Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Способ получения и биологические свойства конъюгированного энтеротоксина Е. со II

УКРАИНСКАЯ АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК

ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи СУХАРЕВ Юрий Станиславович УДК 619:579.842.11:616—098:636.2

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОНЪЮГИРОВАННОГО ЭНТЕРОТОКСИНА Е. со II

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Харьков — 1992

Работа выполнена в лаборатории изучения болезней молодняка Украи£ ского научно-исследовательского института экспериментальной и клиническо ветеринарной медицины.

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук Г. В. Гнатенко.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук А. И. Завирюха, (ИВЛ' УААН), кандидат биологических наук, старши научный сотрудник В. Г. Скибицкий (УСХА).

Ведущая организация — Харьковский зооветеринарный институт.

в /О часов на заседании специализированного совета прр Украинском научно-исследовательском институте экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН (310023, Харьков, ул. Пушкинская, 83, ИЭКВМ УААН).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Украинского научно-исследовательского института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины.

1993 г.

Защита диссертации состоится «Д/ »

Автореферат разослан

»

1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета

Г ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

Одним из наиболее распространенных и наносящих огромный экономический ущерб животноводству, среди инфекционных заболеваний новорожденных телят, поросят и ягнят является коли-бактериоз (Вышелеский С. Н., 1936; Архангельский И. И., 1951; Подкопаев В. М., Шишков В. П., 1967; Коляков Я. Е. и соавт., 1970; Полякова О. А., 1976; Поляков H. Е., 1978).

Колибактериоз протекает в септической и энтеритной формах и вызывается энтеротоксигенными штаммами Е. coll (Вышелеский С. Н., 1935; Улепдеев А. И., 1968; Feyel Н„ 1962). Болезнь регистрируют в раннем неонатальном периоде, ее возникновение и тяжесть течения тесно связаны с нарушением санитарно-гигиенического и противоэпизоотического режима, необычайно высоким уровнем колонизации-слизистой оболочки кишечника вирулентными штаммами Е. coll (Smith H., Halles H., 1967), a также с измененной реактивностью и физиологической незрелостью защитных механизмов новорожденных телят (Зароза В. Г., 1991).

Ведущими патогенетическими факторами при энтеротоксичес-кой форме колибактериоза телят, поросят и ягнят являются термолабильный (Kohler Е., 1971) и термостабильный (Smith H., Halles H., 1965) энтеротоксины, продуцируемые энтеротоксигенными штаммами Е. coll.

Работами отечественных и зарубежных исследователей установлено, что культуры Е. coll, выделенные от телят, поросят, ягнят, козлят и реже крольчат, продуцируют термостабильный, термолабильный или одновременно оба энтеротоксина. При этом чаще выделяются штаммы Е. coll, продуцирующие термостабильный энтеротоксин (Гнатенко Г. В., 1974; Евглевская Н. И., Полякова О. А., Соколова Н. А., 1987; Зароза В. Г., 1991).

Иммунизация животных термолабильным энтеротоксином вызывает у них антитоксический иммунитет, давая защиту от патогенного действия эшерихиа коли. Но термолабильный энтеротоксин не обеспечивает иммунологическую защиту против штаммов микроорганизмов, которые продуцируют термостабильный энтеротоксин.

Ранее считали, что термостабильный энтеротоксин не обладает антигенными свойствами, сейчас установлено, что он является гаптеном, т. е. становится иммуногенным в сочетании с носителем, имеющим большую молекулярную массу. После химического связывания термостабильного энтеротоксина с такими белками, как тироглобулин человека, альбумин сыворотки крови крупного рогатого скота или после полимеризации он становится антигенным и вызывает образование антител в организме животных (Van Wynendaell F., 1982). Однако использование таких препа-

ратов не обеспечивает защиты животных от штаммов Ё. coll, продуцирующих термолабильный или одновременно термолабильный и термостабильный энтеротоксины. Создание иммунизирующего препарата, который давал бы защиту против термостабильного и термолабильного энтеротоксинов Е. coll возможно лишь на основе химического связывания (конъюгации) этих энтеротоксинов. ■ ,

В связи с изложенным, весьма актуальным является разработка метода перекрестного связывания 'ГС- и 'ГЛ-энтеротоксинов Е. coll в единый комплекс, в котором 'ГЛ-энтеротоксин сохранял бы свои антигенные свойства, а ТС-энтеротоксин приобретал бы их, причем токсичность обоих токсинов была бы снижена до минимума.

1.2. Цель и задачи исследований

Разработать способ получения иммунизирующего препарата на основе термостабильного и термолабильного энтеротоксинов Е. coll, а также изучить его биологические свойства на лабораторных и сельскохозяйственных животных. Для разрешения ставились следующие задачи:

1. Отобрать штаммы-продуценты энтеротоксинов (термостабильного и термолабильного) и изучить их биологические свойства.

2. Разработать питательную среду для культивирования штаммов, продуцирующих термостабильный энтеротоксин Е. coll.

3. Усовершенствовать методы выделения и очистки термолабильного и термостабильного энтеротоксинов Е. coll.

4. Разработать способ химического связывания (конъюгации) термостабильного и термолабильного энтеротоксинов кишечной палочки.

5. Изучить биологические свойства препарата из конъюгиро-ванных энтеротоксинов Е. coll.

6. Изготовить образцы вакцины и испытать их защитные свойства в лабораторных и производственных условиях.

1.3. Научная новизна работы

Впервые в нашей стране на основе термостабильного и термолабильного энтеротоксинов Е. coll методом одноступенчатого глю-ггаральдегидного сшивания получен новый препарат — конъюги-рованный энтеротоксин Е. coll.

Разработана питательная среда для культивирования штаммов-продуцентов термдстабильного энтеротоксина Е. coll.

Предложен способ получения ТС-энтеротоксина Е. coll.

Усовершенствованы методы выделения и очистки энтеротоксинов кишечной палочки. 2

Установлено, что конъ'йгированныи энтеротоКсин Ё. coll в опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных обладает антигенными и иммуногенными свойствами.

1.4. Практическая ценность работы

Разработан способ получения конъюгированного энтеротоксина Е. со!1 (положительное решение на заявку № 4788233/14 от 27.02.91 г.).

Разработана питательная среда для культивирования штаммов-продуцентов термостабильного энтеротоксина Е. coll. (положительное решение на заявку № 4930440/13 от 30.01.92 г.).

Разработан способ получения энтеротоксина Е. coll (положительное решение на заявку № 4896276/13 от 3.01.92 г.).

Разработана вакцина против колибактериоза сельскохозяйственных животных на основе факторов патогенности возбудителя, в состав которой входит конъюгированный энтеротоксин Е. coll.

1.5. Внедрение

Материалы исследований включены в «Наставление по применению вакцины против колибактериоза сельскохозяйственных животных на основе факторов патогенности возбудителя, ТУ 1009-118-91, «Временную инструкцию по изготовлению и контролю вакцины против колибактериоза сельскохозяйственных животных на основе факторов патогенности возбудителя», утвержденных ГУВ при Госкомиссии по продовольствию н закупкам Совмина СССР от 13.06.91 г.

1.6. Апробация работы

Материалы диссертации доложены на заседаниях Ученого Совета Украинского НИИ экспериментальной ветеринарии в 1989—1992 гг.; научно-практической конференции «Проблемы научного обеспечения животноводства Молдавии» (Кишинев, 1990 г.); Республиканской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина: экономические, социальные и экологические проблемы» (Харьков, .1990 г.); Республиканской научной конференции «Бюлопчш дослщження i перспективи ïx розвнтку» (Львов, 1990 г.); Всесоюзной научной конференции «Повышение продуктивности и совершенствование мер борьбы с болезнями животных в условиях промышленного животноводства и мелкотоварных хозяйств» (Харьков, 1991 г.).

1.7. Публикация

Основные положения диссертации опубликованы в 8 научных работах.

1.8. Объем й структура диссертации

Диссертация объемом 170 страниц машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.

Список литературы включает 158 источника, в том числе 98 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 38 таблицами, 3 графиками и 4 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть работы выполнена в 1988—1992 гг. в лаборатории изучения болезней молодняка института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины по государственной тематике.

В лабораторных опытах использовали 10 кроликов, 3486 белых мышей, ,695 морских свинок, 188 овец и 86 голов крупного рогатого скота.

Морфологические, тинкториальные и биохимические свойства культур Е. coll из коллекции лаборатории болезней молодняка изучали общепринятыми в микробиологии методами.

Определение О-серотипов производили в пробирочной РА согласно «Наставлению по применению агглютинирующих О-коли сывороток» (утверждено ГУВ МСХ 16 июня 1980 г.), с 24 типовыми О-сыворотками.

Вирулентность культур Е.coll изучали путем введения интра-перитонеально смыва суточной агаровой культуры (500 млн. микроб. тел).

Способность культур Е. coll продуцировать энтеротоксины определяли путем проверки летальной активности надосадочной жидкости 18—20 часовой культуры.

В тесте лигиррванной петли кишечника кроликов и телят (Улендеев А. И. и соавт., 1971; »De et al., 1956) проверяли энтеро-патогенные свойства культур кишечной палочки и их энтероток-синов.

Исходным материалом для приготовления питательной среды для культивирования штаммов-продуцентов ТС-энтеротоксина служили соли фосфатов, микроэлементы, аминокислоты и витамины.

Очистку нативных энтеротоксинов кишечной палочки производили с помощью сернокислого аммония, ацетона и .метанола с последующей гельфильтрацией на сефадексах G-25 и G-150.

Содержание белка в нативных и очищенных энтеротоксинах определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1950) и с помощью.

спектрофотометра СФ-26 при 260 и 280 нм по методу Варбурга и Христиана (1941).

Антигенные свойства энтеротоксинов эщерихиа коли изучали с помощью реакции диффузной преципитации в агаровом геле по Оухтерлонн (Ouchterlony, 1950) и реакции флокуляции по Району (Ramon, 1924).

Биологическую активность очищенного термолабилыюго энте-ротокспна определяли в тесте отека лап белых мышей по методике, описанной Ю. П. Вартаняи и соавт. (1978), а термостабильного — с помощью теста анальной пробы на мышатах-сосунах (Frantj, 1981).

Конъюгированный энтеротоксин кишечной палочки получали из ТС- и TJI-энтеротоксипов Е. coll методом одноступенчатого глютаральдсгидпого сшивания.

Стерильность и безвредность иммунизирующего образца проверяли согласно требованиям, изложенным в технических условиях по приготовлению гидроокись-алюминиевой формол-тиомер-саловой вакцины против колибактериоза телят.

Вакцина против колибактериоза сельскохозяйственных животных на основе факторов патогенности возбудителя (адгезивных антигенов и конъюгированного энтеротоксина Е. coll) разработана согласно комплексной рабочей программы совместно с сотрудниками ВИЭВ (Э. А. Шегидевич, Н. А. Соколова, Ю. Н. Федопов, Н. И. Евглевская) УНИИЭВ Г. В. Гнатенко, А. Н. Головко, Ю. С. Сухарев) и ГЗВУИИ (Т. К- Курашвили, И. Ф. Михайлова, О. Ш. Лондоридзе, Э. И. Сичинава). Описание методики изготовления вакцинных препаратов не приводим так как она является объектом изобретения.

Иммуногенные свойства конъюгированного энтеротоксина Е. coll проверяли на белых мышах, кроликах, овцах и крупном рогатом скоте, а также на полученном от них приплоде по уровню специфических, антител и защите при экспериментальном заражении и спонтанном колибактериозе.

Антитоксическую гипериммунную сыворотку получали на кроликах массой 2,0—2,5 кг по методике, разработанной в лаборатории болезней молодняка УНИИЭВ.

: Результаты проведенных исследований подвергались статистической обработке (Ракитцкий П. Ф'., 1973).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Отбор штаммов-продуцентов энтеротоксинов Е. coll и изучение их биологических свойств

По морфологическим и тинкториальным свойствам все изученные культуры имели типичные для энтеробактерий свойства.

§

На основании данных, полученных при изучении биохимических свойств, все культуры были отнесены к виду Е. coll.

Серологическое типирование Е. coll позволило определить принадлежность 8 культур к 7 серологическим вариантам: 119, 26, 101, 9, 8, 20, 139.

При испытании культур на вирулентность установили, что

5 культур являлись вирулентными (3—10 ДЛМ), а 3 культуры — слабовирулентными (0—2 ДЛМ).

Проведенные исследования показали, что б штаммов кишечной палочки являлись токсигенными (5—10 ДЛМ), а 2 штамма — слаботоксигенными (0—2 ДЛМ).

При определении энтеропатогенных свойств культур Е. coll на кроликах и телятах установили, что 2 штамма были сильно энте-ропатогенными, а б штаммов — среднеэнтеропатогенными.

При изучении культур на наличие адгезивных антигенов Е. coll в реакции агглютинации на стекле с антиадгезивными гиперим-муниыми антисыворотками у 4 штаммов обнаружен адгезивный антиген К99, остальные типы адгезинов у изучаемых культур не были обнаружены.

Способность культур эшерихиа коли продуцировать гемолизины определяли на кровяном агаре (2% эритроцитов). Выявили, что 5 штаммов продуцировали В-гемолизин, остальные культуры гемолизин не выделяли.

С помощью термотеста удалось определить тип энтеротоксинов Е. coll (термостабильный или термолабильный). Способность продуцировать термостабильный энтеротоксин обнаружили у 2 штаммов Е. coll, термолабильный — у 4- штаммов и 2 штамма кишечной палочки продуцировали одновременно оба типа энтеротоксинов.

Таким образом, в ходе проведенного исследования удалось выделить штаммы Е. coll с максимальной продукцией термостабильного и термолабильного энтеротоксинов кишечной палочки.

2.2.2. Разработка питательной среды для культивирования Е. coll, продуцирующей термостабильный энтеротоксин

Было подтверждено, что традиционные питательные среды, используемые для культивирования штаммов-продуцентов ТС-эн-теротоксина — МПБ, среда Финкельштейна, бульон Хоттингера, среда Альдерете и др.. не обеспечивают достаточно высокого уровня накопления термостабильного энтеротоксина Е. coll.

С целью создания Питательной среды, позволяющей получать большие концентрации микроорганизмов с высоким уровнем экспрессии ТС-энтеротоксина, был произведен подбор солевого раствора, источника белкового питания, имеющего набор аминокислот, которые hç оказывает ингибирующег<? действия нз продукцию

ТС-энтеротоксина Е. coll, и витаминов, стимулирующих токснно-образование.

При отработке оптимального варианта среды было изучено влияние различных количеств этих компонентов на накопление биомассы Е. coll-и экспрессию" бактериями ТС-энтеротоксина.

Культивирование Е. coli, продуцирующих ТС-энтеротоксин, па оптимальном варианте разработанной среды позволило получать концентрации бактериальной массы в 2 раза превосходящие этот показатель па среде Альдерете, тогда как, активность эптероток-сина возрастала в 5 раз (10 ДЛМ).

Сравнительное изучение динамики накопления энтеротоксина на жидких питательных средах: А1ПБ, среде УНИИЭВ № 4, среде Финкельштейна, бульоне Хоттингера и Синтетической среде УНИИЭВ показало, что наиболее интенсивно этот процесс происг ходил на Синтетической питательной среде УНИИЭВ.

Таким образом, разработанная питательная среда является пригодной для культивирования Е. coll, продуцирующих ТС-энте-ротоксин, и по способности потенцировать синтез энтеротоксина превосходит существующие аналоги.

2.2.3. Получение нативных и очищенных энтеротоксинов Е. coll

Для получения нативных и очищенных энтеротоксинов использовали штаммы-продуценты ТЛ- и ТС-энтеротоксннов кишечной палочки.

Из центрифугатов суточных бульонных культур получали на-тивные энтеротоксины, которые проверяли на летальную активность в опытах на белых мышах. Активность ТЛ-энтеротоксина составляла 3—10 ДЛМ, а ТС-энтеротоксина — 3,3 ДЛМ.

Для получения высокоактивных термолабильного и термостабильного энтеротоксинов, Е. coll нативные энтеротоксины подвергали рчистке. '

Лучшие результаты были получены при очистке ТЛ-энтеротоксина Е. coll с помощью сернокислого аммония (65 % насыщение), диализа и гельфильтрации на сефадек'се G-150, а ТС-энтеротоксина —' с помощью целофановых мешочков, сульфата аммония (90 % насыщение) и гельфильтрации па сефадексе G-25.

Результаты электрофореза в ПААГ подтвердили гомогенность очищенных образцов ТЛ- и ТС-энтеротоксннов.

Биологическую активность очищенного ТЛ-энтеротоксина определяли с помощью теста отека лап белых мышей, а очищенного ТС-энтеротоксина в тесте анальной пробы на инфантильных мышатах.

Установили, что наибольшей активностью обладали вторые белковые фракции ТС-энтеротоксина (коэффициент расширения ОД 1 ±0,01) и ТЛ — (коэффициент расширения 65± 1,8).

Таким образом, примененные методы получения и очистки на-тивных TJI- и ТС-энтеротоксинов Е. coll являются наиболее эффективными и экономичными. С помощью этих методов возможно получение высокоактивных очищенных препаратов TJI- и ТС-эн-теротоксинов Е. coll.

2.2.4. Изучение биологических и физико-химических свойств ТЛ- и ТС-энтеротоксинов Е. coll

Для изучения биологических свойств энтеротоксннов проводили сравнительное изучение летальной активности нативных и очищенных ТЛ- и ТС-энтеротоксинов Е. coll в опыте на белых мышах до и после термообработки. Изучали условия формольной детокси-кации ТЛ- и ТС-энтеротоксинов, способность энтеротоксннов диффундировать через полупроницаемые оболочки, наличие у них антигенных, иммуногенных и анафилактогенных свойств.

Проведенные исследования показали, что ТЛ- и ТС-энтеро-токсины Е. coll обладали хорошо выраженной летальной активностью, причем последняя возрастала более чем в 10 раз и после очистки нативных энтеротоксннов. Термообработка ТЛ-энтеро- ' токсина при 65° С в течение 30 минут приводит к -полной потере присущих ему биологических свойств, тогда как ТС-энтеротоксин, прогретый при этой температуре, полностью сохранял свои свойства. Он терял свою биологическую активность лишь после прогревания при температуре 120°С в течение получаса.

Оба энтеротоксина при строго определенных условиях под действием формалина способны переходить в анатоксины.

Установили, что ТЛ-энтеротоксин Е. coll — крупномолекулярное вещество, не проходящее через полупроницаемые оболочки и имеющее молекулярную массу 70000—100000 Д. Он обладает антигенными и иммуногенными свойствами и не обладает анафи-лактогенными.

ТС-энтеротоксин — это низкомолекулярное вещество, свободно диффундирующее через полупроницаемую оболочку и имеющее .молекулярную массу 1000—1200 Д. Он не обладает антигенными, иммуногенными и анафилактогенными свойствами.

Полученные данные свидетельствуют о возможности использования препаратов ТС- и ТЛ-энтеротоксинов Е. coll для создания на их основе конъюгированного энтеротоксина.

2.2.5. Способ получения конъюгированного энтеротоксина Е. coll

Для получения иммунизирующего препарата на основе ТС- и ТЛ-энтеротоксинов Е. coll проводили раздельное культивирование штаммов-продуцентов энтеротоксннов на питательной среде УНИИЭВ. Используя метод центрифугирования, получали натив-ные энтеротоксины, которые очищали с помощью сульфата аммо-

ния, диализа и гельфильтрации на сефадексах: ТС — G-25, а ТЛ — G-150.

Концентрацию белка энтеротоксинов определяли с помощью .спектрофотометра СФ-26 при 260 и 280 нм по методу Варбурга и Христиана.

Гомогенность очищенных энтеротоксинов подтверждали результатами диск-электрофореза в ПААГ с додецисульфатом натрия.

Для проведения конъюгации готовили смесь ТС- и ТЛ-энтеро-токсинов (100:1) и 25 % раствора глютаральдегида (2 г/л) в фос-фатно-солевом буфере. Через 1—2 часа инкубирования с помощью диализных мешочков производили задержку всего конъюгирован-ного энтеротоксина и выделяли не прореагировавший ТС-эптеро-токсин и другие низкомолекулярные вещества. Количество связанного ТС-энтеротоксина в конъюгате определяли по возрастанию количества белка (по Лоури) в диализе сверх количества ТЛ-энтеротоксина, первоначально добавленного в конъюгат.

Максимальный процент содержания ТС-энтеротоксина в конечном конъюгате был при молярном соотношении ТС/ТЛ-энте-ротоксинов 100:1, соотношении глютаральдегид/общий белок 2:1—3:1 и экспозиции 1—2 часа.

Изучение физико-химических и биологических свойств конъю-гированного энтеротоксина показало, что препарат представляет собой слегка опалесцирующую жидкость с рН 8,0—8,2 без резкого запаха. Лиофилизированный конъюгат — это порошок розовато-кремового цвета, гигроскопичный, высокомолекулярный (105000—110000), не диффундирующий через полупроницаемые оболочки, гомогенный, не токсичный, безвредный и не анафилак-тогенный для лабораторных животных.

Выбор штаммов-продуцентов энтеротоксинов Е. coll не оказывал существенного влияния на выход конъюгата.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности получения конъюгата из ТС- и ТЛ-энтеротоксинов Е. coll с помощью одноступенчатого глютаральдегидного сшивания.

2.2.6. Антигенные и иммуногенные свойства конъюгированного энтеротоксина Е. col!

Для изучения антигенных свойств конъюгированного энтеротоксина использовали РДП и реакцию термофлокуляции.

Антитоксические сыворотки получали путем гипериммунизации кроликов конъюгированным энтеротоксином Е. coll. Титры антител в полученных сыворотках в РДП были в пределах 1:16—1:32.

Антитоксическая гипериммунная сыворотка к конъюгату в :РДП с очищенными ТС- и ТЛ-энтеротоксинами образовывали четкие линии преципитации и давали хорошо выраженную реакцию флокуляции (в четыре креста).

Йммуногенные свойства конъюгирова иного энтеротоксина ,Е. coll изучали в опытах на белых мышах, морских свинках, кроликах, овцах и крупном рогатом скоте.

Белые мыши, вакцинированные конъюгированным энтероток-сином Е. coll, в 93,3 % ,случаев были защищены от 2 ДЛМ ТС-энтеротоксина; в 96,6 % случаев — от 2 ДЛМ ТЛ-энтеротоксина гомологичных штаммов, в 83,3 % случаев — от 2 ДЛМ ТС- и в 80 % случаев ТЛ-энтеротоксинов • гетерологичных штаммов эше-рихиа коли.

Мыши вакцинированные конъюгированным энтеротоксином, в 90 % случаев были защищены от 2 ЛД культур гомологичного (ТС) и в 86,6 % случаев — от культуры (ТЛ) гомологичного штаммов Е. coll. В 80,0 % случаев защита составила от 2 ЛД культуры (ТС) и в 86,6 % случаев — от культуры (ТЛ) гетерологичных штаммов Е. coll.

Таким образом, конъюгированный энтеротоксин кишечной палочки обладает антигенными свойствами. В РДП он дает полосы преципитации и флокулят в реакции термофлокуляции с гомологичной антитоксический сывороткой. •

Опыты по изучению иммуногенных свойств конъюгированных энтеротоксинов Е. coll, приготовленных из ТС- и ТЛ-энтеротоксинов штаммов кишечной палочки, выделенных от телят и поросят, показали, что мыши, вакцинированные конъюгатом, приготовленным из ТС-энтеротоксина штамма, выделенного от телят, и ТЛ-энтеротоксина штамма Е. coll, выделенного от поросят, в 90—100 % случаев были защищены от 2 ДЛМ энтеротоксинов гомологичных штаммом кишечной палочки, в 80 % случаев — от 2 ДЛМ энтеротоксинов гетерологичных штаммов Е. coll, в 80— 100 % случаев животные были защищены от 2 ЛД культуры эше-рихиа коли гетерологичных штаммов.

Результаты проверки иммуногенных свойств конъюгата, полученного из ТС-энтеротоксина штамма, выделенного от поросят, и ТЛ-энтеротоксина штамма, выделенного от телят, показали, что в 80—90 % случаев животные были защищены от 2 ДЛМ энтеротоксинов гомологичных штаммов Е. coll, в 70—90 % случаев — от 2 ДЛМ энтеротоксинов гетерологичных штаммов, в 80 % случаев — от 2 ЛД культур гомологичных штаммов и в 70—80 % случаев — от 2 ЛД культур Е. coll гетерологичных штаммов.

Определение защитных свойств конъюгата энтеротоксинов Е. coll на морских свинках показало, что животные в 90—100 % случаев были, защищены от заражения 2 ДЛМ энтеротоксинов. гомологичных и гетерологичных штаммов и в 80—90 % случаев — от 2 ДЛМ культур гомологичных штаммов кишечной палочки.

Разработанный иммуногенный препарат конъюгированных энтеротоксинов Е. coll был использован в качестве составного ком-; понента вакцины против колибактериоза сельскохозяйственных 10

животных на основе факторов патогенности возбудителя, в состав оторой входят и адгезивные антигены.

Иммуногенные свойства вакцины изучали на глубокосуягных 1вцематках и полученных от них ягнятах. В сыворотке крови и юлозиве вакцинированных овцематок титр антитоксических ан-■ител (через 21 день после иммунизации) составлял 2,0—2,2 log2, 1 сыворотке крови полученного от вакцинированных животных тотомства антитоксические антитела обнаруживались (РДП) герез 24 часа после рождения (титр антител — 0,5—1,1 log2). К 3—5 суткам он возрастал (1,5—2,2 log2), а к 10 — снижался до ),5 log2. .

Эксперименты по прямому заражению ягнят, полученных ог 'шмуинзировашгых матерей, токсигенными штаммами Е. colt показали, что все животные были защищены от летальных доз этих культур.

Приготовленные образцы вакцины стимулировали выработку антитоксических антител в сыворотке крови и молозиве (титр антител — 0,5—3,0 logs), вакцинированных глубокостельных коров и в сыворотке крови полученных от них телят (титр антител — 0,5—2,2 logs).

Прямое заражение телят, полученных от иммунизированных матерей, токсигенными штаммами Е. coll выявило, что все животные были защищены от летальных доз этих культур.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о достаточно выраженных иммуногенных свойствах вакцинных препаратов, приготовленных из конъюгированных энтеротоксинов Е. coll, и перспективности их использования в ветеринарной практике.

3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведено путем сопоставления результатов с данными литературы. Статистическая обработка экспериментальных данных подтверждает достоверность полученных нами результатов. Считаем целесообразно для профилактики энтеритной формы коли-бактериоза молодняка сельскохозяйственных животных использовать конъюгированный энтеротоксин Е. coll самостоятельно и в сочетании с адгезивными антигенами.

Результаты наших исследований позволяют сделать следующие основные выводы.

4. ВЫВОДЫ

1. Изучены свойства референтных и эпизоотических штаммов эшерихиа коли и подобраны культуры с высоким уровнем продукции термостабильного (5—10 ДЛМ) и термолабильного (3—10 ДЛМ) энтеротоксинов.

И

1. Разработана питательная среда для культивирования штаммов-продуцентов термостабильного энтеротоксина Е. coll, которая дает возможность накапливать в 2 раза большие концентрации микроорганизмов с высоким (5—10 ДЛМ) уровнем экспрессии токсинов (положительное решение на заявку № 4930440/13 от 30.01.92 г.).

3. Усовершенствованы методы получения и очистки термостабильного и термолабильного энтеротоксинов. По своей активности на биологических моделях эти препараты^ превосходили нативные энтеротоксины более чем в 10 раз (положительное решение на заявку № 4896276/13 от 3.01.92 г.).

4. Разработан способ получения конъюгироваиного энтеротоксина Е. coll из очищенных термостабильного и термолабильного энтеротоксинов, методом одноступенчатого глютаральдегидного сшивания (положительное решение на заявку № 4788233/14 от 27.02.91 г.).

5. Конъюгат энтеротоксинов обладает выраженными антигенными и иммуногенными свойствами обеспечивающими защиту привитых животных от летальных доз энтеротоксинов и культур гомологичных и гетерологичных штаммов Е. coll. Со специфической антитоксической сывороткой в РДП он дает полосу преципитации, а в реакции термофлокуляции образовывает флокулят. Гипериммунные антитоксические сыворотки в 80—100 % случаев предохраняли белых мышей от заражения 2 ДЛМ токсинов и 2 ЛД культур гомологичных и гетерологичных штаммов Е. coll. Иммунизированные белые мыши в 93—96 % случаев были защищены от заражения 2 ДЛМ энтеротоксинов и 2 ЛД культур гомологичных и в 80—86 % случаев — от 2 ДЛМ и 2 ЛД культур гетерологичных штаммов Е. coll.

6. Разработанный иммуногенный препарат конъюгирова иных энтеротоксинов Е. coll использован в качестве компонента вакцины против колибактериоза сельскохозяйственных животных в состав которой входят и адгезивные антигены (ТУ 10-09-118-91 Вакцина против колибактериоза молодняка сельскохозяйственных животных на основе факторов патогенности возбудителя, 13.06.91 г.).

7. В сыворотке крови и молозиве вакцинированных глубокосуягных овцематок и глубокостельных коров титр антитоксических антител через 21 день после иммунизации составлял 2,0—3,0 log2; в сыворотке крови новорожденных телят и ягнят антитоксические антитела обнаруживались (в РДП) после первого получения молозива в титре 0,5—1,5 log2, к 5 суткам он был максимальным и составлял 1,5—2,5 log2, а к 10 суткам — снижался до 1,0—0,5 log2.

8. Эксперименты по прямому заражению ягнят ,и телят, полученных от иммунизированных матерей,' токсигенными штаммами Е. coll показали, что все животные были надежно защищены от летальных доз этих культур.

9. Конъюгат энтеротоксинов Ё. coíl, через 24 часа после перо-ального его применения, защищал новорожденных телят и белых ышей от летальных доз культур и энтеротоксинов эшерихна оли.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Способ получения конъюгироваиного энтеротокснна Е. coll положительное решение на заявку № 4788233/14 от 27.02.91 г.).

2. Способ получения конъюгироваиного энтеротоксина Е. coll положительное решение на заявку № 4896276/13 от 25.12.91 г.).

3. Синтетическая питательная среда для получения термоста-ильного энтеротоксина Е. coll (положительное решение на заявку [Ь 4930440/13 от 30.01.92 г.).

4. Нормативно-техническая документация на опытно-промыш-енную партию вакцины против колибактериоза сельскохозяй-твенных животных на основе факторов патогенности возбудителя Временное Наставление по применению, ТУ-10-09-118-91 и Ин-трукция по изготовлению и контролю вакцины против колибакте-иоза сельскохозяйственных животных на основе факторов пато-гнности возбудителя, утвержденных 13.06.91 г. ГУ В при Госко-иссии по продовольствию и закупкам Совмина СССР. Разработка ыполнена в соавторстве с ВИЭВ и ГЗВУИИ.

i

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сухарев 10. С. Иммуногенные свойства энтеротоксина эшерихиа кол // Проблемы научного обеспечения животноводства Молдавии: Тез. докл. Peí пуб. конф., Кишинев, 25 мая 1990 г. — С. 132.

2. Сухарев Ю. С. Вивчення ¡муногенних властивостей кон'югованного енп ротоксину Е. coll // 1 Респуб. наук. конф. 16—18 жовтня 1990 р.: Бюлопч] дослщження i перспективи ix розвитку. Тез. допов. — Льв1в. — 1990. — С. 10

3. Сухарев Ю. С. Создание экономически эффективных средств профила! тики колибактериоза телят в решении задач животноводства // Ветеринарная м< дядина, экономические, социальные и экологические проблемы: Тез. докл. Pecnyi конф. 20—22 ноября 1990 г. — Харьков. — С. 304.

4 Сухарев Ю. С. Ускоренный метод очистки термостабильного энтерото! сина Е. coll // Всееоюз. науч. конф. Повышение продуктивности и соверши ствование мер борьбы с болезнями животных в условиях промышленного Ж1 вотноводства и мелкотоварных хозяйств. — 17—21 сентября 1991 г. — Xapi ков, —С. 148..

5. Сухарев Ю. С., Воробьева Н. Д. Определение анафнлактогенных свойст энтеротоксинов Е. coll // Всесоюз. науч. конф.: Повышение продуктивности совершенствование мер борьбы с болезнями животных в условиях промышлеь ного животноводства и мелкотоварных хозяйств. — 17—21 сентября 1991 г. -Харьков. — С. 148.

6. Гнатенко Г. В., Сухарев Ю. С. Способы очистки энтеротоксинов Е. со // Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка с.х. животных Рес пуб. науч.-произв. конф. — Витебск 12—13 сентября 1990 г. — Минск. — 1990,-С. 39-40.

7. Сухарев Ю. С., Гнатенко Г. В. Иммуногенные свойства препарата и конъюгированных энтеротоксинов Е. coll // Ветеринария. — № 2. — М. -1992. - С. 27—30.

8. Гнатенко Г. В., Сухарев Ю. С. Способ получения конъюгированного эк теротоксина Е. coll // Изобретения. Официальный патентный бюллетень. -

№ 29. — 1992.