Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунохимическая идентификация В-энтеротоксинобразующих стафилококков, выделяемых из секрета вымени коров

Увеличение производства продуктов животноводства и улучшение их качества является одной из важнейших задач сельского хозяйства1.

На ХХУТ съезде КПСС и майском 1982 года Пленуме ЦК КПСС Коммунистическая партия и советское правительство поставили перед работниками сельского хозйства задачу более полного удовлетворения возрастающих потребностей населения в продуктах питания, в том числе и в молоке, В постановлении ЦК КПСС указывается на необходимость повышения качества молока^Получение высококачественного в санитарном отношении молока, увеличение его надоев возможно лишь при осуществлении широких ве-теринарно-санитарных мероприятий на молочных фермах и внедрении в практику ветеринарии эффективных методов контроля качества молока^;Молоко коров может содержать разнообразную микрофлоруМик* робы попадают в молоко непосредственно из воспалённой молочной железы, с кожного покрова животных, из окружающей среды1.

Наиболее распространённым заболеванием молочных коров явля** ется мастит; В настоящее время уровень заболеваемости коров маститами достаточно высок* Широко распространены маститы стафилококковой природы, протекающие в острой и субклинической формах*; Основным этиологическим фактором маститов служат патогенные микроорганизмы стафилококки.

Одной из первых работ, посвященных обнаружению стафилококков в сыром молоке, была работа Williams w. (1941)5. Он обследовал животных десяти стад и обнаружил, что более 50$ коров выделяют ста« филококки с молоком.

Работами других авторов (Байрак В1.А., 1970; Anderson J.c.,1976; BuddleB.М. Cooper M.G. 1978} Laerte P. 1980) также доказано присутствие в молоке патогенных стафилококков**По данным Мутовина В.И. (1974), стафилококковые маститы в последние 10-15 лет регистрируются гораздо чаще, чем маститы стрептококковые и другой этиологии1.

Часто стафилококки, выделяемые из вымени коров, обладают энтеротоксигенными свойствами. В основе энтеротоксигенности лежит способность образовывать энтеротоксины, вызывающие тяжёлые пищевые отравления у людей. Поэтому молоко, обсеменённое энтеротоксигенными стафилококками, особенно опасной Выпаивание такого молока молодняку сельскохозяйственных животных приводит к различным расстройствам желудочно-кишечного тракта.

В настоящее время известны шесть типов стафилококковых эн-теротоксинов - А, В, С, Д, Е, у. Среди них наиболее распространены энтеротоксины типов А, В, С.

Буткус К. Д. с соавт. (1978) установили, что из 28 патогенных стафилококков, выделенных из молока коров с субклиническими формами маститов, 13 штаммов вырабатывали энтеротоксин только типа В, 3 - типов А и В и I штамм - только типа А.

Волович Н.И1. с соавт, (1974) была изучена распространённость стафилококков, продуцирующих энтеротоксины типов А и В. Штаммы, продуцирующие энтеротоксин В, выделялись в три раза чаще, чем стафилококки, продуцирующие энтеротоксин А, и в два раза чаще, чем штаммы, продуцирующие оба энтеротоксина. Процент В-энтероток-сигенных штаммов стафилококков, выделенных из испражнений детей, больных острыми кишечными расстройствами, был равен 29,9% против 4,1% А-энтеротоксигенных штаммов. При вспышках пищевых отравлений выделялись стафилококки, продуцирующие оба типа энтеротоксина, причём количество А- и В-энтеротоксинобразующих было равным(14,6%). В исследованиях Акатова А.К. с соавт. (1980) установлено преобладание продуцентов энтеротоксина А среди штаммов, выделенных при пищевых токсикоинфекциях.

Энтеротоксин типа. В служит причиной пищевых отравлений, связанных с молоком. Высокий удельный вес В-энтеротоксигенных штаммов среди выделенных от больных острыми кишечными заболеваниями детей позволяет предположить вероятное значение энтеротоксина В в патогенезе этих заболеваний.

Все цроводившиеся ранее исследования данного типа стафилококковых энтеротоксинов связаны с медицинской, практикой.

Поэтому перед нами была поставлена цель провести иммунохи-мическую идентификацию В-энтеротоксинобразующих стафилококков, выделяемых из секрета вымени коров. Для достижения этого было не* обходимо решить следующие задачи :1. Получить очищенный препарат стафилококкового энтеротоксина типа В ;2. приготовить антиэнтеротоксическую сыворотку к полученному препарату энтеротоксина типа В ;3. обследовать коров на мастит, выделить культуру стафилококков и проверить возможность образования ими энтеротоксина типа В ;4. определить условия иммунохимической идентификации стафилококкового энтеротоксина типа В в молоке•Новым в диссертации является разработка упрощённого, трёх-этапного способа очистки энтеротоксина типа В, получение впервые в отечественной ветеринарной практике диагностической стафилокок* ковой антиэнтеротоксической сыворотки.к токсину, тица В, изучение возможности.проведения, иммунохимической.идентификации В-энтеро-токсинобразующих стафилококков, выделяемых из секрета вымени коров.

На защиту выносится экспериментальное обоснование полученияочищенного препарата стафилококкового энтеротоксина типа В, приготовления-антиэнтеротоксической сыворотки, возможности проведения иммунохимической идентификации В-энтеротоксинобразующих стафилококков, выделяемых из секрета вымени коров*2;. О Б 3 О Р ЛИТЕРАТУРЫ2,Д*# Роль стафилококков в этиологии маститов коровЗаболевания молочной железы коров (маститы) наносят большой ущерб животноводству, который слагается из потерь молока от больных и переболевших животных, ухудшения качества молочных продуктов, а также из вынужденного убоя больных животных.

В большинстве случаев маститы возникают вследствие проникновения патогенных бактерий в молочную железу через каналы сосков и последующего их размножения?.

Способность стафилококков проникать в глубоко лежащие ткани вымени, устойчивость к лекарственным веществам, широкая распространённость в окружающей среде ставит их на первое место среди многообразия микробов, участвующих в этиологии маститов*. Поэтому в последние годы стафилококковые маститы достигли широкого расп** ространения. Мутовиным ВШ;. (1974, с.56) установлено, что в 80$ случаев при клинических и субклинических маститах обнаруживаются стафилококки и стрептококки'. Шатохин Н.Г. (1971) таквге утверждает, что среди различных клинических форм маститов патология ста филококковой этиологии; занимает наибольший удельный вес*Стафилококковые маститы коров протекают по-разному. В одних случаях отмечается яркое проявление клинических симптомов (клинически выраженный мастит), в других - местные клинические признаки не проявляются (субклинический мастит)5.

По данным Мутовина В.Ш. (1974, с.92} клинически выраженные маститы отмечаются редко и составляют около 20$ от общего количества болезней вымени»Субклинические формы маститов вследствие своего латентного протекания часто остаются незамеченными и вымя больных коров становится источником инфицирования молока стафилококками и другимимикроорганизмами, присутствующими в вымени. Поэтому скрытые формы маститов представляют наибольшую опасность в ветеринарно-сани-тарном и эпидемиологическом отношениях»Степанов Б.А. (1967), Шатохин Н.Г. (1969), Ивашура А.И. (1972), Даниленко И.П. (1978) и другие выделяли патогенные стафилококки, в основном, от коров, больных субклиническим маститом', Падегимасом Т.И. (1968) было выделено 129 штаммов стафилококков, из которых 118 культур было выделено из молока больных скрытым маститом коров,Бияшев К. (1971) отмечает, что из 674 штаммов стафилококков, 386 штаммов выделены от коров с субклиническим маститом1.

Высокий процент выделения стафилококков из молока при субклиническом мастите отмечает и Загаевский И.О. (I978XКарташёва В.М. (1980) подтверждает, что наиболее часто пато* генная микрофлора выделяется из молока при субклиническом мастите (66,2$).

Стафилококковые маститы привлекают особое внимание как исследователей, так и практических работников, поскольку стафилококки, вызывающие указанную патологию, часто обладают энтероток-сигенными свойствами и продуцируют опасные для человека и животного энтеротоксины.

Если учитывать многообразие источников попадания стафилококков в молоко, широкое носительство стафилококков среди животных и людей, то опасность стафилококковых инфекций несомненна'.

Способностью образовывать энтеротоксины обладают 50$ коагу-лазоположительных стафилококков ( Bergdoii M.S. t 1972).Casman E.p. (1965), проверяя энтеротоксигенность стафилококков, выделенных из сырого молока, обнаружил, что 4,2% из 190 культур микробов, обладали способностью продуцировать энтеротоксины типов А и В(;-10 Осташевский А.Г., Образцов В.П. (1967) установили, что стафилококки, обладающие энтеротоксигенными свойствами, чаще (33,3%) обнаруживаются в молоке коров, больных субклиническим маститом и значительно реже (12,3$) в молоке клинически здоровых коров,Карташёвой В!.М!. (1971) был проверен 71 штамм стафилококков, обладавших тремя факторами патогенности * плазмокоагулазной, гемолитической активностями и токсинообразованием. 19 штаммов про« дуцировали энтеротоксин типа А, 6 - типа В, 3 - типа С.

На высокую высеваемость энтеротоксигенных стафилококков, выделяемых из молока больных маститом коров, указывает и Буткус К.Д. с соавт. (1978). Ими также установлено, что штаммы,, выделен^-ные из пастеризованного молока и молочных продуктов, а также из сборного молока, поступающего на молочные предприятия, 7 вырабатывали энтеротоксин типа А, 2 - энтеротоксин типов А и В и 3 штамма не типировались1.

Прослеживается корреляция между типом энтеротоксина и источником выделения токсигенных стафилококков. Штаммы, выделенные из образцов, взятых при пищевых отравлениях, продуцируют, как правило, энтеротоксины А и Д ; штаммы, изолированные из клинических образцов, продуцируют преимущественно энтеротоксин типа В;. Среди штаммов, изолированных в случаях маститов коров, преобладают продуценты энтеротоксинов С и Д ( Швкапеп А. 1977).

Петрас П., Мазкова Л. (1980) было изучено распределение энтеротоксигенных штаммов стафилококков в зависимости от исходного материала.Наиболее часто встречался энтеротоксин А - в 34,5$ случаев, а затем в нисходящем порядке энтеротоксины С, Д, В (они составили 54,8% штаммов). В клиническом материале штаммы, образующие энтеротоксин встречаются на одну треть чаще (53,5%), чем в первой группе. Преобладающим типом является энтеротоксин А, его встречаемость в этой группе гораздо выше (58,5%). В группе 131штамма, выделенного из материнского молока, было обнаружено 93,2$ энтеротоксигенных штаммов*.stras в. (1980) исследовала 146 коагулазоположительных стафилококков, выделенных из молока коров, больных маститом. Ed установлено, что 72 штамма, т.е!. 49,3$ обладали способностью образовывать энтеротоксины, Среди 49,3$ энтеротоксигенных штаммов автором обнаружено два типа энтеротоксинов : А (36,1$) и С (44,4$) и АС вместе (19,4$).Lombai G. Janosi l. е.a. (1980) выделили из вымени коров 101 штамм стафилококков и проверили их энтеротоксигенность. Оказалось, что 11$ штаммов продуцируют энтеротоксины.Niskanen А. (1977), исследуя молоко больных маститом коров, выделял штаммы стафилококков и проверял способность их продуцировать токсины. Из 174 штаммов, выделенных из молока, 41$ их оказался способным продуцировать энтеротоксины.Adekeye D. (1980) изучалась продукция энтеротоксина у 194 стафилококковых штаммов, выделенных от животных и человека1. 39$ человеческих биотипов, изолированных от людей, были энтеротокси-генными. Биовары животных, выделенные от людей, не были энтероток-сигенными, но 8,8$ биоваров, изолированных от животных, вырабатывали энтеротоксин.

В то же время, H0chmann н. е.а.(197б) предполагают, что, вероятно, способностью продуцировать энтеротоксины А, В, Cj штаммы var. bovis обладают крайне редко.

По данным Kato е. > Kume т. (1980), энтеротоксигенные стафилококки были обнаружены в 363 случаях (34,4$) из молока 708 коров на 168 фермах 35 префектур Японии. 54,3$ штаммов продуцировали энтеротоксин С, 31,1$ - А, 27$ - Д и 10,7$ - В. Энтеротоксин Е не продуцировался.

В вымя двух коров вводили очищенный препарат энтеротоксина типа А в дозах 10 и 40 мкг в 20 мл аутогенного молока. Через 3 часа после инокуляции появлялись симптомы воспаления - припухлость,•болевая чувствительность. Общие симптомы не отмечались ; локальные симптомы исчезали через 36 часов.

Авторами также был проведен анализ продукции энтеротоксина на различных стадиях инфекции. Штаммы 575 и 581, продуцирующие энтеротоксин типа С, были способны формировать токсин в условиях воспалительной реакции в вымени, энтеротоксин А-продуцирующие штаммы не образовывали токсин в этих условиях.

2.2'. Физико-химические особенности стафилококковых энтеротоксиновСтафилококковые энтеротоксины « это вещества белковой природы, вызывающие пищевые отравления. Они относятся к группе простых токсинов, так как их молекула представляет собой одну поли** пептидную цепь, соединённую внутри дисульфидным мостиком.

Очищенные лиофилизированные препараты энтеротоксинов имеют вид белого гигроскопического порошка, хорошо растворимого в воде и солевых растворах ( Вег§ао11 м.з. е.а., 1974).

Молекулярная масса стафилококковых энтеротоксинов колеблется в пределах 30000 дальтон (Езепчук Ю.В., 1977).

При изучении стафилококковых энтеротоксинов различными электрофоретическими методами установлена их гетерогенность, то есть множественность форм существования токсина с одинаковым молекулярным весом и различными изоточками (см. табл. 2.1). Разные изоформы токсинов характеризуются сходными биологическими и сеТаблица 2Д Некоторые физико-химические показатели стафилококковых энтеротоксиновПоказатели А В С1 с2 ДЕРМолекулярная масса 27800 28366 26000 34100 29600 Изоэлектричес-кая точка 7,26 8,55 8,6 7,0 — 7,0 —Коэффициент седиментации 3,03 2,89 3,0 2,9 - 2,6 Chang P.C. Dickie N. (1971) выявляли у энтеротокси-на типа В четыре формы с изоэлектрическими точками 7,8 ; 8,0 ; 8,25 ; 8,55.

Флуер Ф.С. (1980) получил при фокусировании этого токсина три фракции, концентрировавшиеся при рН 8,0 ; 8,25 ; 8,6.

При изучении энтеротоксина типа А методом изоэлектрическо-го фокусирования бсиапг е.¿г. е.а. (1972) обнаружили несколько форм с различными изоэлектрическими точками (8,14 ; 7,68 ; 7,26 ; 6,64).

Наличие двух форм энтеротоксина типа А с изоэлектрическими точками 7,1 и 6,5, сходных по молекулярной массе и антигенным свойствам, доказал в своих исследованиях Флуер Ф.С. (1980),Характерной особенностью стафилококковых энтеротоксинов является их термостабильность. Известно, что наиболее термоустойчивым является энтеротоксин типа В.

2.3. Биологическое действие энтеротоксиновМеханизм действия стафилококковых энтеротоксинов отличает** ся от механизма действия других бактериальных энтеротоксинов, таких как V.cholerae E.ColiХолерный энтеротоксин и термолабильный■энтеротоксин е. Coli вызывают диарею у людей и домашних животных. В основе механизма действия этих энтеротоксинов лежит их способность активировать аденилциклазу в эпителиальных клетках малого кишечника, что приводит к нарушению секреторного процесса у них и развитию диареи ( Donta S.T. 1975 ; Kantor Н.З. 1974, 1975).

В отличие от вышерассмотренных энтеротоксинов, стафилококковые энтеротоксины обладают иным механизмом действия и в этом отношении, видимо, ближе стоят к нейротоксинам1.

В опытах с ваготомией и симпатикотомией было установлено, что действие стафилококковых энтеротоксинов на рвотный центр происходит через симпатическую и парасимпатическую нервную систему. Рвотный центр находится в четвёртом желудочке продолговатого мозга ( Sugijama H.J. f 1965).

Через парасимпатическую нервную систему действие токсина распространяется на рвотный центр при введении его per os. При внутривенном введении энтеротоксина действие его на рвотный центр осуществляется через симпатическую нервную систему. Для защиты животных от биологического действия токсина необходимо блокировать оба звена (Езепчук Ю.В., 1977).

В лабораторных условиях энтеротоксическая активность стафилококковых энтеротоксинов изучается на кошках и обезьянах.

Все типы стафилококковых энтеротоксинов вызывают сходные клинические признаки отравления. Основными симптомами пищевых отравлений стафилококковой этиологии являются тошнота, рвота, диарея'.

Установлено, что энтеротоксин возбуждает гладкую мускулатуру кишечника и активирует моторику желудочно-кишечного тракта (Столмакова А1959, с.137>.

Работа по изучению данного действия проводились Самсоновым И.Г. (I9BI, 1982). Автором проведено изучение влияния некоторых ингибиторов ферментов энергетического обмена клетки на двигательную активность изолированных полосок кишечника кошки на фоне интоксикации, вызванной стафилококковым энтеротоксином типа В. Результаты опытов показали, что 2,4-динитройенол и сульфат меди потенцируют возбуждающее действие стафилококкового энтеротоксина В на изолированную полоску кишки. Автор склонен предполагать, что усиление мышечной активности в ответ на введённый стафилококковый энтеротоксин В происходит за счёт активации анаэробного пути окисления.Sullivan R, (1969) изучил влияние очищенного энтеротоксина В на перенос веществ через мембрану в кишечнике. Им установлена значительная задержка переноса воды, натрия, калия, хлора, глюкозы и лактатов** Перенос поваренной соли был снижен в большей )степени, чем натрия, калия, глюкозы, что привело к выделению её, а не к ожидаемому всасыванию;Экспериментальное введение стафилококкового энтеротоксина типа В собакам в тощую кишку, обезьянам непосредственно в желудок приводит к острому энтериту с отёком, гиперемией и изяязвле-ниями в слизистой оболочке двенадцатиперстной и тощей кишок, красширению лимфатических узлов, образованию язв ( warren s.E. е.а., 1964 JKocandrle V. е.а., 1966 ; Merrill S.G. И Spring Н., 1968 ; Sheehan D.G. е.а., 1970).

При введении энтеротоксина обезьянам, кроме признаков энтерита (диареи и рвоты), наблюдается изменение в составе крови-. Лейкоцитов и другие изменения развиваются в крови обезьян уже через тридцать минут после введения энтеротоксина в дозе 5-10 мкг на кг веса животного (Grawley G.J, е.а,, 1966)'.

После введения стафилококкового энтеротоксина типа В в кровяное русло до 16-20$ его обнаруживается в лейкоцитах, остальная часть содержится в,альбуминовой фракции сыворотки. По данным Grawley G.J. е.а. (1966)»лейкоциты, содержащие энтеротоксин, локализуются, в основном, в легочной ткани.

В опытах in vitro на митохондриях печени кроликов показано, что действие стафилококкового энтеротоксина типа В.приводит к нарушению обмена аденозинтрифосфата и ионов магния. В связи с этим предполагается, что в основе клинической картины, вызываемой стафилококковыми энтеротоксинами, лежит поражение функций митохондрий, отдельных чувствительных тканей ( Canonico P.G. Zwieten M.J. 1971).

Стафилококковый энтеротоксин типа В индуцирует митоз лимфоцитов, вызывает генерализованный хемотаксис нейтрофилов, ингиби-рует миграцию макрофагов (цитировано по Езепчуку Ю.В., 1977, с vl 48).

Описан пирогенный эффект, вызываемый введением очищенных препаратов стафилококковых энтеротоксинов А и В ( ciark w.g., Borison H.L. 1963 ; Clark w.G. Page G.S. f 1968). В опытах на обезьянах установлено, что внутривенное введение им стафилококкового энтеротоксина типа В на фоне пирогенного эффекта приводит к развитию лейкопении с последующим лейкоцитозом ишоком*. Повышение температуры цротекает двухфазно при введении; энтеротоксина внутривенно и однофазно, если энтеротоксин введён в полость желудка*. После повторных пероральных или внутривенных инъекций энтеротоксина у животных развивается невосприимчивость к нему'.ciarle w.g. t Page G.s. (1968) наблюдали пирогенный эффект при введении очищенного энтеротоксина типа В per os кошкам в дозе от 10 до ТОО мкг/кг, а также при введении! высокоочи-щенного энтеротоксина А внутривенно (0,01 «1,0 мкг/кг) или в желудочек мозга (0,005 « 0,02 мкг/кг).

При сравнительном изучении токсичности энтеротоксинов на добровольцах И Обезьянах Raj H.D. Bergdoll м.з. (1969) было показано, что люди более чувствительны к действию энтеротоксина, чем обезьяны. Так, у трёх добровольцев, при введении очищенного на 50$ энтеротоксина в дозе 50 мкг/кг через 2-3 часа после приёма наблюдались симптомы пищевого отравления. Доза энтеротоксина, вызывавшая рвоту у макак резусов при перораль-ном введении равнялась 0,9 - 25 мкг/кг, при внутривенном - ОД мкг/кг ( Schans e.j. е.а., 1965).

2^4. Методы получения и очистки энтеротоксина ВДля получения и очистки стафилококкового энтеротоксина ти па В применялись разные методы.

В 1958 году Casman Е.р. была впервые предложена синтетическая питательная среда, состоящая из аминокислот, солей и гидролизата казеина. Эта среда имеет применение и в настоящее время, так как удобна по целому ряду показателей при получении энтеротоксинов с целью их последующей очистки.

Широкое применение имеет и сердечно-мозговой бульон, предложенный casman е.р. е.а. в 1963 году. Он состоит из сердечно-мозговой вытяжки (0,37$) и из коммерческого питательного концентрата ( Bacto Brain Heart Infusion Dehydrated Diphco )'.

Кузькин Б.П. (1979) установил, что сердечно-мозговой бульон является наиболее благоприятной средой для образования стафилококковых энтеротоксинов А, В, Cj. Об этом свидетельствуют титры энтеротоксинов типов А, В, Cj, которые на бульоне из мозговой сердечной вытяжки были в 8-16 раз выше, чем на бульоне Хоттинге-ра с аминным азотом 160 мг$.Wu с-н. и Bergdoli M.S. (1971) показали, что большое количество энтеротоксина В (125 мкг/мл) может образовываться в синтетической среде, состоящей из аминокислот, неорганических солей и витаминов. Аминокислоты, содержащиеся в среде, должны были использоваться штаммом в течение всего цикла его роста. Оказалось, что аспарагиновая кислота, треонин, серин, глютаминовая кислота, пролин, глицин, аланин утилизируются штаммом быстро, в то время как триптофан, цистин, тирозин, фенилаланин, метионин потреблялись лишь в небольших количествах.

При получении стафилококкового энтеротоксина В Keller g.m. е.а. (1978а) предлагают использовать среды с определённым соотношением аргинина, серина, треонина.

Токсинообразование стафилококкового энтеротоксина В и его регуляцию изучали riai Fa-Hsiang е.а. (1978). Ими установлено, что добавление к 3$-ному триптиказо-соевому бульону 0,2$ глюкозы повышает значительно выход токсина в среду, хотя увеличение концентрации глюкозы приводит к ингибиции синтеза энтеротоксина. Образование энтеротоксина подавлялось также глицерином, не оказывающим угнетающего действия на рост культуры.

При изучении влияния минеральных солей на выработку стафилококкового энтеротоксина типа В найдено, что увеличение в среде-концентрации магния до 1,5 мМ обеспечивает прирост стафилококкового энтеротоксина В в культуральном фильтрате, но не влияет на процесс накопления биомассы ( Keller g.m. е.а., 19786).

На накопление энтеротоксина в среде оказывает влияние и аэрация. Mc.Lean r.a. е*а. (1968) установил возможность образования энтеротоксинов А и В в анаэробных условиях в количестве 10 раз меньшем, чем в аэробных условиях. В то же время Mariand r.a. (1967) предупреждает, что чрезмерная аэрация и повышенное содержание кислорода приводят к снижению продукции энтероток-сина типа В*.

Первыми методами, использованными для получения энтеротоксинов, были несложные методики - кислотная и алкогольная преципитация в качестве первичного этапа, адсорбция различными ионообменными смолами, электрофорез на бумаге и в крахмальном геле ( Bergdoll M.S. e.a., 1959. ;Hibniclc Н.Е. f Bergdoll M.S.

1959 ; Prea j.j. e.a., 1963 ; Schana E.j. e.a., 1965).

Немаловажной процедурой при проведении очистки стафилококковых энтеротоксинов является концентрирование собственного токсина, находящегося в культуральном фильтрате в небольшом количестве. Для концентрирования энтеротоксинов в культуральном фильтрате можно использовать лиофилизацию, осаждение солями, полиэти-ленгликоль, фильтрацию через мембраны.

Езепчук Ю.В. с соавт. (1975) для концентрирования энтеротоксина А провели лиофильное высушивание культуральном жидкости споследующим растворением лйофилизата в дистиллированной воде и диализом против дистиллированной воды.

Некоторые авторы для концентрирования использовали полиэти-ленгликоль, но этот способ имеет недостаток, заключающийся в том, что им нельзя обрабатывать большие количества культурального фильтрата.

В последние годы для концентрирования и частичной очистки стафилококковых энтеротоксинов широко используется метод высаливания сульфатом аммония С Ш.в1сапеп А. 1977 ; Сабри Д.М.С., 1979).

В нашей стране очисткой стафилококковых энтеротоксинов занималась группа исследователей во главе с профессором Езепчуком Ю.Вч Так, первоначально этой группой был очищен стафилококковый энтеротоксин типа А при использовании гель-фильтрации на сефадек-сах в - 75, а - 25 и предварительном проведении концентрирования токсина путём лиофилизации культурального фильтрата с последующим диализом (Николаева И.О., 1974).

Гель-фильтрация на сефадексе а - 100, применённая для очистки стафилококкового энтеротоксина типа В, позволила выделить препарат энтеротоксина, освобождённый от балластных азотистых компонентов на 99% по отношению к исходному культуральному материалу (Езепчук Ю.В. с соавт., 1976>.

Бугровой В'.И1., Флуеру Ф.С. (1977) гель-хроматографией на сефадексе о - 100 удалось получить препарат энтеротоксина В, обладающего энтеротоксической активностью в дозе 0,015 мг на кг веса взрослой кошки.

Используя амберлит Са - 50 и проведя дополнительную очистку на колонке с КМ-целлюлозой НаЗог Р. (1978) получил очищенный препарат энтеротоксина типа В, который формировал чёткую полосу в реакции преципитации.

Двухэтапным методом очистки - сорбированием на амберлите с& - 50 и электрофокусированием Бугрова В.И, и Езепчук Ю.В. в 1979 году получили монокомпонентный препарат энтеротоксина В, пригодный для получения антиантеротоксической сыворотки.

Все описанные выше методы очистки энтеротоксина типа В отличаются достаточной сложностью и низким выходом активного материала. Поэтому разработка более простого и доступного метода остаётся весьма актуальной*. В связи с этим своё внимание мы обратили на метод, предложенный для выделения и очистки стафилококкового энтеротоксина типа А. Этот метод при сравнительной простоте препаративных приёмов.позволял получать высокий выход токсина ( ЕяерсЗшк у.у. е.а., 1981)». Метод заключается в том, что очистка стафилококкового энтеротоксина А проводилась в два этапа : на первом этапе авторы проводили осаждение сульфатом аммония 60%-ного насыщения, на втором этапе удаляли примеси ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-32 целлюлозе.

2*.5. Методы идентификации стафилококковых энтеротоксиновДля идентификации стафилококковых энтеротоксинов,широко применяются разнообразные иммуносерологические методы. Все они основаны на принципе специфического связывания антигена с антителом'.

В 1968 году Нойоуа1 ь.Р. е.а., модифицировав реакцию диффузионной преципитации по ОисМ;ег1опу (1949), взамен пробирочной гель-диффузии предложил микрослайдовый метод для обнаружения энтеротоксинов А, В, С, Д. Чувствительность данного метода равняется 0,1 мкг/мл и количество каждого необходимого реагента для реакции равно 25 мкл. Реакция протекает в течение 1-3 едней. Преимущство данного метода в том, что для определения требуется небольшое количество материала и сыворотки, нет необходимости в дополнительном оборудовании. Недостаток метода заключается в необходимости проведения предварительной очистки энтероток-синов*.

Для обнаружения стафилококкового энтеротоксина В Morse s.a. и Mah R.A. (1967) использовали вариант ингибирования пассивной гемагглютинации*. Тест обратной пассивной гемагглютинации разработан Silverman s.J. е.а. (1968). Формалинизированные танизиро-ваннне бараньи эритроциты сенсибилизировали энтеротоксическими антителами,.после чего их добавляли к энтеротоксину в различных разведениях. Реакцию учитывали через 3 часа. Наименьшее количество энтеротоксина В, обнаруживаемое по этому методу, равняется 0,0015 мкг/мл. Это весьма чувствительный метод по сравнению с пассивной гемагглютинацией-ингибированием, с помощью которой можно выявить всего ОД - I мкг/мл энтеротоксина В. Но для выполнения данной реакции необходимо наличие высокоспецифических антиэн-теротоксических сывороток ( Yamada s. е.а., 1977).Genigeorgis С. Sadler W.Yf. (1966) был опубликован иммунофлюоресцентный метод обнаружения энтеротоксина В, заключающийся в появлении жёлто-зелёного свечения вокруг антител, окрашенных изотиоцинатом флюоресцина и связавшихся с антигеном. Этим методом через 3 часа после начала исследований можно было обнаружить 0,05 мкг стафилококкового энтеротоксина В в I г образца.

Метод иммуноэлектрофореза, электроиммунодиффузии заключается в том, что образующиеся в геле преципитаты становятся видимыми при окраске ( Sineii h.j. е.а., 1969).

В 1973 году Kimble С.Е. и Anderson A.W. предложили методику обратного иммуноосмофореза. Метод малочувствителен в сравнении с другими и, поэтому не нашёл широкого применения'.

ПО методу Coulter Counter Latex Oisen F.W. e.a.(1975) выявлял 0,01 мкг стафилококкового энтеротоксина В.

Метод радиоиммуноассей ( ria ) основан на связывании меченого изотопами энтеротоксина с антителами. Связывание количественно подавляется немеченым энтеротоксином. Количество связанного меченого энтеротоксина измеряется и определяется уровень подавления по стандартной кривой. Этим методом можно обнаружить менее 10 нг энтеротоксинов А, В, С. Данный метод можно применять только при обнаружении вышеназванных трёх типов энтеротоксинов, так как только они получены в высокоочищенном виде ( Robern н. е.а., 1978). Радиоиммунный метод, без сомнения, является высокочувствительным и специфичным методом, но его выполнение дорогостояще и требует много времени.

Для обнаружения С2энтеротоксина в 1975 году Robern н. е.а. предложили метод "double-antibody который был способен выявлять 0,0001 мкг препарата.Lindroth S. и Hiskanen А. (1978) обнаруживали этим же методом, но в твёрдой фазе 0,0002 мкг энтеротоксина А. Время определения сокращалось с 48 часов ( при " double antibody ") до б часов(при " double - antibodysolid - phase ")•Иммуноэнзиматический метод ( elisa ) для определения стафилококковых энтеротоксинов был впервые применён Saunder G.C. Bartlett K.L. (1977) и Simon Е. Terplan G. (1977).

Позже этот метод был использован M0rita Т.Н. Wood-burn m.J. (1978), Terplan G. (1978). Terplan G. утверж-. дает, что данный метод позволяет обнаруживать стафилококковый эн-теротоксин в пищевых продуктах в концентрации до 0,1 - 1,0 нг на I мл исследуемого продукта.

Модифицированный иммуноферментный метод для определения стафилококковых энтеротоксинов А, В, С был применён stiffег Rosenberg G. и Реу н. (1978), Он был способен выявлять концентрацию энтеротоксина, равную ОД нг/мл. Основное и ценное достоинство иммуноферментного метода - это высокая чувствительность его, но для выполнения этого метода и применения в практике необходимы дорогостоящие, дефицитные реактивы и специальной конструкции спектрофотометр. Перечисленные недостатки служат препятствием для широкого использования данного метода при выявлении стафилококковых энтеротоксинов-.

Флуером Ф.С1. (1979) был предложен экспресс-метод серологического типирования энтеротоксигенных стафилококков - коагглюти-нация. Данный метод по чувствительности близок к методу двойной диффузии в геле, но превосходит его по быстроте получения результатов (1-3 минуты) и требует значительно меньшего расхода иммунной антисыворотки (2-3 капли). Недостатком этого метода, несмотря на быстроту реакции, является многоступенчатая подготовка реагента.

Метод агрегат-гемагглютинации, основанный на использовании в агглютинации человеческих эритроцитов, покрытых поликонденсиро-ванными белками иммунной сыворотки, способен выявлять 0,005 мкг/мл энтеротоксинов типов А и В и 0,01 мкг/мл энтеротоксина типа Cg. Флуер Ф^С»; (1982) предлагает данный метод для обнаружения и количественного определения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, С^ в пищевых продуктах и культуральных средах«.Ouchteriony (1949) предложил метод двойной диффузии в агаровом геле. Метод основан на диффузном движении антигена и антитела в слое агара навстречу друг другу. В месте встречи их образуются иммунные комплексы, преципитирующие в порах геля и становящиеся видимыми как линии преципитации. Первоначально авторпредложил макрометод постановки реакции. Макрометод проводился в чашках Петри, в которых разлитый агаровый гель образовывал толстый слой. Поэтому лунки и соответственно объём реагентов были необходимы большие1.

В настоящее время широкое применение имеет микрометод реакции диффузионной преципитации, который ставится на предметных стёклах,В 1965 году Bergdoii к.з. е.а, использовали метод двойной диффузии по Ouchteriony для идентификации стафилококкового эн-теротоксина типа С. Данный метод является довольно чувствительным, он способен выявлять от 5 до 20 мкг препарата в I мл.

Метод двойной диффузии в геле в силу своей простоты наиболее доступен из всех методов, используемых с целью обнаружения энтеротоксинов. Широкое применение данного метода объясняется тем, что быстрые и высокочувствительные методы ( RIA Elisa ) требуют соответствующей аппаратуры, дефицитных реактивов1. Для проведения реакции диффузионной преципитации не нужен набор реактивов, не требуется специальная посуда. Методика постановки реакции также не сложна, вполне выполнима в лабораторных условиях.

Исходя из вышесказанного, мы решили проводить иммунохими-ческую идентификацию В-энтеротоксинобразующих стафилококков при помощи реакции диффузионной преципитации по OuchterXonyВ таблице приводятся сводные данные о методах идентификации стафилококковых энтеротоксинов'.

1968Hodoval L.F.e.a. 1968Sinell H. 1969Kimble C., Anderson A. 1973Olsen P.e.a, 1975Kobern H.e.a. J975Robern H.e.a, 1978 Lindroth S.,liiskanen A. 1978 Saunder G., Bartlett M. 1977 $jiyep ^.C-., 1979 Smyep 19823. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯЗ.К Материал и методы исследованийРабота выполнялась на кафедре микробиологии Московской.ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии им. К.И.Скрябина и в лаборатории молекулярных основ патогенности микроорганизмов Института эпидемиологии и микробиологии им, Н.Ф.ГамалеИ' в период с 1979 по 1982 годы.

Для получения препарата энтеротоксина типа В использовали стандартный штамм 243 St. aureus. полученный в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича.

При определении специфичности полученного энтеротоксина использовали антиэнтеротоксическую сыворотку типа В, любезно предоставленную нам профессором Ю.В.Езепчуком (Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи).

З.Г.Г. Культивирование штамма - продуцента энтеротоксина ВС целью получения исходного материала для последующей очистки энтеротоксина типа В стандартный штамм 243 St. aureus культивировали на среде Кэсман (1958), модифицированной Бугровой В.И1. с соавт. (1974).

Состав среди Кэсман :- цитрат железа 0,25 г/л- фосфорно-кислый калий двузамещённый I г/л- фосфорно-кислый калий однозамещённый I г/л- сернокислый магний 0,2 г/л- ацетат натрия 7,0 г/л- Л-цистин 0,025 г/лJI-триптофан 0,075 г/л s» панкреатический гидролизат казеина с содержанием аминногоазота не менее 160 мг$ « экстракт дрожжей 2,0 г/л вода дистиллированная - до I я.рН среды равен 7,2. Режим стерилизации -1,5 атм. в течение 15-«20 минут.

Среду в объёме I литра наливали; в 5«литровую плоскодонную колбу, куда вносили смыв суточной агаровой культуры. Микробная масса вносилась в концентрации; 73 мдфд микробных тел в I мл.

Бактериальные клетки удаляли путём центрифугирования при. 6000 об/мин в течение 30 минут. Полученный супернатант использовали для дальнейшей работы.

Предварительная подготовка целлюлозы проводилась следующим образом :

5.ВЫВ0ДЫ

1. Культивирование эталонного энтеротоксигенного штамма 243 St.aureus на модифицированной среде Кэсман позволяет накапливать стафилококковый энтеротоксин В, пригодный для последующего выделения и очистки.

2. Разработан трёхэтапный метод зыделения и очистки стафилококкового энтеротокеина типа В, включающий осаждение токсического белка сульфатом аммония 70%-ного насыщения, удаление примесей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-32 целлюлозе и гель-фильтрацию на сефадексе g -25.

3. Полученный таким образом препарат токсина очищен.примерно в 40.0 раз по сравнению с исходным, материалом, гомогенен по данным дискового электрофореза, обладает выраженной биологической активностью и специфическим антигенным свойством.

4. Иммунизация кроликов ПО схеме Casman И Bennett очищенным препаратом стафилококкового энтеротокеина типа В возводила нам получить антисыворотку, содержащую специфические противотоксические антитела в титре 1:64.

5. Приготовленная сыворотка была использована при иммуно-химической идентификации штаммов стафилококков, выделенных из молока больных маститом коров. Из НО исследованных штаммов 5 штаммов оказались способными продуцировать энтеротоксин типа В.

6. Из НО выделенных стафилококковых культур 25 коагулировали плазму, 41 штамм обладал гемолитической активностью, 37 сбраживали маннит. ДНКазная активность отмечена у 54 штаммов. .

7. При искусственном контаминировании молока эталонным, эн-теротоксигенным штаммом 243 st.aureus размножения этого штамма и образования им энтеротокеина в испытанных условиях не обнаружено.

8. С помощью моноспецифической сыворотки в реакции диффузионной преципитации стафилококковый энтеротоксин типа В можно обнаружить в молоке при содержании его в концентрации не менее 5 мкг/мл, что даёт возможность рекомендовать её для использования в лабораторной практике.

- 85

Заключение :

Метод диффузионной преципитации с использованием стафилококковой антиэитеротоксической сыворотки типа В позволяет проводить ттунохимичсскуа идентификацию энтеротоксина типа В как л культуральпои фильтрате, тог; л в молоке •

Предложения о дальнейшей применении метода диффузионной преципитации, с использованием антиэнтероток-сической сыворотки типа В в лабораторной практике

1. Проведенные производственные испытания говорят о несомненной диагностической ценности предложенного метода, т.к. он позволяет достаточЕЮ легко, быстро и специфично выявлять как в культуральнои фильтрате, так и в молоке наличие энтеротоксини.

2. Использование в лабораторной практике метода иммунохи-мической идентификации 13-энтеротоксинобразующих стафилококков, выделяемых из секрета вымени коров даст возможность своевременно предупреждать распространение маститов, желудочно-кишечных заболеваний ыолодняко сельскохозяйственных животных и пищевых отравлении людей.

Вышеизложенное позволяет рекомендовать гетод диффузионной преципитации о использованием стафилококковой антиэнтеротоксической сыворотки типа В, полученной Муруевой Г.Б., для применения в лабораторной практике при шшу по химической идентификации В-энтеротоксинобразующкх стафилококков, выделяемых из секрета вымени коров. л

Директор Горветл^орШрпи УтУ7 ГРУЗДЕВА Е.К. т ( Г^П&рПс. '»• I/ /

Зав. отделом ВСЭ 0МИРН03Л л.Н.

Врач-бактериолог^ отдела ВСЭ о^^ -— ЗИСЕЛЬСОН А.И.

С П Р А В а А о внедрении результатов паучник исследований аспиранта кафодш шшш&юлогии Московской ордена Трудов ото »красного Знамени вефергшарзд!* академии им.иЛЦикрябяна Муруевой r.ü, по теме 'Шшунохшшческая идентификация D-ошгеротоксииобрвдующих стафилококков, дадеяешшх из молока больных маститом коров".

Рапработашшй аспирантом Пуруевок Г.Б. пм^иокшшческий меад идентификации стафилококкового сптеротокспна типа В в куль-турашюП кидкости п молоке к пепользуемие еп реагента апробирована и испэльзувтся тз Вошископ областной научио-производственнои ветеринарной лаборатории при проведении исследовании молока больппх маститом коров.

Использование полученных аспирантом дашых дает бозм&хшость проводить при помоия реакции диСОузпошюП преципитацж по Ухтор-локи бнетрую и досяпиуг* в условиях бактериологической лаборатории идентификацию стафилококкового онтеротоксина типа В как в культу-ральмой ни дк ости, так и в молоке непосредственно.

Применение данного метода в соответствии о разработанным а второй наставлением позволяет дать заключение о бозишностй обнаружения стафилококкового онторотоксика типа В в культурашюй видксста и б молоке. При помощи иммунохимического метода возможно обнаружение стафилококкового онторотокеппа типа В в концентрации не менее 5 мкг/мл.

Использование рекомендуемого метода в лабораторной практике позволит проводить созсвромешю лечебно-профилактические мероприятия при маститах коров с целью недопущения использования молока большх маститом коров как продукта питания, так и для выпаивания молодняку сельскохозяйственных швопшх.

Директор лаборатории¿ (7 к андпдат вето шн^^Шшук тт щк.

- 108 ~

I. Дх .г. , V---' '' птстерствс 1 ->•■ <го ич-мпд^р.

Оогпнсьиа обласни сотсркп&рнг. ?:г.у:юоо-окроСжнча йрСКТОр П0ЯШ!ЗК0Й ОилиОТИФ шСуЧНО-КрСИЗВОДСТОСтюй р: " "

КС!»«, »4 »¿л ,.«„

О* '¿Г ^¿А, 16 //-/

Й^7 П.К.ВЫШ

Яуг;.гч пул. ЛЬч ЧгГлгЬо? т* ! Телефон 2-34-07

АКТ производственного педатлшш потопа нкпунокшшеокоп кдоптиСпклпкп стп-Фвлояоккового онтеротокеииа типа Ь 1) культутгглю?* ет^сосзгл п молоке болышк Мастито:: корок с

Коилсеяя и составе председателя - зав♦бзктсрноясгичесшм с?дс~ лом ПоянискоК облкетхАбораторки тов.Павлвка В .К,, членов - ст*вст~ врача-бактсриояога сбвастноП ветяаборатории тов.Окварио К.А., ст. ветврача-сЬктерслога Ковояьско» рой звет лаборатории тов#Товсяв~ ги к.П, и ст.затзрача-баитсриояэга Киверцовсш*: раПво?лаборатории тов.Носовского В.И» провеет производственное пепнтанпе метода ■ пммуиакнппчосиоП пдсита>шзд:и оте;;.'И?:оксккозого опторотокегша типа В б пуяьтуральноП шдкоотк и полоза больно:; молктшров порог? согласно "Уроненного наставления по проведении »ммужшш-ческоП идептифнсацип ета^плококкового онтеротокенпа типа В в куль-яуральиок п молодо болшн:: маститом пороз"» разработанного аспирантом мсфодрм мнкробкояоп-щ Московской ордена Трудового Красного Знамени ветаринерноИ академии ти К.П.Скрябина %рус1зон Г,Б

В реакции диффузной преципитации било исследовано 12 проб молока от бошзни маститом коров к 22 культура ехаОиязкоккоэ» видолепнше по указашпк вапе проб мазока. чет результатов проводили через 12,24, часов от момента постаповш реакции. Из ¿2 проб молока з ? случаю; получена поло-штеяьше розу я ьтатн. дополнительное Ецдерззхшо пспрорсашрэвав-пик проб колока в течение 7 суток от качала постановки реакции по дало пэшшзелыгих результатов.

При исследовании в РДП культур, пояучешшз: из проб молот, давших положительную реакцию с апткатороткаки к стафилококковому звтеротоксину В# получек!.! сог-глдавгяе результата* Это дает осиозшше считать, что разработашгаИ авторов нояод обнаружения сзодилскоздго&ого оэтероясксииа зша В в культурах п молоке Сояы-шг, каоэттом корон шссш спещ*1з:*шн# простой, чувствздгеяыши г? доступиим зз условиях (З&гориояоодчесод; лабораторий

Нродсодотеяь по!«!о ©г:

Павяпк Б.А,

Члслп по!£*сст:с