Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Получение моноклональных антител к термолабильному энтеротоксину эшерихий

г, •РОССдааШ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ПУПШОГО ЗВЕРОВОДСТВА И КРОЛИКОВОДСТВА

_имени В. А. АФАНАСЬЕВА_

ДК: 619: 579: (612. 017). На правах рукописи

СЕРЕБРЯКОВ СЕРГЕИ НИКОЛАЕВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТЕРМОЛАБИЛЬНОМУ ЭНТЕРОТОКСИНУ ЭШЕРИХИЙ

16.00. ОЗ.- Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева

Научные руководители: действительный член Междуна-

родной академии информатизации, доктор ветеринарных наук, профессор Емельяненко П.А.

доктор медицинских наук, профессор Вербицкий М.Ш.

Официальные оппоненты:

член - корреспондент Российской академии естественных наук, доктор медицинских наук, профессор Бондаренко В.М.

кандидат биологических наук старший научный сотрудник Серов С.М.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт экспериментальнльной ветеринарии им.Я. .Р.Коваленко РАСХН.

Оо

Защита состоится 99^ в ^часов на заседании специализированно-

го Совета К 020.90.02. гго зашиг^диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в научно-исследовательском институте пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева (140143, Московская обл., Раменский район, пос.Родники, ул.Трудовая, д. 6. Тел. 501-53-55).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан ноября 1998г.

Ученый секретарь специализированного Совета Коспонина H.A.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. К настоящему времени значительно озрос уровень знаний о природе патогенности микроорганизмов-озбудителей заболеваний человека и животных. Одним из основных (акторов патогенности бактерий является их способность продуцировать оксины.(Вертиев Ю.В.,1991,1996; Celemín С.,1995). Этой способностью бладают многие грамотрицательные бактерии. В настоящее время обь-ктом исследований ученых являются роды Vibrio, Shigella, Salmonella, roteus, Clostridium, Campylobacter, Yersinia, Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella (Бондаренко B.M., 1997). Одним из основных возбудителей иарейных заболеваний, широко распространенных среди людей, сель-кохозяйственных животных и, в частности, пушных зверей являются нтеротоксигенные эшерихии. Из 1 миллиарда ежегодно заболевших де-ей 3 миллиона умирают (Chavasse D.C.,1994). Неблагополучной по зше-ихиозам остается статистика и в ветеринарии, где регистрируется до 0% случаев заболеваемости (Nunos М., 1996).

На долю эшерихий и других энтеробактерий приходится до 70% осемененных патогенной микрофлорой кормов и патматериала от пуш-[ых зверей. До 50% выявленных эшерихий несут детерминанты, обу-ловливающие их LT и ST энтеротоксигенность (Smeth N.W. et. al., 1967, daas R. et. al., 1985). Серьезную тревогу у медиков и ветеринаров вызывает ситуация с распространением энтерогеморрагических эшерихий и [риобретение ими новых сочетаний инфекционных свойств (Пайков Í.A.,1994; Blanco I.E.,1996; Ратинер Ю.А. и др., 1998). Нередко характер заболевания зависит не столько от вида микроорганизма, участ-

вующего в инфекционном процессе, сколько от типа токсина, который он продуцирует. В данном случае речь идет о термолабильном (LT), термостабильном (ST) и шига-подобном энтеротоксинах, из которых доля термолабильного энтеротоксина в острых кишечных заболеваниях значительна (Петровская В.Г., 1990).

Поскольку токсикоинфекции, обусловленные различными представителями семейства энтеробактерий, наносят серьезный ущерб сельскому хозяйству и звероводству в том числе ( Сидоров М.А., 1984, Новак Д.Д., 1995), весьма актуальной задачей является борьба с ними.

Серьезная роль в борьбе с токсикоинфекциями отводится ранней диагностике. Несмотря на то, что показана связь серогруппы с определенными типами продуцируемых энтеротоксинов, нет четкой корреляции между продукцией энтеротоксинов и наличием определенных соматических (О) и капсульных (К) антигенов у эшерихий (Полякова O.A. и др.,1986). Исходя из этого, целесообразным представляется определение непосредственно токсинов. К сожалению, до настоящего времени простых и достаточно надежных методов детекции токсинов не разработано.

Недостатков, присущих биологическим методам, лишены имму-нохимические методы определения энтеротоксинов, основанные на применении специфических антитоксических сывороток. Оптимальной, на наш взгляд, является разработка иммуноферментных тест-систем для детекции токсинов. Идеальным инструментом для создания подобных методов индикации энтеротоксинов эшерихий являются моно-клональные антитела (мкАт). В последние годы за рубежом появились публикации о создании гибридом, продуцирующих моноклональ

je антитела к LT и ST энтеротоксинам эшерихий. Разработаны также ердофазный ИФА метод для определения STa энтеротоксина на основе сАт (Thompson М., 1984) и тест-системы для определенияЬТ и СТ энте-ггоксинов (Germani Y., 1984). Получены также мкАт к адгезину К99 lilis К., 1984) и на их основе создан препарат для лечения диареи телят üaper В. et al., 1996). Данных о ИФА тест-системах на основе мкАт для феделения термолабильного энтеротоксина эшерихий на момент вы-тнения данной работы в доступной нам литературе сообщений не най-¡но.

Цель исследования. Целью настоящего исследования является поучение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к различим типам термолабильного энтеротоксина эшерихий и использование кАт для разработки иммуноферментной тест-системы с целью детекции Г энтеротоксина в объектах ветнадзора.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следую-,ие конкретные задачи:

1. Отработать оптимальные условия гибридизации.

2. Создать гибридомы, продуцирующие мкАт к термолабильному {теротоксину эшерихий.

3. Изучить основные свойства полученных мкАт (специфичность, зоэлектрическая точка, аффинность, субкласс иммуноглобулинов, элек-юфоретическая подвижность).

4. Разработать на основе полученных мкАт иммуноферментную гст-систему для качественного определения термолабильного энтеро-эксина эшерихий.

Научная новизна исследования. Новизна настоящего исследования состоит в том, что получен уникальный набор мкАт против ЬТЪ, подробно исследована специфичность полученных мкАт. Данные мкАт были использованы для разработки оригинальной иммуноферментной тест-системы для качественного определения термолабильного энтеро-токсина эшерихий.

На основе полученных мкАт показана возможность очистки термолабильного энтеротоксина из лизатов продуцентов 1.Т на иммуносор-бентах (Давыдова Л.И., 1998).

Практическая ценность работы. Данная работа может служить методологической основой для создания и характеристики мкАт против различных вариантов термолабильного энтеротоксина и использования их в тест-системах для определения соответствующих антигенов в объектах ветнадзора.

Практическая ценность состоит в том, что на основе полученных мкАт разработана иммуноферментная тест-система для качественного определения термолабильного энтеротоксина эшерихий. По сравнению с широко используемыми биологическими пробами настоящая тест-система специфична, высокочуствительна, воспроизводима, что позволяет использовать ее для массового определения термолабильного энтеротоксина в объектах ветнадзора.

Полученные мкАт можно использовать для разработки новых прогрессивных технологий выделения и очистки препаратов энтероток-синов с целью практического их применения в сельском хозяйстве, в т.ч.

звероводстве, а также для создания стандартов энтеротоксинов для исследовательских целей.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

- создание гибридом, продуцирующие мкАт к различным типам термола-Зильного энтеротоксина эшерихий;

- получение и характеристика мкАт к [.ТИ;

■ разработка на основе полученных мкАт иммуноферментной тест-:истемы для качественного определения 1_Т эшерихий в лизатах.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены на:

-Секции пушного звероводства РАСХН (НИИПЗиК им. В.А.Афанасьева, 1998);

-Научной сессии Россельхозакадемии "Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки в России" ( 1998); Межлабораторном заседании сотрудников НИИПЗиК им. В.А. Афанасье-5а (1998);

■Методкомиссиях отдела им. НИИПЗиК им. В.А. Афанасьевав процессе зыполнения работы (1991-1997).

Объем и структура диссертации. [Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста, иллюст-)ирована 28 таблицами, 16 рисунками, 4 фотографиями. Работа состоит 13 введения, обзора литературы^ материалов и методов исследования, ре-¡ультатов исследований, обсуждения результатов, выводов, списка лите-)атуры, приложений. Указатель цитируемой литературы включает 263 1сточника, в том числе 209 иностранных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования В работе использованы 250 мышей линии Balb/c, 4 кролика, мие-ломные клеточные линии Х63-Ад8.653. и SP2/0-Ag14. Получение гибридом, продуцирующих мкАт, велось по методике, приведенной в обзорной работе (Fazekas de St., Groth S., Schneidegger D. 1980).

В качестве антигенов (AT) служили Lib , LTp и холероген, предоставленные НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи и LT-B, LTh и LTp, полученные в НИИПЗиК им. В.А.Афанасьева.

Вся работа выполнена на мышах линии Balb/c. Животные были иммунизированы внутрибрюшинно по следующей схеме:

День 1 14 28 38 54 59

Количество 100 50 50 взятие 100 слияние

АГ ( мкг) в ПАФ вНАФ вНАФ крови в ЗФР

Убой животных осуществляли после предварительной дачи эфирного наркоза.

Успешное слияние клеток и получение первичных клонов является ключевым моментом гибридомной техники. Мы работали с раствором ПЭГ( 45% ПЭГ+10% ДМСО в ЗФР )> рН которого был доведён до 8,08,2. Для получения препаративных количеств мкАт гибридомные клетки выращивали в асцитной форме в мышах Ва1Ь/с. МкАт очищали из ас-цитной жидкости методом высаливания сульфатом аммония с после

(ующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. С помо-цью электрофореза в полиакридамидном геле (ПААГ) и изоэлектриче-:кого фокусирования в ПААГ охарактеризовали полученные мкАт

При тестировании первичных культур мы и использовали непрямой ИФА на различных типах термолабильного энтеротоксина эшери-сий. Это позволило отобрать гибридомы, продуцирующие мкАт к раз-1ичным эпитопам соответствующих токсинов.

Оптимальные мкАт для создания тест-системы были отобраны на ¡снове данных, полученных в серийных опытах двуцентрового связыва-1ия пар мкАт с токсином. При характеристике мкАт этим путем опреде-1или для каждого моноклонального антитела оптимальные условия по-:адки на пластик. Константу связывания мкАт определили с помощью 4ФА(Веайу т, Веайу ЭБ., У\асоъ 1987).

Изотип полученных мкАт определяли с помощью непрямого че--ырехслойного ИФА и с помощью двойной иммунодиффузии по Ухтер-гони. Специфичность полученных моноклональных антител определяли ; помощью различных типов ЬТ эшерихий. Эпитопную принадлежность лкАт выясняли с помощью серийных опытов по двуцентровому связыва-1ию мкАт с соответствующими токсинами. Для этих опытов и для разра-5отки ИФА-тест-системы конъюгировали мкАт с пероксидазой хрена ПХ) (ТцББеп Р.,1984).

Результаты исследования и их обсуждение Главной целью, задачей и результатом настоящей работы явилось юлучение гибридомных клеточных линий, продуцирующих мкАт против

ЬТЬ эшерихий. Исследовали в первую очередь те свойства мкАт, которые определяют возможность использования их для разработки диагностических тест-систем (специфичность, способность связываться с ащ-игеном в растворе, условия посадки на пластик, взаимное расположение эпито-пов, против которых направлены мкАт).

Такие свойства мкАт, как изоэлектрическая точка, константа связывания с различными вариантами ЬТ, точное положение эпитопов на молекуле антигена имеют второстепенное значение для разработки тест-системы.

В результате слияния клеток миеломной клеточной линии Х63-А£.653 со спленоцитами мышей Ва1Ь/с, иммунизированных 1ЛЪ, были получены 25 первичных культур гибридомных клеток, продуцирующих антитела против термолабильного энтеротоксина эшерихий.

Положительные клоны были получены только при слиянии через 72 часа после последней инъекции антигена. При слиянии через 96 часов после последней инъекции ЬТИ положительные клоны не появились.

Мы полностью отказались от тестирования первичных культур с помощью РИА, так как не нашли различий в результатах тестирования первичных культур после гибридизации для получения мкАт против ЬТИ методом РИА или напрямым ИФА. Использование РИА при первичном тестировании дает представление об относительной аффинности антител полученных клонов при сравнении процента связавшихся токсинов в зависимости от клона. С помощью непрямого ИФА при нанесении антигена для тестирования в оптимальной концентрации исследователь не получает представления об относительной аффинности антител исследо

ванных клонов, поскольку оптическая плотность в этих условиях отражает количество антител, а не их аффинность (Griswold W. R.,1987).

Для получения информации об относительной аффинности исследуемых антител необходимо их дополнительно тестировать при субоптимальной концентрации антигена (Steward М. W., Lew A.M., 1985). Мы относительную аффинность не определяли, так как высокоаффинные мкАт могут использоваться в ИФА, а мкАт с низкой аффинностью - при аффинной хроматографии (разработка новых способов очистки токсинов), что тоже является областью перспективного применения полученных нами мкАт.

Для отбора мкАт против разных эпитопов все клоны, которые положительно реагировали с LTh, были тестированы на LT-B, LTp, холеро-ген (см. табл.1).

На основе данных таблицы 1 все первичные клоны гибридомных клеток при исследовании их на наличие AT к перечисленным антигенам по результатам перекрестных реакций были объединены в 4 группы (см .таблицу 2).

Таблица 1.

Результаты тестирования культуральной жидкости первичных гибридных клеток на наличие мкАт, реагирующих с разными антигенами.

Культура Оптическая плотность взаимодействия с

LTh LTp LT-B Холероген

L1 10 0 10 н.и

L2 10 0 10 н.и

L 3 10 0 10 Н.И

L 4 10 0 10 Н.И

L 5 8 0 8 Н.И

L6 8 0 8 8

L7 9 0 9 9

L8 10 10 0 10

L9 10 10 0 9

L10 10 10 0 9

Lll 8 8 0 9

L12 9 9 2 0

L13 8 8 0 8

L14 8 8 0 8

L15 9 9 0 9

L16 4 3 0 4

L17 4 7 0 0

L18 5 8 0 0

L19 5 8 0 0

L20 5 8 0 0

L21 10 0 9 9

L22 8 0 7 8

L23 10 0 0 0

L24 10 0 0 0

L25 9 0 0 0

ЗФР 0 0 0 0

Таблица 2.

Варианты перекрестных реакций первичных культур гибридом-ных клеток с Lib, LTp, LT-B и холерогеном.

Группа Результаты тестирования с №№ Культуры

LTh LTp LT-B Холероген

I + - + - 1-5

II + + - - 8-9,17-20

III + + - + 6-7,13-16

IV + - - - 21-25

+ -положительная реакция - -отрицательная реакция

Из первичных культур 9 были отобраны для дальнейшей работы, клонированы и переведены в асцитную форму (см табл. 3). Для всех из них мкАт были выделены из асцитической жидкости методом высаливания сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией.

Таблица 3

Клоны, использованные для дальнейшей работы

Антиген Клоны

LTh L1,L2,L3,L5,L7,L10,L11,L14,L15.

Все исследованные нами мкАт относятся к изотипу (см.табл4).

Для выяснения взаимного расположения эпитопов и разработки тест-системы мы конъюгировали отобранные мкАт с ПХ и установили оптимальные условия мечения для обеспечения максимальной чувствительности метода определения энтеротоксина.

Используя метод двуцентрового ИФА (см. табл. 5) на молекуле ЬТИ выявили 3 антигенных региона (результаты см. табл. 6).

Таблица 4.

Характеристика некоторых полученных мкАт.

№ МкАт Изотипы р1 Содержание мкАт в ас-цитической жидкости (мг/мл)

1 И 6,8 7,0

2 Ь2 5,8 3,5

3 ЬЗ 6,4 3,6

4 Ь5 6,7 5,4

5 17 1§а 6,4 9,0

б ЫО 1§С1 6Д 7,5

7 L11 IgGl 7,0 5,2

8 L14 IgGl 6,2 6,5

9 L15 IgGl 7,0 6,3

Из таблицы видно, что все мкАт принадлежат к изотипу lgG1. Пары L3 и L7 ; а также L11 и L15 имеют одинаковую изоэлектрическую точку ( 6,4 и 7,0 соответственно). Очевидно, каждая пара является производной одной гибридомы.

Таблица 5.

Результаты определения одновременного взаимного связывания двух мкАт с молекулой LTh методом двухцентрового ИФА.

МкАт, конъ-югированные сПХ L1 L2 «Тве L3 ■рдофазш L5 ле» мкАт L10 L11 L14

L1 - + ++ - ++ ++ +

L2 -н- - + ++ - + ++

L3 + н.и. - + ++ н.и. н.и

L5 - + - - - ++ ++

L10 - ++ ++ + - н.и. н.и.

Ь11 ++ + ++ + + - н.и.

Ь14 + + - ++ - н.и. -

К-> ЬТ11* ++ ++ + + + ++ +

+ - положительная реакция;

++ - резкоположительная реакция;

- - отрицательная реакция;

• - конъюгат кроличьих антител против ЛТч.

н.и,- не исследовано

Таблица 6.

Антигенные регионы на молекуле ЬТЬ, узнаваемые исследуемыми мкАт.

Антигенный регион МкАт Взаимодействие с

I ы,ьз ЬТИ, ЬТ-В

II Ь2,1_5 ЬТЬ.ЬТ-В ,холероген

III 1Л0ДЛ1ДЛ4 ЬТИ, ЬТр,холероген

Мы установили, что первый антигенный регион находится на В-субъединице ЬТИ и мкАт против него (Ь1,ЬЗ) специфично реагируют с цельной молекулой ЬТИ и В-субъединицей 1_Т1п без перекрестных реакций с другими типами ЬТ энтеротоксина эшерихий. Второй антигенный регион находится также на В-субъединице ЬТЬ, но обнаруживается и на молекуле холерогена. Антигенный регион № 3 не обнаруживается на В-

субьединице ЫЪ, но выявляется на цельной молекуле различных типов термолабильного энтеротоксина эшерихий.

Результаты исследований антигенных регионов молекулы ЫИ свидетельствуют о то02м, что полученный набор мкАт против ЫЪ делает возможным создание двухцентровой тест-системы для определения 1_ТЬ без перекрестных реакций с ЬТр и холерогеном. Создание такого диагно-стикума возможно с помощью полученных нами мкАт против эпитопов региона 1. Кроме того существует возможность разработки «сэндвич» метода для определения цельной молекулы ЫЪ, 1_Тр и холерогена.

При разработке тест-систем на основе полученных мкАт мы ориентировались на ИФА. По чувствительности ИФА не уступает РИА, но значительно снижает вредность для исследователя и позволяет визуально учесть результат анализа. Для чувствительности ИФА существенное значение имеет качество конъюгатов и состав субстратного раствора. Поэтому в своих исследованиях мы определили оптимальную концентрацию Н202 и ОФД в субстратном буфере. Это необходимо еще и потому, что оба реактива нестабильны при хранении. Чтобы получить максимальный ответ при минимальной фоновой окраске мы определили оптимальные условия коньюгации с ПХ.

Оптимальные мкАт для создания тест-системы выбирали на основе данных, полученных из серийных опытов двуцентрового связывания с токсином. При характеристике мкАт таким путем определили для каждого антитела оптимальные условия посадки на пластик (см.рис.1).

Рисунок 1.

Результаты определения условий посадки на пластик мкАт L3 и L10.

рН буфера нанесения

—•—L3 —Е-— L10

Разработанная нами ИФА тест-система предназначена для широкого внедрения в ветеринарную практику с целью определения ЦГЬ в ли затах. Тест-система существенно превосходит по чувствительности, специфичности и точности широко используемые в ветеринарной практике биологические пробы (лигированная петля тонкого кишечника, "кожная проба" и др.).

В заключение можно сказать, что цель настоящей работы достигнута. Мы получили и охарактеризовали уникальный набор мкАт против ЦП"), разработали ИФА тест-систему для качественного определения ЦТИ.

I использованием наших мкАт была разработана современная техноло-ия получения очищенных препаратов термолабильного энтеротоксина шерихий (Давыдова Л.И., Козловский Ю.Е. 1998).

ВЫВОДЫ.

. Получены стабильные высокопродуктивные гибридомы, продуцирую-цие мкАт к различным типам термолабильного энтеротоксина эшерихий. '.Положительные клоны были получены через 72 часа после последнего ведения антигена с использованием 45% ПЭГ 4000 в ЗФР рН 8.0-8.2. ¡. Селекционированные после слияния клеток миеломной клеточной лиши Х63-А§8.653 со спленоцитами мышей Ва1Ь/с, иммунизированных (ельной молекулой ЬТИ получены 25 первичных культур гибридных кле-•ок, продуцирующих мкАт против 1_Т эшерихий. 11 первичных культур (тобраны для дальнейшей работы, клонированы и переведены в асцит-[ую форму.

к МкАт, продуцируемые девятью клонами, выделены из асцитической шдкости путем осаждения сульфатом аммония с последующей ионооб-1енной хроматографией.

!. Для всех девяти мкАт определен изотип. Отобранные мкАт принадлежат к изотипу

6. Полученные мкАт охарактеризованы по ряду параметров специфичность, изоэлектрическая точка, оптимальные условия посадки [а пластик, константы связывания, взаимное расположение зпитопов,

против которых направлены мкАт) и проконтролированы на специфичность на различных типах 1_Т эшерихий.

7. Проведено сопоставление эпитопной специфичности мкАт против ЬТИ и их перекрестной реактивности с ЬТр и холерогеном.

8. С помощью полученных мкАт на молекуле ЬТЬ было выявлено 3 антигенных региона.

9. Первый антигенный регион находится на В-субъединице ЬТЬ и мкАт против него специфично реагируют с молекулой ЬТЬ и В-субъединицей ЬТИ без перекрестных реакций с другими типами ЬТ энтеротоксина эшерихий. Второй антигенный регион находится также на В-субъединице ЬТЬ, но обнаруживается также на молекуле холерогена. Антигенный регион №3 не обнаруживается на В-субъединице ЬТЬ, но выявляется на цельной молекуле различных типов термолабильного энтеротоксина эшерихий.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ На основе полученных мкАт разработана иммуноферментная тест-система для качественного определения ЬТ эшерихий в лизатах.

Данные диссертации использованы при написании нормативно-технической документации по изготовлению и применению диагности-кума для иммуноферментного определения термолабильного энтеротоксина эшерихий (утверждены секцией пушного звероводства РАСХН, протокол №3 от 20.05.1998г.).

С использованием полученных мкАт разработана современная технология получения очищенных препаратов ЬТ эшерихий.

:ПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Серебряков С.Н. и др. Получение гибридом, продуцирующих моно-лональные антитела к различным вариантам термолабильного энтеро-оксина эшерихий./УНаучная сессия Россельхозакадемии "Состояние, роблемы и перспективы развития ветеринарной науки в России" (к 100-етнему юбилею ВИЭВ): Сб.науч.тр ./ ВИЭВ, 1998.

2. Козловский Ю.Е., Серебряков С.Н. и др. Сравнительный анализ ффективности различных методов индикации токсигенной микрофлоры. Научная сессия Россельхозакадемии "Состояние, проблемы и перспек-явы развития ветеринарной науки в России" (к 100-летнему юбилею ИЭВ): Сб.науч.тр ./ВИЭВ, 1998.

3. Серебряков С.Н. и др. Создание гибридом и анализ секретируемых ми моноклональных антител к различным вариантам термолабильного знтеротоксина эшерихий. //Международная научно-практическая кон-еренция"Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными экзотическими болезнями животных".(К 40-летию Всероссийского НИИ гтеринарной микробиологии и вирусологии): Сб.науч.тр./ Покров, 1998.

4. Козловский Ю.Е., Серебряков С.Н. и др. Сравнительный анализ ффективности различных методов индикации токсигенной микрофлоры. Международная научно-практическая конференция"Диагностика, про-илактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями ивотных".(К 40-летию Всероссийского НИИ ветеринарной микробиологи и вирусологии): Сб.науч.тр./Покров, 1998.

5. Емельяненко ПЛ., Козловский Ю.Е., Серебряков С.Н. и др. Токсикозы пушных зверей бактериальной этиологии.//Ж. Пушное звероводство, и кролиководство./Москва, 1998.

6. S. Serebryakov et al. Reception and analjsis of monoclonal antibodies to various variants of heat-labile enterotoxine of Escherichia II The international veterinary immunology symposium./ New Delhy., nov.1998.