, увеличение подачи воздуха не ускоряло роста 3,2x10'-3,5-4x109 5-6x10" 7-8x10" 1,0-1,2x10'"

Пастереллы сероваров А, В, Д не различаются в своих ростовых потребностях.

В качестве универсальной среды для культивирования пастерелл при производстве вакцин мы рекомендуем среду следующего состава;

Перевар Хоттингера с содержанием аминного азота 175-20" в смеси с гидролизатом куриных эмбрионов или гидролизатом кровяных сгустков, засев

матровой расплодки в объеме 8-10%, добавление 3-4% сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота, подачу воздуха из расчета 2 объема в минуту, среда должна перемешиваться из расчета 120 оборотов мешалки в минуту. По мере защелачивания среды добавляется 40%-ный раствор глюкозы! Выход бактериальной массы на описанной среде составляет 18-25 млрд/см3.

2.3. Живые вакцины против пастереллеза птиц.

2.3.1. Сухая живая вакцина из пастеровского штамма.

(ТУ 10-19-604-88)

В 1947 г. из Института им. Пастера в Париже в ВГНКИ поступил авиру-лентный штамм пастерелл, который был использован для изготовления вакцины против пастереллеза птиц. За вакциной сохранилось наименование - Пастеровская.

Проведенное на протяжении 30 с лишним лет исследования вакцины показали отрицательные ее свойства. Так, у части вакцинированной птицы отмечали сонливость, потерю аппетита, гипертермию, снижение яйценоскости, а в' месте введения (грудная мышца) - небольшую отечность и даже ограниченный некроз ткани.

В опытах с контрольным заражением 3-кратно вакцинированных кур продолжительность иммунитета не превышала трех месяцев, что вынуждало проводить неоднократные ревакцинации через каждые 2-2,5 месяца.

Принимая во внимание остаточную реактогенность и слабую имму-ногенность производство вакцины было прекращено.

2.3.2.Вакцина против пастереллеза кур живая (ТУ 9384-002-00494189-00)

Обоснованием для разработка данного препарата послужили:

отрицательные испытания вакцины из пастеровского штамма; неудовлетворительные итоги проверок специфической активности

ряда противопастереллезных вакцин зарубежного производства, что, по-видимому, связано с различной антигенной структурой вакцинных и контрольных штаммов, использованных для заражения птицы;

стремление получить безвредныйи высокоиммуногенный препарат, пригодный не только для индивидуальной, но и групповой иммунизации.

В ВГНКИ (Б.Ю. Шустер, Ю.А. Малахов и-В.И. Заерко) на основе супрес-сорных ревертантов создали моно- и бивалентные вакцины против сальмонел-леза водоплавающей птицы, телят и поросят. Вакцины широко применяются на животноводческих фермах и успешно вытесняют инактивированные формол-вакцины. 1

Мы поставили задачу выяснить возможность использования метода атте-нуации, по аналогшГссальмонеллами, в гене-супрессоре и стрептомициновом локусе. Подобные исследования ранее не проводились. '

Для получения вакцинного штамма использовали вирулентный штамм Р. multocida № 49, выделенный в 1981 г. Р.В. Душуком, В.В. Кашириным и др. в Ростовской области от павшей от пастереллеза курицы. LDso его для'беспород-ных белых мышей массой 16-18 г соответствовала 1x109, а для кроликов массой 1,5-2,0 кг - 2х108 бактерий.

Морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства штамма Р. multocida № 49 были типичными для микробов вида Р. multocida.

Для выделения спонтанных Str-d мутантов 1-2хЮ10 клеток вирулентного штамма высевали в чашки с агаром Хоттингера и 4%-ным содержанием сыворотки и стрептомицина в концентрации 300 ЕД/см3. Колонии, выросшие через 48 часов культивирования были стрептомицино-устойчивыми (Str-d). Эти колонии пересевали в чашки, разделенные на секторы, в среду со стрептомицином и без него. Колонии, выраставшие на среде с антибиотиком, считали Str-d мутан--тами.

Для получения ревертантов брали 2-суточные культуры мутантов и по 0,1 см' засевали в чашки без стрептомицина. Через 2-3 суток культивирования вырастали колонии из ревертировавших в исходное стрептомицинзависимое .состояние. Частота реверсии составила 2-3x105.

Определение генотипа ревертантов проводили методом трансдукции фагом 322. Оказалось, что среди трансдуктантов имеет место расщепление по чувствительности к стрептомицину: 50-75% трансдуктантов были стрептомицину-стойчивыми, а 15-30% - стрептомицинзависимыми. Они также различались по степени вирулентности. В опытах с сальмонеллами у Б.Ю. Шустера (1988) около 80° о ревертантов оставались авирулентными, а у остальных вирулентность восстанавливалась в той или иной степени.

В наших опытах у ревертантов пастерелл вирулентность восстанавливалась до 25%. Последующие исследования остаточной вирулентности у 78 клонов ревертантов позволило нам селекционировать штамм Р. ти1кхпс1а №11, отвечающий требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам.

Низкая стабильная остаточная вирулентность сальмонелл и высокая йм-муногенность позволили использовать их в качестве живых вакцин для профилактики сальмонеллеза у сельскохозяйственных животных.

Наши опыты показали, что метод селекции супрессорных ревертантов позволяет получать вакцинные штаммы и для профилактики пастереллеза живот-пых. что подтверждено в опытах на курах.

Полученный штамм Р. тикосйа №11 представляет собой супрессорный ревертант стрептомицинзависимого мутанта, несет 2 мутации: в гене супрессоре и сгрептомициновом локусе, каждая из которых снижает вирулентность на 1\10"". а обе на 10"'4.

Остаточная вирулентность исходного штами.а составляла около IхIО2, а аггенунрованного более 1x10'' микробных тел. Пятикратный пассаж через организм цыплят не повысил вирулентность аттенуированного штамма. Мыши,

получившие дозу )х)05 микробов аттенуированного штамма не погибли, а после заражения выжило 18 из 20 мышей.

Иммуногенность (ЕД5о) для 3-месячных цыплят у штамма №11 составила 161,8, а для пастеровского штамма 219 млн. микробных тел.

Технология изготовление вакцины слагается из следующих этапов:

- проверка производственного и контрольного штаммов;

- изготовление универсальной среды и проверка ее на стерильность;

- изготовление и засев в реактор матровой расплодки;

- культивирование до начала стационарной фазы, добавление, по мере необходимости, раствора глюкозы, подача воздуха и работа мешалки;

- осаждение бактериальной массы на центрифуге;

- разбавление сгустка бактерий забуференным физиологическим раствором до концентрации .50 млрд/см3;

- смешивание с сахарозо-пептон-желатиновой средой высушивания;

расфасовка в ампулы по 4 см3; высушивание и запайка под вакуумом; контроль вакцины.

Для определения оптимальной схемы иммунизации мы вакцинировали по 18 кур внутримышечно, подкожно, перорально и аэрозольно однократно. Эффективность одно- и двукратного введения была одинаковой.

Наилучшие результаты получены при внутримышечной иммунизации.

После заражения через месяц выжило 83,3%, через 3 и 6 мес. - 70% цыплят. В

»

остальных группах результаты были хуже.

При вакцинации на неблагополучной ферме 100 кур внутримышечно в дозе по 1 млрд. микробных тел при проверке иммуногенности выжило80 кур. В контроле из 10 зараженных кур пало 10.

Вакцина прошла проверку в производственных условиях с положит тельным результатом.

2.4. Инактивированные вакцины против пастереллеза птиц.

2.4.1. Историческая справка.

В 60-70 гг. наша биопромышленность выпускала 4 инактивированных (с масляным адъювантом) вакцины против пастереллеза птиц, в том числе 2 (одна для кур и индеек и вторая для уток и гусей), предложенные Никифоровой Н.М. с соавт. и 2 (для куриных и водоплавающей птиЦы), разработанные Цимохом В.И. с соавт.

Поток рекламаций на недостаточную эффективность вакцин и возникновение в месте введения изменений, снижающих товарную ценность тушек послужили основанием для проведения комиссионной проверки их реактоген-ности и иммуногенности. По результатам испытаний все вакцины были сняты с производства.

Большие потери от пастереллеза в птицеводстве и отсутствие эффективных средств защиты обусловили необходимость дальнейших изысканий в этой области. Разработанная в ВГНКИ (Р.В. Душук, А.П. Простяков и др.) вакцина против пастереллеза птиц обладала достаточной превентивной активностью при содержании в антигенном компоненте не ниже 1,2 мг в см3.

2.4.2. Вакцина против пастереллеза птиц инактивированназ сорбированная

(извещение № 2 об изменении ТУ 10-19-30-88)

Вакцина предложена А Н. Борисенковой с соавт., представляет собой капсульную фракцию производственного штамма Р. ти1и>ас!а 115 в смеси со взвесью бактерий штамма в концентрации 3,0-3,5 млрд/см3.

По предложенной А.Н. Борисенковой технологии выращивания производственного шгамма пастерелл в реакторе, накопление бактерий в 5-6-часовой культуре должно составлять 8-10, а через 12-24 ч - 18-20 млрд/см3. Выращенную культуру сепарируют, бактериальную массу разводят фосфатным буфером до концентрации 40 млрд/см3 и проверяют на чистоту. Взвесь микробов прогревают 2 часа при .-V . эатуре 56±4,0°С. Охлажденную суспензию повторно центрифугируют. Надослдочную жидкость инактивируют в течение суток 1 %-ным раствором

формалина. Надосадочную жидкость снова прогревают в течение 2 часов при температуре 60°С и добавляют для консервирования тиомерсал 1:10000.

Полученную жидкость смешивают с равным объемом 3%-ного геля гидроокиси алюминия. Адсорбцию проводят в течение 48 часов при температуре 10,0±2,0°С. Взвесь перемешивают 2-3 раза в сутки. Вакцину разливают, проб-куют и этикетируют.

Готовая вакцина должна быть стерильной, содержать капсулытое вещество и упомянутую взвесь бактерий. Иммуногенность вакцины проверяют на курах, вакцинируют 10 кур внутримышечно в крыло в дозе 2,0 см3. Вакцину считают активной, если выживает 7 и более кур из числа вакцинированных при гибели не менее 9 контрольных.

Автор указывает, что вакцина должна содержать 20-40,0 мг% белка, содержание которого определяют с помощью предварительно построенной калибровочной кривой. Автор, однако, не расшифровывает, какой белок и как увязать его с активностью вакцины.

Мы поставили задачу определить оптимальную концентрацию белка и микробных клеток в вакцине и разработать метод ее контроля по содержанию этих компонентов. В опыте использовано 50 цыплят 3-месячного возраста. Полученные данные приведены в таблице 5.

Таблица 5

ИММУНОГЕННОСТЬ ВАКЦИНЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА

Доза вакцины Результаты заражения

Цыплят Содержа- Концеч?.. »

•в опыте Объем, см3 ние бел- микр. клеток, пало выжило

ка, т% - млрд'см3

10 2 0,25 1 7 3

10 2 • - 0,50 2 • 5 5

10 2 0,75 .3 2 8

10 2 1,0 5 ' 0 10

Ю(контроль) 0. - 10 0

Из данных таблицы 5 следует, что содержание в вакцинирующей дозе препарата 1,0 и более мг% белка и 3,0-3,5 млрд/см3 микробных клеток предохранило от заболевания всех зараженных цыплят. Считаем, что по содержанию белка в совокупности с микробными клетками в вакцине^ можно судить с достаточной достоверностью и об ее иммуногенности.

Как уже отмечалось, при изготовлении вакцины А.Н. Борисенковой на 50% надосадочной жидкости добавляют 50% 3%-ного гидрата окиси алюминия. Исходя из того, что в подавляющем большинстве вакцин содержание его гораздо большее, мы определили оптимальные дозы ГОА для вакцины против пасте-реллеза птиц. В отличие от принятой технологии, использовали 6%-ную ГОА и добавляли ее до 10, 15, 20, 25, 30, 35 и 40%-ной концентрации. Вакциной каждой серии иммунизировали по 10 двухмесячных цыплят внутримышечно и через 25 дней заражали 51^0>и Р. тиКоскй.

Результаты приведены в таблице 6.

Таблица 6

ИММУНОГЕННОСТЬ ВАКЦИНЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ГОА •

Цыплят в опыте Содержание 6%-ного ГОА в среде Результаты заражения

живы пали

10 10 4 6

10 15 7 3

10 20 6 4

10 25 9 1

10 30 9 1

10 35 10 -

10 40 7 ■ 3

10 50 5 5

Из данных таблицы 6 следует, что наибольшая выживаемость цыплят по-

лучена при концентрации в вакцине ГОА от 25 до 35% 6%-ного ГОА.

Уменьшение или увеличение содержания ГОА снижает иммуногенность вакцины.

Опытные образцы препарата, приготовленного по усовершенствованной

технологии, прошли контроль иммуногенности по предложенной нами схеме.

При проверке в неблагополучных по пастереллезу хозяйствах доказана эпизоотологическая эффективность опытной вакцины.

Таким образом, высокоиммуногенная вакцина против пастереллеза птиц должна содержать не менее 1% белка и 25-35% ГОА 6%-ной концентрации.

2.4.3. Инактивированая сорбированная вакцина против колибактериоза птиц и ассоциированная против пастереллеза и колибактериоза (в стадии разработки АН. Борисенкова, В.И. Заерко с соавторами)

Ставропольская биофабрика изготавливает инактивированную вакцину против колибактериоза птиц.

Вакцина представляет собой взвесь штаммов эшерихий трех серогрупп и предназначена для профилактики эшерихиоза кур, индеек и уток. Иммуноген-ность вакцины не стабильна, что связано с неоднородностью этиологической структуры эшерихиоза птиц. И, если вакцина дает хороший эффект в одном месте, то в другом она может оказаться совершенно не иммуногенной. •

ВНИВИ птицеводства предпринял попытку изготовить вакцину с более широким антигенным спектром. Вакцину готовят из эшерихий.следующих се-роваров: 09:1230 (№1330), 078.К80 (№320), 0141 :К87:К88 (№727), 0115 (№453-37/17), 0141:К99 (353-37/17), 09:КЮЗ:987Р (397-37/14), 0101:Р41 (398,37/14).

Питательной средой для культивирования эшерихий служит бульон Хот-тингера.

Морфологические, культуральные, ферментативные свойства штаммов полностью отвечают паспортным данным. Серогрупповую принадлежность определяют в реакции агглютинации с агглютинирующими 0-коли сыворотками.

Каждую культуру выращивают в отдельном реакторе, осаждают центрифугированием до концентрации 80-100 млрд/см3, прогревают при 60-65°С в те-

чение20мин.

Супернатант отделяют от клеток центрифугированием. Содержание адгезивных антигенов проверяют в РДП. Титр антител во всех случаях должен быть не менее 1:2-1:4.

В реакторе смешивают бактериальную массу и адгезивные антигены, добавляют 0,3% формалина и инактивируют 15-16 суток.

К инактивированной культуре добавляют 6%-ный ГОА до 30%-ной концентрации. Вакцину расфасовывают и контролируют.

Принципиальное отличие предлагаемой вакцины от вакцины .инактивированной против колибактериоза птиц заключается в подборе антигенов. Последняя изготавливается с 1984 г. из корпускулярных антигенов эшерихий.

Вакцина против колибактериоза птиц инактивированная сорбиро-ванная содержит растворимые антигенные комплексы эшерихий. Предназначена для специфической профилактики колибактериоза птиц различных видов, и ту и другую готовят на бульоне Хоттингера', штаммы выращивают в реакторах раздельно Накопление микробных клеток в 12-14-часовой культуре составляет около 14 млрд/см'. Бактериальную массу отделяют от питательной среды центрифугированием и сорбируют- на ГОА.

К числу дефектов предлагаемой против эшерихиоза вакцины относятся следующие: изоляты эшерихий, полученные от кур, крайне редко (сотые доли процента) имеют адгезивные антигены.

Кроме того, основным путем заражения кур является аэрогенный, при котором адгезивные антигены, если бы даже они и были, не играли бы никакой роли.

Роль анатоксинов в иммуногенезе под влиянием вакцин не освещена.

Таким образом, предлагаемая вакцина порочна в своей основе. Вакцина, обогащенная адгезивными антигенами, эффективна в борьбе с эшерихиозом телят и поросят, у которых заражение происходит алиментарным путем.

У иммунизированных животных энтеропатогенные эшерихии не сорбируются в кишечнике, а, следовательно, не вызывают инфекционного процесса.

Куры заражаются возбудителем эшерихиоза аэрогенно и поэтому адгезивные антигены не играют никакой роли в развитии инфекционного процесса, в его специфической профилактике.

В этой связи создание ассоциированной вакцины против эшерихиоза и пастереллеза нуждается в серьезном обосновании.

2.5. Вакцина эмульгированная против пастереллеза нутрий (извещение № 2 об изменении ТУ 10-19-448-87)

Первая вакцина против пастереллеза нутрий предложена Никифоровой Н.М. с соавт. в середине 70-х годов. Готовили вакцину из двух штаммов пасте-релл, выделенных от нутрий.

Бакмассу выращивали в бульоне Хоттингера, приготовленном из говяжьего или конского фарша с добавлением триптического перевара казеина. Оба штамма выращивали в одном реакторе и спустя 8-10 часов с момента засева концентрация бактерий достигала 8-10 млрд/см3. С помощью сепарирования культуру концентрировали, бакмассу ресуспендировали в забуференном физиологическом растворе, доведя содержание бактериальных кпеток.до 20 млрд/см3, инактивировали формалином и эмульгировали с адъювантом, содержащим 83% легкого минерального масла и 17% ланолина. Использование такого адъюванта, хотя и обеспечивало выработку достаточно напряженного иммунитета, однако,

были сложности с введением, особенно неподогретой вакцины, длительным

*

рассэсыванием депо, возможным образованием свищей при подкожном попадании препарата и потерей товарной ценности шкурки.

Отмеченные недостатки послужили основанием для разработки в 80-х годах новой вакцины (Душук Р.В. с соавт.) с использованием сапонина и гидрата окиси алюминия. Технологический процесс изготсвления данного препарата включал получение и концентрацию бакмассы, ресуспендирование" ее забуфе-

ренным раствором до содержания 20 млрд/см3 пастерелл, инактивацию их формалином при 37°С в течение 48 часов, добавляли 10%-ный раствор сапонина из расчета 0,02-0,03 г на 1 литр бактериальной массы. Контроль вакцины осуществляли на кроликах.

Двукратное введение нутриям вакцины в суммарной дозе 3 см3 обеспечивало выработку иммунитета продолжительностью до 6 месяцев.

Однако, отсутствие производства данного адъюванта в нашей стране и нестандартность по химическому составу отдельных партий сапонина, поступающих из-за рубежа и по дорогой цене, вынудили разработчиков отказаться от его использования.

Принимая во внимание, что гидрат окиси алюминия является не только сорбентом, но и иммуностимулятором, нашедшим широкое применение в производстве биопрепаратов ветеринарного и медицинского назначения и невысокую его стоимость, мы испытали его пригодность для изготовления вакцины против пастереллеза нутрий.'

Опыт поставлен по той же схеме, что и при иммунизации кроликов. Вакцина. содержащая 30% шестипроцентного гидроксала, оказалась наиболее им-муногенной. Нутрии, получившие такую вакцину, выживали в 80-90% случаев, тогда как уменьшение содержания в вакцине гидроксала снижало выживаемость нутрий до 60-70 и даже 50% Продолжительность иммунитета у вакцинированных гидроокись алюминиевой вакциной нутрий не превышала 6 месяцев.

При растш ровке иммунизирующей дозы оказалось, что пяти миллиардная концентрация пастерелл. адсорбированная на 6%-ной гидроокиси алюминия при 30%-ном ее содержании является наиболее оптимальной. В связи с этим при отработке схемы иммунизации установлена доза вакцины дня молодняка с 2-месячного возраста 1.0 см' и для взрослых - 1.5 см\ внутримышечное введение вакцины обеспечивает формирование напряженного иммунитета продолжительностью не менее 6 месяцев.

2.6.Вакцина против пастереллеза и стрептококкоза нутрий.

(ТУ 9384-179-00494189-99)

Анализ эпизоотической ситуации в разных зонах Кавказа и Закавказья показал, что в ряде хозяйств пастереллез протекает не как моноинфекция, а в ассоциации с другими болезнями различной этиологии. Чаще, однако, регистрируют одновременное неблагополучие по пастереллезу и стрептококкозу.

Изучение этиологической структуры названных инфекций показало, что вспышки пастереллеза обусловлены тремя сероварами Р. multocida А, В, Д и Streptococcus zooepidemycus серогруппы С. это обстоятельство и побудило разработать ассоциированную вакцину против обеих инфекций.

Для изготовления вакцины отобрано по одному штамму Р. multocida серо-варов А, В, Д и один штамм Streptococcus zooepidemycus серогруппы С.

Пастереллы выращивали в среде, изготовленной на основе перевара Хоттингера с добавлением триптического перевара казеина. Каждый штамм выращивали отдельно в реакторе на протяжении 10-14 часов, и к этому сроку концентрация пастерелл достигала 18-22 млрд/см3. Культуры пастерелл смешивали в равных объемах, концентрировали и ресуспендировали в фосфатном буфере до 60 млрд/см \

Для приготовления стрептококкового компонента вакцины микроб выращивали в бульоне Хоттингера 4-7 часов, и за это время концентрация бактерий достигала 4 млрд/см3. Для изготовления вакцины обе взвеси бактерий смешивали в соотношении 1:1, ииактивировали формалином (0,4%) и добавляли 6%-ную гидроокись алюминия до 25%-ной концентрации, устанавливали pH 7,2-7,4 и фасовали во флаконы емкостью 100-200 см3.

Контроль вакцины на нммуногенность проходит на кроликах по пасте-реллезному компоненту и на белых мышах по стрептококковому.

Внутримышечная иммунизация нутрий по 1 см3 с 2-месячного возраста и по 1,5 см1 взрослых животных обеспечивает выработку напряженного иммуни-

тета не менее чем на 6 месяцев.

Антигены пастерелл и стрептококков не проявляли по отношению друг к' другу ни антагонистического, ни синергического действия.

Суть наших усовершенствований сводится к введению в состав питательной среды для культивирования пастерелл гидролизатов из непищевого сырья, которые не повлекли за собой снижение урожайности пастерелл, и повышение до 30% содержания в вакцине 6%-ного ГОА.

Изготовленные образцы вакцины по усовершенствованной с учетом наших предложений технологии отличались повыщенной иммуногенностью препарата (на 10-20%).

2.7. Вакцина против пастереллеза норок.

(извещение № 2 об изменении ТУ 10-19-447-87)

В середине 70-х годов' Никифоровой Н.М. с соавт. была предложена эмульгированная вакцина, содержащая инактивированную взвесь семи штаммов пастерелл, выделенных от норок, с добавлением адъюванта, используемого при изготовлении эмульгированных вакцин для сельскохозяйственных животных. Однако, в практике звероводства этот препарат широкого.применения не получил. Ему, как и другим препаратам этой группы, присуща высокая вязкость и связанная с этим трудность введения, а также длительность рассасывания. Если учесть, что норки весьма агрессивные и беспокойные животные, то проводить им строго внутримышечные инъекции весьма сложно. Попадание вакцины под кожу сопровождается образованием стерильного абсцесса, который вскрывается с нарушением кожного покрова, и потерей товарной ценности шкурки зверя.

Предпринимались попытки замены масел в вакцине, однако, желаемых результатов получить не удалось. Поэтому нами создана ГОА-формолвакцина с использованием вместо семи одного наиболее иммуногенносо штамма пастерелл. Выращивание бакмассы проводили из модифицированной среде и по обычной технологии. Как и для описанных выше других вакцин использовали

ГОА 6%-ный при 30%-ном содержании.

При .раститровке иммунизирующей дозы оптимальной оказалась 5-миллиардная концентрация пастерелл при отмеченном выше содержании ГОА. По данным опытов, 1,0 см3 для молодняка и 1,5 см3 для взрослых зверей при однократном введении оказалось достаточным для выработки напряженного иммунитета длительностью до 6 месяцев. Принимая во внимание, что молодняк рождается в мае, а убой происходит, в ноябре, то однократная иммунизация полностью обеспечивает защиту молодняка, а маточное поголовье и производителей ревакцинируют по истечении 6-месячного срока.

2.8. Формолвакцина против пастереллеза кроликов. (извещение № 1 об изменении ТУ 46-21-47-84)

Вакцина против пастереллеза кроликов предложена Леонтюком В.И. в 1968 г. и изготавливается из 7 штаммов пастерелл, выделенных от павших кроликов.

В качестве питательной среды использовали экстракт из тканей кроликов, павших от пастереллеза вследствие заражения вакцинными штаммами пастерелл, к которому добавляли 5-8% кроличьего хоттингеровского перевара. Каждый штамм выращивали в отдельном баллоне. Длительность иммунитета, по данным автора, составляла не менее 15 месяцев.

Затем производственные штаммы пастерелл стали выращивать в реакторах в бульоне Хоттингера, приготовленного из говяжьего мяса. Продолжительность культивирования сократили до 12-14 часов. В качестве адъю-ванта добавляли агар-агар до 0,5%-ной концентрации.

Мы проверили иммуногенность вакцины, в частности, продолжительность иммунитета и адъювантное действие агара микробиологического ГОСТ 17206-84. Оказалось, что длительность иммунитета при двукратном введении вакцины не превышает 5-6 месяцев; кроме того, 0,5%-ная концентрация агар-агара затрудняет введение вакцины и не обеспечивает адъювантного действия.

Мы доставили задачу изучить возможность использования в качестве адъюванта гидроокись алюминия. Опыт был поставлен по той же схеме, что и при иммунизации телят. Вакцина, содержащая. 30% шестипроцентного гидро-ксала, оказалась наиболее иммуногенной. Кролики, получившие вакцину с такой концентрацией ГО А, выживали в 90-100% случаев, а из получивших вакцину с агар-агаром - 60-70%.

Мы вакцинировали кроликов двукратно с интервалом 10-12 дней внутримышечно. Каждый см3 вакцины содержал 5 млрд. пастерелл и 30% гидроокиси алюминия 6%-ной.

Кроликам 1,5-месячного возраста вводили 1 см3 вакцины, а с трех месяцев и старше - по 1,5 и 2 см3 вакцины. Продолжительность иммунитета у вакцинированных гидроокисьатоминиевой вакциной кроликов превышала шесть месяцев.

2.9. Прециттированная Формолвакпина против пастереллеза овец и свиней. (извещение № 3 об изменении ТУ 46-21-185-84)

Вакцина представляет собой смесь эпизоотических штаммов пастерелл,' выделенных от крупного рогатого скота и свиней при остром течении инфекции, инактивированную формалином и преципитированную алюмокалиевыми квасцами.

Для изготовления вакцины используют 2 штамма возбудителя пастереллеза крупного рогатого скота (штаммы №№ 796 и 116) и 2 штамма возбудителя пастереллеза свиней (№№ 877 и 656). Контрольным является штамм № 796.

Штаммы 116 и 796 должны вызывать гибель телят в возрасте 4-6 месяцев, массой 80-90 кг через 18-30 часов после внутримышечного введения 1,0-2,0 мл суточной бульонной культуры; штаммы 877 и 656 возбудителя пастереллеза свиней обусловливают гибель поросят 2-3 месяцев массой 20-25 кг через 36 часов после внутримышечного заражения 1,0-2,0 мл культуры.

LD50 для белых мышей упомянутых выше штаммов колеблется от 3 до 20 микробных клеток.

При культивировании в реакторе вырастает 6-10 млрд/см3 микробных тел.

Квасцы добавляют в реактор из расчета 20-25 мл 10%-ного стерилизованного автоклавированием (1 атм., 60 мин) раствора на литр культуры. После добавления квасцов начинается интенсивное выпадение хлопьев в осадок, что указывает на степень преципитации культуры. К последней добавляют формалин до 0,25-0,3%-ной концентрации. Формалипизированную культуру выдерживают сутки при постоянном перемешивании. Вакцина успешно проходит контроль на безвредность и активность.

Однако, ранее при иммунизации крупного рогатого скота в хозяйствах вакцина давала до 50 осложнений в год, которые проявлялись аллергией немедленного типа, нередко с летальным исходом.

В целях недопущения аллергических реакций сократили концентрацию пастерелл в вакцине до 4 млрд/см3. Несмотря на то, что иммунизирующая доза для крупного рогатого скота была сокращена вдвое, количество осложнений ос-.тавалось на прежнем уровне.

Массовые осложнения после вакцинации вынудили прекратить применение вакцины для крупного рогатого скота.

В 1984 г. было утверждено ТУ на формолвакцину против пастерел-леза овец и свиней преципитированную. Овцы и свиньи не давали аллергических реакций и имели иммунитет достаточной напряженности.

Мы поставили задачу усовершенствовать эту вакцину путем замены алю-мокалиевых квасцов на гидрат окиси алюминия и уточнить оптимальную иммунизирующую дозу для крупного рогатого скота, свиней и овец.

Была приготовлена вакцина, содержащая в I см' Р. тиЬоаУа серовара В 5 млрд., сероваров А и Д - по 2,5 млрд. микробных клеток, а вместо алюмокалие-вых квасцов ввели гидроокись алюминия в различной концентрации. Опыт поставлен на бычках 4-5 месячного возраста. Результаты опыта представлены в таблице 7.

Таблица 7

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ГОА НА ИММУНОГЕННОСТЬ ВАКЦИНЫ ' ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА.

Концентрация антигенов (млрд/см3) Телят в опыте Концентрация ГОА 6%-ной Результат заражения (51Л)5о)

А В д живы пали

2,5 5 2,5 10 10 5 5

2.5 5 2,5 10 20 7 3

2,5. 5 2,5 10 25 9 1

2,5 5 2,5 10 30 10 -

2,5 5 2,5 10 30 10 -

2,5 5 2,5 10 . 35 10 -

2,5 5 2,5 10 • 40 7 3

2,5 5 2,5 10 50 6 4

Из материалов таблицы 7 следует, что ГОА 6%-ная в концентрации 2535% обладает выраженным адьювантным действием. Уменьшение или увеличение концентрации ГОА дало худшие результаты. Аллергические реакции не были зарегистрированы ни у одного из 70 вакцинированных бычков.

Опыты, поставленные на подсвинках, четко продемонстрировали выраженное действие на свиней 6%-ной ГОА, добавленной к вакцине в 30%-ной Концентрации. Вакцина испытана на двух неблагополучных по пастереллезу фермах крупного рогатого скота (720 гол.) и на одной свиноферме (1213 гол.).

В производственных условиях вакцина также не вызывала аллергических

■

реакций. Полученные данные позволили дать новое наименование вакцине "Поливалентная гидроокись алюминиевая вакцина против пастереллеза крупного рогатого скота, свиней, овец и коз".

Вакцина вводится внутримышечно двукратно в дозах, указанных в наставлении.

Применявшийся контроль вакцины нг позволял дифференцировать отдельные серии вакцины по качеству, так как большая доза вакцины, вводимая , двукратно, невелировала различия.

Вакцину вводили голубям двукратно в количестве 1 и 3 см3, количество микробных клеток в 1 см3 оставалось неизвестным, а судя по инструкции голуби могли получить от 2 до 10 млрд микробных тел и поэтому ни выживание, ни гибель голубей ничего не говорили о качестве вакцины.

С целью разработки объективного метода контроля активности вакцины мы изготовили серию вакцины с концентрацией 8 млрд/см3 микробных тел и провакцинировали 12 пяти-шести-месячных бычков, 10 подсвинков и 7 овец, Животных заразили 5ЬБ5о смеси пастерелл сероваров А, В, Д. В итоге заражения пал 1 бычок и 1 подсвинок. Эта вакцина, по нашему мнению, достаточно иммуногенна. Вакциной этой же серии мы иммунизировали голубей и установили, что из 10 голубей, получивших 0,5 и 1,0 см3 вакцины и больше, выживает 8-10 птиц. По мере снижения дозы вакцины птицы погибают при заражении. Если в контроле гибнет 7 и больше голубей, вакцину следует считать не достаточно иммуногенной и подлежащей выбраковке.

2.10.Вакцина против сальмонеллеза. пастереллеза и стрептококкоза поросят. (ТУ 9384-116-00494185-96)

А.Г. Малявин (1956) разработал и внедрил в практику вакцину концентрированную поливалентную формолквасцовую против паратифа, пастереллеза и диплококковой септицемии поросят. Для изготовления вакцины использовали следующие штаммы: Б. с1ю1егае8Ш8, Р. тиИос1(1а и Diplococcus эерПсиз. Каждого вида микробов брали по несколько штаммов.

Поросят вакцинировали в возрасте от 20 до 30 дней, свиноматок - за 15-40 дней до опороса. Поросят вакцинировали двукратно с интервалом 5-7 дней в дозе 3-4 см3 для первой и 4-5 см3 для второй инъекции. За семь дней до отъема поросят ревакцинировали однократно в дозе 4-5 см3.

В хозяйствах, особо неблагополучных по сальмонеллезу, пастереллезу или диплококковой инфекции, где молоднлк заболевал в первые' недели жизни,

свиноматок вакцинировали трехкратно: за 35-40 дней до опороса по 5 см3, за 25-30 суток до опороса - по 10 см3 и за 15-20 дней до опороса - по 10 см3. Имму-ногенность вакцины была невысокой, особенно против пастереллеза.

В 1970 г. Diplococcus septicus был заменен на Streptococcus faecalis (штаммы №№ 13, 345, "Соколове", "Константиновский"), а препарат получил наименование "Вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят ассоциированная".

Результаты применения вакцины показали, что энтерококки не играют существенной роли в патологии у свиней, а штаммы S. choleraesuis и Р. multo-cida серовара В не обеспечивают защиту свиней во всех случаях от сальмонеллеза и пастереллеза.

Проведенный нами анализ этиологической структуры заболеваний саль-монеллезом и пастереллезом показал необходимость изготавливать вакцину из следующих штаммов микроорганизмов:

Salmonella choleraesuis - штамм 370;

Salmonella typhimurium - штамм 371;

Pasteurella multocida серовар А штамм 1231;

Pasteurella multocida серовар В штамм 656;

Pasteurella multocida серовар Д штамм 9;

Streptococcus серогруппы С штамм П 2082;

Streptococcus серогруппы R штамм "Касли".

В соответствии с нашим предложением перечисленные штаммы введены в состав вакцины, а вакцина получила наименование "Вакцина против сальмонеллеза. пастереллеза и стрептококкоза поросят".

Все штаммы типичны по морфологическим, культуральным и ферментативным свойствам, антигенной структуре и характеризуются высокой вирулентностью. Так Salmonella choleraesuis имеет LD50 для белых мышей 10-50, Salmonella typl.imurmm - 180-120 микробных вдеток. Смертельная доза для мор-

ских свинок колеблется для обоих сероваров от 0,5 до 2 млрд микробных клеток.

Раз1еиге11а тикоаск (штамм 656) убивает 2-3-месячных поросят за 24-48 часов, штаммы 1231 и 9 убивают кроликов через 72 часа после внутримышечного заражения одним см3 суточной бульонной культуры.

Стрептококк контрольный штамм П-2082-к убивает белых мышей в дозе 0,3 см3 культуры в течение 5-7 суток. .

Одним из сложных вопросов при изготовлении ассоциированных вакцин является взаимоотношение антигенов, которое может быть антагонистическим или синергическим.

Предлагаемая нами вакцина содержит 2 серовара сальмонелл, 3 -пастерелл и 2 - стрептококков.

Для выяснения характера взаимодействия антигенов этих микроорганизмов мы поставили серию опытов, результаты которых приведены в таблице 8.

Таблица 8

ВЗАИМООТНОШЕНИЕ АНТИГЕНОВ НЕКОТОРЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ (ПО ДАННЫМ ОПЫТОВ НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ)

моно- ассоцииро-

мор- голу- белые вакцины ванная вак-

Штамм ские би мыши цина

свинки живы пали живы пали

Salmonella choleraesuis 10 8 2 9 1

Salmonella typhimurium 10 10 - 9 1

Pasteurella multocida серовар А 10 7 3 8 2

Pasteurella multocida серовар В 10 9 1 8 2

Pasteurella multocida серовар Д 10 9 1 9 1

Streptococcus серогруппы С 10 8 2 9 1

Streptococcus серогруппы R 10 8 2 8 2

Ассоциированная вакцина 20 30 20 59 11 60 10

Из материалов таблицы 8 следует, что антигены в моновакцинах и ассоциированной вакцине обладают одинаковой иммуногенностью, что позволяет отовить из них ассоциированную вакцину.

Иммуногенность ассоциированной вакцины проверили на 20 трехмесячных поросятах, которых после вакцинации заразили сальмонеллами и пас-тереллами типа В; из 20 поросят пали по одному после заражения сальмонеллами и пастереллами.

Каждый штамм выращивают в отдельном реакторе и устанавливают следующие концентрации микробных тел в вакцине: сальмонеллы по 2, пастереллы по 5 и стрептококки по 2 млрд/см3. Общая концентрация 21 млрд/см'.

Контроль активности осуществляется по отношению к каждому микробу.

Иммуногенность сальмонелл контролируется на морских свинках, пасте-релл - на голубях и стрептококков - на белых мышах.

Для формирования у молодняка колострального иммунитета вакцину вводят супоросным свиноматкам за 1-1,5 месяца до опороса дважды с интервалом 10-12 дней.

2.11. Вакцина против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов инактивированная и лиофилизированная.

(ТУ 2634-002-00482861-99)

Предшественником этой вакцины послужила полужидкая формол-гидроокисьалюминиевая вакцина против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов АзНИВИ( 1965).

Вакцину изготавливали из штаммов пастерелд, выделенных из трупов крупного рогатого скота и буйволов, используя по 3 штамма от каждого вида животных. Штаммы характеризуются высокой вирулентностью и убивали телят и буйволят через 24-18 часов после внутримышечного введения.

Питательным субстратом служила полужидкая среда на бульоне Хоттин-гера с добавлением триптического перевара казеина.

Подача воздуха в процессе выращивания культуры не нормирована, перемешивание практически не проводилось, культивирование продолжалось 1824 часа. Контроль количества выросших пастерелл не предусмотрен.

Проверка активности вакцины проводится на пяти голубях, которых вакцинируют двукратно. После заражения допускается гибель двух из пяти вакцинированных голубей.

Таким образом, технология изготовления и методы контроля вакцины далеки от совершенства и не отвечают современным требованиям.

Мы поставили задачу усовершенствовать технологию изготовления и методы контроля формолвакцины против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов полужидкой гидроокисьалюминиевой.

Культуру пастерелл необходимо выращивать на ранее описанной среде с непрерывной подачей воздуха и работающей мешалке.

Концентрация микробных тел в каждой выращенной культуре должна быть не менее 8 млрд/см3.

Выращенную в реакторе культуру инактивируют 0,3%-ным формалином, концентрируют на предварительно простерилизованных центрифугах ОТР-Ю1 К. Для предупреждения загрязнения бактериальной массы в центрифугах поддерживают повышенное давление (0,3 атм.) за счет постоянной подачи стерильного воздуха.

Простерилизованный и собранный с соблюдением необходимых условий стерильности ротор центрифуги включают и, после установления постоянного количества оборотов - 15000 об/мин, подают в ротор центрифуги культуру из реактора при давлении (0,3-0,4 атм.) со скоростью 100-200 л/час.

В процессе центрифугирования берут периодически пробы надосадочной жидкости для определения степени полноты отделения бактериальной массы от питателчюй среды. Надосадочная жидкость должна быть прозрачной. При микроскопии можно обнаружить единичные микробные клетки.

Извлечение бактериальной массы из ротора центрифуги производят в предварительно просгерилизованном ламинарном боксе стерильным металиче-ским шпателем в стерильный металлический стакан от размельчителя тканей марки РТ-1, в который предварительно вносят небольшое количество (500-600 мл) среды высушивания (10% сахарозы, 4% желатина, 1 % пептона).

На размельчителе тканей РТ-1 бактериальную массу ресуспендируют в течение 2-3 мин и под факелом переливают из металлического стакана в градуированный стеклянный баллон.

Из полученной суспензии берут пробу, определяют концентрацию микробных тел по оптическому стандарту мутности или на ФЭКе, для которого предварительно строят калибровочную кривую. Колориметрирование проводят в кюветах толщиной 5 мм в световом спектре 434-435 ммк. В качестве контрольного раствора используют защитную среду.

Ресуспендированный антиген доводят до концентрации не менее 200 млрд/см3 защитной средой в соотношении 1:1.

К объему полученной суспензии добавляют 20% стерильного 6%-ного раствора ГО А.

После этого содержимое емкости тщательно перемешивают на шут-тельаппарате до полной гомогенизации суспензии.

Полученную суспензию контролируют на стерильность посевами на МП А, МПБ, МШШ и среду Сабуро и расфасовывают во флаконы.

Замороженную во флаконах (ампулах) вакцину перегружают в предварительно охлажденную до 60-65°С сублимационную установку. После подключения системы контроля за параметрами подогрева подо к и продукта сублиматор герметизируется и камера вакуумируется до предельного остаточного давления 8-10 Па. Через 1-2 часа включается подогрев полок. Конечная температура достигается +30°С в течение 4-6 часов и поадеркчвается в данном режиме до конца процесса сушки. Время сублимации 30-35 часов. При достижении температуры

в продукте +10°С подогрев полок снижается до +25°С и производят досушивание в течение 22-24 часов. Остаточная масса влаги должна быть в пределах 1 -4%. Общее время сушки составляет 72 часа.

После окончания процесса высушивания камера сублимационной установки заполняется стерильным осушенным воздухом или азотом.

Кассеты с лиофилизированной вакциной извлекают из камеры сублимационной установки, в стерильных условиях ампулы запаивают под вакуумом или в среде инертного газа, флаконы укупоривают стерильными резиновыми пробками, накрывают алюминиевыми!колпачками и обкатывают на закаточном полуавтомате.

Флаконы (ампулы) с вакциной укладывают в картонные коробки с разделительными перегородками, обеспечивающими целостность биопрепарата. В каждую коробку вкладывают наставление по применению вакцины. На коробку с флаконами (ампулами) наклеивают этикетку, на которой указывают: наименование и товарный знак предприятия изготовителя, полное наименование вакцины, номер серии и номер контроля, количество флаконов (ампул) в коробке, объем вакцины во флаконе (ампуле), количество растворителя для одного флакона (ампулы), количество доз в одном флаконе (ампуле), количество доз в коробке, дозы для животных, дату изготовления (месяц, год), срок годности, условия хранения и обозначение ТУ.

Каждая серия вакцины должна быть проверена на предприятии-изготовителе отделом биологического контроля.

Для определения внешнего вида, цвета, наличия посторонних примесей, плесени, следов оттаивания, трещин каждый образец с вакциной просматривают визуально, одновременно проверяют на прочность укупорки и правильность этикетирования. Наличие вакуума в ампулах проверяют согласно ГОСТ 2808389, фиолетово-синее свечение, сопровождающееся характерным потрескиванием, указывает на наличие вакуума.

Для определения растворимости в 3 флакона (ампулы) с сухой вакциной вносят физиологический раствор в объеме соответствующем объему вакцины до высушивания. После этого флаконы (ампулы) встряхивают и наблюдают за растворением вакцины. В течение 3-4 минут во флаконе (ампуле) должна образовываться равномерная взвесь от желтоватого до серо-белого цвета без комочков и хлопьев.

Определение массовой доли влаги проводят по ГОСТ 24061-80 "Препараты биологические сухие. Метод определения влажности". Массовая доля влаги должна быть в пределах 1-4%.

Для контроля стерильности вакцины используют 5 флаконов (ампул). Испытание проводят в соответствии с ГОСТ 28085-89 "Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности".

Для проверки вакцины на чистоту, окрашенные мазки из 5 флаконов (ампул) исследуют под микроскопом. В мазках должна быть чистая культура пас-терелл с характерной для них морфологией.

Определение безвредности вакцины.

Для испытания берут 5 флаконов (ампул) с сухой вакциной. Из кажд о флакона (ампулы), разведенного стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:20, отбирают 15-20 см3 вакцины и переносят в стерильный флакон. Полученную общую пробу вакцин» I используют для испытания.

Для проверки на безвредность вакцину вводят подкожно пяти белым мышам массой 18-20 г по 0,3 см3 каждой и двум кроликам массой 1,5-2,0 кг по 3 см3 внутримышечно. Животные в течение 10 дней должны оставаться клинически здоровыми. На месте введения вакцины допускается ограниченное уплотнение.

Активность вакцины проверяют на голубях.

Закцину вводят 10 голубям внутримышечно - первый раз в грудную мышцу с одной стороны, в дозе 1 см'', вторично через 10 дней в дозе 1 см3 - с

другой стороны. Через 10 дней после введения второй дозы вакцины всем вакцинированным голубям и пяти контрольным вводят подтитрованную смертель-•\'ю дозу суточной бульонной культуры вирулентного штамма Р. тиИо^а № 796.

Вакцина должна предохранять от гибели не менее 7 из 10 вакцинированных голубей, при гибели всех контрольных. Срок наблюдения за вакцинированными голубями - 7 дней с момента введения им вирулентной культуры.

Срок годности вакцины 12 месяцев со дня изготовления при условии хранения ее в темном месте при температуре не выше 20°С.

Вакцину транспортируют всеми видами транспорта в соответствии с "Правилами перевозки скоропортящихся грузов и багажа, действующими на данном виде транспорта".

Все производственные процессы по изготовлению вакцины: засев, концентрирование, расфасовка, высушивание, контроль и прочее записывают в прошнурованные журналы по установленной форме, в тот же день, когда была проведена та или иная работа.

Таким образом, с учетом эпизоотологического мониторинга пастереллеза животных и с учетом антигенной структуры возбудителей заболевания нами разработаны биологические основы универсальной технологии производства и контроля вакцин против данного заболевания различных видов животных.

Применение такой технологии в условиях промышленного производства позволяет получить вакцины для профилактики пастереллеза всех видов животных. В необходимых случаях универсальная технология позволяет осуществлять производство ряда живых и ассоциированных вакцин.

40

ВЫВОДЫ

1. Разработаны 4 новые вакцины против пастереллеза:

- крупного рогатого скота и буйволов инактивированная лиофилизирован-

ная;

- кур живая сухая;

- пастереллеза, сальмонеллеза и стрептококкоза поросят ассоциированная;

- пастереллеза и стрептококкоза нутрий бивалентная.

2. Усовершенствована технология изготовления и методы контроля 5 вакцин: 1

- формолвакцина против пастереллеза овец и свиней преципитированная;

- инактивированная сорбированная вакцина против пастереллеза птиц;

. - формолвакцина против пастереллеза кроликов;

- вакцина эмульгированная против пастереллеза норок;

- вакцина эмульгированная против пастереллеза нутрий.

3. Изготовлена живая сухая вакцина против пастереллеза птиц из штамма Р. multocida, несущего мутации в гене-супрессоре и стрептомициновом локусе. Вероятность реверсии штамма в вирулентное состояние составляет 10"14.

Впервые установлено, что метод получения супрессорных ревертантов, примененный для аттенуации сальмонелл, пригоден.для атгенуации пастерелл. Исходный штамм Р. multocida имел вирулентность около 1000, а аттенуированг ный более 1 млрд. микробных клеток.

.4.. Разработана универсальная питательная среда для культивирования пастерелл в реакторах, включающая в оптимальных соотношениях перевары Хотгингера, казеина и гидролизаты из непищевого сырья белкового происхождения в количестве до 60-65%.

5. Установлены отношения коменсалов в ассоциированной вакцине против пастереллеза, сальмонеллеза и стр^г. ■ - оккоза поросят между Р. multocida А, В, Д, S. choleraesuis, S. typhirmirium, Streptococcus серогрупп Си R, что по-

¡воляет изготавливать вакцину из семи сероваров.

6. Оптимизирована технология изготовления вакцин против пасте-реллезов животных, включающая внесение 8-10% матровой расплодки, 100-120 об/мин мешалки, подачу двух объемов воздуха в минуту по отношению к питательной среде, прекращение культивирования в экспоненциальной фазе роста, что обеспечивает накопление бактериальной массы до 22-25 млрд./см3.

7. Установлены иммунизирующие дозы пастерелл в живой вакцине для кур 50 млн. и в инактивированных для свиней, крупного рогатого скота, буйволов по 30 млрд., для кроликов и нутрий -по 3 млрд. при добавлении к вакцине 6%-ного гидрата окиси алюминия до 25-30%-ной концентрации.

8. Специфическая профилактика эшерихиоза кур вакциной из адгезивных и растворимых антигенов эшерихий не обеспечивает специфичёской профилактики эшерихиоза кур потому, что адгезивные антигены не играют значимой роли в патологии у кур.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 .Разработана техническая документация, отработана промышленная технология и предложены для практического применения вновь созданные вакцины:

- против пастереллеза кур живая ТУ 9384-002-0494189-00;

- против пастереллеза и стрептококкоза нутрий ТУ 9384-179-00494189-99;

- против сальмонеллеза, пастереллеза и стрептококкоза поросят ТУ 9384-116-00494185-96;

- против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов

. инактивированная лиофилизированная ТУ2634-002-00482861-99. Разработана и внедрена 'в производство технология получения гидролиза-тов из белоксодержащего сырья непищевого происхождения для производства универсальной питательной среды (патент № 2103375 от 27 января 1998 года). Усовершенствованы, используемые в ветеринарной практике, вакцины:

- формолвакцина против пастереллеза овец и свиней преципитированная. Извещение № 3 об изменении ТУ 46-21-185-84;

- вакцина эмульгированная против пастереллеза норок. Извещение № 2 об изменении ТУ 46-21-124-75;

- вакцина против пастереллеза птиц инактивированная сорбированная. Извещение^» 2 об изменении ТУ 10.19.30-88;

- формолвакцина против пастереллеза кроликов. Извещение № 1 об изменении ТУ 46-21-47-84.

- вакцина эмульгированная против пастереллеза нутрий. Извещение № 2 об изменении ТУ 10-19-448-87.

2. Для промышленного культивировг>;.:я пастерелл использовать универсальную питательную среду, а для изготовления вакцин - отработанные техно-

логические режимы.

Для контроля активности вакцин использовать:

- 2-3-месячных цыплят при оценке вакцины живой сухой для кур и инакти-вированной сорбированной для птиц;

- кроликов массой 1,5-2,0 кг для контроля инактивированной лиофи-лизированной вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов, а также ассоциированной вакцины против пастереллеза и стрептококкоза нутри й.

Сердечно благодарю за оказание практической помощи в выполнении наших исследований сотрудников ФГУП «Ставропольская биофабрика» и ВГНКИ, в частности профессора Ситькова В.И., профессора Панина А.Н., профессора Малахова Ю.А., профессора Душук Р.В., профессора Тутова И.К., начальника ОБВК Каменского Н.И., начальника бактериального производства Ге-ладзе В.Ш., микробиологов Лемешко Л.В., Усову Н.Б., Солдатову Л .А.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ Д ИССЕРТАЦИИ

1. И.К. Тутов, В.И. Заерко. - Совершенствование биотехнологии изготов пеняя вакцин из аттенуированных штаммов /Материалы Всероссий ской научно-производственной конференции к 100-летию биологиче ской промышленности России, г. Курск, 1996, с.122-123.

2. В.И.Ситьков, В.И.Заерко.-Технологическая обвязка биоферментеро для выращивания микроорганизмов в стерильных условиях. Матери; лы Всероссийской научно-производственной конференции к 10( летаю биологической промышленности России, г. Курск, 199 с.121-122.

3. В.И. Ситыссв, И.К. Тутов, В.И. Заерко.- Достижения Ставропольем биофабрики в решении проблемы борьбы с инфекционными заб леваниями животных / Журнал "Вестник ветеринарии", 1996, №17, с.

4. Ю.А,Малахов, А.Н.Панин, Р.В.Душук, Т.Н.Мохина, В.И.Заерко,- Ва цина против сальмонеллеза, пастереллеза и стрептококкоза порой ТУ 9384-116-00494185-96. 30.04.1997 г.

5. A.Borisenkova, T.Rochdesyvenskaya, V.Gavrilova, A.Lebede-V.Zacrko - The new approachles to create the bird Pasteurellosis vacci lOth Europen poultry conference "The poült-ry Industry Towards the 21 Centure", Jerusalem, Israel, june 21-26,1998, p.80,85

6. В. И. Заерко - Разработка технологии промышленного изготовлеь . инактиБированной сорбированной вакцины против пастереллеза пт

/Сборник научных трудов Ставропольской ГСХА, 1998, № , с.8-9.

7. В.И. Ситьков, В.И. Заерко.- Опыт приготовления и оценка качества социированной вакцины против колибактериоза и пастереллеза п /Сборник научных трудов Ставропольской ГСХА, 1998, № , с. 10-11.

8. В.Ш. Геладзе, В.И. Ситьков, В.И. Заерко И.К. Тутов, - Изыскание у версальных питательных сред для культивирования аэробных и ;

эробных микроорганизмов /Сборник научных трудов Ставропольской ГСХА, 1999, № ,с.30-31.

9. В.И. Ситьков, И.К. Тутов, А.П. Сурмило, Р.Г. Колпакова, В.И. Заерко-Способ получения гидролизатов и использование их при изготовлении питательных сред для культивирования организмов. Патент №2103375 от 27 января 1998 г.

10.В.И. Заерко.- Комплексная профилактика пастереллеза и других инфекций нутрий / Материалы 2-ой региональной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе", п. Персиановский, 1999, с. 14-15.

11.В.И. Заерко.- Совершенствование технологии получения вакцин для специфической профилактики пастереллеза кроликов / Материалы 2-ой региональной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе", п. Персиановский, 1999,с.14-15.

12.А.А. Раевский, М Я. Ярцев, Л.В. Анасимова, A.A. Нежута, Е.С. Сервис, В.И. Ситьков, Н.И. Каменский, Л Ю. Жаренко, В.И. Заерко,- Получение сухих вакцин против пастереллеза птиц непрерывным способом /Журнал "Ветеринария", 1999, №3, с. 24-25.

13.В.И. Заерко,- Перспективность технологии изготовления и применения лиофилизиро ванной вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота / Материалы Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии - вклад в науку и практику XXI века", Ставрополь, 1999. с.43-44.

14.И.К. Тутов,' В.И. Ситьков, А.П. Сурмило, В.И. Заерко- Научно-практическое оббснование способа получения гидролизатов из отходов биофабричного и инкубаторского производства /Материалы Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии -

вклад в науку и практику XXI века", Ставрополь, 1999. с.82-83

15.В.И. Заерко В.И. Ситьков, И.К. Тутов - Перспективность технологий изготовления и применения живых вакцин для профилактики саль-монеллезов и пастереллезов / Материаг ' Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии - вклад в науку и практику XXI века", Ставрополь, 1999. с.86-87.

16.В.И. Заерко, В.И. Ситьков.-Мобильность технологии производства биопрепаратов - основа успешной борьбы с инфекционными заболевг ■ ниями животных / Материалы Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии - вклад в науку и практику XXI зека", Ставрополь, 1999. с. 89-90.

17.В.И. Ситьков, В.И. Трухачев, И.К. Тутов, В.И. Заерко.- Экологическая безопасность производства ветеринарных препаратов / Сборник научных трудов Ставропольской ГСХА, 1999, №, с.3-5.

18.Р.В.Душук, в.И.Заерко, В.Ш.Геладзе Л.В.Лемешко,- Вакцина против пастереллеза крупного рогатого сиг-1 и буйволов инактивированная лиофилизированная ТУ 2634-002-00482861-99. • '

19.В.И. Заерко И.К. Тутов, В.И. Ситьков. В.А. Мартынов, В.И. Заерко.-Устройство и использование ферментеров (биореакторов) при производстве ветеринарных препаратов /Учебное пособие, Ставрополь, 1999г.

20.В.И. Ситьков, И.К. Тутов, В.И. Заерко В.А. Мартынов.-Методические указания по использованию правил GMP при производстве биопрепаратов /Ставропольская ГСХА, Ставрополь,. 1999г.

21.В.И. Ситьков, В.И. Заерко A.C. Бакумов, Н.И. Каменский - Отработка технологических параметров производства биопрепаратов под инертным газом в мелкодозной расфасовке /Сборник научных трудов Ставропольской ГСХА, 1999, № , с. 24-25.

22.А.П. Сурмило, В.И. Заерко В.А. Мартынов, В.И. Ситьков, Н И. Каменский - Валидация оборудования и технологических процессов при прошводстве биопрепаратов по требованиям СМР /Сборник научных трудов Ставропольской ГСХА, 1999, № , с. 30-31.

23.Ю.А.Малахов, В.И.Заерко, Р.Ь.Душук, А.Н.Панин - Вак ..на против пастереллеза и стрептоккоза нутрий. ТУ 9384-179-00494189. 02.021999г.

24.В.И.Заерко, Ю.А.Малахов, Р.В.Душук,- Сухая живая вакцина против пастереллеза кур. ТУ 9384-002-00494189-00.2000 г.

ЗАКАЗ »452 ТИРАЖ 100»«» П»л 3„2 СтГСХА

ВЫВОДЫ

1. Разработаны 4 новые вакцины против пастереллеза:

- крупного рогатого скота и буйволов инактивированная лиофилизированная,

- кур живая сухая;

- пастереллеза, сальмонеллеза и стрептококкоза поросят ассоциированная;

- пастереллеза и стрептококкоза нутрий бивалентная.

2. Усовершенствована технология изготовления и методы контроля 5 вакцин: i

- формолвакцина против пастереллеза овец и свиней преципитированная;

- инактивированная сорбированная вакцина против пастереллеза птиц; - формолвакцина против пастереллеза кроликов;

- вакцина эмульгированная против пастереллеза норок;

- вакцина эмульгированная против пастереллеза нутрий.

3. Изготовлена живая сухая вакцина против пастереллеза птиц из штамма Р. muitocida, несущего мутации в гене-супрессоре и стрептомициновом локусе. Вероятность реверсии штамма в вирулентное состояние составляет 10~14.

Впервые установлено, что метод получения супрессорных ревертантов, примененный для аттенуации сальмонелл, пригоден для аттенуации пастерелл. Исходный штамм Р. muitocida имел вирулентность около 1000, а атгенуирован-ный более 1 млрд. микробных клеток.

4. Разработана универсальная' питательная среда для культивирования пастерелл в реакторах, включающая в оптимальных соотношениях перевары Хотгингера, казеина и гидролизаты из непищевого сырья белкового происхождения в количестве до 60-65%.

5. Установлены отношения коменсалов в ассоциированной, вакцине против пастереллеза. сальмон^тлез;: п ; у .оккоза поросят между Р. muitocida А, В, Д, S. choleraesuis, S. i>phim;!fmi:i, Streptococcus серогрупп С и R, что по

41 воляет изготавливать вакцину из семи сероваров.

6. Оптимизирована технология изготовления вакцин против пасте-зеллезов животных, включающая внесение 8-10% матровой расплодки, 100-120 эб/мин мешалки, подачу двух объемов воздуха в минуту по отношению к питательной среде, прекращение культивирования в экспоненциальной фазе роста, что обеспечивает накопление бактериальной массы до 22-25 млрд./см3.

7. Установлены иммунизирующие дозы пастерелл в живой вакцине для кур 50 млн. и в инактивированных для свиней, крупного рогатого скота, буйволов по 30 млрд., для кроликов и нутрий - по 3 млрд. при добавлении к вакцине 6%-ного гидрата окиси алюминия до 25-30%-ной концентрации.

8. Специфическая профилактика эшерихиоза кур вакциной из адгезивных и растворимых антигенов эшерихий не обеспечивает специфической профилактики эшерихиоза кур потому, что адгезивные антигены не играют значимой роли в патологии у кур.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Разработана техническая документация, отработана промышленная технология и предложены для практического применения вновь созданные вакцины:

- против пастереллёза кур живая ТУ 9384-002-0494189-00;

- против пастереллеза и стрептококкоза нутрий ТУ 9384-179-00494189-99;

- против сальмонеллеза, пастереллеза и стрептококкоза поросят ТУ 9384-116-00494185-96;

- против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов инактивированная лиофилизированная ТУ2634-002-00482861-99. Разработана и внедрена в производство технология получения гидролиза-тов из белоксодержащего сырья непищевого происхождения для производства универсальной питательной среды (патент № 2103375 от 27 января 1998 года). Усовершенствованы, используемые в ветеринарной практике, вакцины:

- формолвакцина против пастереллеза овец и свиней преципитированная. Извещение № 3 об изменении ТУ 46-21-185-84;

- вакцина эмульгированная против пастереллёза норок. Извещение № 2 об изменении ТУ 46-21-124-75,

- вакцина против пастереллёза птиц инактивированная сорбированная. Извещение № 2 об изменении ТУ 10.19 30-88;

- формолвакцина против пастереллёза кроликов. Извещение № 1 об изменении ТУ 46-21-47-84

- вакцина эмульгированная против пастереллёза нутрий. Извещение № 2 об изменении ТУ 10-19-448-87.

2 Для промышленной) культивировг. ?- пастерелл использовать универсальную питательную среду, а для чзготов;,с.тя вакцин - отработанные техно

43 логические режимы.

Для контроля активности вакцин использовать:

- 2-3-месячных цыплят при оценке вакцины живой сухой для кур и инакти-вированной сорбированной для птиц;

- кроликов массой 1,5-2,0 кг для контроля инактивированной лиофи-лизированной вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота и буйволов, а также ассоциированной вакцины против пастереллеза и стрептококкоза нутрий.

Сердечно благодарю за оказание практической помощи в выполнении наших исследований сотрудников ФГУП «Ставропольская биофабрика» и ВГНКИ, в частности профессора Ситькова В.И., профессора Панина А Н., профессора Малахова Ю.А., профессора Душук Р.В., профессора Тутова И.К., начальника ОБВК Каменского Н.И., начальника бактериального производства Ге-ладзе В.Ш., микробиологов Лемешко Л.В., Усову Н.Б., Солдатову Л.А.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. И.К. Тутов, В.И. Заерко. - Совершенствование биотехнологии изготов ления вакцин из аттенуированных штаммов /Материалы Всероссий ской научно-производственной конференции к 100-летию биологиче ской промышленности России, г. Курск, 1996, с. 122-123.

2. В.И.Ситьков, В.И.Заерко.-Технологическая обвязка биоферментеро для выращивания микроорганизмов в стерильных условиях Матери; лы Всероссийской научно-производственной конференции к I ОС летию биологической промышленности России, г. Курск, I99i с.121-122. ' ' .

3. В.И. Ситьков, И.К. Тутов, В.И. Заерко,- Достижения Ставропольскс биофабрики в решении проблемы борьбы с инфекционными заб леваниями животных / Журнал "Вестник ветеринарии", 1996, №17, с.

4. Ю.А.Малахов, А.Н.Панин, Р.В.Душук, Т.Н.Мохина, В.И.Заерко - Ва цина против сальмонеллеза, пастереллеза и стрептококкоза порос: ТУ 9384-116-00494185-96. 30.04.1997 г.

5. A.Borfsenkova, T.Rochdesyvenskaya, V.Gavrilova, A.Lebede' V.Zaerko- The new approachles to create the bird Pasteurellosis vacc 10th Europen poultry conference "The poult-ry Industry Towards the 21 Centure", Jerusalem, Israel, june 21-26,1998, p.80,85

6. В. И. Заерко,- Разработка технологии промышленного изготовле! инактивированной сорбированной вакцины против пастереллеза п' /Сборник научных трудов Ставропольской ГСХА, 1998, № , с.8-9.

7 В.И. Ситьков, В.И. Заерко,- Опыт приготовления и оценка качества социированной вакцины против колибаетериоза и пастереллеза п /Сборник научных трудов Ставропольской ГСХА, 1998, №., с. 10-11.

8. В.Ш. Геладзе, В.И. Ситьков, В.М Заерко И.К. Тутов,.- Изыскание } версальных питательных сред для культивирования аэробных и ; эробных микроорганизмов /Сборник научных трудов Ставропольской ГСХА, 1999, №,с.30-31.

9. В.И. Ситьков, И.К. Тутов, А.П. Сурмило, Р.Г. Колпакова, В.И. Заерко.-Способ получения гидролизатов и использование их при изготовлении питательных сред для культивирования организмов. Патент №2103375 от 27 января 1998 г.

10.В.И. Заерко.- Комплексная профилактика пастереллеза и других инфекций нутрий / Материалы 2-ой региональной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе", п. Персиановский, 1999, с. 14-15.

11 В И. Заерко - Совершенствование технологии получения вакцин для специфич схой профилактики пастереллеза кроликов / Материалы 2-ой региональной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на Северном Кавказе", п. Персиановский, 1999,с.14-15.

12.А.А. Раевский, М.Я. Ярцев, Л.В. Анасимова, A.A. Нежута, Е.С. Сервис, В.И. Ситьков, Н.И. Каменский, Л Ю. Жаренко, В.И. Заерко - Получение сухих вакцин против пастереллеза птиц непрерывным способом /Журнал "Ветеринария", 1999, №3, с. 24-25.

13.В.И. Заерко - Перспективность технологии изготовления и применения лиофилизированной вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота / Материалы Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии - вклад в науку и практику XXI века", Ставрополь, 1999. с.43-44.

14.И.К. Тутов,' В.И. Ситьков, А.П. Сурмило, В.И. Заерко- Научно-практическое обоснование способа получения гидролизатов из отходов биофабричного и инкубаторского производства /Материалы Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии вклад в науку и практику XXI века", Ставрополь, 1999. с.82-83

15.В.И. Заерко В И. Ситьков, И.К. Тутов - Перспективность технологии изготовления и применения живых вакцин для профилактики саль-монеллезов и пастереллезов / Материаг т Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии - вклад в науку и практику XXI века", Ставрополь, 1999. с.86-87.

16.В.И. Заерко, В.И. Ситьков.-Мобильность технологии производства биопрепаратов - основа успешной борьбы с инфекционными заболев; ■ ниями животных / Материалы Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии - вклад в науку и практику XXI "¡е-ка", Ставрополь, 1999. с.89-90.

17.В.И. Ситьков, В.И. Трухачев, И.К. Тутов, В.И. Заерко,- Экологическая безопасность производства ветеринарных препаратов / Сборник научных трудов Ставропольской ГСХА, 1999, № , с.3-5.

18.Р.В.Душук, в.И.Заерко, В.Ш.Геладзе Л.В.Лемешко - Вакцина против пастереллёза крупного рогатого ско^'1 и буйволов инактивированная лиофилизированная ТУ 2634-002-00482861-99. •

19.В.И Заерко И.К. Тутов, В.И. Ситьков, В.А. Мартынов, В.И. Заерко-Устройство и использование ферментеров (биореакторов) при производстве ветеринарных препаратов /Учебное пособие, Ставрополь, 1999г.

20 В.И. Ситьков, И.К. Тутов, В.И. Заерко В.А. Мартынов -Методические указания по использованию правил GMP при производстве биопрепаратов /Ставропольская ГСХА, Ставрополь,. 1999г.

21.В.И. Ситьков, В.И. Заерко A.C. Бакумов, Н.И. Каменский,- Отработка технологических параметров гиюшводства биопрепаратов под инертным газом в мелкодозной расфасовке /Сборник научных трудов Ставропольской ГСХА, 1999, № , с. 24-25.