Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка технологии получения очищенных препаратов термолабильного энтеротоксина эшерихий

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТРЛЬСШ ИНСТИТУТ ПУ1ШОГО ЗВЕРОВОДСТВА И КРОЛИКОВОДСТВА имен* В.А.АФАНАСЬЕВА

ДАВЫДОВА Любовь Ивановна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ТЕРМОЛАБИЛЬКОГО ЭНТЕРОТОКСИНА ЭШЕРИХИЙ

16.СО.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

На правах р^я-.писи

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа ысмкнена в Научно-исследовательском институте путного звероводства и кролиководства имени В.А.Афанасьева.

Научный руководитель: действительный член Международной

академии информатизации, доктор ветеринарных наук, профессор Еиельяненг? П.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Интизаров М.К.

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Дроздова Э.И.

Ведущая организация:

Московский государственный университет прикладной биотехнологии Министерства общего и профессионального образования РФ

Защита состоится "/-3 " 1998 г. в часов

на заседании специализированного совета К 020.90.02 по защите диссертаций на соисканиэ ученой степени кандидата наук в Научно-исследовательском институте пушного звероводства и кролиководства имени В.А.Афанасьева (140143, Московская область, Рамевский район, пос.Роднакн, уд.Трудовая, 6. Тел. 501-53-55).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан ' 6 ' 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета

Костюкина Н.А.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работа. Инфекционная патология с синдроыоы острой диареи продолжает оставаться проблемой как для медицины, тах ж для ветеринарии. Из I миллиарда ежегодно заболевающих летев 3 миллиона уйирают (Персон М.Х., 1990; Chavaese B.C. , 1994). Согласно научным данным, основными этиологическими агентами здесь являются Vibrio eholerae и Escherichia esli. Несмотря на достигнутые успехи в изучении патогенеза и патофизиологии холеры и на снижение случаев летального исхода благодаря превентивному лечению, она продолжает беспокоить человечество сведениями о спорадических случаях, заболевания» либо пандемиях.

Особую озабоченность у медиков вызывает проявление кишечной палочкой новых инфекционных свойств (Пайков В.А., 1994 ; Bettelbelm К.А., 1990; Siifonen А., 1994; Blanco I.В. , 1996). Неблагополучной остается со эшерихиозаы статистика в ветеринарии, где регестрируется до 40 % случаев заболеваемости (celemín С., 1995 ; Huno в и., 1996). Особенно уязвимыми оказываются молодые особи, для которых характерен летальный исход болезни (Новак Д.Д., 1995; Vray е., 1984), в связи с чем сельское хозяйство, и звероводство в том числе,' терпят значительные убытки (Евглевский A.A., 1995 ; Новак Д.Д., 1995 ; Iorgeneen и., 1996). Причиной этого является широкое распространение различных факторов патогенности в популяциях эшерихий, основную роль среди которых играют токсины (Вертиев D.B., 1991, 1996 ; Oyles C.I>., 1971 ; Bofcreouhe 1., 1980; Celémin С., 1995). Речь идет о термолабильном (ЛТ), термостабильном (CT) и шига-подобном (3LT) энтеротоксинах, из которых доля первого в остра кишечных заболеваниях достаточно значительна (Вертиев D.B., 1984, 1987 ; Петровская В.Г., 1990; German! Y., 1988).

В связи с распространенностью инфекций, вызванных в.coli, синтезирующих в кишечнике человека или животных ЛТ-белок, актуальным на сегодняшний день является разработка способов защиты макроорганизма от данной токсической функции бактерий (Сидоров М.А., 1984). И в первую очередь необходимы ноше подходы к получению очищенных препаратов энтеротоксина, как исходного материала для разработки диагностических и лечебно-профилактачес-ких средств (Смирнов Г.Б., 1984 ; Tinkeletein В., 1990; Меп-doza-Vega О., 1995).

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка эффективных способов получения препаратов полноразмерного термолабильяого энтеротоксина зшерихяй я его рецепторной части (В-субъединицы).

Для достижения поставленной цели необходыо было решить следующие задачи:

1) отработать условия культивирования рекомбинантных штаммов-продуцентов полноразмерного токсина и его рецепторной части с целью получения биомассы, обогащенной искомыми белками ;

2) определить эффективные методы ввдедения ЛТ в В-субъединицы из бактериальных клеток;

3) исследовать возможность использования нм»огноа£финной хроматографии для получения очищенных препаратов ЛТ и В-субъединицы в активной форме.

Научная новизна. В качестве продуцентов термолабильного энтеротоксина эшерихий и его рецепторной субъединицы в работе впервые использованы рекомбянантные штаммы, для которых экспериментально определены оптимальные условия культивирования.

С учетом локализации термолабального энтеротоксина в бактериальных клетках в серии сравнительных опытов впервые доказана эффективность в доступность экстракции годотоксяна и его рецепторной части мочевиной (как способ получения лизатов бактерий) .

Впервые апробирован метод очистки годотоксина и его субеди-нвцы В, основанный на аффинных свойствах голубой агарозы (ГА), обеспечиваний получение из биомассы продуцентов препаратов, обогащенных белками с нативннми свойствами.

Доказана возможность использования этих препаратов дкя иммунизации животных с целью получения антисывороток и имцуносор-бентов.

Показана реальная возможность одноступенчатой очистки токсина н е1Ч) рецепторной частк с помощью иммуноаффинной хроматографии с использованием в качестве лигандов поли- и монокло-яальных антител.

Практическое значение работа. Разработана технология выделения и очистки препаратов термолабильного энтеротоксина эшерихий, пригодных для создания диагностикумов, специфических профилактических и лечебных средств.

Апробация -работа. Основные положения диссертации доложены на конференции молодах ученых, состоявшейся в Московской ветеринарной академии имени К.И.Скрябина (1988 г.), юбилейной конференции, посвященной 65-летию создания научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства имени А.В.Афанасьева (1997 г.), на совещаниях сотрудников отделов и лабораторий НИИПЗиК им.А.В.Афанасьева (I99I-I997 гг.).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, рекомендаций по использованию научных вызодов, сведений о практическом использовании результатов исследований, списка литератур!, включающего 235 источников, в том числе 165 иностранных авторов, приложения. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 7 рисунков, 9 фотографий, 2 графика.

Публикация работы. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных статей, в которых отражены ее основные положения.

. 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы в методы исследований

Бактериальные штаммы. Первоначально эксперименты проводили со штаммом в.coli H74II4 - клиническим изолятом, любезно предоставленным ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи. В дальнейшей работо бнли использованы штаммы-суперпродуценты, пол/ченные в нашей лаборатории путем клонирования генов, ответственных за синтез токсина и его рецепторьой части - рХТ-701 (увеличение синтеза ЛТ-белка в 16 раз) и LT-в (увеличение синтеза В-субъеданицц в 24 раза).

Культивирование Етат.;ов з. coli проводили на среде Эванса, впоследствии caye с добавлением 100 мкг/мл лиякомицина для штамма H74II4, 20 мкг/мл тетрациклина для pLT-701 и 50 мкг/мл ампицилина для м-в при 37 °С в условиях высокой аэрации в течение 36 часов.

Препаративные методы. Дизат микробных клеток получали посредством ультразвуковой обработки биомассы по методу М.В.Степановой (1985), воздействием полимиксиноы В и тритоном Х-100 по методу Ю.Е.Козловского (1988), лизоциыом и тритоном Х-100 в двух вариантах (1-й - по методу Г.В.Холминой, 1980 ; 2-й -

по методу Е.ж.3сь*1пвьатег, 1982), мочевиной согласно разработанной наин методике.

Удаление ЛТ и В-субъединиды из лизатов осуществляли посредством аффинной хроматографии на голубой агарозе, полученной в условиях лаборатории посредством иммобилизации красителя цибакрона голубого рзба. на агарозной матрице, а также посредством иммуноаффинной хроматография на сорбентах с поли- и моно-клональными антителами в качестве лигандов к полноразмерному токсину, иммобилизованных на агарозной матрице также в условиях лаборатории.

Физико-химические методы. Для характеристики белкового состава выделенных препаратов использовали метод электрофореза в ПААГе с Вс-Иа по п.к.ЬаешпИ (1970). Молекулярную массу определяли по методу Х.УеЪег и М.ОвЪогп (1969).

Химические методы. Концентрацию белка определяли по методу М.М.Вгас^ога (1976).

Биологические методы. Энтеротоксическую активность препарата ЛТ определяли по методу Ю.П.Вартанян (1978) - по тумароген-ному эффекту на беспородных белых мышах. Поликловальные антитела к ЛТ получали посредством иммунизации кроликов породы шиншилла, массой 2-2,5 кг, препаратом токсина.

В работе использованы моноклональные антитела к полноразрядному токсину, полученные методом гибридомной техники сотрудником лаборатории С.Н.Серебряковым.

Иммунологические методы. Обнаружение токсина, субьедяннцы В и специфических антител в сыворотке проводили по методу Ух-терлони (1950). Антигенную активность полученных препаратов оценивали посредством метода 1.1.Ие1са1впоа (1978) и выражала в единицах удельной активности (е.а./иг).

2.2. Результаты собственных исследований

Определение оптимальных условий культивирования рекомбинантных штаммов

В отличие от штамма Н74114 било установлено отрицательное влияние линкомицина на рост, размножение бактериальных клеток рекомбинантных штаммов, синтез в них целевого белка на примере штамма рЬТ-701, культивирование которого на среде, содержащая

25 мкг/мд антибиотика привело к снижению выхода биомассы в 6 раз, концентрации белка в лизате в 1,3 раза, удельной активности токсина в 6 раз по сравнению с контролем (Р< 0,001), не содержащим линкомицин, увеличение которого в остальных случаях (50, 75, 100 мкг/мл) вызывало подавление роста культуры.

Наиболее благоприятным значением рН среды культивирования рекомбинактных штаммов оказалось значение 8,0, при котором превышение показателей выхода биомассы, концентрации белка, удельной активности целевого белка в лизате по сравнению с рН 7,0 ; 7,5 ; 8,5 (Р< 0,001) было примерно для штамма рЬТ-701 в 1,5 ; 1,2 ; 2 раза соответственно, для штамма га-в в 1,5 ; 1,2 ; 3 раза соответственно.

При выращивании штамма рЬт-701 выход биомассы с I литра среды составил 6 г с содреясанием внутриклеточного ЛТ 44,2 мг, для штамма ьт-в выход биомассы был 7,2 г с содержанием в ней целевого белка 31 мг. Применение в определении содержания В-субъединицы поликлональной антитоксической сыворотки несколько занижает результаты антигенной активности этого белка, и истинное его количество приближается к 50 мг, что соответствует функциональной способности сконструированной плазмиды.

Определение наиболее эффективного метода выделения

целевых белков из бактериальной клетки Критериеи эффективности метода служил показатель удельной активности токсина и субъеданицы В в лнзатах биомассы штаммов Н74П4, рЬТ-701, ьт-в, полученных в результате воздействия на клетки ультразвука, полимиксина В и тритона Х-100, лизоци-ма и тритона Х-100 (2 модификации), мочевины. Самые высокие значения активности целевых белков были характерны для разработанного нами метода - экстракции 8-ми молярной мочевиной в триеовом буфере (рН 8,0): 83,34 ; 370,37; 180,67 е.а./мг соответственно.

При этом концентрация белка в лизагах была приблизительно одинаковой: 12,05; 10,80; 11,07 мг/ш соответственно. Солвби-лизационные свойства мочевины по отношению к плазматической мембране, осмотический эффект раствора этого вещества, а также периплазматическая локализация целевого белка в совокупности приводит к плазмолизу и выходу из бактериальной клетка значительного количества токсина, субъеданицы В. К этому добавляется

и ренатуриружщее свойство мочевины по отношению к клеточным • белкам.

Метод прост в постановке, воспроизводим, не требует дорогих реактивов и приборов, значительных временных затрат.

Более низкие значения показателя удельной активности были получены при выделении целевых белков посредством лизоцима в фосфатном буфере (pH 7,6) и тритона Х-ЮО: 41,98 ; 176,21 ; 66,89 е.а./мг соответственно. В сравнении с этой модификацией эффективность использования лизоцима в трисовом буфере (pH 8,6) и тритона Х-100 была в 1,7 раза ниже. Увеличение же концентрации белка в лизатах рекомбинантных штатов примерно в 2 раза, отмеченное в обоих способах, в сравнении с экстракцией мочевиной, является следствием полного разрушения клеток, возрастания доли балластных компонентов в растворе. Это приводит к значительной вязкости лизата и потерям целевого белка.

Показатели активности ЛТ и В-субъединида при использовании полимиксина В и тритона Х-ЮО составили 20,53 ; 102,04 ; 39,28 е.а./мг соответственно при приблизительно равной концентрации белка в лизатах рекомбинантных штаммов (Р>0,05) s в 1,7 раза меньшем значении этого показателя для штамма H74II4 в сравнения с воздействием мочевиной, что свидетельствует в пользу предлагаемого нами метода.

Ультразвуковое разрушение приводит к потере с клеточным дебрисом 80 % целевого белка. Наблюдаемое при этом увеличение концентрации белка при низком показателе удельной активности (17,03; 62,89 ; 29,17 е.а./мг соответственно) свидетельствует о возрастании доли балластных компонентов в лизать.

Таким образом, метод экстракции токсина и рецепторной частицы из бвомассы экспериментальных штаммов посредством мочевины является наиболее эффективным из всех рассмотренных способов выделения (ряс. I). .

Получение гомогенных препаратов токсина в субъединицы В

В связи с отрицательным результатом применения для очистки энтеротоксина из лизата штамма H74II4 описанных в научной литературе способов (Clements I.D, Pinkelstein H.А, 1979 ; Ы.В.Степанова, 1987) нами разработан метод, в основу которого

П - лизсцима и тритона Х-100 (1-я кодификация), Ш - лизоцима и тритона Х-100 (2-я модификация), 1У - полимиксина 3 и тритона Х-100, У - ультразвука.

легли аффинные свойства голубой агарозы. Использование цибах-рона голубого Р35А в качестве лиганда увеличивает емкость ага-розного геля по отношению к ЛТ. Предварительная обратная сорбция на ДЕАЕ-целлшозе и фракционирование сульфатом аммония (интервал максимального осаждения токсина составляет от 33 % (осадок отбрасывали) до 55 %) повышает эффективность хроматографии на голубой агарозе. В конечном итоге метод позволяет достичь 242-кратной степени очистки токсина с выходом продукта 4,7 % (табл. I) низкое значение которого объясняется потерей

целевого белка на последних стадиях - гелъфильтрации на 5-200 и концентрировании на гидрокс ил апатите (ГАП) вследствие недостаточной емкости сорбентов.

Гомогенность препарата была подтверждена денатурирующим электрофорезом в ПААГе с о с-к а, где наблюдали две полосы, соответствующие по молекулярной массе субьединицам А и В. Титр в реакции Ухтерлони составил 1/32. Биологическая активность в тумарогенном тесте соответствовала приводимым в научной литературе показателям.

Таблица I

Хроматография 1Т на основе голубой агарозы

Стадия

Объем 1 9бщк£ » Удельная , иищак | Степень * белок, {активность, ¡активность,; ш мг е.а./мг е.а. очистки

Обцая

Дизат 200,00 1040,2 48,0 50,0x10^ 1.0

Обратная сорбция на ДЕАЕ-целлю-лозе 210,00 672,0 78,0 52.0Х103 1.6

Фракционирование сульфатом аммония 10,30 60,0 689,0 42,0x1С3 14,0

Хроматография на Га 30,00 12,0 1250,0 15.0Х103 26,0

Гельфильтра-ция на 5-200 8,00 1.3 625,0 8,0x10® 130,0

Адсорбционная хроматография на ГАП' 0,58 0,2 11625,0 2,3x10® 242,0

Данный препарат ЛТ использован при иммунизации кроликов с целью получения антитоксической сыворотки, из которой посредством хроматографии на смоле см А±л-Се1'-В1ие и фракционирования сульфатом аммония был получен препарат полиюгоналышх антител, титр которого в реакции Ухтерлони составил 1/32, гомогенность подтвреядена электрофорезом в ПААГе с ис-иа.

С целью повышения гЗфехтавнссги очитски ЛТ полученные иммуноглобулины были иммобилизованы на сефарозс СЬ-4В, и на данном сорбенте осуществлена одноступенчатая очистка токсина и субъединицы В из лизатоз рекомбинантных штаммов (элгоцига с колонки осуществляла 3 М ксяз). Результаты проделанной работы - 29-кратная степень очистки ЛТ с выходом продукта 85 % (табл. 2) и 104-кратная степень очистки В-субъединицы с выходом продукта 38 % (табл. 3)„ а также выявление исследуемых белков во фракциях несорбировавшегося на колонке материала свидетельствуют о низкой емкости икмуносорбента по отношению к рецепторному белку и недостаточной по отношению к ЛТ (рис. 2,3).

Таблица 2

Хроматография ЛТ на иммуноаффинной матрице с поликлональными антителами

Этапы ¡Объем,(Общий' Удадьная } Общая j Z jСт8П0нь ! ™ !6^°Kj ае!"Ь' I а™?СТЬ>! вь-^ода! очп£ткл

очистки

1.Лизат, содерж.ЛТ 5,0 54,00 370,4 20хЮ3. 100 I

2.Хроматография на иммуносор-бенте 8,5 1,87 9090,9 17хЮ3 85 29

Таблица 3

Хроматография В-субъединицы на иммуноаффинной матрице с поликлональными антителами

Т

Этапы 'Объем, »б^ок'актиЕНОсхь ¡а™с~ь ? * |°»впень

очистки j ил ; мг ! • ^ .активность,jБщ(0да|

1.Лизат, содержащий В-субъ- о

единицу 5,0 55,35 180,7 I0,0xI0d 100 I

2.Кммуноаф$. о

хроматогр. 7,5 0,53 7142,9 3,8x10° 38 101

В,

280 нм

нанесение лизата

элоция ЛТ

»

объем элювии, мл

Рис. 2. Очистка ЛТ на иммунозффинпом сорбечге с поди-кл ональшлш антителами.

п,

280 нм

нанесение лизата

3 Ы КСМЗ Л—злгция В-субъединвдн

I

объем элпции. кл

. Рис. 3. Хроматографаческая очистка В-еубъвдияявд на иммуноаффинном сорбенте с политональными антителами.

объем 8ло-ции, ид

280 нм

объем элю-дии, ш _

Рис. 4. Хроматографическая очгстка ЛТ и В-субъединицы на иммуноаффинном сорбенте с моновхонадышми антителами: а) элхшда ЛТ-содержащего материала, б) элюция материала, содержащего субъединицу В.

Гомогенность препарата была подтверждена денатурирующим электрофорезом в ЕААГе с Ве-Иа. В реакции преципитации наблюдали падение активности токсина с 1/32 до 1/16, В-субъединицы -с 1/16 до 1/4.

Использование в дальнейшей работе в качестве лигандов мо-ноклональных антител позволило повысить е?лкость сорбента по отношению к и в 6 раз, субьеданиц? В - в 14,5 раза. Результаты хроматографии отражены в таблицах 4 и 5, из которых следует, что выход белков по активности составил 100 % со степенью очистки 27 и 43 соответственно (рис. 4).

Таблица 4

Очистка ЛТ на иммуносорбенте с моноклональными антителами

I

отяго. ¿(VKPUf •'иощий! Сдельная ! Общая ! \ !оРТТЙН, ЭТЗШ ' ' |бмТ1 аТГл%Ь' 1 аКТИГ.Юа?'ГЬ' i внесла! оч"

очистки

мл

1.Раствор белков перед хроматографией

2.Хроматография на иммуносорбенте с моноклон, антителами

30,0 324

370,4

7,5 12 10000,0

I2XI04

12x10^

100

100

27

Таблица 5

Очистка В-субъеданицн на иммуносорбенте с моноклональными антителами

Этапы 5йелок'активность ! активность ' * {Степень

очистки ; мл I ^ I ^^ « 1 ^^ивность,: выхода; очистки

1.Лизат, содержащий В-субьедя-ницу 30,0 332,10 180,7 6.00XI04 100,0 I

2.Хроматография на иммуносорбенте с моноклон, антителами 7,4 7,77 7692,3 5,98хЮ4 99,7 43

В процессе хроматографии произошло концентрирование препаратов, о чем свидетельствует повышение активности IT с 1/32 до I/I28, В-субъединицы - с I/I6 до 1/54 в реакции преципитации по Ухтерлони.

Достаточно низкая степень очистки в этих методах обусловлена фактически селективным экстрагированием из бактериальной клетки периплазматически локализованных целевых белков посредством мочевины, что позволяет изначально избежать присутствия в препаративном материале весомой доли внутриклеточных балластных компонентов.

Проведение денатурирующего электрофореза в ПААГе с Dc-Na позволило подтвердить гомогенность полученных препаратов и определить молекулярную массу субъедкниц А, В и мономеров, составляющих рецепторный белок: 28+0,5 кД, 48,0+0,5 кД и 12,0^ +0,5 кД соответственное

Биологическая активность полученного препарата в тукаро-генном тесте совпадала с данными, приведенными в литературе.

С целью определения минимального количества препарата В-субьединица, оказывающего экранирующий эффект по отношению к голотоксину, был проведен опыт, позволивший заключить, что 1,5 мкг рецепторного белка, введенного per ос ;лышам, предотвращали токсическое действие 0,025 мкг ДТ, введенного таким же образом от 33 до 100 % случаев. Для достижения 100 í-ного эффекта защиты дозу В-субъединицы следует увеличить вдвое (Р=0,05).

Таким образом, использование в хроматографии в качестве биоспецифических центров адсорбции моноклональных антител является гарантией получения гомогенных препаратов целевых белков с высокими качественными и количественными характеристиками.

Представленные результаты экспериментов свидетельствуют о целесообразности использования в препаративных работах реком-бинанткых форм продуцентов. Поскольку эти штаммы отличаются по ряду свойств от исходных, пришлось видоизменить технологию очистки целевых белков, что в конечном итоге позволяет оценить ее как специфическую, включающую этапы культивирования рекомби-нантных штаммов, экстракции мочевиной целевых белков и их им-муноаффинной очистки с использованием в качестве лигандов

монокяонаяьных антител. Анализ полученных результатов, а также литературные данные позволяют сделать заключение о том, что подобная препаративная работа проведена впервые и представляет интерес в плане целостного технологического процесса, который может стать основой промышленных способов получения целевых белков, либо в виде отдельных прикладных научных разработок (например, экстракция мочевиной белков, локализованных в пери-плазматическом пространстве бактериальной клетки) использован в биотехнологии.

В практическом отношении проделанная работа представляет интерес в связи с высокой эффективностью, отсутствием необходимости в дорогом оборудовании и реактивах, значительных временных затратах. '

3. ВЫВОДУ

1. Определены оптимальные условия культивирования полученных генно-инженерными методами продуцентов термолабильного эн-теротоксина и его рецепторной субьединицы, при которых выход биомассы для штамма рИ-701 с I литра среда составил 6 г с содержанием внутриклеточного ЛТ 44,2 мг, для штамма LT-B - 7,2 г с содержанием целевого белка 31 мг.

2. Разработан эффективный и доступный способ экстракции голотоксина и его рецепторной субъединицы из биомассы, основанный на использовании 8 М мочевины.

3. Разработан препаративный пятиступенчатый метод получения гомогенного препарата энтеротоксина на основе использования аффинного сорбента голубой агарозн с лигандом цибакроном голубым F2GA, что позволило достигнуть 242-кратной степени очистки препарата с конечным выходом 4,7 %.

4. Очищенный разработанным способом препарат был применен для иммунизации животных с целью получения моно- и поликлональ-ных антител к терыолаб ильному токсину.

5. Ииыуноаффинные свойства иммобилизованных на твердой матрице поликлональных антител позволили осуществить одноступенчатую очистку термолабильного энтеротоксина и его субъединицы В, в результате которой била достигнута 29-кратная степень очистки ЛТ с выходом продукта 85 % и 104-кратная степень очистки рецепторной субъединицы с конечным выходом 38 %.

6. Емкость сорбента значительно возрастает при использовании в качестве лиганда моноклональннх антител, результатом чего был 100 %-т& выход препаратов IT и его рецепторной субъедянипы с 27- и 43-кратиой степенью очистки соответственно.

7. У очищенных таким образом препаратов голотоксина ж субъединицы В функциональная активность я антигенные свойства сохраняются, что подтверждает биологическое тестирование.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Простота я высокая эффективность представленного в диссертация метода экстракция токсина и субъединяцк В из бактериальной клетки с помощью мочевины могут быть использованы при исследования бактериальных белков.

2. Приведенные в диссертации результаты использования при очистке терколабильного энтеротоксина аффинного сорбента - голубой агарозы, а В-субъединивд - нммуноаффинного сорбента с иммобилизованными моно- и поликлональными антителами к полноразмерному токсину мохут стать основой теоретических исследований данных белков, а тахже служить в качестве исходного материала для создания диагностжкумов я лечебно-профилактических средств при токсикоинфекциях.

СВЕДЕНИЯ 0 ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработанный метод очистки голотоксина на основе голубой агарозы рекомендован х использованию и представлен в лабораторном регламенте по изготовлению реагентов для обнаружения термолабильного экзсэнтеротоксина эшерихий (утвержден директором НИИПЗК имени В.А.Афанасьева, 1991 г.).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I. Давыдова Л.И., Магочедова А.Д., Хохлова O.A., Сивогра-кова И.А. Эффективный метод разрушения бактериачьных клеток для выявления токсигенных штаммов Е.сои//Вопросн ветеринарной биологии:Сб.науч.тр./1|1оск»вет.акад. им.К.И.Скрябина, 1992. С.30-32.