Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка технологии изготовления живой вакцины против реовирусного теносиновита кур

На правах рукописи

Для служебного пользования №9 дсп от 18.04.2001 ^^

УДК: 619:615.371:578.823.2:616.72 - 002.6:636.52 Бурдейная Людмила Васильевна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЖИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РЕОВИРУСНОГОТЕНОСИНОВИТА КУР

16.00.03. «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2001

Работа выполнена в ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, старший

научный сотрудник Старое С.К.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Груздев К.Н. (ВГНКИ, г. Москва)

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Фомина ~7гА7 (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир)

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский и

технологический институт биологической промышленности (ВНИиТИБП, г. Щелково)

Защита диссертации состоится /^¿у2001г. в £^часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01. в ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных Минсельхоза России по адресу: 600900, Владимир, п.о. Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных.

Автореферат разослан

года.

Ученый секретарь диссертационного

совета Семенова Г.М.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Реовирусный теносиновит птиц - контагиозное заболевание, характеризующееся хромотой, связанной с воспалением сухожилий и суставов конечностей, высокой ранней смертностью, замедленным ростом, снижением яйценоскости и выводимости цыплят. Оно зарегистрировано во многих странах мира, включая Австрию, Аргентину, Бразилию, Францию, Нидерланды, Великобританию. Исследования, проводимые во ВНИВИП и ВНИИЗЖ за период 1990-1998 г., свидетельствуют о широком распространении реовирусных заболевании среди птиц в хозяйствах РФ.

Экономические потери в промышленном птицеводстве значительны и связаны с гибелью птицы (до 6%), повышенной выбраковкой (до 50%), низкими приростами живой массы, снижением категорийности мяса, уменьшением яйценоскости на 6-20%, увеличением риска возникновения других инфекций (Jones R.C.et.al.1989, Meanger J. et.al., 1997). В племенных хозяйствах отмечают снижение половой активности петухов, что является причиной уменьшения оплодотворяемое™ и выводимости инкубационных яиц (van der Heide L., 1975). Кроме того, реовирус обладает иммунодепрессивным действием, что приводит к увеличению восприимчивости к инфекциям. Реовирусный теносиновит провоцирует и обостряет основное заболевание, обуславливая в дальнейшем его скрытое течение без явных клинических признаков. У переболевшей птицы отмечают авитаминоз, замедленный рост, плохое оперение, искривление костей и аномалии скелета, остеопороз, повышенную раннюю смертность, атрофию бурсы, снижение уровня расплода, иммунодепрессию (Монтизль Э., 1999).

Общие ветеринарно-санитарные мероприятия не обеспечивают в полной мере оздоровления птицеводческих хозяйств от реовирусного теносиновита. В Российской Федерации основным способом борьбы с данной инфекцией является выбраковка и убой пораженной птицы, что в условиях промышленного птицеводства является нецелесообразным.

В странах с развитым птицеводством широко применяются как живые, так и инактивированные вакцины. Однако в нашей стране такие вакцины отсутствовали. В <^язи с появлением в России в 90-х гг. очагов заболевания,

возникла необходимость в создании отечественных препаратов для специфической профилактики реовирусного заболевания.

Цель и задачи исследований. Целью работы является разработка технологии изготовления живой вакцины против реовирусного теносиновита кур.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

-•—отработать—оптимальные_условия культивирования штамма в 1133

реовирусного теносиновита (изучить влияние питательных сред, сывороток, рН поддерживающей среды, дозы заражения, времени культивирования, возраста культуры, посевной концентрации клеток);

• определить оптимальный состав защитной среды для живой вакцины против реовирусного теносиновита при лиофилизации;

• изучить стабильность лабораторных образцов вакцины в процессе хранения при разных температурных режимах;

• подобрать оптимальный разбавитель лиофилизированных препаратов;

• изучить иммуногенные свойства и эффективность живой вакцины против реовирусного теносиновита из штамма БИЗЗ в лабораторных и промышленных условиях;

• разработать нормативно-техническую документацию на живую вакцину против реовирусного теносиновита птиц.

Научная новизна. Впервые в России разработаны и обоснованы технологические параметры получения отечественной живой вакцины против реовирусного теносиновита птиц из штамма БИЗЗ.

Отработаны оптимальные параметры культивирования реовируса штамма БИЗЗ на культуре ФЭК, обеспечивающие получение высокоактивной суспензии с титром не менее 8,0 1дТЦД50/мл.

Отработан режим лиофилизации и подобрана защитная среда.

Изучена стабильность иммунобиологических свойств вакцины в процессе хранения при различных температурах.

Изучена динамика формирования иммунитета после одно- и двукратной вакцинации.

Изучена иммуногенная активность живой вакцины против реовирусного теносиновита в лабораторных условиях и установлена высокая противоэпизоотическая эффективность в производственных условиях.

Практическая значимость работы. Разработана промышленная технология изготовления живой вакцины против реовирусного теоносиновита кур из штамма 51133, на основе которой осуществляется промышленное производство вакцины во ВНИИЗЖ.

Разработана нормативно-техническая документация на изготовление, контроль и применение вакцины, одобренная ученым советом ВНИИЗЖ и утвержденная Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ на постоянный срок действия, включающая в себя:

• Промышленный регламент на производство вакцины против реовирусного теносиновита птиц живой сухой.

• Технические условия (ТУ) на вакцину против реовирусного теносиновита кур живую сухую 9384-043-00495527-00.

• Наставление по применению вакцины живой сухой против реовирусного теносиновита птиц.

Основные положения, выносимые на защиту:

• обоснование параметров получения и применения отечественной вакцины против реовирусного теносиновита (выбор культуры, параметры культивирования, состав защитной среды, разбавитель лиофилизированных препаратов);

• иммуногенная активность живой вакцины против реовирусного теносиновита птиц в лабораторных условиях;

• сохраняемость иммунобиологических свойств живой вакцины в процессе хранения при различных температурных режимах;

• технологический регламент изготовления и контроля живой вакцины;

• иммуногенная активность живой вакцины в производственных условиях. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на

конференции "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов" (Щелково, 2000г.),"на конференции "Молодых ученых" (ВНИИЗЖ, 2000г.), на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 1997-2000гг.

Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и список использованной литературы (190 источников, в т.ч. 170 иностранных). Работа иллюстрирована 18 таблицами, 6 рисунками.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1997-2000гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ, г. Владимир).

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Штамм реовируса птиц. В исследованиях использовали культуральный

реовирус птиц штамм S1133, выращенный в первичной культуре

фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), с титром инфекционное™ не менее

8,00 Ig ТЦЦ so/мл.

Подопытная птица. Проверку вакцины на безвредность и иммуногенность проводили на клинически здоровых, серонегативных к реовирусу птиц, цыплятах 1-40-дневного возраста, яичных и мясных пород, полученных из хозяйств, благополучных по острым инфекционным болезням. Культуры клеток и куриные эмбрионы. В экспериментах использовали: культуру ФЭК, перевиваемые линии клеток почки зеленой мартышки (Vero), почки кролика RK-13/91, коронарных сосудов теленка (КСТ), СПФ-эмбрионы фирмы "Lohman Tierzucht" (Германия).

Культивирование реовируса птиц. Культивирование реовируса птиц для производства живой вакцины проводили в первично-трипсинизированной культуре ФЭК. Культуру клеток готовили из 12-дневных СПФ-эмбрионов кур.

Из роллерных сосудов 48-часового срока выращивания с хорошо сформированным монослоем клеток ФЭК сливали ростовую среду, отмывали монослой раствором Хенкса с антибиотиками и вносили вирус из расчета

0,1-0,5 ТЦД/кл. Сосуды с инфицированной культурой помещали в роллерный аппарат при температуре 37±1 °С на 1 час для контакта вируса с клеткой. Затем вносили поддерживающую среду ПСП, рН 7,3-7,4 с 2% инактивированной сыворотки КРС в объеме 250-300 мл. Культивирование реовируса на матрасах проводили аналогично, объем поддерживающей среды составлял 100-150 мл.

Вакцины. Экспериментальные серии живой вакцины готовили путем лиофилизации вируссодержащей суспензии с добавлением защитной среды. Контроль вакцины. Контроль вакцины осуществляли путем определения стерильности, безвредности, реакгогенности и иммуногенной активности. Определение стерильности вакцины. Определение стерильности вакцины проводили согласно ГОСТу 28085-89, "Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности".

Определение биологической активности вируссодержащего материала. Биологическую активность определяли путем титрования каждой серии вакцины, в монослойной культуре клеток ФЭК 48-часового срока роста, выращенной в пенициллиновых флаконах.

Титр вируса рассчитывали по методу Кербера-Ашмарина и выражали в 1д ТЦЦ50/мл.

Определение безвредности вакцины. Испытание на безвредность проводили на цыплятах однодневного возраста. Вакцину вводили в дозе 0,2 мл с активностью 105,5 !дТЦЦ5с/кл. За птицей вели наблюдение в течение 10 суток. Вакцина считалась безвредной, если все цыплята в течение срока наблюдения оставались живы и видимых отклонений от физиологической нормы не отмечалось.

Определение иммуногенности вакцины. Иммуногенную активность вакцины проверяли на опытной и контрольной группах цыплят. Вакцину вводили внутримышечно в область бедра в дозе 0,2 мл. Через 21 сутки проводили отбор проб крови из подкрыльцовой вены. Сыворотки анализировали на наличие антител против птичьего реовируса методом ИФА в тест-системе КР1~ Вакцина считается иммуногенной, если титр антител в 80 процентах проб через 21 день после иммунизации был 1:800 и выше или прирост антител составлял не менее двух разведений по сравнению с исходным

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Отработка оптимальных условий культивирования вакцинного штамма S1133 реовируса птиц

3.1.1. Подбор клеточной системы для культивирования вируса

На первом этапе работы адаптировали вирус к различным культурам клеток и определяли наиболее продуктивную клеточную систему для культивирования в стандартных условиях. Для этих целей опыты проводили в культуре ФЭК, RK-13/91, Vero, ВНК-21 и КСТ.

В работе использовали штамм S1133 реовируса птиц с инфекционном активностью 106'5 1дТЦЦ5с/мл. Проводили три последовательных пассажа вируса в клетках ФЭК, RK-13/91, Vero, ВНК-21 и КСТ. Размножение вируса учитывали по времени и интенсивности лизиса клеток в монослое. За четко выраженное ЦПД принимали образование пустот в монослое, округление и лизис клеток. Активность вируса определяли методом титрования на культуре клеток ФЭК. Данные представлены в табл.1.

Таблица 1

Уровень накопления вакцинного штамма S1133 реовируса кур

в стационарных клеточных культурах __п=3

Вид культуры клеток Время 100% лизиса клеток, часы Уровень накопления вируса, lg ТЦД50/мл (М±т)

ФЭК 48-72 7,42+0,08

RK-13/91 48-72 6,0±0,08*

Vero 96-120 6,25±0,14*

ВНК-21 96-120 6,58±0,08*

КСТ 96-120 5,25±0,08*

Примечание: * - р<0,01 по отношению к культуре клеток ФЭК

В клеточной культуре ФЭК уровень накопления был значительно выше, чем в клетках RK-13/91, Vero, ВНК-21, КСТ. В результате проаеденных исследований, нами в качестве системы культивирования для дальнейших исследований была выбрана культура ФЭК.

3.1.2. Влияние возраста культуры и времени культивирования на репродукцию реовируса

Были проведены исследования по влиянию возраста культуры и времени культивирования на накопление вируса. В опыте использовали культуру ФЭК 48-часового выращивания. Вирус культивировали 24, 48, 72 и 96 часов. Размножение вируса учитывали по времени и интенсивности лизиса клеток в монослое. Активность вируса определяли методом титрования на культуре клеток ФЭК.

Результаты, приведенные в табл. 2., свидетельствуют о том, что наиболее высокий выход реовируса отмечается при его репродукции в течение 48-72 час.

Таблица 2

Динамика накопления реовируса шт. Э1133 в клеточной культуре фибробластов эмбрионов кур, М±т

п=3

Время культивирования, часы Возраст культуры, часы Доза вируса, 1дТЦД50/кл Титр вируса, !д ТЦДбо/мл

24 48 . 0,1 6,83±0,22

48 48 0,1 7,92±0,08**

72 48 0,1 8,0 ±0"

96 48 0,1 7,75±0,14*

Примечание: *- р<0,05, **- р<0,01 по отношению к данным по культивированию в течение 24 часов.

Установлено, что на выход вируса значительное влияние оказывает посевная концентрация клеток. В опытах при культивировании на матрасах применяли посевную концентрацию клеток ФЭК от 100 до 400 тыс/мл. Культуру ФЭК выращивали в течение 48 часов при 37+0,5 °С. Заражающая доза составляла 0,1 ТЦДбо/кл. Размножение вируса учитывали по времени и интенсивности лизиса клеток в монослое. Активность вируса определяли методом титрования на культуре клеток ФЭК. Результаты представлены в табл. 3.

s

Таблица 3

Влияние посевной концентрации клеток на репродукцию реовируса, М±т

п=5

Посевная концентрация клеток, тыс/мл Время культивирования, часы Возраст культуры, часы Титр вируса, Ig ТЦД5о/мл

100 72 48 7,33±0,08

200 48 48 8,33±0,22

300 48 48 7,67±0,08

-400 -48_ АР, 7.33±0,08

Проведенные нами исследования показали, что наиболее оптимальной посевной концентрацией клеток в монослое, обеспечивающей высокую степень получения вируссодержащего сырья, для матрасов является 200-300тыс. кл/мл. При более низкой или повышенной посевной концентрации клеток (100 и 400 тыс./мл) отмечалось ослабление репродукции вируса. Полученные данные были подтверждены в серийных опытах по наработке вируссодержащего сырья.

3.1.3. Влияние множественности заражения и числа пассажей

на уровень накопления реовируса

Для определения влияния множественности заражения использовали дозы заражения 1; 0,1 и 0,01 ТЦД50/кл. Культивирование прекращали при полном лизисе клеток. Активность вируса определяли методом титрования на культуре клеток ФЭК. Результаты опытов показали, что максимальное накопление вируса отмечается при множественности заражения равной 0,1 ТЦД50/МЛ, как при 48ч, так и 72ч культивирования. В обоих случаях наблюдалось четко выраженное ЦПД. При уменьшении или увеличении заражающей дозы наблюдается снижение титров вируса. Таким образом, оптимальной заражающей дозой является 0,1 ТЦД50/КЛ.

3.1.4. Влияние рН среды и сыворотки на репродукцию вируса

Проведена серия опытов по' подбору оптимальной величины рН поддерживающей среды ПСП. При проведении опытов изменяли данный

параметр в диапазоне от 6,9 до 7,8. Активность вируса определяли методом титрования на культуре клеток ФЭК. Наиболее интенсивно реовирус размножался в культуре клеток ФЭК при рН 7,3-7,4. Изменение этого показателя в более щелочную или кислую сторону вело к снижению уровня накопления вируса (до 6,58+0,08 и 6,33±0,17 1д ТЦД50/мл соответственно) при исходном титре равном 7,58±0,08 1д ТЦД50/мл.

В дальнейших опытах по подбору наиболее оптимальных параметров культивирования мы определяли влияние сыворотки в поддерживающей среде на репродукцию вируса. В опытах использовали среду ПСП с добавлением 2% сыворотки и без сыворотки, применяя различные заражающие дозы. Культивирование вируса проводили в течение 48 часов. Активность вируса определяли методом титрования на культуре клеток ФЭК. При использовании низких доз заражения 0,1-0,35 ТЦД50/кл отмечалась незначительная тенденция к увеличению выхода вируса на средах без добавления сыворотки и, наоборот, при дозе 0,75 ТЦЦ50/КЛ уровень накопления реовируса в ФЭК был несколько выше при добавлении в среду сыворотки. Однако достоверных различий нами не установлено. Таким образом, можно сделать заключение, что добавление сыворотки крупного рогатого скота, обработанной ПЭГ в концентрации 2%, не влияло на накопление реовируса в культуре клеток ФЭК.

3.1.5. Культивирование вируса штамма ЭНЗЗ в роллерных установках

Одним из путей повышения эффективности производства вирусных биопрепаратов является использование роллерных культур. В наших опытах первоначально определяли оптимальную посевную дозу клеток куриных фибробластов для получения максимального сбора урожая реовируса. В опытах использовали посевную концентрацию клеток от 900 до 2100 тыс./мл. Экспериментальными исследованиями установлено, что вирус максимально накапливался при посевной концентрации клеток в монослое 1400 -1600 тыс./мл (8,53±0,08 )д ТЦЦ50/мл). Увеличение (до 2100 тыс./мл) или уменьшение (до 900 тыс./мл) посевной концентрации клеток вело к ослаблению репродукции вируса (7,93+0,08 и 7,50+0 1дТЦД50/мл соответственно). В

дальнейшем при культивировании реовируса в роллерных установках использовали посевную концентрацию ФЭК 1400 - 1600 тыс./мл.

В следующей серии опытов мы изучали возможность использования данного приема для культивирования вакцинного штамма реовируса S1133 в культурах клеток Vero и ФЭК. При культивировании использовали поддерживающие среды ПСП-24 (ФЭК) и ПСП-26 (Vero) с 2% сыворотки, обработанной ПЭГ. При выращивании вируса использовали различные объемы поддерживающей среды — 100 мл, 200 мл, 300 мл. Сбор вируссодержащего сырья проводили после полного лизиса клеток и четко выраженного ЦПД. Активность вируса определяли путем титрования на культуре клеток ФЭК. Результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4

Уровень накопления вируса в роллерных культурах клеток Vero и ФЭК в зависимости от времени культивирования и объема поддерживающей среды, М±т

Культура клеток Объем среды, мл Время культивирования, час Титр вируса, 1дТЦД5о/мл

ФЭК 100 24 7,42+0,17

48 7,42±0,08

72 7,83±0,08

96* 7,37±0,08

200 96 7,96±0,08

120* 7,42±0,17

300 24 8,17±0,08

48 72 96* 8,42±0,08 8,38±0,14 7,98±0,08

Vero 100 72 8,0 ±0,14

96* 7,4 2+0,17

200 96 7,25±0,14

120 7,17±0,08

300 96 7,08±0,08

120* 7,67±0,17

Примечание: * - р<0,05 по отношению к предыдущему значению

Результаты проведенных исследований показывают, что применение роллерных культур по сравнению со стационарными для получения реовируса штамма БИЗЗ является более эффективным. Целесообразней для этих целей использовать культуру ФЭК, обеспечивающую наиболее высокий выход антигена при выращивании реовируса в течение 48-72 час в сосудах с объемом поддерживающей среды 300 мл.

3.1.6. Определение параметров лиофилизации

Для изготовления сухого препарата применяли лиофилизацию вируссодержащей суспензии реовируса. В наших исследованиях проведена серия опытов по подбору стабилизирующих сред и определению режима лиофилизации, обеспечивающих максимальное сохранение биологической активности вируса. Были испытаны в различных концентрациях и пропорциях пептон, лактоза, сахароза, гидролизат лактальбумина (ГЛА), желатоза, глютамат натрия. Установлено, что наибольшую сохраняемость биологической активности вакцинного вируса обеспечивает стабилизатор в составе: 3% сахарозы, 3% ГЛА и 0,5% желатозы. Лиофилизацию при получении вакцины следует проводить при следующем режиме: вначале вакцина промораживается при температуре от минус 40°С до минус 50°С в течение 24 часов. Первый этап лиофилизации проводится в течение 10-12 часов при температуре от минус 38°С до минус 40°С. Затем температура в сублиматоре постепенно повышается (1-2°С в час). Процесс сушки длится 60-80 часов.

3.2. Определение биологической активности вакцины при различных режимах хранения и после растворения

С целью определения режимов хранения и применения сухой вакцины изучали влияние на ее биологическую активость видов растворителя, продолжительности хранения препарата при различных температурных режимах в лиофильном и растворенном виде.

При выборе растворителя опыты выполнены с пятью различными растворителями. В опытах использовали вирус с одинаковой исходной активностью (7,08±0,081дТЦЦ50/мл) и разбавляли сухие препараты следующими растворителями: растворителем фирмы "Интервет", растворителем для

вакцины против болезни Марека, средой БПС, фосфатно-буферным раствором, изотоническим раствором хлорида натрия, средой Игла. Опыты проводили в трех повторностях.

В опытах установлено, что растворение сухой вакцины любым препаратом в разной степени ведет к снижению ее биологической активности менее чем на 0,3 1дТЦД50/мл. Таким образом, для применения в промышленных условиях мы рекомендуем изотонический раствор натрия хлорида.

Изучение влияния температуры и продолжительности хранения на биологическую активность вакцины проводили в течение 12 месяцев.

Для этого биологическую активность вакцины определяли ежемесячно. Образцы вакцины одной серии хранили при температуре 4°С и минус 20°С. В конце каждого месяца для определения активности вируса проводили трехкратное титрование проб разбавленных средой Игла на культуре клеток ФЭК.

Хранение вакцины при температуре минус 20 °С в течение 12 мес. приводило к потере ее биологической активности на 0,4 1дТЦЦ50/мл, в то время как при хранении при 4°С — на 1,0 1дТЦД5о/мл. Показатель биологической активности вакцины к концу срока хранения при минус 20°С за этот период был значительно выше, чем при 4°С и составил 6,67+0,08 против 6,08±0,08 1д ТЦД50/мл.

3.3. Изучение динамики формирования иммунитета у цыплят на введение вакцины против реовирусноготеносиновита

После получения вакцины с высокой биологической активностью необходимо было изучить динамику формирования иммунитета у вакцинированной птицы в зависимости от:

• способа введения вакцины,

• возраста цыплят,

• наличия пассивных антител,

• дозы и кратности вакцинации.

3.3.1. Определение оптимального способа введения вакцины

Для определения оптимального способа введения вакцины 60 цыплят 14-дневного возраста разделили на 3 опытные и одну контрольную группы по 15 голов в каждой. Для иммунизации использовали вирусвакцину сухую живую против реовирусного теносиновита кур, которую первой группе вводили интраназально, второй — выпаивали с водой, третьей группе вводили внутримышечно. Титры антител у цыплят определяли через 14, 21 и 40 дней после вакцинации. Результаты представлены на рис.1.

5000-

4500-

4000-

3500-

3000-

2500-

2000-

1500-

1000-

500-

0-

21 40

Дни после вакцинации

И Интраназально ИПерорально □Внутримышечно □ Контроль

Рис.1 Влияние способов введения вакцины на антителообразование

Из данных рис.1 видно, что внутримышечное введение вакцины является более оптимальным способом иммунизации, так как титры антител в крови у цыплят были значительно выше, начиная с 14 дня после введения вакцины и сохранялись на высоком уровне до 40 дня (срок наблюдения). Титры антител так же повышались, но были значительно меньше при выпаивании вакцины и после интраназального введения.

3.3.2. Влияние дозы вакцины на формирование иммунитета у цыплят

Для определения оптимальной дозы вакцины цыплят семидневного возраста разделили на 4 опытных и одну контрольную группы по 15 голов в каждой. Вакцину вводили в дозе от 102,5до 105'5 1дТЦД50/0,2 мл. Титры антител определяли методом ИФАчерез7,14, 21 день. Данные представлены в табл.5.

Таблица 5

Антителообразование у птицы в зависимости -от-и м мунизи рующей_дозы,М±т__

Вакцина Доза вируса, !д ТЦД5о/0,2 мл Титры антител в сыворотке крови (ИФА)

через 7 дн. Через 14 дн. через 21 дн.

Сухая живая ю2-5 520,2±89,8 870,5±154,2 1192,9±470,8

103.5 970,7+170,5 2100,4±134,7 3577,9198,.6

104'5 1560,9+231,7 2271,8±100,8 3592,71170,2

105'5 1700,9+270,7 2300,8±150,5 3582,31308,1

Контроль - 430,0±100,2 520,б±50,4 540,2175,4

Установлено, что введение вакцины в различных дозах индуцирует образование антител в крови птиц во всех экспериментальных группах. На 7 день гуморальный ответ на введение вакцины в дозе от 104,5 до 106,5 1дТЦД50/0,2 мл был значительно выше, чем при вакцинации дозой от 102,5 до 103'5 1дТЦД50/0,2 мл. В дальнейшем наблюдалась тенденция к повышению титров. К 21 дню титры антител в группах цыплят, привитых вакциной в дозе от 103'5 до 105,5 1дТЦД50/0,2 мл, находился на одном уровне. Минимальный титр антител отмечен в группе цыплят, вакцинированной в дозе 102,51дТЦД50/0,2мл (1:1192±470,8), хотя динамика антителообразования была сходной с остальными группами. На основании этих данных для применения в практических условиях нами рекомендуется использовать дозу вакцины Ю3,5 1дТЦЦ50/О,2мл, которая обеспечивает образование напряженного

иммунитета на 21 сутки. Применение более высоких и низких иммунизирующих доз нецелесообразно.

3.3.3. Определение безвредности вакцины Испытание на безвредность вакцины против реовирусного теносиновита проводили на 50 клинически здоровых, серонегативных цыплятах однодневного возраста, полученных из хозяйств, благополучным по острым инфекционным болезням. Вакцину вводили в дозе 0,2 мл с активностью 105,51дТЦД5о/0,2мл. Контролем служила группа не вакцинированных цыплят того же возраста. Наблюдение вели в течение 30 суток. В, результате проведенных исследований установлено, что у птицы отсутствовали отклонения от физиологической нормы, а также не отмечалось видимых местных и общих реакций на введение препарата. Полученные данные свидетельствуют о том, что в указанной дозе 105,5 1дТЦД50/0,2мл вакцина живая сухая против реовирусного теносиновита из штамма БИЗЗ безвредна.

3.3.4. Разработка оптимальной схемы вакцинации

3.3.4.1. Изучение динамики антителообразования у цыплят, привитых живой вакциной

Опыты по определению динамики антителообразования при использовании вакцины выполнены на 76 СПФ-цыплятах 8-дневного возраста. Вакцину с активностью 103,5 1дТЦД50/0,2мл вводили внутримышечно в дозе 0,2 мл. Сыворотку крови исследовали в ИФА через 15, 30, 60, 90, 120, 150 и 180 дней. Половину цыплят через 60 дней иммунизировали повторно. Сыворотку крови от них исследовали трехкратно с интервалом в 30 дней. Результаты исследований представлены на рис. 2.

Экспериментальными исследованиями установлено, что иммунный ответ у цыплят на первое введение вакцины характеризовался активной выработкой антител, достигая максимума через 30 дней (3 титрогруппа), с последующим снижением, особенно выраженным после 60 дней поствакцинального периода и выявлением их следов через 90 дней. Гуморальный ответ на повторное введение вакцины характеризовался более . высокой интенсивностью и продолжительностью. Высокий уровень антител (5 титрогруппа) удерживался в течение последующих трех месяцев.

дни после вакцинации

-однократная вакцинация -»-ревакцинация

Рис.2 Антигенная активность вакцины против реовирусного теносиновита кур

Таким образом можно сделать заключение, что однократная иммунизация цыплят живой вакциной против реовирусного теносиновита обеспечивает полноценную защиту только в течение первых 1,5—2 месяцев, после чего необходима повторная вакцинация, которая увеличивает интенсивность иммунного ответа и у цыплят сохраняются высокие титры антител в течение 120 дней после ревакцинации (срок наблюдения).

3.3.4.2. Определение сроков первичной иммунизации птицы

Успех профилактики вирусных заболеваний во многом зависит от сроков первичной иммунизации птицы. 8 связи с этим мы провели серию опытов по определению интенсивности иммунного ответа на введение вакцины у цыплят в зависимости от наличия материнских антител. Опыты были выполнены на 5 группах цыплят - одно-, пяти-, десяти-, 15- и 20-дневного возраста, по 10 голов в каждой. Цыплят иммунизировали внутримышечно вакциной в дозе 103,5 1дТЦД50/мл. Титры антител определяли методом ИФА до вакцинации и через 21 день после прививки. Результаты представлены на рис. 3.

2000 т

1500 -

10811147 Ю38 1040

1000 --

500 -

0

»

1

5

10

15

20

Возраст цыплят

0 Фоновые показатели титров антител ■ Титры антител через 21 сут после вакцинации

Рис. 3 Титры антител у цыплят при различных сроках первичной

В опытах установлено, что у цыплят в возрасте до 15 дней антительный ответ независимо от уровня материнских антител практически не различался (1:1038 — 1:1147), в то время как у 20-дневных цыплят наблюдалось более активное антателообразование (1:1468), что свидетельствует о способности их организма адекватно отвечать иммунной реакцией на антигенное раздражение. По нашему мнению, наиболее оптимальным сроком первичной иммунизации птицы является 20 дней.

3.3.4.3. Определение кратности введения вакцины

С целью определения наиболее оптимальной схемы иммунизации, способствующей выработке активного иммунитета, мы провели серию опытов по определению кратности вакцинации. Птицу разделили на три опытные и одну контрольную группы цыплят по 15 гблов в каждой. Всю птицу иммунизировали в 14-дневном возрасте вакциной с активностью 103,5 1дТЦЦ50/мл. Цыплят первой группы иммунизировали повторно в 28-дневном

иммунизации

возрасте, второй и третьей - в 42 и 74-дневном возрасте соответственно. Титры антител определяли методом ИФА до вакцинации и в 28-, 42-, 60-, 74-дневном возрасте. У птицы 3 и 4 группы антитела определяли дополнительно в 90-дневном возрасте. Результаты представлены на рис.4.

7000т __6000-ш 5000-

| 4000-<

3 3000-а.

| 20001000-

0-г

14 28 42 ' 60 74 90

СУТКИ

Щ Ревакцинация через 14 дней ■ Ревакцинация через 28 дней □ Ревакцинация через 60 дней СЖонтроль

Рис. 4 Титры антител в зависимости от кратности вакцинации

Экспериментальными исследованиями установлено, что, независимо от сроков и числа прививок титр антител у цыплят к 60-дневному возрасту находился на одном уровне (1:3582 - 1:3649), следовательно, проводить ревакцинацию в 28 - и 42-дневном возрасте нецелесообразно. Наиболее оптимальной является повторная иммунизация в двухмесячном возрасте, когда тигр повышается до 1:6200 через 16 дней после ревакцинации.

3.4. Сравнительная оценка иммуногенных свойств вакцин . против реовирусного теносиновита

Была проведена сравнительная оценка иммуногенной активности разработанной вакцины с препаратом импортного производства. Испытывали

живые вакцины против реовирусного теносиновита из штамма БИЗЗ (ВНИИЗЖ) и вакцину из штамма 133 (ЭЬаЛ^ЛДля этого цыплятам в возрасте 14 дней вводили вакцины в дозеЮ3,5 1дТЦД50/мл. В каждой группе было по 15 голов цыплят. За птицей вели постоянное наблюдение. Через 21 день после вакцинации у них была взята кровь и проведено определение титра антител в ИФА. В ходе исследований сывороток крови было обнаружено, что титр антител в ИФА при иммунизации вакциной фирмы БИаШ составил 2492,6+614,8, при обработке птицы вакциной ВНИИЗЖ из штамма Э1133 --2080,1 ±604,9. Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение, что несмотря на то, что иммуногенная активность вакцины импортного производства несколько выше, чем активность отечественной вакцины, последняя создает напряженный иммунитет к реовирусу, обеспечивающий полную защиту от данной инфекции и может широко применяться в птицехозяйствах.

3.5. Испытание экспериментальных серий живой вакцины против

реовирусного теносиновита в производственных условиях Эффективность живой вакцины против реовирусного теносиновита проверяли в производственных условиях на птицефабриках Российской Федерации.В качестве примера можно привести птицефабрику " Волжская" Костромской области. Цыплят в возрасте 8 дней в количестве 15 тыс. гол. вакцинировали живой вакциной против реовирусного теносиновита внутримышечно. Остальные корпуса оставались невакцинированными. В результате установлено, что выбраковка цыплят в вакцинированных корпусах уменьшилась в 2 ^аза, а падеж снизился на 20% по сравнению с невакцинированными корпусами, Аналогичные результаты наблюдали на других птицефабриках Российской Федерации.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология изготовления отечественной высоко-иммуногенной живой сухой вакцины против реовирусного теносиновита на основе аттенуироваиного штамма БИЗЗ, которая в экспериментальных и

производственных усгтяиях оказалась безвредной, ареактогенной и высокоиммуногенной для птиц различного возраста.

2. Отработаны оптимальные условия культивирования вакцинного штамма БИЗЗ реовируса птиц на культуре фибробластов эмбрионов кур, обеспечивающих получение больших объемов вируссодержащего материала с титром биологической активности не ниже 8,0 1дТЦД5о/мл, что пригодно для производства высокоиммуногенной вакцины. Установлено, что оптимальная посевная концентрация клеток ФЭК составляет в роллерах 1400—1600 тыс./мл, в матрасах—20СР300 тыс7/мл~при—множественности—заражения— 0,1 ТЦДбо/кп и времени культивирования — 48 часов.

3. В процессе лиофилизации вакцины установлено, что наибольшую сохраняемость биологической активности вакцинного вируса обеспечивает стабилизатор, состоящий из 3% сахарозы, 3% ГЛА и 0,5% желатозы.

4. Показано, что биологическая активность сухой вакцины в процессе хранения в течение 12 мес при температуре минус 20°С снижается незначительно (5,8%), в то время как при положительных температурах наблюдается значительное снижение активности вакцины (14,1%).

5. Установлено, что вакцину после разведения изотоническим раствором хлорида натрия необходимо использовать в течение двух часов при условии хранения ее при температуре 4 °С.

6. Показано, что при внутримышечном применении вакцины против реовирусного теносиновита создается более напряженный иммунитет по сравнению с алиментарным и интраназальным введением препарата.

7. Установлено, что оптимальная иммунизирующая доза вакцины против реовирусного теносиновита птиц составляет 103,5 1дТЦД5о/0,2мл. Эта доза индуцирует образование напряженного и длительного иммунитета у цыплят на 21 день после вакцинации.

8. В экспериментах по изучению динамики формирования иммунитета у цыплят, привитых живой вакциной против реовирусного теносиновита установлено, что однократная вакцинация обеспечивает защиту птицы от заражения в течение двух месяцев. Ревакцинация цыплят по иммунному фону через 60 - 74 дня после первой вакцинации индуцирует напряженный и продолжительный иммунитет.

9. Проверка иммуногенности живой вакцины против реовирусного теносиновита птиц из штамма S1133 в условиях птицехозяйств показала, что вакцина является высокоиммуногенным и безвредным препаратом и обеспечивает защиту птицы различных возрастных групп от этой инфекции..

6. Практические предложения

1. Рекомендуются для использования в ветеринарной практике разработанные и утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ НТД на вакцину против реовирусного теносиновита живую сухую:

• Промышленный регламент на производство вакцины против реовирусного теносиновита птиц живой сухой;

• Технические условия на вакцину ТУ 9384-049-00495527-00;

• Наставление по применению вакцины против реовирусного теносиновита птиц.

• Методика титрования реовируса птиц и определения вируснейтрализующих антител в первичной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур. Вакцина по разработанному регламенту производится во ВНИИЗЖ и

используется в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации с высоким иммуногенным эффектом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бурдейная Л.В., Старое С.К., Герасимова Н.И., Шкиря В.И., Куляшбекова Ш.К., Герасимов В.Н., Черняева Т.Ю., Ельников В.В. Выращивание вакцинного штамма S1133 реовируса птиц в различных клеточных системах // Научн. основы произ-ва вет. биол. преп.: Тез. докл. - Щелково, 2000. - С.93-94.

2. Бурдейная Л.В., Старов С.К., Герасимова Н.И., Шкиря В.И., Ельников В.В.

Изучение условий хранения вируса теносиновита кур // Научн. основы производства вет. биол. преп.: Тез. докл. - Щелково, 2000. - С.92-93.

3. Бурдейная Л.В., Старов С.К., Герасимова Н.И., Шкиря В.И., Черняева Т.Ю., Сарбасов А.Б. Условия выращивания вакцинного штамма S1133 реовируса птиц // Научн. основы производства вет. биол. преп.: Тез. докл. - Щелково, 2000. - С.95.

i. Бурдейная Л.В., Старов С.К. Профилактика реовирусного теносиновита птиц // 2овр. аспекты вет. патол. ж-ных: Матер, конф., посвящен. 40-летию ВНИИЗЖ. -Зладимир,1998. - с.235-238.

5. Бурдейная Л.В., Старов С.К., Борисов A.B. Антигенная актиь>хть вакц| против инфекционного реовирусного теносиновита // Пробл. инфекц. патологии с.-> ных: Тез. докл. конф.... - Владимир, 1997. - С.146.

6. Старов С.К., Борисов A.B., Бурдейная Л.В. Культивирование вакцина-штамма S1133 реовируса птиц II Пробл. инфекц. патологии с.-х. ж-ных: Тез. д( конф.... - Владимир, 1997. - С.144-145.

7. Бурдейная Л.В., Мельников В.В., Куляшбекова Ш.К., Старов С.К. Антиген активность комбинированной вакцины против реовирусного теносиновита и боле

_Марака,_введенная i \ыппятам-В-суточном-возрасте^/-Достижения-молодых-учены ветеринарную практику: Матер, конф. - Владимир, 2000. - С.74.

8. Старов С.К., Герасимова Н.И., Бурдейная Л.В. Технология получе| вакцинного штамма реовируса при специфической профилактике реовирусн теносиновита кур П Актуальные проблемы науки в агропромышлене комплексе:Матер. межвуз. научн.-пракг. конф. Т.1. - Кострома,2000. - С.154-155.

9. Старов С. К., Бурдейная Л.В. Изучение кратности введения жие реовирусной вакцины при специфической профилактике реовирусного теносинов! кур // Актуальные проблемы науки в агропромышленном комплексе: Матер. межЕ научн.-практ. конф. Т.1. - Кострома,2000. - С. 155-156.

Отпечатано на базе отдела координации научных исследований, информацм международных связей ВНИИЗЖ, тираж 80 экз., апрель 2001 г.