Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка технологии изготовления и контроля ассоциированной инактивированной вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней

Ни правах рукописи Дли служебного полыоппмпн №7 дем о г 18.04.2001г.

ЭК1 № б"

УДК 619: 616.98: 578.833: 578.822.2: 615.371

1СУРМАП Игорь Ярослаиоинм

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И КОНТРОЛЯ АССОЦП И РОВА1II ЮН ШШП ИВИРОПАПИОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РЕПР0ДУ1СТ11В110-РЕС11ИРАТ0Р110Г0 СИНДРОМА II ПАР1Ю1ШРУСИОЙ ИНФЕКЦИИ СВИНЕЙ

16.00.03 "Ветеринарная микробиология, вирусология, липоотологпя, микология с мпкотокепколошей и иммунология"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1!ладим11|)-2001

Работа выполнена d ФГУ Всероссийский иаучпо-исслсдопатсльскпП iineiinyi защиты животных Министерства сельского хозяйств Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, старший научный алрудиик БпйбиконТ. 3.

Официальные оппоненты: - доктор ветеринарных наук Гусалеев B.C.

(ВНИИЗЖ, г. Владимир);

- доктор биологических паук Ерсмсц П.И. (ШШиТИБМ, г. Щелково).

Ведущее учреждение: Всероссийский государственный иаучпо-псслсдопптсльскнй институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратом (ВГНКИ, г. Москва).

Защита диссертации состоится часов на

заседании диссертационного совета Д 220.015.01 п ФГУ Всероссийским научно-исследовательский институт защиты животных но адресу: 600900, г. Владимир, и. Юрьевсц, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться п библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных.

Автореферат разослан "JJ " ...^J^.^rS...... 2001г.

Ученый секретарь диссертационного совета

I '.М. Ссмеиона

OI>IДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ашпучпышгть темы, Реиродукптно-рссниратрими синдром cninicil (PI'CC) и иарттнрусиая инфекции ciimieii (I IUI 1С) - 'Jio iii.RimoKumai iiotiimc 'JiiCiMicii.'iiiiiM CMiincil, котами хнрактсртуняся нарушением функции поепрон-людстна у сиииоммгок, «боргами, рождением мерших или слабых порос л г с пмсокон их смертностью (Б.Г. Оряяикни и др.,1987; Л.II. Панин и др.,1994; H.II. Сюрип и др., 1998; Christiansen W.'J'. el nl., 1994).

l'/'CC зпрансгри/юнплн и конце 80-х годсм сначала н лспяПеишх США и Канады, a j.ticm и iio многих других странах (Botiier Л. ct al.,1994; Mardassi II. el nl.,1994). К середине 90-х годоп им была охиачена почт» пся Европа (Christiansen W.T.,1994; Joo U.S.. 1994; Albina Г... 1997,1998). 13 России и и некоторых других eipaiiax СНГ I'1'CC регистрируемся с 1993 годи (U.A. Мищенко и др., 1994; М.Ф, IJiiiiiNjiKOii и др., 1997).

иозбудитель рспродуктпшю-рсспираторного енндрома cniincii - РНК-содержащим »прус, ошосящнНся к роду Artcrivirus семсИстиа Artcriviridac, впервые был пмделеп и 1991 г. н паями "иирус Лелнстад" (A.A. Колонцоп,1998; Murphy P.A., 1996).

Масеонме iiciimiiikii l'1'CC наносят большой экономический урон спннонодчсекпм xojiiüctdíim. По данным различных псточпикои, юдоная продукт тнюен. при острой испышке l'1'CC снижается па 5-20 % (Van Alstine W.C¡.. 1991; Zimmerman J .J., 1991; Möllensen S., 1992).

Ипрус PI'CC обладает иммупосунрссшин.шн споПетпамп (Мищенко H.A., 1995, 1997; Gnjccki M.el al., 1996) н эго создает предпосылки для полткнонспия шорпчиых иируепмх или бактериальных инфекций (H.A. Мпщснко, 1995). Уешпоилсно, 'ми п болмнинете смпшподческнх хозннсгн, иеСшатиолучпмх по PI'CC. одиоиремспио циркулирует и iiapnoiiiipyc ciuiiicii (С.А. Кукушкин, 2000; Christianson W.T., 1994).

IJ настоящее мрсмя в ряде стран основным среде i пом борьбы с III31IC и PI'CC ЯНЛЯС1СИ специфическая нрофплактка, для Koiopoii нрименякнея пнактимпромаипые пакцинм (Ii.Г. Орлинкпн и др., 1988, 2000; II.И. Скпорцопа н Лр.,1989; H.A. Мищенко н др., 1996). Следовательно, разработка oic4cciiicnmiii

инакгивированной эмульсионной ассоциированной вакцины против 1'РСС и ПВИС является актуальной задачей ветеринарной науки, применение которой позволит значительно улучшить эпизоотическую ситуацию по этим заболеваниям в стране.

Цели и задачи исследования. Основной целью данных исследований являлось разработать технологию изготовления и контроля иммуногенной активности инакгивированной эмульсионной ассоциированной вакцины против РРСС и ПВИС.

Дпя^шолнения^оставленной~цел1гнеобхш1шо~бшо~решнть~следу1ощйё~" задачи:

- разработать оптимальные условия культивирования вируса РРСС, штамма "БД", в перевиваемой линии культуры клеток Магс-145;

- разработать режим инактивации вируса РРСС димером этиленимина и подобрать приемлемый масляный адьювант для изготовления вакцины против РРСС;

- разработать непрямой вариант ИФА выявления антител против вируса РРСС в сыворотках крови свиней для оценки у них поствакциналыюго иммунитета;

- изучить иммуногенные свойства инакгивированной ассоциированной вакцины против РРСС и ПВИС в лабораторных условиях и дать оценку эффективности ее применения в производственных условиях.

Научная новизна исследований. Разработан метод культивирования вируса РРСС роллерным способом, при использовании которого вирус репродуцируется в высоких титрах.

Разработан режим инактивации вируса РРСС, штамм "БД", димером этиленимина.

Установлено, что на одновременное введение антигенов вируса РРСС и парвовируса свиней в составе ассоциированной инакгивированной вакцины у свиней вырабатываются специфические антитела против РРСС и ПВИС на достаточно высоком уровне.

Установлено, что оптимальным соотношением инактивированных антигенов вируса РРСС и парвовируса свиней при изготовлении ассоциированной вакцины является соотношение 2:1 соответственно.

Разработана методика постановки непрямого варианта ИФА для выявления специфических антител против вируса РРСС с целью изучения поствакциналыюго иммунитета.

Практическая значимость исследований. Впервые разработаны технология изготовления и контроля эмульсионной инактивированной ассоциированной вакцины против РРСС и ПВИС, а также наставление по ее применению.

На основании проведенных исследований составлена и утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхоза России нормативно-техническая документация на вакцину эмульсионную инактивированную против РРСС и ПВИС. Вакцина производится на базе ВНИИЗЖ и широко внедрена в ветеринарную практику, показана ее эффективность в неблагополучных хозяйствах.

Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ 11.04.2000г.:

- "Методика получения антигена вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для использования в иммуноферментном анализе";

- "Методика определения антител в сыворотке кровн свиней к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом непрямого иммуноферментнго анализа".

Публикации научных исследований. Но теме диссертации опубликовано 14 научных работ.

Апробации работы. Материалы диссертации доложены па научных конференциях "Современные аспекты ветеринарной патологии животных" (Владимир, 1998г.), "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов" (Щелково, 2000г.), "Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику" (Владимир, 2000г.), а также на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 1998-2001гг.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 168 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы,

практические предложения и приложения. Список литературы включает 273 источника, в том числе 195 работ на иностранном языке. Работа иллюстрирована 6 рисунками и 22 таблицами.

Основные положения, выносимые на защиту:

- условия культивирования вируса РРСС, штамм "БД", в перевиваемой линии культуры клеток Marc-145;

- режим инактивации вируса РРСС димером этиленимина и подбор -приемлемого-масляного-адьюванта-для изготовления-вакцины-против-РРСС^-

технология изготовления эмульсионной инактивированпой ассоциированной вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней;

результаты применения эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС и ПВИС в лабораторных и производственных условиях;

- методика определения антител в сыворотке крови свиней к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней с помощью непрямого иммуноферментнго анализа.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

В работе использованы штаммы вируса РРСС: "Lelystad" (Нидерланды), "БД" (ВНИИЗЖ), "Ст-96" (ВНИИЗЖ), изоляты вируса РРСС: "Пермский" и "Надеево", а также штамм "Вл-94" (ВНИИЗЖ) парвовируса свиней. Опыты были поставлены на 122 свиньях разных возрастных групп из благополучных по РРСС, ПВИС и другим инфекционным заболеваниям хозяйств. Для культивирования вируса РРСС использовали перевиваемую культуру клеток Marc-145, а для вируса ПВИС - перевиваемую культуру клеток ППК.

Инактивацию вируса проводили димером этиленимина (ДЭИ), содержащим 16-25% действующего вещества. Эффективность инактивации вирусов проверяли на культуре клеток Магс-145 и ППК путем проведения трехкратных "слепых" пассажей. При этом учитывали, что инакгивированный антиген не должен вызывать ЦПД.

13 работе использовали неполный адыоиант Фрейм да (Dilco, CILIA), адыоваиты, npiii отопленные но 13ПИИЭЖ на основе минерального масла Marcol 52 (liSSO, Франция), н ад-ыо вант Moiilanidc ISA-70 (Scppic, Франция).

Контроль эмульсионной ппакшнпроиапной вакцины осуществляли путем определения внешнею вида, циста, стабильности, стерильности, безвредности н HMMyiiorciiHoii активности (па подсвинках массой 20-25 кг или кроликах массой 22.5 кг). Наличие специфических антител к вирусам РРСС и ГШИС в сыворотках крови животных определяли в реакциях ИФА, РИГА, РТГЛ, P1I по методикам, утвержденным директором ВНИИЗЖ, а та осе с использованием коммерческого набора ИФА фирмы ЮЕХХ (США).

Разработка предлагаемого варианта ИФА состояла из трех этапов: 1) получение специфического антигена вируса 1'РСС; 2) получение контрольных сывороток для постановки реакции; 3) отработка методики постановки иммупофермептпого анализа.

13 экспериментальных исследованиях о наличии вируса 1'РСС в пробах (суспензия иатматсриала, вируссодсржащая культуральпая жидкость н др.) судили по появлению характерных клинических признаков у зараженных животных, специфических цнтопатнческнх изменений в культурах клеток и по результатам обнаружения генома вируса 1'РСС с помощью ГИДР.

Статистическую обработку результатов исследований проводили методами, рекомендованными 11.11. Лшмаринмм п др. (1974), Р.<1>. Сосоиым и A.A. Глушкопым (t

Исследовании материалов с использованием диагностического набора ИФЛ фирмы II)l:XX (США) и методом Г1ЦР проводили п лаборатории генной ииженернн ВНИИЗЖ (заведующий 13.Г. Андреев). Очистку и концентрирование антигена вируса РРСС проводили в лаборатории молекулярной биологии (заведующий U.U. Дрыгни). Монослониыс культуры клеток и питательные среды получали из отдела болезни Марека и культивирования клеток (заведующая Ш.К. Куляшбекова), готовые адъюваиты были получены из лаборатории биотехнологии (щисдующнн П.И. Михлпимиш). Сотрудникам тих лаборл lopnii выражаем искреннюю бллшдарииси. за помощь при проведении исследовательской работ.

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Изучение иммунобиологических свойств некоторых штаммов вируса РРСС

Поставленная перед нами задача по разработке инактивированной вакцины против РРСС требовала использования высокоактивного вируса. С этой целью нами было проведено сравнительное изучение иммунобиологических свойств трех штаммов вируса РРСС: Лелистад, "БД" и "Ст-96". Результаты сравнительного изучения их культуральных свойств показали, что эти штаммы отличаются по интенсивности накопления вируса. Штамм "БД" обладает ярко выраженным ЦПД, которое начинает проявляться к концу первых суток после заражения культуры клеток и достигает максимального проявления через 40-48 часов, с накоплением на уровне 7.2-7.5 lg ТЦДзо/мл- Другие два штамма (Лелистад и "СТ-96") вызывали максимальное ЦПД лишь на 3° сутки и накопление вируса было па 1.5-2.0 Ig ниже.

У поросят, начиная с 14-ти дней после иммунизации штаммом "БД" вируса РРСС, в сыворотке крови выявляли высокий уровень специфических к вирусу РРСС антител. Через 28 дней после иммунизации подопытных и контрольных подсвинков заражали вирулентным штаммом Лелистад вируса РРСС. На это заражение иммунизированные свиньи не реагировали, в то время как контрольные заболели с типичной клинической картиной РРСС.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что вирус РРСС штамм "БД", способен накапливаться в культуре клеток Магс-145 в высоких титрах, обладает хорошими иммуногенными свойствами и может быть предложен в качестве производственного штамма для изготовления инактивированной вакцины против РРСС.

Результаты культивирования вируса РРСС, шт. "БД", стационарным монослойным методом и в роллерных установках показали, что оптимальный возраст монослоя клеток должен быть трое суток, доза заражения 0.01-0.1 ТЦД50 на клетку и сроки культивирования - 36-48 часов.

Культивирование в роллерных установках позволило получить вирус с титром 8.28 ± 0.15 lg ТЦДзо/Мл> что на 1.0 - 1.2 lg превышает накопление вируса РРСС в монослойных стационарных культурах. Без добавления в

поддерживающую среду эмбриональной сыворотки КРС накопление вируса резко снижается как при стационарном, так и при роллерпом методе культивирования.

2.2.2. Разработка режима миактпвацин вируса РРСС

Рабочий раствор димера этиленимина (ДЭИ) готовили путем разбавления коммерческого препарата стерильной дистиллированной водой до 1% концентрации; pH раствора доводили до 7.4 - 7.6 0.1Н раствором янтарной кислоты. В суспензию вируса вносили различное количество инактиванта. Степень инактивации определяли через 24 часа путем заражения культуры клеток Marc-145. При отсутствии характерного ЦПД проводили не менее трех "слепых" пассажей на этой же культуре (табл.1).

Таблица 1

Показатели инактивации вируса РРСС при различных режимах

в присутствии ДЭИ

_(п=3)

Температура Титры вируса (Ig ТЦД50/мл) в зависимости от конечной концентрации ДЭИ (%)

0 0.0001 0.0005 0.001 0.005 0.01 0.05

+6°С 7.49±0.01 6.30±0.19 5.1 Uo.l 1 2.21 ±0.10 1.38±0.08 - -

+18"С 6.4 1±0.04 4.57±0.09 2.18±0.09 + + - -

+37"С 5.22±0.1) 2.48±0.01 ± - - - -

Примечание: "+" - вирус выделен;

"±" - вирус выделен в отдельных опытах; "-" - вирус не выделен.

Как видно из таблицы 1, полная инактивация вируса наступала при температуре +37 ±0.5 "С и конечной концентрации димера эшленимнна 0.001%, а для инактивации при более низких температурах (6±0.5°С и 18±0.5°С) потребовалось увеличение концентрации ДЭИ в 10 раз (0.01%).

Таким образом, оптимальный режим инактивации вируса в течение 24 часов достигается при концентрации ДЭИ 0.001% и при температуре 37.0±0.5 °С.

2.2.3. Испытание различных масляных адъювантов и изучение нммуногенности эмульсионной вакцины против РРСС

В специальных опытах на подсвинках была изучена степень реактогенности образцов вакцины, изготовленных на основе неполного адъюванта Фрейнда (01{со, США), адъювантов, приготовленных во ВНИИЗЖ на основе минерального масла Магсо1-52 (ЕББО, Франция) и Montanide 18А-70 (Беррк, Франция).

_Изучение реактогенности проводили метолом, который основан_на.

выявлении местной и общей реакции у животных после введения вакцины в установленной дозе. В течение 15-30 суток за животными вели постоянное клиническое наблюдение с измерением температуры тела. По истечении срока наблюдения животных убили и провели осмотр места введения препарата (табл. 2).

Таблица 2

Результаты изучения реактогенности эмульсионной вакцины против РРСС с различными адыовантамн

у':Х:. .. Адъювант . , Реакция подсвинков на введение вакцины

повышение температуры тела местная воспалит, реакция на месте введения

олеогранулема через 30 сут. следы эмульсии через 1.5 мес

Неполный адъювант Фрейнда 3/4 4/4 4/4 3/4

ВНИИЗЖ (Магсо1-52, эмульгатор 139) 4/6 4/6 3/6 2/6

ВНИИЗЖ (Магсо1-52, ЭПОЛ) 3/4 4/4 2/4 3/4

Монашек 1БА-70 3/6 2/6 2/6 1/6

Примечание: в числителе - количество реагировавших жипотных.

в знаменателе -количество вакцинированных животных.

Как видно из таблицы 2, наиболее приемлемыми по степени реактогенности для изготовления вакцины оказались адъювант приготовленный во ВНИИЗЖ на основе минерального масла Магсо1-52 и адъювант МогНашс1е 1БА-70, обладающие умеренной реактогенностыо. В дальнейшем для разработки эмульсионной вакцины были использованы эти два адъюванта.

Изучение iiMMyiiorcinioii активности эмульсионной инактииировшпюп вакцины пронш I'1'CC па подсвинках и кроликах показало, чго у всех серонсгатнинмх кроликов через 28 суток нослс иммунизации разными образцами вакцины и сыворотках кропи выявляются впруснсПтрализующие антитела. Средние титры ам ин ел по группам составляли от 4.7±0.3 до 5.010.3 log 2. Следует отмети н., что реакция нейтрализации для выявления антител была трудно выполнима, гак как нечеткое цитопатнческое действие вируса 1'1'СС, шт. Лелистад, осложняло учет результатов реакции. В связи с этим для исследования сывороток крови кроликов и свиней сотрудниками лаборатории (А.И. Егорова и др.) была разработана реакция непрямой гемагглютннацин (РИГА).

Результаты исследований в ИФЛ (1DI2XX) сывороток крови иммунизированных подсвинков и заражения их вирулентным штаммом Лслнстад вируса РРСС представлены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты изучении пммуногеннветн эмульсионной вакцины прогни РРСС ни подсвинках

№Я» подсвинков Уровень ai до вакцинации гмтел (s/p) иа 30 сутки после вакцинации Результаты контрольного заражения

1 2 3 0.06 0.02 0.05 0.52 0.57 0.39 -

М ± m 0.04 ±0.01 0.49 ¿0.05

КОНТРОЛЬ 1 ^ 0.05 0.006 0.06 0.0079 + +

Примечание: Значении s/p 11 ИФЛ: <(1.3 чгфшипелин.м! результат. >0.4 -нялстшсльмин результат; "+" ■ наличие температурной реакции и типичных клинических проявлений; "-" - отсутствие температурной реакции н клинических проявлений.

Кик иидпо из таблицы 3, у двоих in трех пакцшшропаппмх подсвинков и сыворотках крови выявили высокий уровень антител против вируса PI'CC. (o'iimmcimc s/p у них равнялось 0.52 и 0.57) и только у одною животного результат был ниже 0.4. Все вакцинированные подсвинки оказались устойчивыми к заражению вирусом Лелистад. Контрольные подсвинки заболели с типичной

клинической картиной РРСС: повышение температуры тела на 1-1.5°С, угнетение, отсутствие аппетита, конъюкгивит, кашель, цианоз кожных покровов.

В специальных опытах была изучена эффективность эмульсионной инактивированной вакцины против РРСС по отношению к двум изолятам вируса РРСС, циркулирующих на территории России. Для этого 5 поросят, иммунизированных эмульсионной инактивированной вакциной против РРСС (с уровнем антител в сыворотке крови 0.54-1.47 в ИФА фирмы "ГОЕХХ") и 4 серонегативных были внутрилегочно заражены 20% суспензией, приготовленной из патматфиОаТполученноштггсвинейгинфицированных-изолятами-вируса РРГС "Пермский" и "Надеево". Серонегативные животные заболели с типичными клиническими признаками РРСС, а привитые животные реагировали на заражение только кратковременным и незначительным повышением температуры тела.

Проведенные нами исследования показали, что разработанный вакцинный препарат обладает способностью вызывать выработку специфических антител у иммунизированных животных в высоких титрах и защищает их от контрольного заражения как эталонным вирулентным штаммом Лелистад, так и полевымнн изолятами вируса РРСС, циркулирующими на территории России, т.е. обеспечивает стойкий иммунитет против репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

2.2.4. Разработка непрямого варианта ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней

Первым этапом работы являлось получение концентрированного и очищенного антигена вируса РРСС. Для изготовления такого антигена использовали штамм "БД", так как он при культивировании в роллерных сосудах репродуцируется в титрах до 8.0-8.5 ^ТЦЦ5о/мл.

Концентрированный полиэтиленгликолем вирус до 1/10, 1/50 и 1/100 от первоначального объема переосаждали центрифугированием при 70000 g в течение 2 часов при +4°С. Осадок снова ресуспендлровали до 1/10, 1/50 и 1/100 от первоначального объема в трис-НС1 буфере. Следовательно, в результате описанных операций, получили четыре вида концентрированного антигена.

Полученные антигены титровали методом двукратных разведений п ИФЛ с сыворотками крови синпсЙ, предварительно проверенными в наборе ИФЛ (1DEXX), с нормальной сывороткой евнней (s/p= 0.06) и специфической к вирусу РРСС (CVL, Wcybridge) сывороткой (s/p=0.6). Сыворотки крови использовали в постоянном разведении 1:50. Непрямой метод ИФЛ ставили по стандартной методике.

Проведенные исследования показали, что антигены, полученные различными методами концентрирования, обладают различной активностью по отношению к вышеуказанным сывороткам. При исследовании концентрированных препаратом и ИФЛ с нормальной сыиороткой симисй во всех случаях результаты были отрицательными или на уровне »(.'специфического фона. Исследования но отношению к специфической сыворотке свиней против вируса РРСС показали, что вариант антигена вируса PI'CC, концентрированного полиэтилеиглнколем п 10 раз с последующим концентрированием методом ультрацентрнфугирования в 100 раз, положительно реагировал со специфической сывороткой в среднем разведением 1:533±133, в то время как другие варианты антигенов слабо реагировали с подобной сывороткой. В дальнейшем использовали только антиген, концентрированный а 1000 раз.

В связи с тем, что в концентрированном таким образом вирусе содержится большое количество балластных белков и клеточных компонентов, возникала необходимость о его очистке. Для этих целей использовали очистку антигена вируса 1'РСС двумя методами: в ступенчатом градиенте сахарозы и п градиенте плотности CsCI -сахароза.

Антиген вируса РРСС, очищенный в градиенте сахарозы и концентрированный в 1000 раз, обладал большей активностью, чем антиген, очищенный в CsCI -сахарозном градиенте, и со специфической сывороткой в среднем разведении реагировал 1:2667±533. Одновременно снижался и нсспсцнфлчсскнй фон (с нормальной сывороткой свиней до разведения - 1:50).

В результате пронеденнмх исследований оптимальное рабочее разведение антигена было определено как 1:2000 при начальном разведении исследуемых сывороток 1:50.

Для определения специфичности полученного антигена нами была проведена иммунизация подсвинка с последующим исследованием его сыворотки крови на наличие специфических антител против различных вирусов (табл.4).

Таблица 4

Результаты исследования сыворотки крови подсвннка, иммунизированного очищенным и концентрированным антигеном вируса РРСС

Исследование Уровень антител в сыворотке крови

—против—

вирусов в реакции Од. 14 д. 21 д. 35 д.

РРСС РНГА <1:20 1:80 1:160 ' 1:640

ИФА"ЮЕХХ" (s/p) 0 0.7 1.7 6 1.87

ПВИС РТГА 1:128 1:128 1:128 1:128

КЧС РНГА <1:20 <1:20 <1:20 <1:20

ТГС РНГА 1:20 1:40 1:40 1:40

Примечание: Значение в: ИФА Б/р>0.4 - положительный результат; РТГА - > 1:128 - положительный результат; РНГА - > 1:80 - положительный результат.

Как видно из таблицы 4, через 35 дней после иммунизации титр антител против вируса РРСС достиг максимального уровня и составил в РИГА 1:640 и ИФА-1.87. Повышение титров антител в сыворотке крови подсвинка отмечено только против вируса РРСС, что свидетельствует о специфичности полученного антигена.

Нами было исследовано несколько вариантов антигена с различными сыворотками крови свиней в реакции ИФА.

Полученный антиген обладал достаточной специфичностью и позволял выявлять специфические антитела против вируса РРСС. Необходимо отметить, что в препарате содержалось некоторое количество балластных белков, которые в свою очередь давали неспецифический фон. Для снижения неспецифического фона и повышения достоверности результатов в качестве контрольной отрицательной сыворотки использовали специально полученную сыворотку крови от подсвинка, иммунизированного нормальной культурой клеток Marc-145, и высчитывали титр антител относительно последней.

Таким образом, в результате проведенных исследовании отработан метод концентрирования и очистки вируса РРСС, определено оптимальное рабочее разведение вирусного антигена для использования его в ИФА, которое составляет 1:2000. Показано, что для снижения неспецифического фона реакции в качестве отрицательной контрольной сыворотки необходимо использовать сыворотку крови от подсвинка, иммунизированного нормальной культурой клеток Маге-145.

Относительная чувствительность и относительная специфичность разработанного метода по отношению к базовой реакции ИФА(ШЕХХ) составляют 95.1% и 95.6% соответственно.

2.2.5. Разработка ассоциированной пакцнны против РРСС и ПВИС

В течение 1997-2000 годов во ВНИИЗЖ было исследовано на натичпе антител против вируса РРСС и ПВИС более 7 тыс. проб сывороток крови свиней, полученных из 335 свиноводческих хозяйств. Было установлено, что в 256 (74%) хозяйствах одновременно циркулируют вирусы РРСС и ПВИС. Это подтверждается также данными зарубежных исследователей (СЬшПапзоп №'.Т. е( а!., 1994). В связи с этим возникла необходимость одновременной профилактической иммунизации свиней против РРСС н ПВИС.

Ассоциированную ииактппнроваииую эмульсионную вакцину против РРСС и ПВИС изготавливали на основе разработанной нами инактивированноп вакцины против РРСС и инактивнроваиной вакцины против нарвовируса свиней, выпускаемой во ВНИИЗЖ из штамма "Вл-94" (Т.З. Байбиков и соавторы, 1998 г.). Парвовирус инактивировали димером эгилеиимина и активность его после инактивации составляла не ниже 1:1024 в реакции гемагглютпнации (РГА). Инактивмроваиные антигены вирусов РРСС и ПВИС, после произведенного расчета, смешивали в соотношении 2:1 соответственно и эмульгировали с адъювантом.

Вначале нами было изготовлено три опытных образца вакцины. После проверки на стерильность и безвредность вакцину каждого образца вводили внутримышечно 5 кроликам по 1мл и трем подсвинкам по 2мл. Наблюдение за привитыми животными показало, что вакцина безвредна, т.к. каких-либо

отклонений о состоянии животных пс отмечали. Через 30 су ток и сыворотках кропи подешшкш тигр нпписл прошв вируса 1Ч'СС в 14II'Л и среднем но группам составлял от 1:426 ±107 до 1:853 ±213, а у кроликов - от 1:448 ±78 до 1:5123 ±78. Титры антител против парвовируса свиней в среднем по группе были в пределах от 1:1024 ±0 до 1365 ±341 у подсвинков и от 512 ±0 до 1024 ±0 у кроликов.

Экспериментальные серии вакцины готовили по 15-20 л и после контроля на стерильность и безвредность проверяли на иммуногенность. Отдельные серии контроллровали-на-подсвинках-€ыворотку-крови-свн1/ей-}1сследовалн-с-11омо1цыо-ИФА (ВНИИЗЖ) и РТГА (табл. 5).

Таблица 5

Данные по контролю нммуногснпоП актипности экспериментальных серий иякцнны на подсвинках

< № : Титры вируса Исслед. Уровень антител в

серии РРСС ПВИС против сыворотках крови

вакц. (18ТЦЦ5о,м„) (ГАЕ) вируса Од. 14 д. 21д. 35 д.

3 5.7 1:1024 РРСС 25±0 25±0 58±22 150±28

ПВИС 85±21 128±0 170±43 512±0

4 6.48 1:2048 РРСС 25±0 33±8 Ю0±0 233±88

ПВИС 42±П 170±43 213*42 1024±0

5 6.73 1:2048 РРСС 33±8 42±8 Ю0±0 26С±67

ПВИС 37*14 213±42 256±0 1365±341

6 7.0 1:4096 РРСС 25±о 42±8 133±зз 333=1.66

ПВИС 26±5 256±0 682±170 2730±683

Примечание: сыворотки крови на наличие антител исследованы против вируса РРСС в ИФЛ (ВНИИЗЖ), а против вируса ПВИС в РТГА.

Как видно из таблицы 5, в сыворотках крови подсвинков, иммунизированных ассоциированной инактивированной вакциной, выявляли высокий титр антител против вирусов РРСС и П13ИС. Отделите экспериментальные серии вакцины были проверены па иммукогсшюск, комиссионно, нугем контрольного заражения иммупизиропапных животных вирулентным эталонным вирусом РРСС, шт. Лелистад, Результаты контрольного

заражения девяти вакцинированных и трех контрольных подсвинков представлены на рисунке 1.

41.5

л

« 38.5

33

О

2

4

6

3

10

12

14

16

18

О контрольные животные ® вакцинированные животные

Сутки после заражения

Рис. 1. Температурная реакция у свиней после заражения шт. Лелистад вируса РРСС

Из рисуика 1 видно, что у вакцинированных подсвинков сушсстпанюго повышения температуры тела после заражения вирулентным штаммом Лелистад не наблюдали, лишь отмечали незначительное повышение температуры тела с 39.1°С до 39.8°С на 3-5 сутки после впутрипульмонального введения вируссодержащей жидкости. У контрольных животных возникала ярко выраженная гипертермия с 7 по 12 день после контрольного заражения и температура тела у них повышалась на 1-1.5°С.

С целью изучения иммуногенностл, а также для определения безвредности вакцины были нммупизированны две супоросные свиноматки па 47-50 дни супоросности. Через 42 дня после введения вакцины (на 90-93 день супоросности) свиноматки были интраназалыю заражены вирулентным эталонным вирусом РРСС, штамм Лелистад. Эти свиноматки принесли 16 поросят, из них 14 живых здоровых и 2 мертворожденных. Сохранность среди живых поросят за время подсосного периода составила 100%.

Большое внимание было уделено изучению сроков хранения вакцины. Известно, что для эмульсионных инактивированных вакцин важными моментами является как сохранение иммуногенности, так и стабильности препарата.

Результаты исследования сывороток крови кроликов, иммунизированных образцами вакцины после различного срока хранения, показали, что в течение 12 месяцев хранения при температуре +6"С иммуногенная активность препарата фактически не снижалась. Образование над вакциной незначительного слоя масла в результате хранения не влияло на активность препарата.

2.2.6. Изучение длительности ностиакцинального иммунитета против РРСС и ПВИС у свиноматок и колострялыюго иммунитета у поросят

С целью изучения напряженности и длительности поствакципального иммунитета у свиноматок в условиях хозяйства, а также для разработки эффективной схемы вакцинации нами были проведены широкомасштабные испытания вакцины в хозяйствах Воронежской области. В этих опытах активное участие принимали сотрудники ВНИИПТ и Ф (Ануфриев Л.И., Голубцов Д.О. и др.).Пробы сывороток крови отбирали от свиноматок до и после вакцинации против РРСС и ПВИС в течение 6 месяцев с интервалом и 14-30 суток и исследовали на наличие специфических антител в реакциях ИФЛ и РТГЛ. Результаты исследований приведены на рисунках 2 и 3.

20 40 60 80 е> двукратная вакцинация в однократная вакцинация

20 140 160 180 Сутки после вакцинации

Рис. 2. Длительность поствакцинального иммунитета против РРСС у свиноматок, вакцинированных против РРСС и ПВИС

20 40 60 80

<0 двукратная вакцинация * однократная вакцинация

100 120 140 160 180 Сутки после вакцинации

Рис.3. Длительность поствакцинального иммунитета против ПВИС у свиноматок, вакцинированных против РРСС и ПВИС

Как видно из рисунка 2 и 3, при однократной вакцинации против РРСС и ПВИС антитела в сыворотках крови свиноматок достигали максимального уровня к 45 суткам и сохранялись на этом уровне до 70-75 и 90 дней после вакцинации соответственно. Однако ко времени опороса животные становились ненммунпыми. У свинок, нммуннзированных двукратно с интервалом в 20 суток, перед осеменением выявляли высокий уровень антител, а к 65 суткам он достигал максимального титра. Затем титр антител начинал снижаться, но до 6 месяцев (срок наблюдения) поствакцинальные антитела против РРСС и ПВИС оставались на довольно высоком уровне.

Таким образом, двукратная прививка ассоциированной вакциной способствует' формированию стойкого постнакцппалыюго иммунного ответа у свиноматок против РРСС » ПВИС до 6 месяцев. 11аличпс высоких тигров антител в сыворотке кропи подсосных синномагок обеспечивает иысакиП уровень колострадыюго иммунитет у порося т прогни РРСС и ПВИС и среднем до 25- и 35-дневного возраста соответственно.

2.2.7. Изучение эффективности применения эмульсионной ипаьстнвнрованной вакцины против РРСС и ПВИС в условиях хозяйств

В течение 1997-2000гг эффективность эмульсионной ннакхивированион

вакцины против РРСС и ПВИС изучали в ряде свиноводческих хозяйств, неблагополучных по РРСС и ПВИС. В них проводили эиизоотологический анализ до и после вакцинации, учитывая количество свиноматок с репродуктивной патологией, в частности мертворождаемость и смертность поросят в первые 7 дней жизни (табл.6).

Таблица 6

Эффективность применения ассоциированной инактнвированной вакцины против РРСС и ПВИС в неблагополучных по этим заболеваниям хозяйствах

• Хозяйства Продолжительность применения вакцины (мее) Уровень репродуктивной патологии, %

до применения вакцины после применения вакцины

АО "Вишневское" 24 78.8 3.0

АО "Тихий Дон" 24 74.0 11.8

1 Свинокомплекс "Кузнецовский" 5 2 * 1

ЗАО "Надеево" 6 70 2

Свинокомплекс "Лазаревский" 24 14.1 *

АПП им. Кирова 12 79.3 *

АОЗТ "Комунар" 6 66.6

В среднем 14 55 2.7

Примечание: * - единичные случаи.

Как видно из таблицы 6, регулярная профилактическая вакцинация значительно снижает количество свиноматок с репродуктивной патологией (мертворождаемость и рождение нежизнеспособных поросят).

Несмотря на то, что вакцина применялась в неблагополучных по РРСС и ПВИС хозяйствах, где имелось большое количество больных животных, она позволяла стабилизировать ситуацию и в течение 5-24 месяцев количество свиноматок, приносящих мертвых поросят, снижалось в среднем с 55% до 2.7%.

2.2.8. Разработка нормативно-технической документации на эмульсионную ннактивированнуго вакцину против РРСС и ПВИС

На основании результатов проведенных исследовании по разработке инактивироваиной эмульсионной ассоциированной вакцины против РРСС и ПВИС нами была подготовлена временная нормативно-техническая документация (НТД), утвержденная 04.02.1997 г. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России.

На основании проведенных с положительным эффектом производственных испытаний и применения в условиях хозяйств 41 серии вакцины была разработана постоянная НТД на вакцину эмульсионную инактивированную против РРСС и ПВИС, утвержденную 30.06.1999 г. Департаментом ветеринарии Мипсельхоза России. К НТД прилагаются лицензия на вакцину Ж>525 от 23.02.2000г., сертификат соответствия № РОСС ГШ.ФВ01.В04490 срок действия с 07.02.00г. но 07.02.01г.. н регистрационное удостоверение № Р012-1 -2.9-0222 от 16.09.99 г. со сроком действия 5 лет.

В настоящее время налажен выпуск эмульсионной инактнвированной вакцины против РРСС и ПВИС на производственных площадях ВНИИЗЖ. В 2000 году было выпущено 1 062 685 доз этого препарата. Вес 8 серий прошли государственный контроль, отвечали требованиям ТУ 9384-026-00008064-99 и были реализованы.

3. ВЫВОДЫ

1. Разработана технология изготовления и контроля ассоциированной инактнвированной вакцины против РРСС и ПВИС на основе культуральных вирусов РРСС, шт. "БД", и ПВИС, шт. "Вл-94". Вакцина безвредна, обладает умеренной рсактогспностыо и высокой иммупогенпой активностью.

2. Подобраны оптимальные условия культивирования штамма "БД" вируса РРСС в культуре клеток Маге-145: возраст монослоя трое суток, доза заражения 0.01-0.1 ТЦД50 на клетку и сроки культивирования 36-48 часов. Установлено, что вирус макснмааыю накапливается в титрах 7.2-7.5 lg Т1Щ5д;м.| при использовании стационарных клинских матрасов и не менее 8.0 Ig ТЦД3од1Лпри культивировании в роллерпых сосудах.

3. В сыворотках крови подсвинков, иммунизированных штаммом "БД" вируса РРСС, обнаруживаются специфические антитела к вирусу РРСС. Привитые животные устойчивы к заражению вирулентным эталонным европейским ни. Лелистад вируса РРСС,

4. Разработан режим инактивации культурального вируса РРСС, шт. "БД", димером этилеиимина. Установлено, что при конечной концентрации препарата в вирусной суспензии 0.001% и температуре 37.0 "С в течение 24 часов происходит полная утрата инфекционностн вируса без потери его иммуногенных свойств.

5гЭкспериме1ггально-уста110вленогчто-маслянь1й-адъювант-приготовлс1|цьи1-_ во ВНИИЗЖ на основе минерального масла Магсо1-52 и адъювант Моп1аш(1е 1ЭЛ-70 обладают умеренной реактогенностью для свиней, образуют стойкую эмульсию типа "вода-масло". Эмульсионная инактивированная вакцина против РРСС из шт. "БД", изготовленная на основе этих адъюоантов, создаст напряженный иммунитет у привитых животных.

6. В опытах показано, что в сыворотках крови евнпей, иммунизированных ассоциированной эмульсионной инактиоированноп вакциной, выявляются специфические антитела против вирусов РРСС и ПВИС (0.28-0.9 в ИФА и 1:5121:2048. в РТГА соответственно). Привитые этой вакциной свиньи приобретают устойчивость к вирулентным вирусам РРСС (к эталонному шт. Лелистад и отечественным изолятам).

7. Установлено, что при ревакцинации свиней эмульсионной ассоциированной инактивированпой вакциной с интервалом в 20 суток создастся напряженный иммунитет против вирусов РРСС и ПВИС продолжительностью не менее 6 месяцев (срок наблюдения). В сыворотках крови поросят, родившихся от таких свиноматок, количество колостральцых антител против вирусов РРСС и ПВИС в защитных титрах сохраняется в среднем до 25 и 35-днсвного возраста соответственно.

8. Показано, что антигены вирусов РРСС и ПВИС в составе ассоциированной вакцины сохраняют свою активность при хранении биопрепарата в течение 12 месяцев и температуре -*6"С (срок наблюдения).

9. Разработан непрямой вариант ИФА для выявления антител против вируса РРСС в сыворотках крови вакцинированных енппей. Относительные

чувствительность и специфичность разработанного метода к базовой реакции ИФЛ (IDEXX) составляет 95.1% и 95.6% соответственно.

10. Широкие производственные испытания ассоциированной ипакттшнроваппон вакцины протп» РРСС и Г113ИС показали, что в результате се применения в неблагополучных хозяйствах доля свиноматок с патологией воспроизводства (мергворождаемость и рождение нежизнеспособных поросят) снижается в среднем от 55% до 2.7%, а в отдельных хозяйствах - до единичных случаев.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны:

нормативно-технические документы на "Вакцину эмульсионную инактивировапную против РРСС и ПВИС" (ТУ 9384-026-00008064-99, инструкция по изготовлению и контролю и наставление по ее применению), которые одобрены ученым сонетом ВНИИЗЖ и утверждены Департаментом встсрнпарпи Мипсельхоза России 30.06.1999г. Вакцина по разработанной документации производится во ВНИИЗЖ и используется в свиноводческих хозяйствах;

- "Методика определения антител в сыворотке крови свиней к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом непрямого иммуноферментнго анализа" (утверждена директором ВНИИЗЖ 11.04.2000г);

- "Методика получения антигена вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для использования в нммупофсрмсптном анализе" (утверждена директором ВНИИЗЖ 11.04.2000г).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Байбнков Т.З., Дудникова Н.С., Курман И.Я., Куляшбекова Ш.К., Кукушкин С.А. Преимущества культивирования вируса репродуктпвно - респираторного синдрома свиней (РРСС) на культуре MARC-145 в роллерных установках //Акт. пробл. с.-х. бпотехнол.: Матер, коиф.- пгт.ГвардейскиП,1998.-С.111.

2. Байбиков Т.З., Дудникова Н.С., Курман И.Я, Кукушкин С.А., Гаврилова В.Л, Долганова Е.К. Эпизоотология, диагностика и специфическая профилактика

репродуктивно - респираторного синдрома свиисй // Соврем, аспекты вст. патол. жив-х: Матер, конф., посвящен. 40-летию ВНИИЗЖ.-Владимир,1998.-С.85-92.

3. Долганова Е.К., Байбиков Т.З., Николаева К.П., Курман И.Я. Количественная оценка антигенной активности вакцины против парвовирусной инфекции свиней (ПВИС) //Акт. пробл. с.-х. биотехнол.: Матер, конф. пгг.Гвардейский,1998.-С.123.

4. Шахов А.Г., Ануфриев А.И., Голубцов A.B., Гусев A.A., Байбиков Т.З., Долганова Е.К., Курман И.Я. Смешанное течение репродуктивно -респираторного синдрома и парвовирусной инфекции свиней // Ветеринария.-1999.-№7.-С. 18-22.

5. Курман И.Я., Байбиков Т.З., Кукушкин С.А., Егорова А.И., Дудникова Н.С., Долганова Е.К., Ануфриев А.И. Поствакцинальный иммунитет у свиней против репродуктивно - респираторного синдрома и парвовирусной инфекции // Экол. аспекты эпизоотол. и патол. жив-х: Междунар. науч.-произв. конф.-Воронеж,1999.-С.112-114.

6. Курман И.Я., Кукушкин С.А., Долганова Е.К. Колостральный иммунитет у поросят от свиноматок, вакцинированных против репродуктивно респираторного синдрома свиней (РРСС) и парвовирусной инфекции (ПВИС) II Матер. учредит, конф. междунар. ассоциации паразитоценологов,-Витебск,1999.-С.95-96.

7. Курман И.Я., Байбиков Т.З., Дудникова Н.С., Долганова Е.К., Кукушкин С.А., Ерофеев С.Г. Иммунобиологические свойства эмульсионной инактивированнои ассоциированной вакцины против репродуктивно-рсспираторпого синдрома и парвовирусной инфекции свиней // Роль вет. науки в развитии жив-ва: Матер, междунар. науч.-произв. конф., посвящен. 75-летию Казах. НИВИ.-Алматы,2000.-С. 126-128.

8. Байбиков Т.З., Кукушкин С.А., Дудникова Н.С., Курман И.Я., Куляшбекова Ш.К., Рахманов A.M. Эффективность применения сухой культурапьной вирусвакцины против репродуктивно-респнраторного синдрома свиней II Роль вет. науки в развитии жив-ва: Матер, междунар. науч.-произв. конф., посвящен. 75-летию Казах. НИВИ.-Алматьт,2000.-С.62-65.

9. Байбиков т.З., Дудникова U.C., Дол rai юна U.K., Яременко U.A., Курман И.Я., Кукуижии С.А., Рахманов A.M. Разработка и применение отечественных вакцин для специфической профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней // Науч. основы производства вет. бнол. препаратов: Тез. докл. Всерос. пауч.-практ. конф., посвящен. 30-летию ВНИиТИБП.- Щелково,2000.-С.87-89.

Ю.Курман И.Я., Байбиков Т.З., Дудникова Н.С. Разработка непрямого иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу РРСС // "Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику": Матер, конф. молодых ученых.-Владимир,2000.-С.155-161.

П.Гаврилова В.Л., Кукушкин С.А., Курман И.Я., Байбиков Т.З. Изучение чувствительности первичных, перевиваемых культур клеток и куриных эмбрионов к вирусу РРСС // "Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику": Матер, конф. молодых ученых.-Владимир,2000.-С.23-25.

12. Кукушкин С. А., Байбиков Т.З., Курман И.Я. Особенности течения рспродуктивио-респираторпого синдрома свиней в хозяйствах разного типа // "Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику": Матер, конф. молодых учеиых.-Владимир,2000.-С.51-57.

13.Байбиков Т.З., Долганова Е.К., Дудникова Н.С., Яременко H.A., Гуленкин В.М., Кукушкин С.А., Курман И.Я., Куляшбекова Ш.К., Рахманов A.M. Разработка и применение вакцин производства ВНИИЗЖ против РРСС и ПВИС // Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации вет. препаратов: Тез. докл. Всерос. науч. конф.-Москва,2001.-С.116-118.

14. Байбиков Т.З., Гусев A.A., Яременко H.A., Дудникова Н.С., Гаврилова В.Л., Кукушкин С.А., Курман И.Я., Ковалпшип В.Ф., Рахманов A.M. Рспродукгивпо-рсспираторпый синдром свиней //Ветеринария.-2001.-№.3-С. 18-24.

Отпечатано на полиграфической базе отдела координации научных исследований, информации п международных связей ВНИИЗЖ.

Тираж 80 экз., апрель 2001г.