Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Течение реовирусного теносиновита в ассоциации с кокковыми инфекциями

На правах рукописи

ПРУГЛО ВЛАДИМИР ВЛАДИМИРОВИЧ

ТЕЧЕНИЕ РЕОВИРУСНОГО ТЕНОСИНОВИТА В АССОЦИАЦИИ С КОККОВЫМИ ИНФЕКЦИЯМИ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург-2005

Работа выполнена в отделе вирусологии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства, на птицефабриках различного технологического направления Омской и Ленинградской областей.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор ветеринарных наук

Трефилов Борис Борисович

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: доктор ветеринарных наук,

профессор, заслуженный деятель науки РФ Борисенкова Адель Наумовна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: - доктор ветеринарных наук, доцент

Соколова Лидия Николаевна - доктор ветеринарных наук, профессор Субботина Светлана Григорьевна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

Защита диссертации состоится «<_3_» июня 2005 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Узюмова О. В.

1. Общая характеристика работы 1.1. Актуальность темы.

В последнее время проблема смешанных инфекций (син.: ассоциированные инфекции, сателлитные инфекции, микстинфекции (БМЭ, 3-е изд., 1984)) в промышленном птицеводстве приобретает чрезвычайную актуальность в связи с возрастающей частотой выявления такой формы патологии. Особое значение имеет эта проблема при заболеваниях опорно-двигательного аппарата птиц.

Выраженная полиэтиологичность инфекционных болезней, широко распространенная одновременная циркуляция возбудителей вирусной и бактериальной природы и их накопление во внешней среде, высокая концентрация птицы на ограниченной территории и конвейерная технология производства закономерно приводят к возникновению новых взаимоотношений между макро- и микроорганизмами, а также способствуют естественному пассированию микроорганизмов и усилению их патогенных свойств. Все вышеперечисленное создает весьма благоприятные условия для возникновения ассоциированного инфицирования организма животного (Урбан В.П., Найманов И.Л., 1984; Гаффаров Х.3.и др., 2002).

Серологические и вирусологические исследования, проведенные во ВНИВИП, свидетельствуют о широком распространении реовирусной инфекции и ассоциированных форм ее течения у птиц разного возраста в хозяйствах РФ (Малушко В.В., Коровин Р.Н., 1992.; Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., 1996; Трефилов Б.Б., 2000). Смешанные реовирусно-бактериальные инфекции наносят существенный экономический ущерб промышленному птицеводству, затрудняют постановку диагноза и снижают эффективность проведенных противоэпизоотических мероприятий (Трефилов Б.Б. и др., 2003).

Инфекционными агентами, выделенными из пораженных суставов, являются как реовирусы (Ритова В.В., Трофимов Н.М., 1977), так и микроорганизмы бактериальной природы: стафилококки (Борисенкова А.Н. и др.), микоплазмы (Нваджей Б., 1989), кишечная палочка. Однако изучение взаимодействия этих возбудителей и вызываемые ими патологические процессы в организме птиц при ассоциированном течении не описаны.

В связи с вышеизложенными аспектами возникла необходимость изучения особенностей проявления реовирусной инфекции в ассоциации с бактериями. Данная работа является самостоятельным разделом

задания 07.01. отдела вирусологии ВНИВИП «Усовершенствовать методы диагностики, средства специфической профилактики и разработать меры борьбы с реовирусным теносиновитом кур» (№ госрегистрации 01.2.00 109631)

1.2. Цели и задачи исследований

Целью настоящей работы явилось изучение особенностей проявления и течения реовирусно-стафилококковой инфекции. Для её достижения были поставлены следующие задачи:

1. Изучить эпизоотическую ситуацию в некоторых птицеводческих хозяйствах Российской Федерации по реовирусной инфекции;

2. Изучить взаимодействие реовируса птиц и стафилококка (Staphylococcus aureus) в развивающихся куриных эмбрионах;

3. Изучить влияние стафилококка на репродукцию реовируса в культуре клеток;

4. Изучить влияние стафилококка на развитие и течение реовирусной инфекции у цыплят;

5. Разработать рекомендации по диагностике и профилактике реовирусной инфекции птиц.

13. Научная новизна

Проведен эпизоотологический мониторинг по реовирусному теносиновиту на трех птицефабриках и установлено, что болезнь часто протекает в ассоциации с другими инфекциями.

Впервые в экспериментальных условиях воспроизведена смешанная реовирусно-бактериальная инфекция на различных биологических моделях. Изучена клинико-патоморфологическая картина проявления ассоциированной реовирусно-бактериальной инфекции в развивающихся куриных эмбрионах и на цыплятах различных возрастных групп, а также влияние стафилококка на репродукцию реовируса в культуре клеток. Показано различие биологических особенностей штаммов реовируса птиц.

Впервые изучены особенности формирования иммунитета при реовирусном теносиновите у цыплят в условиях смешанной инфекции. Установлено иммуносупрессивное влияние стафилококка на формирование и напряженность иммунитета против реовирусного теносиновита в экспериментальных и производственных условиях.

1.4. Практическая значимость работы

Показано широкое распространение реовирусной инфекции, особенности её ассоциированного течения в условиях птицехозяйств Российской Федерации.

Доказана этиология заболевания с поражениями в области головы у кур. В эксперименте на суточных цыплятах воспроизведена реовирусная инфекция с синдромом малабсорбции и задержкой роста.

На основании проведенных исследований разработаны «Рекомендации по диагностике и профилактике реовирусной инфекции птиц» и составлен информационный обзор на тему: «Болезни опорно-двигательной системы у птиц».

1.5. Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на методических советах отдела вирусологии и опухолевых болезней птиц ВНИВИП (2002-2004 гг.), на юбилейной Международной конференции, посвященной 300-летию г. Санкт-Петербурга (17-19.06.03), международной научно-практической конференции «Современные вопросы патологии сельскохозяйственных животных» (г. Минск, 2324.10.03) и международной юбилейной научно-практической конференции «Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве (г. С-Петербург-Ломоносов, 14-16.09.04).

1.6. Публикации

По теме диссертации опубликовано десять научных статей. Публикацию работ проводили в журналах «Животноводство России», «Вестник Россельхозакадемии», «РацВетИнформ», материалах Международных и Юбилейных конференций.

1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые на

защиту:

• Результаты эпизоотологического обследования птицехозяйств на реовирусную инфекцию;

• Взаимодействие реовируса и стафилококка {Staphylococcus aurew) в развивающихся куриных эмбрионах;

• Влияние стафилококка на репродукцию реовируса птиц в культуре клеток куриных фибробластов;

• Влияние стафилококка на течение реовирусного теносиновита у цыплят;

• Формирование иммунитета против реовирусного теносиновита при смешанной реовирусно-стафилококковой инфекции.

1.8. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и список литературы. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами, 6 диаграммами и 37 рисунками (фотографиями). Список литературы включает 244 источника, из которых 181 зарубежный.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в 2002-2004 гг. в соответствии с утвержденным планом научно-исследовательской работы Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства.

Соисполнителями отдельных фрагментов работы были старший научный сотрудник Королев A.M. и научный сотрудник Новикова О.Б.

Эпизоотологическое обследование птицехозяйств проводили согласно методике, разработанной ВНИВИП. При изучении эпизоотической ситуации по отношению к реовирусной инфекции птиц на птицефабриках различного направления использовали вирусологические, бактериологические и серологические методы исследования. Патологический материал для изоляции вирусов и проведения бактериологического исследования брали от цыплят разного возраста, выбракованных в процессе технологического цикла, у которых наблюдали суставную патологию конечностей и обнаруживали антитела к реовирусу.

Пораженные конечности, головы и кусочки внутренних органов (печень, селезенка, почки, кишечник) убитых или павших цыплят до проведения лабораторных исследований хранили в морозильной камере при температуре -12°С. Подготовку патологического материала для вирусологических исследований проводили согласно общепринятым методикам.

Смешанное течение реовирусного теносиновита и

кокковых инфекций изучали на трех биологических системах: первичной культуре фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), развивающихся куриных эмбрионах и цыплятах разных возрастных групп.

При выполнении работы использовали следующие штаммы реовируса и стафилококк:

• Вакцинный штамм «ВНИВИП», эмбриональный вариант, аттенуированный перемежающимися пассажами на куриных эмбрионах и в культуре клеток;

• Эпизоотический штамм «СП-73» выделен от индюшат и любезно предоставлен Германом В. В.;

• Вирусный изолят «С-02» выделен от цыплят бройлеров ЗАО «Птицефабрика Сибирская» (ВНИВИП);

• Стафилококк золотистый патогенный (Staphylococcus aureus) был любезно предоставлен в отделе микробиологии ВНИВИП. Поддерживали на обычных питательных средах МПБ и МПА.

Все штаммы вируса использовали в дозах, определяемых путем титрации на куриных эмбрионах или в культуре клеток.

Цыплят, развивающиеся куриные эмбрионы или племенное яйцо получали из птицефабрик или фермерских хозяйств, благополучных по острым инфекционным болезням птиц.

При постановке экспериментов подопытные и контрольные группы сформировали по принципу аналогов. Для проведения всех исследований было использовано 2000 эмбрионов и 400 цыплят, проанализировано методом ИФА 600 проб сывороток крови от птиц различных возрастных групп.

Первично-трипсинизированную культуру клеток готовили по методу Dulbecco R. & Vogt MJ. (1954) в модификации Younger J.S. (1954) из кожно-мышечной ткани 10-11-суточных СПФ-куриных эмбрионов, описанной в соотвествующих руководствах (Голубев Д.Б., и др., 1976). Ростовая среда состояла из: среды Игла MEM и среды №199 в соотношении 2:1, 10% сыворотки крупного рогатого скота неконсервированной и антибиотиков (пенициллина ЮОЕД/см3, стрептомицина 100 мкг/см3 и канамицина ЮОЕД/см3). Инфекционную активность штаммов реовируса определяли титрованием на 9-суточных эмбрионах кур, культурах клеток по общепринятой методике и рассчитывали по методу Reed L. & Muench H.(1938) (Сюрин В.Н., и др., 1986).

Наличие специфических антител к реовирусу в сыворотках крови птиц определяли в реакции нейтрализации и методом иммуноферментного анализа с использованием диагностических наборов производства ВНИВИП и СИНКО-ВНИИЗЖ. Обнаружение реовирусного антигена в культуре клеток проводили прямым методом флуоресцирующих антител по Coons A.H. & Kaplan M.N. (1950), описанным Шесточенко М.А. и Кузьминым Н.А.(1979).

Стафилококковую сыворотку получали из лаборатории люминесцирующих сывороток при НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Для статистической обработки результатов исследований использовали разностный метод Стьюдента-Фишера (Терентьев П.В., Ростова Н.С., 1977) с применением программы Microsoft Excel 2002.

2.2. Данные эпизоотологического обследования птицехозяйств

Анализ эпизоотических данных, проведенный в отделе вирусологии ВНИВИП показал, что реовирусный теносиновит (РВТ) продолжает оставаться распространенным заболеванием в промышленных птицехозяйствах как мясного, так и яичного направлений. При проведении комплексных исследований на протяжении многих лет РВТ выявили в 90-95% обследованных птицехозяйств.

Такому широкому распространению этой болезни способствуют биологические особенности возбудителя (длительное персистирование в организме птицы, устойчивость к физическим и химическим воздействиям); наличие множества серовариантов, использование племенного материала без учёта эпизоотической ситуации в данном хозяйстве, высокая концентрация птицы, несовершенство и/или несоблюдение технологии выращивания. Течение инфекционного процесса, вызванного реовирусами птиц, осложняется присутствием в хозяйствах различных агентов вирусной и бактериальной природы. В связи с этим РВТ в птицехозяйствах протекает как в форме моно-, так и смешанной (ассоциированной) инфекции.

За период 2002-2004 гг. нами был проведен мониторинг проявления реовирусного теносиновита в птицехозяйствах Омской (ЗАО «Птицефабрика Сибирская») и Ленинградской областей (СПК «Птицефабрика Ударник», ЗАО «Птицефабрика Синявинская»).

В каждом хозяйстве анализировали эпизоотическую обстановку, выясняли условия, способствующие распространению и развитию

возбудителя, определяли источники инфекции, оценивали условия содержания, кормления птиц и формирования стада.

Родительское стадо обследованных хозяйств комплектуется суточным молодняком и/или племяйцом из птицефабрик, где ранее была зарегистрирована реовирусная инфекция и начата вакцинация птицы инактивированной вакциной «Provac» (пр-во «Ford Dodge»),

ЗАО «Птицефабрика Сибирская» мясного направления (кросс «Смена»). В 1998 году в хозяйство был завезён племенной материал с птицефабрики «Рефтинская» Свердловской области. У цыплят (12-14 суток) в период выращивания наблюдали следующие клинические признаки: диарея, отставание в развитии, взъерошенность перьевого покрова («вертолётные перья»). У птицы в возрасте 19-28 суток отмечали поражения суставов конечностей (опухание латеральных сухожилий голени и в области над пяточной костью, «ходульная» походка, хромота различной степени, артриты).

На основании клинико-серологических исследований и собранных эпизоотологических данных был поставлен предварительный диагноз -реовирусная инфекция и принято решение провести вакцинацию родительского поголовья в возрасте 110 дней инактивированной вакциной из штамма S 1133 против данного заболевания. Напряжённость иммунитета у птиц в 150 дней составила 92%, постепенно понижаясь к 300-дневному возрасту в два раза, а к 400 - в 3-4 раза.

Однако проведённые мероприятия не давали положительных результатов, потому что уровень специфических антител у родителей к концу эксплуатации не обеспечивал защиту молодняка в суточном возрасте от инфицирования полевым вирусом.

При клиническом осмотре родительского поголовья у петухов в возрасте 250-300 дней и старше в 100% случаев наблюдали патологию конечностей в виде: артритов, синовитов, пододерматитов с некрозом мякиша подошвы одной или обеих конечностей, птица малоподвижна, передвигается с трудом.

Из пораженных суставов были изолированы реовирус, Staph. aureus, E.coli, Mycoplasma gallisepticum, а из внутренних органов цыплят -реовирус (табл.1).

Установили, что в помещении, где содержалось родительское стадо, способствующими факторами распространения инфекции являлись неудовлетворительное состояние подстилочного материала, повышенная влажность, запылённость и повышенное содержание аммиака в птичнике.

СПК «Птицефабрика Ударник» комплектуется суточным

молодняком кросса «Lohmann-Braun» и специализируется на производстве товарного яйца.

При клиническом осмотре кур-несушек отмечали удовлетворительное состояние птицы, перьевой покров гладкий, гребешки и сережки ярко красные, активна, яйценоскость 90-95%. У отдельных индивидуумов наблюдали ограниченное опухание скакательного или голеностопного сустава и хромоту различной степени тяжести. Птица с поражёнными суставами, которую выбраковывали при выращивании, составляла 1-2%. У птиц в возрасте 200 дней и старше на голове в области гребешка и на надглазничной дуге наблюдали плотные инкапсулированные фибринозные образования.

Таблица 1.

Данныеэпизоотического состояния обследованныхптицефабрик

Наименование хозяйства Дата обследования, год Выделенный вирус Другие возбудители

ЗАО «Птицефабрика Сибирская» Str.

2002 Реовирус «С-02» zooepidemicus, E.coli, М. gallisepticum

СПК «Птицефабрика Ударник» 2003-2004 Реовирус «У-03» Staph. aureus, E. coli, M. gallisepticum

АОЗТ «Птицефабрика Синявинская» 2003 Реовирус «Син-03» M. gallisepticum, Болезнь Марека (гистологически).

При лабораторном исследовании из патматериала (поражённые суставы, головы, внутренние органы от молодняка 15-28 суточного возраста) был выделен реовирус, стафилококки, микоплазма, а в сыворотке крови от разновозрастной птицы методом ИФА выявлены антитела к реовирусу.

ЗАО «Птицефабрика Синявинская» яичного направления, комплектуется собственным суточным молодняком, кросс «Hisex white».

При комплексном обследовании хозяйства установлено неблагополучие по болезни Марека. Гибель птицы от неё составила 60-

80% от общего числа павших по разным птичникам. Данные иммуноферментного анализа показали, что в сыворотке крови птиц различного возраста присутствуют специфические антитела к реовирусу в высоких титрах до 1:6000 в 100% случаев, что свидетельствует о циркуляции возбудителя в стаде и подтверждено изоляцией этого вируса.

Проведенный эпизоотологический мониторинг на реовирусную инфекцию показал, что реовирусный теносиновит широко распространен в птицеводческих хозяйствах и чаще встречается в форме смешанной инфекции.

23. Изучение ассоциированного течения реовирусной и кокковых инфекций

Оценка изменений, происходящих в любой биологической системе в результате ассоциированной инфекции, вызываемой реовирусом и кокковыми инфекциями, может базироваться только на сравнительном анализе поражений при моноинфекции. Поэтому нами были проведены несколько серий опытов для получения «чистых» инфекций и последующей оценки отличительных признаков и поражений при их ассоциированных формах. Для подтверждения результатов и отслеживания динамики развития поражений опыты проводили на различных биологических моделях: развивающихся куриных эмбрионах, культурах первично-трипсинизированных клеток и цыплятах различных возрастных групп.

23.1. Влияние стафилококка на репродукцию реовируса теносиновита в куриных эмбрионах

При изучении смешанной реовирусно-кокковой инфекции на куриных эмбрионах были сформированы подопытные и контрольные группы, которых заражали различными штаммами реовируса птиц и суточной бульонной культурой золотистого стафилококка в различных объемах и сочетаниях.

При заражении куриных эмбрионов (КЭ) культурой Staphilococcus aureus в объеме 0,2 см3, отмечали гибель 20% от общего числа КЭ в группе. Примечательно то, что в группе с первичным заражением Staph. aureus и через 24 часа реовирусом смертность КЭ также была весьма низкой и ограничивалась 40%, хотя во внутренних органах эмбрионов и на хориоаллантоисной оболочке присутствовали признаки, характерные как для реовирусной, так и для стафилококковой инфекции (табл. 2).

Макроскопические изменения в развивающихся

куриных эмбрионах при реовирусно-стафилококковой инфекции зависят от штамма реовируса, последовательности и интервала заражения инфекционными агентами. К основным, наиболее характерным поражениям, наблюдавшимся у развивающихся куриных эмбрионов в результате смешанной инфекции можно отнести:

■ Образование на хориоаллантоисной оболочке крупных бляшек с обширными некротическими фокусами в центре и множественными геморрагиями по краям.

Отставание эмбрионов в развитии. Отеки затылочной области и подчелюстного пространства, зародыши застойно гиперемированы. На спине, шее и в затылочной области множественные точечные или полосчатые симметричные кровоизлияния. Пальцы конечностей скрючены.

Таблица 2

Гибель куриных эмбрионов при смешаннойреовирусно-кокковой

инфекции

Динамика гибели Общий

№№ Первичное Вторичное эмбрионов, % %

групп заражение заражение 48* 72 96 120 гибели

24* 48 72 96

1. Reo "ВНИВИП" — - 20 30 - 50

2. Reo "СП-73" — - 20 60 80

3. Reo "C-02" — 10 30 40

4. Reo "ВНИВИП" + Staph.aureus - 10 20 50 - 80

5. Reo "СП-73" + Staph.aureus 10 - 60 30 100

6. Reo "C-02" + Staph.aureus - 50 10 20 - 80

7 Reo "ВНИВИП" Staph. aureus - 40 60 - 100

8. Reo "СП-73" Staph. aureus - 20 80 - 100

9. Reo "C-02" Staph. aureus - 10 40 50 100

10. Staph. aureus Reo "ВНИВИП" - - 40 - 40

11. Staph. aureus Reo'^^" - - - 30 30

12. Staph. aureus Reo "C-02" - - 10 30 40

* Часы после первого заражения

** Часы после второго заражения

• Патологоанатомические изменения внутренних органов: печень глинистого цвета, ломкая, увеличена, с некрозами по краям и в паренхиме. Отмечаются точечные кровоизлияния под капсулой. Сердце бледное (цвета «вареного мяса»), единичные некрозы. Селезенка увеличена, застойно гиперемирована. Почки значительно увеличены, кровенаполнены.

При гистологическом исследовании срезов из внутренних органов КЭ при смешанной инфекции наблюдали нарушения гемодинамики во всех обследованных органах. Так, в сердце отмечали геморрагическую инфильтрацию миокарда, в основном, между мышечными пучками, сильно выраженное истончение и разволокнение мышечных пучков, в печени - нарушение структуры печеночных балок и их распад на отдельные печеночные пластинки и многочисленные гепатоциты. В почках интерстициальная ткань диффузно инфильтрирована элементами крови, наблюдали разрушение эпителия мочевых канальцев, коагуляция цитоплазмы эпителиальных клеток, плазмо- и кариолизис; в отдельных случаях отмечали гипертрофию сосудистых клубочков (нефрона).

Результаты опытов показали, что гибель куриных эмбрионов при смешанной вирусно-стафилококковой инфекции наступала раньше по времени и была выше в 1,5-2,0 раза при первичной инокуляции реовирусом и вторичном заражении через 24 часа стафилококком.

2.3.2. Взаимодействие стафилококка и реовируса в культуре клеток

куриных эмбрионов

Актуальность проблемы смешанных вирусно-бактериальных инфекций вызывает необходимость изучения подобных процессов, происходящих не только в организме, но и непосредственно на уровне клетки. Исследования проводили в культуре клеток куриных эмбрионов. В процессе работы использовали вакцинный штамм «ВНИВИП» реовируса теносиновита с биологической активностью 6,7 ^ ТЦЦ50 и эпизоотический штамм СП-73 с инфекционным титром 5,67 ^ ТЦЦ50, а также золотистый стафилококк, патогенный, обладающий гемолитической и гшазмокоагулирующей активностью с содержанием 109 микробных клеток/см3 суточной бульонной культуры.

Бактериологические тесты проводили по общепринятым методикам, морфологические изменения в клетках изучали методом

иммунофлуоресценции. Культуру куриных фибробластов

выращивали в пробирках на покровных стеклах. Через определенные сроки после инокуляции реовируса и стафилококка стекла извлекали из пробирок и окрашивали специфическими сыворотками, меченными флуоресцеин-изотиоционатом.

Опыты сопровождали контрольными исследованиями на специфичность свечения.

Клетки тканевой культуры куриных эмбрионов инфицировали различными штаммами реовируса птиц, а затем через 24 часа (или одновременно) патогенным стафилококком. В качестве контролей использовали незараженную культуру клеток, а также тканевые культуры, инфицированные только реовирусом птиц или стафилококком. Пробы для проведения вирусологических и морфологических исследований отбирали через 6, 8, 16 и 24 часа после введения стафилококка в монослой клеточной культуры.

Опыты показали, что стафилококк оказывал сильное цитопатогенное действие, которое выражалось в сморщивании большей части клеток и сползании участков монослоя. Уже через 6 часов после заражения наблюдался некроз клеток, через 12 часов разрушалось около 50% клеток, а к 24 часам наблюдали полную деструкцию клеточного слоя.

При одновременном заражении и совместном культивировании реовируса птиц и стафилококка наблюдали более выраженную дермонекротическую активность стафилококка.

В культуре клеток, предварительно инфицированной реовирусом с последующей инокуляцией стафилококка, наблюдали усиление дегенеративных изменений в клетках монослоя. Так, почти полную деструкцию клеточного пласта отмечали через 8 часов после наслаивания стафилококка, что в 2-2,5 раза быстрее, чем при моноинфекции. Стафилококк, введенный в тканевую культуру после инокуляции реовирусом, вызывал лизис клеток и способствовал освобождению вируса в культуральную среду, что выражалось в увеличении титра вируса в жидкой фазе на 0,7 -1,0 по сравнению с контролем.

В результате проведенных исследований выяснили, что золотистый стафилококк в условиях экспериментальной смешанной реовирусно-бактериальной инфекции в культуре клеток куриных эмбрионов активно способствует дегенерации клеток, ускоряя тем самым разрушение клеток монослоя и освобождения вируса в культуральную среду.

2.33. Влияние кокковой инфекции на течение реовирусного теносиновита у цыплят

При экспериментальной смешанной реовирусно-кокковой инфекции у подопытных цыплят отмечали комплекс патологических изменений, характерных как для бактериальной, так и для вирусной инфекции. Однако поражения носили значительно более тяжелый характер. Признаки заболевания также сильно варьировали в зависимости от дозы и штамма вируса или бактериального агента.

В первые дни после инокуляции инфекционных агентов во всех группах отмечали сильно выраженную местную реакцию в виде припухлости, а в некоторых случаях - некроз тканей в течение первых двух суток и быструю гибель цыплят с признаками септицемии, чего не наблюдали при заражении только стафилококком. Гибель цыплят, зараженных вирусом и бактериальным агентом, колебалась в пределах от 70 до 100% в течение первой недели после заражения, при этом обнаруживалась корреляция с вирулентностью штамма реовируса и метода введения агентов (табл. 3). Максимальный отход зафиксировали при одновременном заражении Staphylococcus aureus и штаммами реовируса: «СП-73», «С-02». Так, при введении реовируса в мякиш подошвы, вне зависимости от способа инокуляции стафилококка, отмечали снижение смертности цыплят на 10-15% по сравнению с таковым при подкожном введении в нижнюю треть шеи.

При инфицировании в мякиш лапы у птиц наблюдали хромоту, опухание голеностопных суставов, конечности горячие и болезненные при пальпации. Птица с трудом передвигалась, состояние угнетенное. У цыплят, больных смешанной инфекцией, и выживших в первую неделю после инокуляции, отмечали деформацию конечностей, а также отставание в росте и развитии.

Для этих цыплят были характерны признаки реовирусной инфекции:

• наличие желтого пуха на голове («желтые головы»), так называемая «вертолетная птица» - торчащие в разные стороны и под разными углами перья;

• поражения конечностей, обусловленные патологическими изменениями в сухожильно-связочном аппарате.

Таблица 3

Гибель цыплят при экспериментальной «чистой» и смешанной реовирусно 'стафилококковой инфекциях

Группы цыплят Метод заражения Гибель цыплят, % Общий % гибели

дни после заражения

1-й | 2-й | 3-й | 4-й | 5-й | 6-й | 7-й

Яео"81133"+ 8ШрЬ_.аигеш г/к 10 30 10 50

и/о

Яео"81Ш" гук 5 5

Яео "81 133" + 81арЬ.ащеш п/л 60 20 80

и/о

Яео"81133" + 81арЬ.ашещк п/к 40 20 60

п/л

Яео"81133" п/л 0

Яео"Сп-73" + 81арЬ.ашещк п/л 10 20 10 50 90

и/о

Яео "СП-73" п/л 10 10

Яео -СП-73- + 81арЬ.аигещк гук 30 20 40 10 100

п/л

Яео "СП-73" п/к 10 10

81арЬ.ащгещ8 и/о 10 10 20 40

81арЬ.ащгещк п/л 10 20 10 40

Яео "С-02" + 81арЬ.ащгещк п/к п/л 30 30 60

Яео «С-02» гук 20 20

Яео «С-02» п/л 10 10

Контроль 0

п/к - подкожно; п/л - в подушечку лапы; и/о - инфраорбитально

Для выяснения влияния больших доз возбудителя, кратности введения и вторичной бактериальной инфекции на проявление признаков заболевания была проведена серия опытов по заражению цыплят в возрасте 30 дней вирусным изолятом «С-02» в больших дозах при двукратном введении с недельным интервалом. На 18 и 30 сутки после первой инокуляции реовируса брали кровь для проведения серологического исследования.

К концу второй недели у 20% подопытных цыплят отметили нарушение положения конечностей и деформацию пальцев, хотя птица оставалась активной и сохраняла аппетит. Заболевание быстро прогрессировало и через две недели (28 день после первой инокуляции) было поражено 100% особей. Птица неохотно передвигалась, однако потребление кормов снижено незначительно. Конечности подвернуты медиально, суставы деформированы, опухшие и горячие на ощупь, болезненные, плотные, пальцы скрючены. Птица находилась в неестественном положении, в области мякишей лап -некротический пододерматит. При бактериологическом исследовании из подушечки лапы был выделен золотистый стафилококк.

2.4. Изучение влияния сопутствующих кокковых инфекций на напряженность поствакцинального иммунитета против реовирусного теносиновита

Известно, что суточные цыплята являются наиболее восприимчивыми к реовирусам птиц непосредственно после вывода и становятся более резистентными к инфекции с возрастом. Для защиты цыплят было бы идеальным и наличие материнских антител при выводе и защита активной иммунизацией в период после исчезновения желточных антител. Однако основными препятствиями при выработке полноценного и активного иммунитета у цыплят являются вторичные инфекции и специфичные материнские антитела.

При изучении влияния сопутствующих бактериальных инфекций на формирование активного иммунитета у цыплят после применения аттенуированных вакцин в первую неделю после вывода и инактивированных вакцин у родителей, отслеживали динамику образования реовирус-специфических антител в иммуноферментном анализе. Мониторинг выработки иммунитета против реовирусной инфекции проводили на птице, как в экспериментальных условиях, так и при эпизоотологическом обследовании птицехозяйств. Получение исследуемых сывороток, постановка реакций и расчет результатов осуществляли по общепринятым методикам и наставлениям по применению наборов.

Анализ проб сывороток крови цыплят, вакцинированных в возрасте 10 суток и от цыплят, инфицированных в возрасте 30 суток, показал нарастание титров специфических антител и значительную корреляцию между уровнями титров и наличием вторичного

заболевания, как вирусной, так и бактериальной природы.

Результаты полученных экспериментальных и эпизоотологических данных свидетельствует, что в случае сопутствующей инфекции, уровни титров антител к реовирусам птиц были значительно ниже и составляли в среднем не более 30 % от аналогичных показателей у здоровой птицы (диагр.1). При этом также наблюдали неоднородность иммунологического статуса поголовья, что свидетельствует о неравномерной защите птиц от заражения эпизоотическим вирусом.

Диаграмма 1

Формирование иммунитета против РВТу здоровой птицы и на фоне сопутствующихинфекций

3. Выводы

1. Анализ эпизоотической ситуации в РФ по реовирусному

теносиновиту за последние годы свидетельствует о широком распространении болезни. Полученные данные позволили установить, что РВТ часто протекает в сочетании как с бактериальными, так и с другими вирусными инфекциями.

2. Выделены вирусные изоляты, которые идентифицированы как

реовирус птиц. Выявлен широкий спектр патогенности вирусных изолятов, циркулирующих на территории РФ.

3. На цыплятах экспериментально воспроизведена реовирусная

инфекция с синдромом малабсорбции. Установлена этиология заболевания с поражениями в области головы у кур.

4. При смешанной реовирусно-стафилококковой инфекции на

куриных эмбрионах отмечали задержку роста и развития, нарушение гемодинамики, образование некротическо-геморрагических бляшек на хориоаллантоисной оболочке и высокий процент гибели. Патоморфологические изменения характеризовались геморрагической инфильтрацией в миокарде, нарушением структуры печеночных балок и их распадом, разрушением эпителия почечных канальцев, плазмо- и кариорексисом эпителиальных клеток и диффузной инфильтрацией элементами крови в интерстиций почки.

5. Стафилококк в условиях инфицированной реовирусом культуры

клеток способствует активной дегенерации клеток и разрушению монослоя, проявляя выраженную некротическую активность и, тем самым, способствуя освобождению реовируса в культуральную среду, что выражалось в увеличении титра вируса в жидкой фазе на 0,7 -1,0 по сравнению с контролем.

6. Реовирусно-стафилококковая инфекция у цыплят до 10-суточного

возраста протекала в септической форме с высоким процентом гибели, у птиц старших возрастов она характеризовалась суставной патологией, деформацией конечностей и пододерматитами.

7. При смешанной инфекции реовирус создает условия для

размножения стафилококка и способствует его диссеминации. Сочетание этих двух механизмов, очевидно, приводит к проявлению значительного синергидного эффекта.

8. Установлен феномен иммуносупрессии при

смешанной реовирусно-стафилококковой инфекции,

выражающейся в нарушении формирования иммунитета против реовирусного теносиновита после переболевания, а при наличии сопутствующих инфекций в хозяйстве - ослаблении и неоднородности поствакцинального иммунитета.

Практические предложения

1. Рекомендации по диагностике и профилактике реовирусной инфекции птиц.

2. Информационный обзор «Болезни опорно-двигательной системы у птиц».

3. Материалы, изложенные в диссертационной работе, будут использованы в учебном процессе со студентами, на курсах повышения квалификации ветеринарных врачей и работе в промышленном птицеводстве.

5. Список опубликованных работ

1. Трефилов Б.Б., Борисенкова АН., Новикова А.Ф., Новикова О.Б., Пругло В.В. Ассоциированное течение реовирусной и бактериальных инфекций // Вестник Россельхозакадемии. -2003, -№ 4, -С.66-68.

2. Пругло В.В. Проблемы реовирусной инфекции (эпизоотология, диагностика и профилактика) // Юбилейная Международная Конференция, посвященная 300-летию г. Санкт-Петербурга: Материалы конф., Санкт-Петербург, 17-19 июня 2003 г. -СПб., 2003. -С.93-94.

3. Пругло В.В. Смешанная бактериально-вирусная инфекция в куриных эмбрионах, вызванная реовирусом птиц и стафилококком // Современные вопросы патологии сельскохозяйственных животных: Материалы международной научно-производ. конф., Минск, 23-24 октября 2003 г. -Минск, 2ООЗ.,-С81

4. Трефилов Б.Б., Пругло В.В. Реовирусная инфекция птицы // Животноводство России. -2003, -№10, -С.8-10.

5. Коровин Р.Н., Трефилов Б.Б., Пругло В.В. Реовирусы птиц // РацВетИнформ. -2004, -№8,9, -С.7-9.

6. Дубовой А.С., Самусева Г.Н., Пругло В.В., Явдошак Л.И. Оптимизация методики культивирования производственного штамма реовируса птиц // Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве: Материалы международной юбилейной научно-практической конф., С-Петербург-Ломоносов, 14-16 сентября 2004 г. -СПб., 2004. -С.96-97.

7. Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Сморчкова Т.Н., Пругло В.В., Лозовский B.C., Степнова Н.С. Антигенная вариабельность реовирусов птиц // Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве: Материалы международной юбилейной научно-практической конф., С-Петербург-Ломоносов, 14-16 сентября 2004 г. -СПб., 2004. -С.93-94.

8. Трефилов Б.Б., Пругло В.В., Лозовский B.C., Степнова Н.С. Биологические свойства штаммов реовирусов птиц // Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве: Материалы международной юбилейной научно-практической конф., С-Петербург-Ломоносов, 14-16 сентября 2004 г. -СПб., 2004.-С.91-93.

9. Трефилов Б.Б., Коровин Р.Н., Никитина Н.В., Явдошак Л.И., Пругло В.В. Рекомендации по диагностике и профилактике реовирусной инфекции птиц. -СПб.:ВНИВИП,2004.-32с.

10. Трефилов Б.Б., Пругло В.В. Болезни опорно-двигательной системы у птиц. Информационный обзор. - СПб.: ВВМ, 2004. - 64с.

Подписано в печать 26 04.2005 г. Заказ № 592227, тираж 100 экз. Объем 1,5 п.л. Отпечатано в типографии ТИНТО

Санкт-Петербург, Московский пр., 74Б

89

<> г сг с с О