Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка средств и методов серологического мониторинга классической чумы свиней на основе твердофазного иммуноферментного анализа

УДК 619.616.98:578.833 31:616-076

На правах рукописи

ЖИВОДЕРОВ Сергей Петрович

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ И МЕТОДОВ СЕРОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Покров - 2007

003056956

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ).

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Стрижаков Александр Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Диев Вячеслав Иванович

кандидат биологических наук Балашова Елена Алексеевна

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии (ГНУ ВИЭВ).

Защита состоится 27 апреля 2007 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, г. Покров Владимирской области, ВНИИВВиМ. Тел/факс: (49243)62125; www.vniiwim.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « Л » марта 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук -

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы. Классическая чума свиней (КЧС) - особо опасная, высококонтагиозная болезнь свиней, эпизоотии и вспышки которой регистрируют как в России, так и за рубежом. Несмотря на тенденцию к снижению количества вспышек болезнь наносит значительный экономический ущерб (Horzinek М.С., 1991; Van Oirschot G., 1994; Джупина С.И., 2001).

Противоэпизоотические мероприятия при классической чуме свиней включают вакцинацию поголовья, в том числе в повышенных дозах, полное или частичное уничтожение животных в эпизоотическом очаге и диагностику болезни. Однако, несмотря на проводимые мероприятия в некоторых свинокомплексах установлена стационарность эпизоотических очагов этой болезни (Вишняков И.Ф., 1985; Коломыцев A.A., 1992; Джупина С.И., 2001). Эффективность современной системы защиты свиноводческих хозяйств от классической чумы свиней и меры борьбы с болезнью постоянно подвергаются углубленному анализу. В настоящее время в качестве основных звеньев совершенствования противоэпизоотических мероприятий при классической чуме свиней выдвигаются диагностика, специфическая профилактика, оценка поствакцинального иммунитета и серологический мониторинг болезни (Макаров В.В., 2001; Vannier Р., 1986; Harcness J.W., 1985).

Природная очаговость классической чумы свиней среди диких кабанов представляет опасность для промышленного свиноводства возможностью вовлечения домашних свиней в цепь циркуляции возбудителя. В связи с этим оценка эффективности специфической профилактики, а именно, определение популяционного иммунитета диких свиней в природе также является актуальным (Скупый М.Ф., 1973; Коломыцев A.A., Куриннов В.В., 1992).

Основным методом серологического мониторинга при определении напряженности иммунитета в нашей стране является реакция нейтрализации (Carbrey Е.А., 1988). Однако, несмотря на ее важное значение, использование реакции нейтрализации (РН) для широкомасштабного мониторинга классической чумы свиней и определения напряженности иммунитета при

массовых обследованиях крайне затруднительно ввиду длительности ее постановки, высокой стоимости, необходимости специально оснащенных лабораторий - стерильные условия, поддержание культуры клеток, наличие живого эпизоотического вируса.

Для решения аналогичных задач в настоящее время предложены методы, основанные на использовании моноклональных антител (Wensvoort G. и др., 1988). Для определения специфических к вирусу КЧС антител имеются коммерческие наборы (Ceditest ELISA), SYNBIOTICS (Франция), IDEXX, CYPRESS (Бельгия) и др., однако, эти методы пригодны для качественного определения антител, но не позволяют оценивать напряженность иммунитета.

Разработан ряд методов твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА), в которых в качестве антигена использовали целую вирусную частицу (Have Р., 1984). Несмотря на их высокие чувствительность и специфичность, возможны проблемы, связанные с интерпретацией результатов (Thibault J., 1994). Имеются сложности при очистке вируса КЧС. Применение в качестве антигена в методах ТФ ИФА рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС исключает эти проблемы

На основании вышеизложенного совершенствование и разработка высокопроизводительных средств и методов для серологического обследования большого количества свиноводческих хозяйств и определения напряженности иммунитета при классической чуме свиней на основе рекомбинантного белка Е2 ВКЧС являются актуальными.

1.2. Цели и задачи. Основная цель исследований - разработка средств и методов для проведения широкомасштабного серологического мониторинга и определения напряженности иммунитета при классической чуме свиней на основе ТФ ИФА.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- Определить оптимальные условия получения антигенов вируса классической чумы свиней, их концентрирования и очистки для использования в методах ТФ ИФА.

- Разработать тест-систему на основе моноклональных антител (МА) для технологического контроля активности протективных антигенов вируса классической чумы свиней.

- Разработать тест-систему с использованием рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней, экспрессируемого вирусом осповакцины для выявления антител к вирусу классической чумы свиней в сыворотках крови свиней.

Определить чувствительность, специфичность и коэффициент корреляции результатов разработанного непрямого метода ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 по отношению к результатам РН.

- Оценить эффективность разработанного "Набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС" при проведении серологического мониторинга и определения напряженности иммунитета свиней при классической чуме свиней в условиях свинокомплексов и охотхозяйств.

1.3. Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:

- Прямой метод ТФ ИФА на основе моноклональных антител для технологического контроля при получении протективных антигенов вируса классической чумы свиней и определении условий их оптимального накопления, концентрирования и очистки.

- Непрямой метод ТФ ИФА для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней в сыворотках крови свиней с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней, экспрессируемого вирусом осповакцины и конъюгата моноклональных антител к 1§ в свиней.

- Чувствительность и специфичность разработанного непрямого метода ТФ ИФА и его корреляция с результатами, полученными с использованием РН.

- "Набор препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС" для проведения серологического мониторинга классической чумы свиней в практике полевых исследований на свинокомплексах и охотхозяйствах.

1.4. Научная новизна исследований.

Разработан метод концентрирования и очистки рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС на основе вектора вируса осповакцины.

Разработан непрямой метод ТФ ИФА и набор препаратов для обнаружения специфических к ВКЧС антител в сыворотках крови свиней, пригодный для проведения серологического мониторинга КЧС.

Показана корреляция между результатами выявления антител с помощью разработанного непрямого метода ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС и РН, изучена диагностическая ценность разработанного непрямого метода ТФ ИФА.

1.5. Практическая значимость исследований.

На основании результатов проведенных экспериментов, апробации при проверке полевых материалов и результатов комиссионных испытаний разработанный "Набор препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС" рекомендован для определения напряженности иммунитета при КЧС после вакцинации животных на свинокомплексах и проведения серологического мониторинга КЧС в свиноводческих хозяйствах и дикой природе.

1.6. Апробация работы.

Результаты исследований, выполненных по теме диссертационной работы, доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ

ВНИИВВиМ (г.Покров) 2002-2005гг., Международной научно-практической конференции ВНИТИБП (Щелково, 2005г.)

1.7. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в т.ч. одна статья в журнале «Ветеринария».

1.8. Личный вклад соискателя

Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по разделам 4.2.1, 4.3.2., 4.4.3., 4.7. практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ: Новиков Б.В., Власова H.H., Анохина Е.Г. и Стрижакова О.М.

1.9. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 112 страницах, иллюстрирована 15 таблицами и 5 рисунками. Список литературы включает 160 источников, из которых 137 иностранные.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы. Методы.

Вирусы КЧС.

Вирулентный штамм- "Ши-Мынь", в виде вирус-крови с активностью 106'°-106'5 ЛД50/СМ3, получен из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ и его клеточно-культуральный вариант "Ши-Мынь-51" (вирус 55-го пассажа в культуре клеток РК-15, активность Ю60 ККИД50/см3), получен в лаборатории Диагностики ГНУ ВНИИВВиМ;

Аттенуированный (вакцинный) штамм: штамм "ЛК-ВНИИВВиМ" ("ЛК-65"), культуральный, с активностью Ю50 ИмД50/см3, получен из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ.

Рекомбинантный вирус осповакцины (Рек-КЧС/ экспрессирующий полипептиды вируса КЧС, культуральный, с активностью Ю8,0 ТЦД50/см3, получен из лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ.

Сыворотки крови

Сыворотки специфические к ВКЧС, полученные из лаборатории Музейных штаммов ВНИИВВиМ.

Сыворотки крови свиней, полученные в процессе проведения серологического мониторинга КЧС из различных регионов России.

Нормальные и специфические к вирусу КЧС сыворотки крови от интактных и зараженных свиней, полученные в результате экспериментов.

Сыворотки крови свиней, содержащие специфические антитела к вирусам болезни Ауески, болезни Тешена, ТГЭС, РРСС.

Животные:

- мыши линии ВАЬВ/с: 3-4 недельного возраста живой массой 10-15 г, взрослые рожавшие самки живой массой 25-30 г. Животные получены из питомника "Столбовая" РАМН. До начала эксперимента животных выдерживали под наблюдением в течение 10-14 дней. Кормление осуществляли в соответствии с рационами;

- свиньи крупной белой породы различного возраста (от 2 до 6 мес.) и пола, выращенные в условиях чистого вивария ГНУ ВНИИВВиМ;

кролики различного возраста и пола, выращенные в условиях чистого вивария ГНУ ВНИИВВиМ,.

Культуры клеток:

- перевиваемая культура клеток почки поросёнка РК-15. Получена из Федерального Научно-исследовательского Центра Вирусных Болезней Животных, г. Тюбинген, Германия. Периодически поддерживалась и хранилась в лаборатории Культур клеток с музеем клеточных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ;

- первичная культура клеток тестикул 1-2 месячных ягнят (ТЯ), получена в лаборатории Культур клеток с музеем клеточных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ;

- перевиваемая культура клеток почки зелёной мартышки (СУ-1), поддерживалась и хранилась в лаборатории Культур клеток с музеем клеточных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ;

перевиваемая культура клеток почки сибирского горного козерога, линия ПСГК, монослойный трофовариант, получена из лаборатории Культур клеток с музеем клеточных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ;

Моноклональные антитела

Монокпональные антитела к вирусу КЧС клонов К-3, К-6, К-9, К-12 (получены к.б.н. Васильевым А.П., ГНУ ВНИИВВиМ).

Моноклональные антитела специфические к Ig G свиней, получены в лаборатории Иммунологии ГНУ ВНИИВВиМ.

Сыворотки

Для поддержания роста гибридных клеток и перевиваемых клеток животных использовали фетальную сыворотку КРС для выращивания гибридом (Sigma, США, Cat. № F 2442).

Питательные среды и добавки.

- среда для культивирования клеточных культур Игла-МЕМ.

Белки и ферменты:

- бычий сывороточный альбумин кристаллический (Serva, ФРГ);

- пероксидаза хрена, тип VI (Sigma, США).

Методы

Культивирование вируса КЧС

Для получения культурального вируссодержащего материала использовали культуру клеток РК-15, выращенную в матрасах в среде Игла-МЕМ. Титр вируса определяли по методу Рида-Менча и выражали в ККИД50/см3.

Культивирование рекомбинантного вируса осповакцины

Для получения культурального вируссодержащего материала использовали культуру клеток CV-1, выращенную на матрасах в среде Игла-МЕМ.

Приготовление иммунопероксидазных конъюгатов

Конъюгирование IgG моноклоиальных антител с пероксидазой хрена проводили модифицированным методом периодатного окисления по Tjissen Р. (1985).

Лиофилизацию специфических и нормальных антигенов и коньюгатов моноклоиальных антител с пероксидазой хрена проводили на установке "Hitossicc" (Дания) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

Определение концентрации белка Определение белка проводили как описано Lowry О.Н. et al. (1951).

Электрофорез и иммуноблоттинг Проводили как описано Jaemmli U.K. (1970).

Реакцию нейтрализации флуоресцирующих микробляшек в культуре клеток РК-15 проводили по Методическим указаниям по лабораторной диагностике классической чумы свиней № 13-7-2/809 от 30.12.96 г.

Гистохимический иммуноферментный анализ Определение специфических антител к вирусу КЧС проводили непрямым ГХ ИФА, в качестве антигенов использовали инфицированную и неинфицированную вирусом КЧС культуру клеток РК-15, выращенную в лунках микропанелей. Для обнаружения комплекса «антиген-антитело» использовали антивидовой пероксидазный конъюгат с активностью 1:300. В качестве субстрата использовали З-амино-9-этилкарбазол. Методы твёрдофазного иммуноферментного анализа Непрямой метод твердофазного иммуноферментного анализа

Данный метод использовали для выявления антител, специфичных к антигенам вируса КЧС (Джонс Э.И., 1991).

Прямой метод твердофазного иммуноферментного анализа

Данный метод использовали для выявления и титрования антигенов вируса КЧС, а также для определения активности специфических пероксидазных конъюгатов моноклоиальных антител.

Определение функциональных свойств метода ТФ ИФА

Для определения функциональных свойств разработанного метода ТФ ИФА использовали рекомендации, указанные в руководстве МЭБ (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines 2000, часть 1.1.З.). В качестве эталонного метода использовали реакцию нейтрализации флуоресцирующих микробляшек (Методические указания по лабораторной диагностике классической чумы свиней № 13-7-2/809 от 30.12.96 г.).

Статистические методы обработки результатов Статистическую обработку результатов при определении корреляции результатов разработанного непрямого метода ТФ ИФА и РН проводили с использованием пакета прикладных программ Statgraphics (Version 2.1.)-

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Оптимизация условий культивирования рекомбинантного вируса осповакцины для получения рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС

Антигены вируса КЧС (штаммы JIK-ВНИИВиМ и Ши-Мынь), рекомбинантного вируса осповакцины использовали для определения их пригодности в качестве антигенов в методах ТФ ИФА. Штаммы вируса КЧС выращивали в культурах клеток РК-15, ПСГК; рекомбинантный вирус - в культуре клеток CV-1.

Для определения оптимальных условий накопления интрацеллюлярного антигена вирусы культивировали при множественности заражения от 0,1 до 0,0001 ТЦЦ50/клетка в течение 1 - 5 суток. Уровень антигенной активности лизатов поверяли прямым методом ТФ ИФА

Установлено, что для получения антигена рекомбинантного белка вируса классической чумы свиней, экспрессируемого рекомбинантным вирусом осповакцины, оптимальное время культивирования зараженной культуры клеток CV-1 составляет 42 часа, при оптимальной множественности заражения

0,001 ТЦД5о/клетка. Указанный способ позволяет получить вируссодержащее сырье с титром 8,25 ^ ТЦД50/см3.

Антигенная активность полученных лизатов клеток в прямом методе ТФ ИФА составила: для штамма Ши-Мынь - 1:100, штамма ЛК-ВНИИВВиМ -1:100, штамма Рек-КЧС - 1:400.

2.2.2. Оценка антигенной активности и специфичности рекомбинантных белков вируса классической чумы, экспрессируемых вирусом осповакцины

В методах ТФ ИФА, используемых для определения напряженности иммунитета, необходимо использовать антигены соответствующего возбудителя, обладающие высокой иммуногенной активностью и имеющие в своем составе максимальный спектр антигенных детерминант, вызывающих при введении животным выработку вируснейтрализующих антител.

Антигенную активность и специфичность экспрессируемых рекомбинантных белков вируса классической чумы свиней изучали на поросятах 2 мес. возраста путем двукратного внутримышечного введения рекомбинантного вируса осповакцины Пробы сывороток крови исследовали в реакции нейтрализации. В сыворотках крови иммунизированных свиней через 21 день после второй иммунизации обнаружены вируснейтрализующие антитела (ВНА) к вирусу классической чумы свиней в титре 1:16.

Таблица 1

Уровень ВН антител в сыворотках крови поросят после иммунизации рекомбинантным вирусом осповакцины

п=3

Штамм Иммунизация Сутки после иммунизации Титр в РН

Рек- 1-я 21 день 1:2-1:4

КЧС 2-я 42 дня 1:8-1:16

Контроль - - 0

Данные представленные в табл. 1 свидетельствуют о том, что рекомбинантный вирус осповакцины (Рек-КЧС) экспрессирует протективные

полипептиды вируса КЧС, которые были использованы при разработке ТФ ИФА.

2.2.3. Разработка прямого метода ТФ ИФА для определения активности полученных антигенов

Для проведения технологического контроля при производстве рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС и проверки активности полученных антигенов нами разработан прямой метод ТФ ИФА на основе моноклональных антител, специфичных к белку £р 55 вируса КЧС. С этой целью моноклональные антитела К-3, К-6, К-9 и К-12 конъюгировали с пероксидазой хрена (конъюгаты МА-ПХ), активность которых представлена в табл. 2.

Таблица 2.

Активность конъюгатов МА-ПХ в прямом методе ТФ ИФА и ГХ ИФА

п=3

Коньюгаты клонов гибридом Активность конъюгатов МА

Прямой ТФ ИФА ГХ ИФА

К-3 1:200 1:100

К-6 1:200 1:100

К-9 1:400 1:200

К-12 1:400 1:200

Данные, представленные в табл. 2 свидетельствуют о том, что из 4-х клонов моноклональных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, наибольшей активностью обладали конъюгаты клонов К-9 и К-12, титры которых составили в прямом методе ТФ ИФА 1:400, а в гистохимическом ИФА 1:200. При проведении предварительных исследований по проверке активности антигенов вируса КЧС, с использованием этих конъюгатов, были получены идентичные результаты. Поэтому в дальнейших исследованиях нами использовался ПХ конъюгат клона К-12.

Разработанный прямой метод ТФ ИФА на основе моноклональных антител позволяет оценить активность рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней, определить динамику и уровень накопления указанного белка в перевиваемой культуре клеток.

С помощью разработанного прямого метода ТФ ИФА на основе моноклональных антител клона К-12 установили, что уровень накопления рекомбинантного белка Е2 в перевиваемой культуре клеток С\М составляет 1:400 на 2 сутки культивирования.

2.2.4. Приготовление культуральных антигенов. Оценка пригодности полученных антигенов для использования в методах ТФ ИФА

Для концентрирования и очистки антигенов штамма ЛК-ВНИИВВиМ и рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней применяли метод фракционирования из культуральной жидкости с использованием сульфата аммония в различных концентрациях, а также методы гельпроникающей хроматографии.

В результате проведенных исследований установили, что наивысшую активность полученных антигенов обеспечивало высаливание во фракции с 30%-ным насыщением сульфатом аммония. Активность полученного антигена рекомбинантного белка составила в прямом методе ТФ ИФА -1:1600, вакцинного штамма ЛК-ВНИИВВиМ- 1:400 (табл. 3).

Таблица 3

Активность различных фракций антигенов белка Е2 вируса КЧС полученных при высаливании сульфатом аммония в прямом методе ТФ ИФА

п=3

Фракции Активность фракций

ЛК-ВНИИВВиМ Рек-КЧС

сульфат аммония 20% 1:200 1:400

сульфат аммония 25% 1:100 1:200

сульфат аммония 30% 1:400 1:1600

сульфат аммония 35% 0 1:100

сульфат аммония 40% 0 0

сульфат аммония 50% 0 0

2.2.5. Определение антигенной активности, протективных свойств и специфичности очищенного рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней

Антигенную активность, протективные свойства и специфичность рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней, полученного высаливанием сульфатом аммония, определяли на кроликах.

Использовали 3 группы кроликов по два животных в каждой. В дозе 0,5 мг/гол испытуемый антиген кроликам 1-й группы вводили внутримышечно, кроликам 2-й группы - подкожно, кроликам 3-й группы - в складку кожи между пальцами.

Через 14 суток после введения антигена сыворотку крови кроликов проверяли на наличие вируснейтрализующих антител к вирусу классической чумы свиней в РН со штаммом Ши-Мынь. Титры антител у кроликов составили: гр. 1->1:128, гр. 2-1:16 и 1:128, гр. 3- 1:16 и >1:128.

Данные исследований свидетельствуют о том, что полученный специфический антиген вируса классической чумы свиней обладает протективной активностью, что подтверждено образованием вируснейтрализующих антител.

Фракцию антигена рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней, полученную при высаливании сульфатом аммония при 30 % насыщении, подвергали фракционированию путем гельпроникающей хроматографии на Суперозе-6 и Ультрагеле-34.

После проведения хроматографии на Суперозе-6 активность антигена выявлена во фракциях 6 - 9 с максимумом во фракциях 6 и 7.

После проведения хроматографии на Ультрагеле-34 наивысшая активность антигена наблюдалась во фракциях 12-20.

Полученные пробы анализировали методом ДСН-ПААГ - электрофореза с последующим иммуноблоттингом с гипериммунной сывороткой крови кролика, полученной после проведения иммунизации антигеном рекомбинантного белка,

очищенного методом хроматографии с Ультрагелем-34, с активностью в РН с вирусом КЧС (штамм Ши-Мынь) 1:128. В качестве отрицательного контроля была приготовлена проба культурального нормального антигена культуры клеток СУ-1.

На рис. 1 приведена блотограмма полученных проб культуральных антигенов с гипериммунной сывороткой крови кролика. Пробы 1, 2, 3 и 4 приготовлены с добавлением дитиотреитола, проба 5 - без дитиотреитола.

Рисунок 1. Иммуноблоттинг проб рекомбинантного белка вируса КЧС с гипериммунной сывороткой крови кролика.

Примечания к рис. 1:1- нормальный антиген, 2 - рекобинантный белок вируса КЧС, полученный концентрированием сульфатом аммония 50% насыщения, 3-рекобинантный белок вируса КЧС, полученный концентрированием сульфатом аммония 30% насыщения, 4 и 5 - хроматографическая фракция 12-20 рекомбинантного белка, концентрированная, полученная после проведения хроматографии с Ультрагелем-34, обработанная соответственно в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Справа отмечено положение маркеров молекулярных масс.

На рис. 1 показано, что гипериммунная сыворотка крови кролика

выявляет в препаратах культурального рекомбинантного антигена вируса КЧС

белок с молекулярной массой 36 кДа, который отсутствует в нормальном

антигене. Та же полоса представлена на треке с хроматографической фракцией

12-20, приготовленная в денатурирующих условиях, в то время как в неденатурирующих условиях в данной пробе выявляется полоса с диапазоном молекулярных масс 83-94 кДа.

Антиген фракций 12-20 после очистки на Ультрагеле-34 и концентрирования имел активность в прямом методе ТФ ИФА 1:3200. Этот антиген в дальнейшем был использован при разработке метода ТФ ИФА для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней.

2.2.6. Разработка непрямого метода ТФ ИФА с использованием рекомбинантного белка Е2 ВКЧС для выявления антител к вирусу КЧС в сыворотках крови свиней

Разработка непрямого метода ТФ ИФА включала в себя определение условий адсорбции рекомбинантного антигена на твердой фазе, т.е. установление оптимальной концентрации белка, времени сенсибилизации и состава сенсибилизирующего буфера, условий отмывания не связавшихся компонентов, подбора блокирующего буфера, определение режима и времени инкубации сывороток.

2.2.6.1. Выбор оптимальных условий адсорбции, рабочей концентрации антигена рекомбинантного белка Е2 ВКЧС и блокирования сайтов связывания. Исследовали влияние различных буферных систем, температуры и времени адсорбции на специфическую активность антигена. Анализ сорбционной способности рекомбинантного белка проводили в непрямом варианте ТФ ИФА методом последовательных разведений с использованием моноклонапьных антител клона К-12.

В результате исследований установлено, что оптимальным для сенсибилизации лунок планшета рекомбинантным антигеном является режим при температуре 4°С в течение 18-20 ч или в течение 1,5-2 ч при температуре 37°С при сорбции белка Е2 из 0,02М КББ- рН 9,5.

На достоверность результатов ТФ ИФА оказывает влияние неспецифическое связывание реагентов со свободными сайтами связывания полистироловых пластин.

Исследования показали, что блокирование свободных центров связывания на планшете целесообразно проводить 0,5% раствором БСА на фосфатном буфере рН 7,6 с добавлением 0,05% Твин-20 (табл. 4).

Таблица 4

Зависимость оптической плотности субстратного раствора от концентрации БСА в растворе для блокирования свободных сайтов связывания

п=3

Конц-я БСА, % Сыворотка Разведения референтных сывороток

1:20 1 1:40 1:80 1:160

без БСА Спец. Норм. 1,739-1,742 0,250-0,253 1,429-1,433 0,160-0,164 1,060-1,066 0,130-134 0,671-0,677 0,110-0,117

0,1 Спец. Норм. 1,739-1,742 0,250-0,254 1,428-1,431 0,159-0,164 1,061-1,065 0,132-1,137 0,672-0,674 0,112-0,116

0,5 Спец. Норм. 1,591-1,595 0,118-1,122 1,320-1,322 0,112-0,115 1,025-1,027 0,095-0,099 0,630-0.634 0,095-0,098

1 Спец. Норм. 1,589-1,593 0,115-1,119 1,304-1,312 0,110-0,112 1,010-1,014 0,095-0,104 0,562-0,566 0,096-0,099

2 Спец. Норм. 1,589-1,591 0,115-0,118 1,305-1,310 0,099-0,113 1,008-1,013 0,095-0,098 0,550 0,095

Для выбора оптимальной (рабочей) концентрации сорбируемого антигена методом последовательных разведений ИФА определяли оптическую плотность референтной положительной сыворотки в разведении 1:20 с различными концентрациями иммобилизированного антигена. Результаты показали, концентрация белка 6 мкг/мл является оптимальной для сенсибилизации панелей.

2.2.6.2. Определение оптимальной продолжительности инкубации сывороток. Для определения оптимальной продолжительности инкубации сывороток крови в непрямом ТФ ИФА, исследовали оптическую плотность субстратного раствора в лунках, где предварительно инкубировались контрольная положительная и контрольная отрицательная сыворотка через 15, 30, 60, 90 минут их взаимодействия с антигеном при температуре 37°С. Результаты исследования показали, что 60-90 минут при температуре 37°С

является оптимальным временем инкубации сывороток крови свиней при постановке непрямого ТФ ИФА.

2.2.7. Оптимизация условий постановки непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного белка ВКЧС для определения антител к вирусу КЧС в одном разведении сыворотки крови

2.2.7.1. Выбор величины разведения сывороток крови при тестировании проб в одном разведении

При тестировании сывороток крови методом одного разведения результаты, как правило, представляют в виде отношения величин оптической плотности исследуемой сыворотки (Б) и положительного контроля (Р) - Б/Р.

Для определения оптимального разведения сыворотки крови предварительно методом последовательных разведений тестировали 31 пробу сывороток крови свиней с различным уровнем антител к вирусу КЧС. Для разведений 1:20; 1:40; 1:80 вычисляли значения Б/Р по формуле:

в/Р= (ОП - 1ЧС„)/(РСХ - 1ЧС„), где

ОП- оптическая плотность исследуемой сыворотки;

ЫС*- оптическая плотность отрицательного контроля;

РСХ- оптическая плотность положительного контроля.

Полученные результаты обрабатывали с помощью компьютерной

программы Statgraf¡cs, которая позволила рассчитать значения параметров уравнения, коэффициент корреляции, стандартную ошибку для каждого из выбранных разведений.

Наиболее высокий коэффициент корреляции (Я= 0,95) со стандартной ошибкой 0,05 был получен для разведения 1:20, поэтому данное разведение было выбрано в качестве рабочего.

2.2.7.2. Определение позитивно-негативного порога для разграничения неспецифической и специфической реакции.

Для определения пороговых показателей, разграничивающих неспецифическую (отрицательную) и специфическую (положительную) реакции в непрямом варианте ИФА, определяли значение оптической

плотности 15 образцов сывороток крови, не имеющих антител к вирусу классической чумы свиней.

Установлено, что среднее значение оптической плотности составило для разведения 1:20 - 0,159 оптических единиц (o.e.). Выделена зона сомнительных которая составила 0,145 o.e. Для каждого из установленных значений (0,159 o.e. и 0,145 o.e.) вычисляли S/P - отношения, которые приняли в качестве критериев для разграничения специфической и неспецифической реакций. Установлено, что сыворотки следует считать отрицательными, если S/P<0.2, или положительными, если S/P>0.3. Результаты тестирования считались сомнительными, если полученные для сывороток значения S/P попадали в промежуточный интервал 0.2<S/P>0.3.

2.2.7.3. Определения допустимых величин оптической плотности контрольных сывороток. Для определения допустимых величин оптической плотности контрольных сывороток исследовали 18 повторностей положительной референтной и отрицательной референтной сывороток в разведении 1:20.

Было показано, что допустимыми значениями оптической плотности контрольных сывороток являются значения, лежащие в диапазоне: для положительного контроля - от 0,27 o.e., для отрицательного контроля - до 0,13 o.e.

2.2.8. Определение активности рекомбинантного белка Б2 вируса КЧС при различных условиях хранения

Для получения воспроизводимых результатов ИФА необходимым условием является постоянство концентрации иммобилизированного антигена. В связи с этим исследовали возможность длительного хранения сенсибилизированного рекомбинантного белка на полистироловых планшетах для последующего использования в диагностике. Высушенные при комнатной температуре сенсибилизированные антигеном планшеты хранили до применения при 4-8°С и минус 20°С в герметически закрытых полиэтиленовых

пакетах и периодически испытывали на сохранение исходной активности рекомбинантного белка.

Исследования показали, что активность иммобилизированного антигена не зависела от режима хранения планшет. На протяжении 12 месяцев (срок наблюдения) его активность не изменялась. По этому в дальнейшем сенсибилизированные панели хранили при 4°С.

С целью определения оптимальных условий хранения нативного рекомбинантного белка Е2 провели исследование влияния различных режимов хранения на его активность, применяя прямой метод ТФ ИФА. Стабильность антигена проверяли при хранении его в различных температурных режимах : 4°С, минус 20°С, минус 50°С без добавления и с добавлением глицерина в соотношении 1-1.

Таблица 5

Изменения активности нативного рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС при различных режимах хранения

п=3

Срок хранения (недели) Титр белка Е2 в ИФА при режиме хранения

без глицерина в глицерине (1:1)

4иС -20°С -50°С 4°С -20°С -50°С

1 1:3200 1:3200 1:3200 1:3200 1:3200 1:3200

2 1:800 1:3200 1:3200 1:1600 1:3200 1:3200

4 1:200 1:3200 1:3200 1:1600 1:3200 1:1600

10 - 1:3200 1:3200 1:800 1:3200 1:1600

20 - 1:1600 1:3200 1:400 1:1600 1:800

50 - 1:1600 1:1600 - 1:800 1:800

Результаты представленные в табл. 5, показывают, что оптимальным для хранения рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС является режим в пределах минус 20°С или минус 50°С без добавления глицерина.

2.2.9. Определение характеристик разработанного метода ТФ ИФА

Для определения характеристик разработанного метода ТФ ИФА использовали рекомендации, указанные в руководстве МЭБ (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines 2000, часть 1.1.3.). В качестве эталонного метода, по сравнению с которым проводили расчёты, использовали реакцию нейтрализации флуоресцирующих микробляшек в культуре клеток РК-15 (Методические указания по лабораторной диагностике классической чумы свиней № 13-7-2/809 от 30.12.96 г.).

2.2.9.1. Определение аналитической чувствительности и специфичности

С целью исследования аналитической чувствительности разработанной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней тестировали 58 проб сывороток крови от свиней вакцинированных вакциной из штамма JIK-ВНИИВВиМ против классической чумы свиней, экспериментально зараженных вирусом КЧС (штамм Ши-Мынь) и иммунизированных рекомбинантным вирусом осповакцины. Сыворотки крови получали от поросят в сроки от 7 до 40 дней после иммунизации и исследовали в РН с вирусом классической чумы свиней (штамм Ши-Мынь).

Результаты, полученные непрямым методом ТФ ИФА, сравнивали с результатами реакции нейтрализации. Антитела к вирусу классической чумы свиней в пробах сывороток в непрямом методе ТФ ИФА были обнаружены на 7 сутки после вакцинации.

2.2.9.2. Аналитическую специфичность метода определяли по перекрестной реакции с гетерологичными сыворотками крови свиней, содержащими специфические антитела к вирусам болезни Ауески, болезни Тешена, респираторно-репродуктивного синдрома, трансмиссивного гастроэнтерита, и отрицательной сывороткой (не содержащей вируснейтрапизующих антител к вирусу КЧС). Результаты представлены в табл. 6.

Таблица 6

Определение аналитической специфичности непрямого ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 ВКЧС

п=3

Пробы сывороток крови свиней, содержащие антитела к различным вирусам Результат ТФ ИФА

ОП Цвет, реакц.

Содержащие специфические антитела к ВБА 0,091-0,093 -

-------//-------//-------//------ антитела к ВБТ 0,088-0,090 -

-------//-------//.------//.-----антитела к РРСС 0,089-0,092 -

-------//-------//-------//------ антитела к ТГЭС 0,090-0,093 -

-------//-------//-------//------антитела к ВКЧС 0,541-0,984 +

Не содержащие специфические антитела к ВКЧС 0,091-0,093 -

Примечания: (+) - содержит антитела специфические к ВКЧС;

(-) - не содержит антитела специфические к ВКЧС.

Полученные результаты свидетельствуют, что разработанный метод является специфичным, т.е. дифференцирует антитела, специфические к ВБА, ВБТ, РРСС, ТГЭС, от антител, специфических к вирусу классической чумы свиней.

2.2.10. Апробация разработанного непрямого метода ТФ ИФА в полевых условиях при выявлении антител к ВКЧС в сыворотках крови свиней

Для оценки эффективности разработанного "Набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом ТФ ИФА" при проведении серологического мониторинга и определения напряженности иммунитета при классической чуме свиней в условиях свинокомплексов и охотхозяйств набор апробировали на практике. Исследовали пробы сывороток крови из свинокомплекса "Владимирский" - 61 пробы, свинокомплекса "Северный ключ" - 36 проб, свинокомплекса "Рощинский" - 14 проб, свинокомплекса "Кудряшовский"- 350 проб, ОАО «Агрофирма Ливенское мясо» - 33 пробы, вивария института - 84 пробы, от диких кабанов Г/К "Завидово" и охотхозяйства Смоленской области - 11 проб. Результаты представлены в табл. 7.

Таблица 7

Результаты обнаружения специфических к вирусу КЧС антител в сыворотках крови свиней в РН и непрямом методе ТФ ИФА.

п=3

Хозяйство Всего проб РН ИФА

полож. отриц. полож. отриц.

СК "Владимирский" 61 29 32 33 28

СК "Северный ключ" 36 36 0 36 0

СК "Рощинский" 14 14 0 14 0

СК "Кудряшовский" 350 243 107 231 119

ОАО"Агрофирма Ливенское мясо" 33 25 8 23 10

Охотхозяйства 11 1 10 1 10

Виварий института 84 56 28 60 22

ВСЕГО 589 404 185 398 191

Диагностическую чувствительность и специфичность метода определяли путем сравнения результатов, полученных с его использованием, и результатов реакции нейтрализации. На первом этапе с помощью РН проводили скрининг 589 проб сывороток крови от свиней и диких кабанов, полученных из различных свиноводческих и охотничьих хозяйств РФ. По результатам РН из 589 проб сывороток 404 содержали специфические антитела к вирусу КЧС и 185 - не содержали антител к вирусу КЧС.

При исследовании этих проб с помощью разработанного "Набора..." оказались, что 398 проб сывороток содержали специфические антитела к вирусу КЧС, 191 проба сывороток не содержали антител к вирусу КЧС, при чем 24 пробы положительные в РН, дали отрицательный результат в непрямом методе ТФ ИФА, 14 проб, положительных в непрямом методе ТФ ИФА, дали отрицательный результат в РН.

На основании полученных результатов рассчитали диагностическую чувствительность и специфичность разработанной тест-системы по отношению

к PH. Установлено, что диагностическая чувствительность метода составила 94%, диагностическая специфичность метода составила 92,4%.

Проведена сравнительная оценка результатов определения уровня специфических антител к вирусу КЧС полученных при исследовании сывороток крови непрямым методом ТФ ИФА с применением в качестве антигена штамма JlK-ВНИИВВиМ вируса КЧС и полученных в разработанном непрямом методе ТФ ИФА, в котором в качестве антигена использовался рекомбинантный белок Е2 вируса КЧС. Установлено, что разработанный непрямой метод ТФ ИФА имеет более высокую диагностическую чувствительность и специфичность, чем непрямой метод ТФ ИФА на основе целого вируса КЧС.

Надежность разработанного метода подтверждена исследованиями, суть которых состояла в сравнении результатов обнаружения специфических к вирусу КЧС антител двумя методами (РН и разработанным непрямым методом ТФ ИФА) и определения уровня корреляции данных, полученных этими методами. Уровень корреляции результатов, полученных в РН, с результатами, полученными с применением разработанного "Набора...", рассчитывали с применением программы Statgrafics Version 2.1.

Сравнивая уровни вируснейтрализующих антител, полученные при исследовании проб сывороток крови в РН и с помощью разработанного "Набора...", получили результаты, представленные в табл. 8.

Таблица 8

Сравнительная оценка уровней ВНА полученных в РН и непрямом методе ТФ ИФА

РН непрямой метод ТФ ИФА Всего проб

Титр ВНА log2 Титр антител к вирусу КЧС logs

1:8 3 1:20 1,86 63

1:16 4 1:100 2,86 38

1:500 3,86 9

1:32 5 1:500 3,86 97

1:2500 4,86 33

1:64 6 1:2500 4,86 53

1:12500 5,86 45

1:500 3,86 10

1:128 7 1:2500 4,86 11

1:12500 5,86 21

Титры антител к вирусу КЧС перевели в логарифмы по основанию 2 в РН и по основанию 5 в непрямом методе ТФ ИФА. Представленные в таблице данные показывают, что титр ВНА 1:8 в РН соответствует титру 1:20 в разработанном непрямом методе ТФ ИФА, титр ВНА 1:16 в РН соответствует титру 1:100-1:500 в разработанном непрямом методе ТФ ИФА и далее по таблице. Из 82 проб сывороток крови, имевших титр ВНА 1:8 в РН, -19 дали отрицательный результат в непрямом методе ТФ ИФА. Из 52 проб сывороток крови имевших титр ВНА 1:16 в РН, - 5 дали отрицательный результат в непрямом методе ТФ ИФА.

Исследования, проведенные на 380 пробах сывороток свиней, выявили высокую степень корреляционной связи титров вируснейтрализующих антител в РН и ТФ ИФА. Коэффициент корреляции составил г=0,93 при уровне значимости р<0,001.

Полученные данные свидетельствуют, что при содержании вирусспецифических антител к ВКЧС в сыворотке крови в титре менее 1:20 животные являются не защищенными от заболевания КЧС, если титр вирусспецифических антител от 1:20 и более такие животные защищены от заболевания КЧС.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан метод непрямого варианта ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней и моноклонального антивидового пероксидазного конъюгата для определения напряженности иммунитета к вирусу классической чумы свиней у вакцинированных свиней и диких кабанов. Метод пригоден для проведения серологического мониторинга классической чумы свиней на свинокомплексах и в дикой природе.

Выводы

1. Установлено, что оптимальными условиями получения антигена рекомбинантного белка вируса КЧС, экспрессируемого вектором осповакцины являются: время культивирования зараженной культуры клеток СУ-1 - 48 часов, множественность заражения - 0,001 ТЦД50/кл. Указанный способ позволяет получить вируссодержащее сырье с титром 8,25 ТЦЩо/см3.

2. Полученный специфический рекомбинантный антиген вируса КЧС при введении животным вызывает образование вируснейтрализующих антител к вирусу КЧС в титре более 1:128 и пригоден для использования при исследовании напряженности иммунитета при КЧС методами ТФ ИФА.

3. Разработанный прямой метод ТФ ИФА на основе моноклональных антител позволяет определить активность рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС при его наработке в перевиваемой культуре клеток. Максимальный уровень накопления указанного белка в перевиваемой культуре клеток СУ-1 составляет 1:400 через 48 часов культивирования при дозе заражения 0,001

ТЦЦ50/КЛ.

4. Разработанный метод очистки и концентрирования рекомбинантного белка путем фракционирования высаливанием с использованием сульфата аммония и последующей очисткой методом гельпроникающей хроматографии позволяет получать белок Е2 вируса КЧС с активностью в прямом ТФ ИФА 1:3200.

5. Разработанный непрямой метод ТФ ИФА позволяет выявлять специфические антитела к вирусу КЧС в сыворотках крови свиней и диких кабанов через 7 дней после иммунизации или заражения животного. Максимальный уровень антител к вирусу КЧС (1:2500) данный метод обнаруживает на 28 сутки после заражения или иммунизации.

6. Установлено, что сенсибилизированный на планшет рекомбинантный белок Е2 ВКЧС при температуре 4°С сохраняет активность в течение 12 месяцев (срок наблюдения). Разработанный непрямой метод ТФ ИФА при использовании одного планшета позволяет исследовать на наличие антител к

ВКЧС 46 проб сывороток крови методом одного разведения в двух повторностях.

7. В ходе проведения апробации разработанного непрямого метода ТФ ИФА в полевых условиях при выявлении антител к ВКЧС в сыворотках крови свиней установлено, что метод пригоден для применения на практике при определении напряженности иммунитета к вирусу КЧС после вакцинации свиней и проведения серологического мониторинга заболевания на свинокомплексах и в дикой природе. По отношению к РН диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность непрямого метода ТФ ИФА составила 94% и 92,4% соответственно. Коэффициент корреляции результатов РН и разработанного непрямого метода ТФ ИФА составил г=0,93.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для применения в ветеринарной практике с целью проведения серологического мониторинга и определения напряженности иммунитета при классической чуме свиней на основе ТФ ИФА разработан и предложен «Набор препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом иммуноферментного анализа на основе рекомбинантного белка Е2 ВКЧС». Подготовлена и утверждена директором ГНУ ВНИИВВиМ временная нормативная документация: "Инструкция по изготовлению и контролю набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом иммуноферментного анализа на основе рекомбинантного белка Е2 ВКЧС", "СТО 00495549-0019-2006 на набор препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом иммуноферментного анализа на основе рекомбинантного белка Е2 ВКЧС", "Наставление по применению набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом иммуноферментного анализа на основе рекомбинантного белка Е2 ВКЧС".

Пригодность для практического использования разработанного «Набора...» подтверждена комиссионными испытаниями и при проведении диагностических исследований в ГНУ ВНИИВВиМ.

Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Классическая чума диких кабанов: "Экологический портрет" возбудителя / A.A. Коломыцев, A.A. Стрижаков, В.В. Куриннов, С.П. Живодеров, А.П. Васильев, В.М. Балышев, А.Ю. Чичикин //Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: труды Международной научно-практической конференции,- Ч.2.- Покров, 2003.- С. 354-360.

2. Живодеров С.П. Разработка методов приготовления антигенов вируса классической чумы свиней для использования в ТФ ИФА при обнаружении специфических к возбудителю антител / С.П. Живодеров // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы международной научно-практической конференции. - Щелково, 2005.- С. 170173.

3. Живодеров, С.П Разработка непрямого метода ТФ ИФА для обнаружения антител к вирусу КЧС на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС / С.П. Живодеров // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: материалы Международной научно-практической конференции- ГНУ ВИЭВ.- Москва, 2006,- С. 209-212.

4. Оценка эффективности иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу КЧС с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС / С.П. Живодеров, A.A. Стрижаков, H.H. Власова, Б.В. Новиков, А.П. Васильев // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: материалы Международной научно-практической конференции.- ГНУ ВИЭВ.- Москва, 2006,- С. 212-215.

5. Живодеров С.П. Изучение эффективности непрямого ТФ ИФА для выявления антител к вирусу КЧС с использованием в качестве антигена

рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС при проведении полевых исследований / С.П. Живодеров, А.А.Стрижаков // Достижения и перспективы развития животноводства: материалы Международной научно-практической конференции.- Кишинев, 2006.- С. 189-192.

6. Живодеров С.П. Разработка и оценка эффективности непрямого метода ТФ ИФА для оценки напряженности иммунитета к вирусу классической чумы свиней и проведения серологического мониторинга болезни / С.П. Живодеров, А.А.Стрижаков // Ветеринария.- №12,- 2006.- С. 46-48.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, г. Покров Владимирской области. Тираж 70 экз.

1.1. Актуальность темы. Классическая чума свиней (КЧС) особо опасная, высоко контагиозная болезнь свиней, эпизоотии и вспышки которой регистрируют как в России, так и за рубежом. Несмотря на тенденцию к снижению количества вспышек болезнь наносит значительный экономический ущерб (6, 76,139,). Противоэпизоотические мероприятия при классической чуме свиней включают диагностику болезни, вакцинацию поголовья, в том числе в повышенных дозах, полное или частичное уничтожение животных в эпизоотическом очаге. Однако, несмотря на проводимые мероприятия в некоторых свинокомплексах установлена стационарность эпизоотических очагов этой болезни (3, 6, 9). Эффективность современной системы защиты свиноводческих хозяйств от классической чумы свиней и меры борьбы с болезнью постоянно подвергаются углубленному анализу и усовершенствованию. В настоящее время в качестве основных звеньев совершенствования противоэпизоотических мероприятий при классической чуме свиней эффективных выдвигаются средств высокоспецифические специфической методы диагностики, оценка профилактики, поствакцинального иммунитета и серологический мониторинг болезни (14, 72, 140). Природная очаговость классической чумы свиней среди диких кабанов представляет опасность возможностью вовлечения домашних свиней в цепь циркуляции возбудителя и угрозу промышленному свиноводству. В связи с этим оценка эффективности специфической профилактики, а именно, определение популяционного иммунитета диких свиней в природе также является актуальным (9,12, 19). В нашей стране основными методам серологического мониторинга, при определении напряженности иммунитета служит реакция нейтрализации (10, 41). Однако, несмотря на ее важное значение, использование реакции нейтрализации для широкомасштабного мониторинга классической чуме свиней и онределения напряженности иммунитета при массовых обследованиях крайне затруднительно ц виду длительности ее постановки, высокой стоимости, необходимостью в специально оснащенных лабораториях стерильные условия, поддержание КК, наличие живого эпизоотического вируса. В настоящее время при решении аналогичных задач предложены методы, основанные на использовании моноклональных антител (Wensvoort G. и др. 1988), имеются коммерческие наборы для определения специфических к вирусу КЧС антител (Ceditest ELISA), SYNBIOTICS (Франция), IDEXX, CYPRESS (Бельгия), однако, эти методы пригодны для качественного определения антител, но не позволяют оценивать напряженность иммунитета. Разработан ряд методов ТФ ИФА, в которых в качестве антигена использовали целую вирусную частицу (73). Несмотря на их высокие чувствительность и специфичность, возможны проблемы, связанные с интерпретацией результатов (134). Также имеются сложности при очистке вируса КЧС. Применение в качестве антигена в методах ТФ ИФА рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС исключает эти проблемы. На основании вышеизложенного совершенствование и разработка высокопроизводительных средств и методов на основе рекомбинантного белка Е2 ВКЧС для широкомасштабного серологического обследования большого количества свиноводческих хозяйств и определения напряженности иммунитета при классической чуме свиней является актуальным. 1.2. Цели и задачи. Основная цель наших исследований заключалась в разработке средств и методов для проведения серологического мониторинга и определения напряженности иммунитета при классической чуме свиней на основе ТФ ИФА. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 10 Определить оптимальные условия получения антигенов вируса классической чумы свиней, их концентрирования и очистки для использования в методах ТФ ИФА. Разработать тест-систему на основе моноклональных антител (МЛ) для технологического контроля активности протективных антигенов вируса классической чумы свиней. Разработать тест-систему с использованием рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней, экспрессируемого вирусом осповакцины для выявления антител к вирусу классической чумы свиней в сыворотках крови свиней. Определить чувствительность, специфичность и коэффициент корреляции результатов разработанного непрямого метода ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 по отношению к результатам РН. Оценить эффективность разработанного "Набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС" при проведении серологического мониторинга и определения напряженности иммунитета свиней при классической чуме свиней в условиях свинокомплексов и охотхозяйств. 1.3. Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту: Прямой метод ТФ ИФА на основе моноклональных антител для технологического контроля при получении протективных антигенов вируса классической чумы свиней и определение условий оптимального накопления, концентрирования, очистки рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней. Непрямой метод ТФ ИФА для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней в сыворотках крови свиней с 11 использованием в качестве антигена рекомбинантного белка Е2 вируса классической чумы свиней, экспрессируемого вирусом осповакцины и конъюгата моноклональных антител к Ig G свиней. Чувствительность и специфичность разработанного непрямого метода ТФ ИФА и определение корреляции его результатов полученными с использованием РН. "Набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом ТФ ИФА на основе с результатами рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС" при проведении серологического мониторинга классической чумы свиней в практике полевых исследований на свинокомплексах и в охотхозяйствах. 1.4.. Научная новизна исследований. Разработан метод концентрирования и очистки рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС на основе вектора вируса осповакцины. Разработан непрямой метод ТФ ИФА для обнаружения специфических к ВКЧС антител в сыворотках крови свиней, пригодный для проведения серологического мониторинга КЧС. Показана корреляция между результатами выявления антител с помощью разработанного непрямого метода ТФ ИФА на основе рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС и РН, изучена диагностическая ценность разработанного непрямого метода ТФ ИФА. 1.5. Практическая значимость исследований. На основании результатов проведенных экспериментов, апробации при проверке полевых материалов и результатов комиссионных испытаний разработанный непрямой метод ТФ ИФА рекомендован для определения напряженности иммунитета при КЧС после вакцинации животных на 12 свинокомплексах проведения серологического мониторинга КЧС в свиноводческих хозяйствах и дикой природе. 1.6. Апробация работы. Результаты исследований, выполненных по теме диссертационной и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ работы, доложены ВНИИВВиМ (г.Покров) 2002-2005гг. и Международной научно-практической конференции ВНИТИБП (Щелково, 2005г.) 1.7. Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в т.ч. одна статья в журнале «Ветеринария». 1.8. Личный вклад соискателя Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по

6. Выводы

1. Установлено, что оптимальными условиями получения антигена рекомбинаншою белка вируса КЧС, экспрессируемою вектором осповакцины являются: время культивирования зараженной культуры клеток CV-1 - 48 часов, множеавенносп» заражения - 0,001 ТЦД^кл. Указанный способ позволяет получить вируссодержащее сырье с шфом 8,25 lg Т11Д50/см3.

2. Полученный специфический антиген вируса КЧС при введении животным вызывает образование вируснейфализующих ашшел к вирусу КЧС в титре более 1:128 и приюден для использования при исследовании напряженности иммунитета при КЧС методами ТФ ИФЛ.

3. Разрабошнный прямой метод ТФ ИФА на основе моноклональных антител позволяет определи п> ак1ивносп> рекомбинантного белка Е2 вируса КЧС при ею параболе в перевиваемой культуре клеток. Максимальный уровень накопления указанною белка в перевиваемой культуре клеток CV-1 составляет 1:400 через 48 часов культивирования при дозе заражения 0,001 ПЩ50/кл.

4. Разработанный меюд очисти и конценфирования рекомбинантного белка путем фракционирования высаливанием с использованием сульфата аммония и последующей очисткой методом гельнроникающей хромаю!рафии позволяет получать белок Е2 вируса КЧС с активностью в прямом ГФ ИФА 1:3200.

5. Разрабошнный непрямой меюд ТФ ИФА позволяет выявлять специфические антитела к вирусу КЧС в сыворо1ках крови свиней и кабанов через 7 дней после иммунизации или заражения животного. Максимальный уровень антител к вирусу КЧС (1:2500) данный метод обнаруживает на 28 cyiKH после заражения или иммунизации.

6. Сенсибилизированный на планшеi рекомбинангный белок Е2 ВКЧС при температуре 4°С сохраняет активность в гечение 12 месяцев (срок наблюдения). Разработанный непрямой метод ТФ ИФА при использовании одного планшета позволяет исследован» на наличие анiиiе,i к ВКЧС 46 проб сывороюк крови методом одного разведения в двух повгорностях.

7. Апробация разрабо шиною непрямою метда ГФ ИФА в нолевых условиях при выявлении антител к ВКЧС в сыворотках крови свиней свидетельствуат, чю меюд приюден для применения на практике при определении напряженноеiи иммуншеш к вирусу КЧС после вакцинации свиней и проведения серологическою мониюритна заболевания на свинокомплексах и в дикой природе. По отношению к PII диагностическая чувствительность и диатоешческая снецифичносп. непрямого метода ТФ ИФА сосшвила 94% и 92,4% соответственно. Коэффициент корреляции результатов РН и разработанною непрямою метода ТФ ИФА составил г=0,93.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для применения в вегеринарной пракшке с целыо проведения серологическою мониюриша и определения напряженносж иммуншега при классической чуме свиней на основе '1Ф ИФА разработан и предложен «Набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом иммуноферменжого анализа на основе рекомбинашною белка Е2 ВКЧС». Подготовлена и утверждена директором ГНУ ВНИИВВиМ временная норма!ивная документация: "Инструкция по изготовлению и кош ролю набора препаратов для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым методом иммунофермешною анализа на основе рекомбинашною белка Е2 ВКЧС", "СТО 00495549-0019-2006 на набор ирепараюв для выявления специфических ашшел к вирусу классической чумы свиней непрямым методом иммуноферментною анализа на основе рекомбинантного белка Е2 ВКЧС", "Нааавление по применению набора ирепараюв для выявления специфических антител к вирусу классической чумы свиней непрямым меюдом иммуноферментною анализа на основе рекомбинашною белка Е2 ВКЧС".

Приюднос1ь для иракшческого использования разрабспанною «Набора.» подтверждена комиссионными исиьпаниями и при проведении диашосшческих исследований в ГНУ ВНИИВВиМ.