Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Диагностика чумы у собак методом иммуноферментного анализа

г б с;

2 7 ОКТ 1998 На правах рукописи

Сазонкин Владимир Николаевич

Диагностика чумы у собак методом иммуиоферментного анализа

16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва -1998

Работа выполнена в лаборатории препаратов, применяемых в звероводстве Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) г. Москва и лаборатории болезней пушных зверей ВНЦ вирусологии и биотехнологии НПО «Вектор» г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук В.И. Уласов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Заслуженный деятель Российской Федерации Гуненков В.В. (ВГНКИ) доктор ветеринарных наук Слугин B.C. (ЗАО «Ветзвероцентр»)

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт охотничьего хозяйства и звероводства им. проф. Б.М. Жидкова (601601 г. Киров, ул. Энгельса, 79).

Защита состоится «_»_1998 года, в_часов на заседании диссертационного совета Д 120.85.01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ.

Автореферат разослан «_»_1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. вет. наук

Ю.А. Козырев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Актуальной проблемой современной инфекционной патологии является разработка высокочувствительных и специфических методов диагностики распространенных болезней плотоядных. Одной из таковых является чума собак, вызываемая PIIK-содсржащим вирусом из рода морбилливирус, проявляющаяся лихорадкой, воспалением слизистой оболочки глаз, органов дыхания, пищеварения и признаками поражения нервной системы.

Несмотря на большое число публикаций, касающихся этиологии, патогенеза, симптоматики и специфической профилактики болезни, практическая ветеринария по настоящее время не имеет надежных средств прижизненной диагностики. Под диагнозом «чума» в ветеринарных клиниках проходят не только весьма сходные в клиническом проявлении инфекционные болезни, но и патология совершенно другой этиологии.

Поэтому разработка и внедрение достоверного и быстрого лабораторного метода диагностики могут привести к эффективным мерам борьбы с этой инфекцией.

Учитывая вышеизложенное, в плановую тематику лаборатории препаратов, применяемых в звероводстве ВГНКИ на 1992-1994 г. был включен вопрос о разработке тест-систсмы иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики чумы плотоядных.

Работа выполнялась в комплексе со специалистами НПО «Вектор» г. Новосибирска.

При этом нами преследовалась цель создания прижизненного метода диагностики, не требующего инструментального оснащения, легко и быстро выполнимого в условиях ветеринарных лабораторий.

Этим требованиям соответствует твердофазный точечный иммуно-фермелтиый анализ (ИФА) на нитроцеллюлозе - НЦ (dot - ИФА), с успехом использующийся в настоящее время для индикации многих вирусных антигенов (Heberling et al. (1991), Le H.W. (1990), Sfeinitz M., et al. (1991).

Для выявления антигенов вируса чумы собак - метод dot -ИФА ранее в стране не использовался.

Основной целью нашей работы было создание набора для диагностики чумы у собак, с помощью которого можно было бы подтверждать клинический диагноз заболевания у этого вида животных.

В задачи исследований входило:

1. изучение эпизоотологических и клинических особенностей проявления чумы плотоядных у собак на фоне широкого применения средств специфической профилактики и терапии болезней;

2. сравнительная оценка существующих методов лабораторной диагностики болезни;

3. определение путей и сроков элиминации вируса чумы плотоядных из организма спонтанно больных и вакцинированных животных;

4. разработка и внедрение в ветеринарную практику иммунофермент-ного метода диагностики чумы плотоядных у собак.

Научная новизна. Впервые в нашей стране разработана высокочувствительная и специфичная иммуноферментная тест-система для обнаружения вируса чумы плотоядных в секретах подозрительных по заболеванию собак.

Осуществлено конструирование конъюгирующей сэндвич-смеси для твердофазного ИФА на основании экспериментально полученных диагностических сывороток, осаждение из них глобулиновых фракций с последующей меткой пероксидазой хрена в соотношении 1:3. Работа защищена получением из ВНИИГПЭ положительного решения на получения патента РФ 93066227/14 от 23.02.96.

Впервые в стране дана сравнительная оценка некоторых методов лабораторной диагностики чумы плотоядных у собак.

Определены сроки выявления вируса чумы плотоядных в секретах из глаз и носа спонтанно больных и вакцинированных против этого заболевания собак.

Практическая значимость. Полученные результаты явились основой для разработки и внедрения нормативной документации «Тсст-системы нммуноферментной для диагностики чумы плотоядных», утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ ТУ № 9388-001-33425200 97. Разработанный метод лабораторной диагностики болезни включен в п. 1.3. "Инструкции о мероприятиях по предупреждению и ликвидации чумы плотоядных", утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ № 13-4-2/911 от 25.04.97.

Апробация работы. Материалы проведенных исследований были обсуждены на заседании:

Ученого Совета ВГНКИ, ноябрь 1994, заседаниях проблемных научно-исследовательских комиссий по вирусным препаратам ВГНКИ (19931997 г.г.), конференции по проблемам ветеринарной медицины (Литва, июнь 1993г., Койшидорис), 1-й Межгородской научно-практической конференции по проблемам заболеваний мелких домашних животных (Санкт-Петербург, 1995 г), 1У-й Международной конференции по актуальным проблемам профилактики, диагностики и лечения болезней мелких домашних животных (Москва, март 1996 г.), VI-ом Международном конгрессе лабораторных методов исследования — 1РА8А ( г. Варшава, Польша, август 1996 г.), 1-й Региональной конференции по болезням домашних животных (Новосибирск, май, 1996 г.).

Разработка демонстрировалась на ВВЦ и согласно постановлению Главного комитета отмечена золотой медалью.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, получено положительное решение на выдачу патента, принят и зарегистрирован заключительный отчет "Разработать тест-систему иммуноферментную для диагностики чумы плотоядных" № госрегистрации 01930006119.

К основным положениям диссертационной работы, выносимой на защиту относится определение породной, возрастной и половой предрасположенности собак к чуме плотоядных, разработка метода лабораторной диагностики заболевания.

Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, 11 глав собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и приложение.

В список литературы включены 283 работы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и о рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы.

Экспериментальную часть работы выполняли в период с 1993 по 1997 гг. в лаборатории препаратов, применяемых в звероводстве ВГНКИ и в лаборатории болезней пушных зверей ВНЦ вирусологии и биотехнологии НПО «Вектор» (г. Новосибирск). Материал для исследований поступал в институт от собак, принадлежащих питомникам в/ч 32516, 2625, а также из ветеринарных учреждений ряда городов.

В работе использовали следующие материалы:

1) производственные штаммы «ЭПМ», «Вакчум», «668-КФ», «Белорусский», «Гауязский», «Sneider-Xill» вируса чумы плотоядных (ВЧП); штамм «Дан» возбудителя парвовирусного энтерита собак, штамм «Карат» — коронавирусного энтерита собак, штамм лептоспироза L.Canicola, L.icterogemoragia, L.pomona, любезно представленные сотрудниками профильных лабораторий ВГНКИ;

2) рсфсренс-сыворотку к вирусу чумы плотоядных, полученную от доктора P. Chappius /Франция/;

3) полевые изоляты вируса, выделенные нами от спонтанно больных чумой плотоядных собак и пушных зверей;

4) вакцину антирабическую инактивированную сухую из штамма «Щелково-51»;

5) гипериммунные положительные сыворотки к штаммам адено-, пар-во- и коронавирусов собак, имеющиеся в лаборатории;

6) клинический материал, полученный от экспериментально зараженных, спонтанно больных и клинически здоровых 2510 собак.

Питательные среды и растворы. Перечень использованных растворов, питательных сред и реактивов представлен в соответствующих разделах нормативной документации, прилагается к диссертации.

Животные.

В работе использовали 56 собак различного возраста, 168 тхорзофре-ток, 6 коз, 150 морских свинок, 48 кроликов, 10 лисиц; вскрыто свыше 37 собак, проведено исследование 132 сывороток крови собак.

Для выделения вируса чумы плотоядных из различного клинического материала, полученного от спонтанно больных животных использовали:

1) первично-трипсинизированные культуры клеток фибробластов японских перепелов (ФЭП), культуры клеток почки щенка собак (ПС), перевиваемые культуры клеток VERO, МДСК.

2) тхорзофреток и щенков собак соответственно заражали внутримышечно и интрацеребрально и наблюдали в течение месяца. В динамике брали смывы из носа и глаз, кровь, а у павших различные паренхиматозные органы.

Электронно-микроскопические исследования проводили совместно с ведущим научным сотрудником лаборатории инструментальных методов исследований ВГНКИ к.б.н. Могильным Ю.А. Препараты готовили двумя методами — прямой иммуноэлектронной микроскопией и методом повышения иммуноспецифической способности пленок-подложек.

Эпизоотологические исследования.

Собранные результаты оценивались и систематизировались согласно «Рекомендациям по методике эпизоотологнческого исследования» (Баку-лов И.А. и др. (1975). Были использованы материалы официальной статистики по ветучету и ветотчетности (форма Мй 1-вет).

В качестве исходных материалов, отражающих состояние профилактических и противоэпизоотичсских мер, использовали документы отчетности по ветеринарии, любезно предоставленные сотрудниками отдела статистики Департамента ветеринарии МСХ и П РФ.

В работе также использовали сведения, опубликованные в центральной печати.

Разработка компонентов диагностикума.

Получение диагностических гипериммунных сывороток к вирусу чумы плотоядных.

В качестве продуцентов сывороток крови нами были использованы кролики породы шиншила массой не ниже 3 кг и козы массой 30—40 кг, а также щенки породы бигль и тхорзофретки.

Через две недели после завершения цикла гипериммунизации проводили крововзятие. Сыворотки получата общепринятым методом.

В качестве консерванта полученных сывороток использовали азид натрия в концентрации 1:10000. Их исследовали на активность в течение года ежеквартально.

Активность сывороток определяли макрометодом в реакции нейтрализации в культуре клеток ФЭП против 200ТЦЦ 5005 см3 штамма «ЭПМ».

Результаты титрования учитывали по специфическому цитопатическо-му действию вируса на 6—7 сутки и выражали по методу Рида и Менча (Лярски 3.(1980).

Специфичность полученных сывороток проверяли в серологических реакциях с различными штаммами вирусов плотоядных, имеющихся в коллекции лаборатории.

Приготовление флюоресцирующих сывороток к вирусу чумы плотоядных.

Полученную на козах сыворотку использовали для получения флюоресцирующей сыворотки. Выделение гамма-глобулиновой фракции и ее

метку ФИТЦ проводили в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени академика Н.Ф. Гамалеи АМН РФ по методике, описанной КЛ.Шиханиной и др. (1968).

Сравнительное изучение различных методов диагностики чумы плотоядных у собак.

Собранный клинический материал от экспериментально зараженных и спонтанно больных и павших от чумы плотоядных собак и тхорзофреток исследовали следующими методами.

1) Постановкой биопробы на тхорзофретках по методу, описанному Селивановым A.B. и Груздевым К.Н. в 1979 г.

2) Методом флюоресцирующих антител по методике, описанной КЛ.Шиханиной и соавторами в 1968 г.

3) Элсктронномикроскопические исследования проводили на электронном микроскопе JEM—7А (Япония) при инструментальном увеличении — 40000—60000 раз.

4) Использовали реакции ко-агглютинацни для выявления вируса чумы плотоядных.

Иммуноферментный анализ.

Компановку и испытание диагностического набора проводили совместно с сотрудниками лаборатории болезней пушных зверей НПО "Вектор" (зав. лабораторией Шестопалов A.M.). Использовали твердофазный точечный ИФА на нитроцеллюлозе — «dot-ИФА».

Апробацию тест-системы проводили в соответствии с приказом Департамента ветеринарии МСХ и П РФ по рабочей программе, утвержденной директором Центральной научно-производственной ветеринарной лаборатории.

При анализе и обобщении результатов исследований использовали общепринятые методы статистической обработки, применяемые в биологии и медицине (Урбах В.Ю. (1975).

В проведении исследований, апробации и внедрении в практику разработки оказывали помощь ветеринарные специалисты различных ведомств (А.П. Плотвинов, К.Т. Сулимов), ветеринарные специалисты различных ветстанций г.г. Москвы, Санкт-Петербурга, Новосибирска, специалисты ряда ветеринарных лабораторий (В.Г. Чулкова, М.И. Рыков, C.B. Середа).

Всем соавторам и коллегам, а также коллективам профильных лабораторий ВГНКИ и НПО "Вектор" выражаю глубокую благодарность.

Результаты исследований.

Анализ некоторых эпизоотологнческих данных по чуме плотоядных.

Вопрос о восприимчивости различных пород собак к чуме плотоядных остается дискуссионным. Из 1651 спорадического случая чумы в г.г. Москве и Санкт-Петербурге наиболее часто болели собаки пород; немецкая овчарка (18,1- 24,2 %), беспородные (17,1%), пудель и чау-чау (5,9%).

Среди всех пород собак четко прослеживается зависимость заболеваемости от возраста. По данным Мосгорветлаборатории в 1996 году заболело чумой 1516 животных, причем 65% - составили щенки в возрасте до 1 года, 26,75% - собак в возрасте от 1 до 2 лет, и только лишь 8,25% - животные более старшего возраста. При этом кобели болели чаще, чем суки.

Трехлетние наблюдения за состоянием 164 собак в одном из питомников служебного собаководства свидетельствуют, что наиболее критическими для щенков собак являлся возраст 4-6 месяцев, а также от 8 до 9 месяцев жизни.

Статистические данные за 3 года в г. Москве показывают, что инфекция стала отмечаться во все сезоны года, однако чаще и тяжелее она протекала весной и осенью.

Симптомы чумы плотоядных, особенно на первых этапах ее проявления, разнообразны: в начале болезнь имеет неспецифические проявления: лихорадка, угнетение, анорексия, светобоязнь, позже появляются признаки поражения как желудочно-кишечного, так и респираторного тракта. Часто признаки болезни бывают неспсцифичны, что затрудняет дифференциальную диагностику болезни от инфекций, характеризующихся сходными клиническими признаками: парво- и коронавирусные энтериты, инфекционный гепатит, а также отравления, энтериты и бронхопневмонии бактериальной этиологии.

Клинические особенности проявления чумы плотоядных у собак.

Инфекцию воспроизводили на трех группах по 5 беспородных щенков собак в возрасте от 2 до 5 месяцев в каждой. Щенки первой группы были серонегативны, у животных второй группы в сыворотке крови были выявлены специфические антитела в тиграх от 1:4 до 1:32. Собак обоих групп одновременно заразили интрацеребральпо вирулентным штаммом вируса чумы плотоядных «Снайдер Хилл» в дозе 10" ЛД50/см\ Аналогично щенкам третьей группы (контрольной): двум серонегативным и двум с титром нейтрализующих антител 1:16 вводили культуральную жидкость, не содержащую вируса.

Заболевание у собак первой группы проявилось на 2 сутки и сопровождалось подъемом температуры тела до 42° С, потерей аппетита, кома-

тозным состоянием и гибелью 4 животных из 5 на 4 день болезни. У животных второй группы вначале наблюдали лихорадку постоянного типа, а через неделю она стала ремитирующей, в последующем отмечали: пугливость, тремор, сухость носового зеркала. На 8—9 день болезни у 4 животных появились серозно-слизистые, а затем гнойные истечения, которые, высыхая, закупоривали носовые отверстия. У животных отмечали вначале серозный, а затем гнойный конъюнктивит. На коже внутренней поверхности бедер и брюшной стенки обнаруживали пустулезный дерматит. В течение месяца после заражения с признаками нервной формы чумы (тики, парез тазовых конечностей) пали 2 собаки.

Контрольная группа животных на протяжении периода наблюдения (2 месяца) оставалась клинически здоровой.

Попытка воспроизвести инфекцию на белых мышах, кроликах разной массы и возраста, белых крысах и кошках была безуспешной.

Проведенный нами анализ клинических проявлений чумы у спонтанно заболевших 178 собак различного возраста, поступавших на прием в ветеринарные учреждения города, показал, что у всех животных регистрировали гипертермию, у 163 из них наблюдали ринит, 147 — конъюнктивит, 138 — поражение органов дыхания, 82 — желудочно-кишечного тракта (Ж.К.Т.), 74 — поражение кожных покровов, 23 — поражение центральной нервной системы (Ц.Н.С.) и 13 — гиперкератоз подушечек лап. В большинстве случаев отмечали одновременное поражение нескольких систем органов.

С учетом литературных сведений все клинические признаки, отмеченные у больных и подозрительных по заболеванию животных были разделены на 6 наиболее типичных групп признаков:

1 — Гипертермия (фебриальная лихорадка вначале ремитирующего, а затем и постоянного типа).

2 — Гнойный конъюнктивит и ринит.

3 — Симптомы поражения респираторного тракта (ринит, трахеит, бронхит, пневмония).

4 — Симптомы поражения Ж.К.Т (рвота, диарея).

5 — Поражение кожных покровов (папулезный дерматит).

6 — Симптомы поражения Ц.Н.С (тики, парезы, параличи и т.д.).

Исходя из этого мы считаем, что наличие у собак хотя бы одного из 6

вышеуказанных признаков дает основание подозревать чуму плотоядных.

Анализ патанатомических изменений у 56 погибших животных показал следующее: истощение, тусклость и взъерошенность шерстного покрова, на вскрытии собак у 32 наблюдалась катаральная и катарально-гнойная пневмония, в том числе у 18 — фибриозный плеврит, у 26 — катаральный и катарально-геморрогический и язвенный гастроэнтерит с увеличением лимфоузлов брыжейки. У трупов животных наблюдали дис-

трофию паренхиматозных органов и гиперплазию селезенки. Головной и спинной мозг отечный и гиперемированый у 12 трупов животных. На эпикарде и под капсулой почек кровоизлияния, лимфоузлы грудной и брюшной полости увеличены, сочные на разрезе, слизистая оболочка мочевого пузыря гиперемирована, с точечными кровоизлияниями.

Проведенные исследования показали, что по некоторым эпизоотоло-гическим данным, клиническим признакам и патологоанатомическим изменениям можно в отдельных случаях отдифференцировать чуму плотоядных у собак от наиболее распространенных инфекционных болезней.

Лабораторная диагностика чумы плотоядных.

Наши исследования были направлены на разработку новых методов диагностики этой болезни (электронная и иммуноэлектронная микроскопия (ЭМ и ИЭМ), реакция ко-агглютинации (РКОА), иммунофлюорес-центный метод (ИФМ) и иммуноферментный анализ (ИФА), и сравнение их чувствительности с уже существующими.

Получение специфических диагностических сывороток.

Для серологических методов исследований необходимы специфические высокоактивные гипериммунные сыворотки.

В качестве продуцентов сывороток использовали кроликов, коз, тхор-зофреток и собак. Антигеном при гипериммунизации служили культу-ральные расплодки штаммов ВЧП "ЭПМ", "Вакчум" с активностью в 2,75—3,5 1§ и производственный штамм "Снайдер Хилл" вируса чумы плотоядных с активностью 4 ЛД50/см3. При получении сывороток на каждый из штаммов вируса использовали 2 схемы, отличающиеся между собой дозой и способом введения антигена, кратностью и интервалом между введениями.

Получение гипериммунной сыворотки проводили на трех группах животных, одна из которых была контрольной. Первой группе вирус вводили еженедельно, внутримышечно в течение четырех недель, а затем однократно внутривенно согласно методу, описанному А.А. Сулимовым и Е.Ю. Зеленовым ( 1980 г.).

Вторую группу продуцентов гипериммунизировали малыми дозами антигена, используя "эффект иммуной памяти", по методу, предложенному для получения гипериммунных сывороток МасаЛЬеу. Кроликам вводили антиген с полным адъювантом Фрейнда в дозе 1,5 см3, козам — в дозе 5 см3, тхорзофреткам — 1,0 см3, собакам — 3 см3, а через 2 месяца антиген без адъюванта инъецировали внутривенно. Животным контрольной группы вводили суспензию не зараженных культур клеток.

Специфическую активность сывороток определяли в РН до и по окончании иммунизации-

Сыворотки крови первой группы кроликов, которым производили еженедельное введение антигена, обладали активностью в РН с разными штаммами ВЧП в пределах — 6,6±0,24 — 8,5±0,25, коз — 7,2±0,37 — 8,0+0,0, хорьков — 8,25±0,5 — 9,5±0,3, собак —■ 7,75±0,25 — 10,0±0,7. Более высокую активность (на 2—3 в РН проявили сыворотки крови, полученные от животных, иммунизированных с использованием эффекта "иммунной памяти".

Разница активности сывороток от разных доноров, иммунизированных по одной и той же схеме была статистически недостоверной.

В качестве контроля специфичности реакции при исследовании всех сывороточных образцов в РН была использована стандартная сыворотка против чумы плотоядных с активностью в РН 6,0 полученная из Франции от доктора Р. СИарршз.

Все полученные сыворотки не обладали активностью в РТГА с возбудителем парвовирусного энтерита, в РДП с штаммами аденовирусов собак обоих серотипов и культуре клеток в реакции нейтрализации.

Оценка полученных сывороток по показателям специфичности и активности показала, что диагностические сыворотки, полученные методом иммунизации "малыми дозами антигена" на козах и кроликах превосходили аналогичные, полученные на собаках и тхорзофретках. Поэтому в дальнейшей работе мы использовали именно эта сыворотки.

Использование метода флюоресцирующих антител для выявления вируса чумы плотоядных (МФА).

Полученную на козах сыворотку с активностью в реакции нейтрализации 1:2048 использовали для получения конъюгата. В научно-исследовательском эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи АМН РФ из нее была выделена гамма-глобулиновая фракция и проведена метка ФИТЦ по методике, описанной КЛ. Шиханиной и др. (1968).

Реакция ко-агглютинации (РКОА).

Диагностикум готовили путем сенсибилизации специфическими сыворотками клеток золотистого стафилококка ( шт. Со\уап-1). В реакции использовали 10% стафилококковый сорбент с титром 1:512.

Постановку реакции проводили на обычном обезжиренном предметном стекле, помещая на него каплю испытуемого материала. В нее и контроля вносили по капле 2% взвеси антительного стафилококкового препарата и, покачивая стекло, смешивали.

Электропномикроскопнческие исследования (ЭМ и ИЭМ).

Для проведения исследований этим методом нами совместно с ведущим научным сотрудником института Ю.А.Могильным методом негативного контрастирования были исследованы пробы, полученные от больных тхорзофреток.

В результате проведенных исследований ЭМ из 18 проб две дали сомнительные результаты, девять проб были отрицательными, семь проб -положительными. Две пробы, давшие сомнительные, и пять проб, давшие отрицательные результаты, при электронной микроскопии, в ИЭМ были охарактеризованы как положительные. Семь проб положительных при ЭМ, были положительными и в ИЭМ с характерным группированием чумных вирионов в "облаке" специфических антител.

Использование ИФА для диагностики чумы плотоядных.

В основу использованного нами метода обнаружения вируса ЧП был положен "сэндвич"-вариант ИФА (с1о1:-ИФА), как один из сравнительно простых, достаточно надежных и воспроизводимых методов.

При использовании этого метода для выявления антигена к вирусу чумы плотоядных в смывах из носа и конъюктивы больных и павших животных нами решелись следующие задачи:

• на основе полученных специфических сывороток и иммуноглобулинов к вирусу чумы плотоядных, создать пероксидазный конъюгат;

• отработать условия постановки всех этапов реакции;

• создать коммерческий набор для экспресс-диагностики чумы плотоядных;

• провести испытания тест-системы в условиях ветеринарных лабораторий.

В качестве позитивной сыворотки к вирусу чумы плотоядных использовали полученные нами на козах сыворотки с активностью в реакции нейтрализации 1:2048.

Иммуноглобулины в класса выделяли путем осаждения насыщенным раствором солей сульфата аммония по общепринятой методике.

Полученный таким образом иммуноглобулин имел следующие показатели: массовая доля общего белка — 5,1% и его фракций - 96%, активность в РН 1:512.

Важным фактором, определяющим чувствительность и специфичность данного теста является качество используемого пероксидазного конъюга-та. Метод Иакагп Р.Н. (1974), Р. Т^сп с! а1. (1982) лег в основу, но был модифициран специалиствми НПО "Вектор"(патент № 93036227/14), которые нашли оптимальные соотношения иммуноглобулин-фермент, что

обеспечивало более высокий уровень специфического ответа за счет возможного устранения воздействия не меченных антител на активные центры антигенов.

При конструировании сэндвич-смеси учитывали изменение величины специфического ответа (степень окрашивания проб на нитрацеллюлозной мембране) при различных разведениях сорбируемого иммуноглобулина и конъюгата. При выборе рабочего разведения иммунопероксидазного конъюгата оптимальным явилось разведение: сывороточных антител козы, специфичных к ВЧП 1:100, и антивидовых ^ в, меченых пероксида-зой хрена, в разведении 1:3000. Такое соотношение компонентов обеспечивало высокую четкость реакции ИФА, выражавшуюся в окрашивании заведомо положительных проб на подложке (нитроцеллюлозе) и полное отсутствие фонового окрашивания. При больших концентрациях имели место фоновое окрашивание за счет неспецифической сорбции молекул конъюгата, при меньших концентрациях отмечалось снижение величины специфического ответа (интенсивность окраски контроля ВЧП).

В отличие от классической схемы постановки ИФА с раздельным инкубированием специфичных и антивидовых антител нами была предложена ускоренная схема проведения анализа, в основе которой лежит приготовление сэндвич-смеси, содержащей комплекс этих антител.

Было проведено сравнительное испытание чувствительности и специфичности двух вариантов ИФА: общепринятого и ускоренного твердофазного ЕЫБА-ёо!. В качестве тестируемых антигенов были использованы стандартные штаммы вируса чумы, парвовирусного энтерита, аденовируса плотоядных.

Сравнительный анализ показывает, что разница результатов, полученных при исследовании антигенов в том и другом варианте реакции была статистически недостоверной.

Таким образом, внесенные нами в стандартную методику усовершенствования позволили ускорить проведение исследований в 3—4 раза без снижения чувствительности и специфичности реакции и использовать минимальное количество исследуемого материала (1—2 мкл).

В серии отдельных экспериментов с использованием предложенного нами экспресс-метода были определены параметры его чувствительности и специфичности.

Оценку чувствительности разработанной иммуноферментной тест-системы проводили со штаммами ВЧП, а также клиническим материалом, полученным от больных или погибших от чумы животных, предварительно оттигрованным в соответствующей биологической системе. Контролем служили некоторые гетерологичные штаммы вирусов плотоядных и смывы из носа и глаз от клинически здоровых собак и коз. Метод сЫ-ИФА позволяет обнаружить чумной антиген только у эпизоотических штам-

мов, с титром не ниже 4 полученных от больных чумой животных и производственный штамм вируса чумы плотоядных «Снайдер-Хилл» (титр 3,75—4,0

В серии экспериментов на клиническом материале, полученном от экспериментально зараженных собак, изучали специфичность и оптимальные сроки отбора материала для исследования в ИФА. Оценку этой реакции здесь и далее производили визуально: интенсивное коричневое «++++», менее интенсивное «+++», слабое коричневато-розовое «++», слабо розовое «+». В эксперименте мы использовали 11 беспородных щенков, разделенных на 4 группы. Трех собак первой группы интрацеребрально заразили штаммом «Снайдер Хилл» вируса чумы плотоядных с активностью 10" ДЦ50/см3 в дозе 1 мл. Аналогичное число собак второй группы - внутривенно штаммом Дан возбудителя парвови-русного энтерита (титр 1:1024 в РГА) в дозе 5 см3, трех собак третьей группы -внутримышечно штаммом ВГЫКИ (с титром 104 ТЦД50/СМ3) вируса гепатита плотоядных в дозе 5 см3 и два щенка аналогичного возраста заражению не подвергали - они служили контролем.

Ежедневно в течение месяца у животных брали смывы выделений из глаз и носа, исследовали в ИФА. На 2—3 сутки после заражения собак ВЧП, еще до развития клинических признаков болезни, смывы со слизистых оболочек носа и глаз давали положительную реакцию в ИФА. На 4— 5 сутки после заражения у собак повысилась температура тела до 39,8°С. В последующие сутки наблюдали угнетение, анарсксию, выделение гнойно-серозной жидкости из носа, конъюнктивит, светобоязнь и диарею. Пробы, отобранные для исследования в ИФА, в этот период давали более интенсивное окрашивание «++++». На 8—9 сутки общее состояние животных резко ухудшилось, прогрессировали судороги и парезы тазовых конечностей. Животные впали в кому и на 11—13 сутки погибли. Данные проведенных исследований показали, что метод ИФА позволяет обнаружить вирус чумы в смывах из носа и глаз экспериментально зараженных животных до появления клинических признаков болезни. По мере их развития реакция в ИФА становится более интенсивной, что выражается ярким окрашиванием нитроцеллюлозы в местах наненсения иследуемых проб.

Подтверждением специфичности реакции служила биопроба на ин-тактных тхорзофретках, зараженных клиническим материалом от больных собак, давшая положительные результаты. При введении тхорзофрет-кам смывов со слизистой от больных собак, через 3 суток и в последующем появлялись характериные признаки болезни: подъем температуры, расстройство Ж.К.Т., появились выделения из глаз, отмечалась светобоязнь и признаки поражения Ц.Н.С.-тики. На 9 сугки начался падеж среди экспериментально зараженных животных. Пробы от хорьков, исследованные в ИФА, дали четкое окрашивание нитроцеллюлозной мембраны в местах нанесения образцов.

Сравнение лабораторных методов диагностики чумы плотоядных.

Были исследованы 26 образцов смывов со слизистой носа и глаз, полученных от собак и 8 образцов от тхорзофреток, зараженных вирусом чумы плотоядных интрацеребрально и внутримышечно соответственно. Четыре собаки были заражены парвовирусом, по четыре аденовирусом 1 и 2 серотипов, две - коронавирусом и две - парагриппом. Отрицательным контролем служили пробы, полученные от животных, которым вводили суспензию клеток селезенки здоровых хорьков. В качестве положительного образца использовали гомогенат селезенки хорька, зараженного вирусом чумы плотоядных (штамм «Снайдер Хилл»). Результаты опыта показаны в таблице № 1.

Исследование МФА показало, что 5 из 26 испытуемых образцов от собак и 5 от 8 тхорзофреток дали характерное желто-зеленое свечение вирусного антигена, представляющее многочисленные очаги флюоресцирующих клеток, интенсивность свечения составила три "креста" «+++».

В пяти пробах ог собак свечение было менее интенсивным, в поле зрения находилось по две характерные клетки, поэтому результат интерпретировали как сомнительный. Здесь и далее сомнительные результаты всех лабораторных методов трактовали как отрицательные.

Отсутствие характерного свечения было отмечено в 6 образцах.

Результаты исследований в РКОА при исследовании 26 проб от собак и 8 от хорьков показали появление агглютината и осветление жидкости в 7 и 5 соответственно.

В результате проведенных исследований ЭМ из 26 проб от собак в 9 был обнаружен парамиксовирус, 17 проб дали отрицательные результаты. В 4 из 8 проб от хорьков был обнаружен ВЧП. Результаты проведенной затем иммуноэлектронной микроскопии, показали более высокую чувствительность и положительные результаты были получены в 19 и 6 пробах соответственно. При ИЭМ наблюдали характерное группирование чумных вирионов в "облаке" специфических антител.

Результаты ИФА показали, что из 26 исследованных препаратов от собак 24 были положительными, все 8 проб от хорьков прореагировали положительно, сомнительных результатов реакций не отметили ни в одном случае.

Пробы контроля на специфичность и отрицательного контроля (полученные от животных зараженных штаммами вирусов парвовирусного энтерита, инфекционного гепатита и препаратов селезенки здоровых животных) во всех использованных нами методах исследований продемонстрировали отрицательные результаты.

Положительный контроль во всех случаях имел специфическое проявление, характерное для данного метода.

Сравнительное испытание тест-системы для диагностики чумы плотоядных

Таблица № 1

Исследуемый материал Количество проб Методы диагностики

Биопроба МФА РКОА ЭМ ИЭМ ИФА

Количество положительно прореагировавших

Клинический материал от собак, больных чумой 26 5 5 7 9 19 24

Клинический материал от тхорзофреток, больных чумой 8 8 5 5 4 6 8

ВЧП шт. «Снайдер-Хилл» («+» контроль) 1 1 1 1 1 1

Клинический материат от собак и тхорзофреток, зараженных вирусом:

ИГП, шт. ВГНКИ 3 и/и 1 — - — —

АВИ, шт. «Ада» (адено) 4 и/и

ПВС, шт. «Чин» (парво) 4 н/и 2 — - — —

КВС, шт. «Карат» (корона) 1 н/и

ПГС, шт. «Рикан» (парагринн) 1 н/и 1 - —

Клинический материал от здоровых собак и тхорзофреток («—» контроль) 3 3/0

Совпадение результатов (%) 100 29,4 35,2 38,2 73,5 96

Длительность проведения одного исследования 9—12 суток 48 часов 1 час 6—8 часов 12 часов 1 час

Примечание: н/и — не исследовал»; «—» - отрицательный результат.

Анализ полученных данных, произведенный по методу Фечилда (1990 г.) показал, 100% специфичность всех использованных реакций по отношению к результатам, полученным при биопробе. Совпадение результатов при исследованиях разными методами с полученными при проведении биопробы с ИФА — 96%, МФА — 29,4%, ЭМ — 38,4%, РКОА — 5,2%.

Из всех испытанных нами методов диагностики чумы наиболее приемлемым для практического использования был метод ИФА. Его постановка занимала около 60 минут, не требовала какого-либо инструментального оснащения. Этот метод показал высокую чувствительность и специфичность.

Испытание иммуноферментной тест-системы для диагностики чумы плотоядных.

Сравнительные испытания, показавшие преимущество ИФА перед другими лабораторными методами, вызвали необходимость создания коммерческого набора для диагностики чумы плотоядных этим методом. Нашей задачей стало создание такого набора, ко торый мог быть использован в широкой ветеринарной практике и применим как в лабораторных, так и в клинических условиях.

В состав набора включены следующие компоненты.

В качестве контрольного положительного образца (К*) осветленный инактивированный формалином 20% гемогенат селезенки больной чумой тхорзофретки.

В качестве отрицательного контрольного образца (К-) применяли осветленный инактивированный гомогенат селезенок незараженных тхорзо-фрсток, приготовленный аналогичным способом.

Все жидкие компоненты набора кроме экстрагирующей смеси и перекиси водорода содержали мертиолят в концентрации 0,003%.

Фосфагно-солевой буферный раствор с твином, рН 7,4 включал в свой состав:

— натрий фосфорнокислый двузамещенный

12-водный по ГОСТ 4172-76 — 2,76 г

— натрий фосфорнокислый однозамещенный

2-водный по ГОСТ 245-76 — 0,36 г

— натрий хлористый по ГОСТ 4233-77 — 8,50 г

— твин-20 «Сигма» или твин-80 по ФС 42-167-72 — 0,5 см3

— вода дистиллированная — до 1,0 дмЗ

— кислота соляная по ГОСТ 3118-77 до получения рН 7,4

Цитратно-фосфатный буферный раствор, рН 4,9 включал в себя:

— натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный — 37,59 г

— кислота лимонная по ТУ 6-09-584-75 — 5,21 г

— вода дистиллированная до 1,0 дм3

— кислота соляная до получения рН 4,9

Экстрагирующая смесь хлороформа по ТУ 64-6-306-85 и этилового спирта по ГОСТ 18300-87 в соотношении 3:1.

В наборе были использованы: перекись водорода по ГОСТ 10929-76, диаминобензидина тетрагидрохлорид (ДАБ) фирмы "Сигма"и мембрана нитроцеллюлозная производства «Био-Рад» (трансблот) или аналогичная.

Пробы от подозрительных по заболеванию чумой животных получают методом смыва с конъюктивы и слизистой оболочки носа. Образцы для анализа исследуют сразу или хранят по необходимости при температуре 40°С в течение 1—2 дней. Схематично проведение исследований отображено на рисунке № 1.

Рисунок Nq 1

Схема проведения реакции

I. Отбор проб

АГ

Г1. Нанесение гена на нитроцеллн

Сэядвнчаая (АГ + ПХ)

смесь

III. Инкубация антигена с сэндвич-смесью и пероксидазой хрена

АГ + АТ К+ К-

IY. Внесение ДАБ и Н202 и окрашивание положительных проб на нитроцеллюлозе

2 2

—/ГмГ"^ Чу' ''/Г'

В дальнейшем определяли стабильность сохранения активности и специфичности разработанной тест-системы при ее хранении (температура +2+6°С ) в течение одного года. С этой целью 3 испытуемых диагностических набора каждые 3 месяца в течение полугора лет проверяли на активность и сравнивали полученные результаты с результатами исследований, проведенными с использованием вновь приготовленного набора. Установили стабильность работы диагностического набора в течение восьми месяцев.

Предложенный нами коммерческий набор представляет собой комплект препаратов для постановки иммуноферментной реакции по выявлению антигена чумы плотоядных в смывах из носа и конъюнктивы больных и павших животных. Набор рассчитан на 20 анализов.

Исследования методом с!о1-ИФЛ смывов от 283 собак одной из клиник г. Москвы с диагнозом "ринит", "конъюнктивит" и "чума", позволяли уточнить в ряде случаев диагноз на ранних стадиях заболевания и назначить соответствующее лечение для животных из групп с диагнозом "ринит" и "конъюнктивит".

Использование ИФА-диагностики позволило диагностировать чуму у 19% животных с диагнозом "ринит" и у 38% - с диагнозом "конъюнктивит". Наблюдения за развитием у этих собак клинической картины чумы плотоядных в дальнейшем полностью подтвердило результаты наших лабораторных исследований.

В группе собак с клиническим диагнозом "чума" в результате лабораторных исследований положительная реакция на антиген ВЧП была отмечена только у 65% животных. Дальнейшее наблюдение показало, что из 35% животных, диагноз которых не был подтвержден в ИФА, диагноз -"чума" в последующем не подтвердился и клинически. Важно отметить, что 14% собак, у которых были выявлены антигены ВЧП, наблюдали дальнейшее прогрессированис клинических признаков чумы. Таким образом, очевидно, что применение в ветеринарной практике (Ы-ИФА для выявления антигенов ВЧП позволяет с достаточной достоверностью подтвердить или опровергнуть первоначальный клинический диагноз.

С целью исключения возможности выявления в ¿оЬИФА антигенов вакцинных штаммов ВЧП и возможной интерпретации результатов как ложноположительных, мы исследовали смывы со слизистых от собак различных пород через 3, 7 и 14 дней после вакцинации.

Проведенные исследования показали, что у абсолютного большинства обследованных животных наличие вакцинного вируса чумы плотоядных выявить не удалось.

Практическое использование набора показало, что получение материала для исследования не представляет трудностей для врачей, не травматично для животных. Выявление антигена вируса чумы занимает около 1 часа и не требует специально оснащенных лабораторий.

За 4 года коллегами из НПО "Вектор" изготовлено и реализовано около 800 диагностических наборов для проведения 16000 диагностических исследований.

В течение 4 лет рекламаций на качество выпускаемых диагностикумов не поступало.

Таким образом, в результате проведенных исследований решены поставленные задачи и достигнута цель — разработан метод и сконструирована "Тест-система иммуноферментная для диагностики чумы плотоядных", позволяющая проводить раннюю прижизненную диагностику чумы плотоядных.

Выводы

1. Установлены породные, возрастные различия в предрасположенности собак к заболеванию чумой и возможность предварительной постановки диагноза на чуму, при обнаружении хотя бы одного из 6 наиболее характерных симптомов болезни.

2. Гипериммунизация кроликов методом "малых доз", обеспечивает получение высокоактивных гипериммуннных противочумных сывороток, с титром вируснейтрализующих антител с 1:512 в РН..

3. Путем подбора оптимальных соотношений объемов специфической сыворотки кролика против вируса чумы и антнвидовой сыворотки козы, получен высокоактивный и специфичный иммуносорбснт, пригодный для выявления вируса чумы собак в тест-системе ИФА.

4. Разработана тест-система для выявления вируса чумы собак в выделениях со слизистой носа и глаз больных животных, которая включает в себя нанесение материала на нитроцеллюлозную подложку, наслоение иммуносорбента и окраску комплекса "вирус + антитело", раствором красителя (ДАБ).

Тест-система обладает высокой чувствительностью, специфичностью и превосходит по этим показателям другие методы лабораторной диагностики болезни. Результаты, полученные при использовании иммунофер-ментной тест-системы, совпадают с результатами биопробы — в 96%; МФА - в 29,4%; ЭМ - в 38,4%; ИЭМ - в 73,5%; РКОА - в 35,2%.

6. Данный метод позволяет обнаруживать вирус чумы собак в секретах из носа и глаз экспериментально зараженных и больных собак в период со второго по 15—20 дни после заражения, то есть за 3—4 дня до появления симптомов болезни. Максимально вирус накапливается в выделениях на 8—9 сутки.

Практические предложения

1. Разработанная тест-система применяется для диагностики чумы плотоядных.

2. Наставление по применению тест-системы утверждено Департаментом ветеринарии МСХиП РФ Na 13-7-2/900 от 01/IV—97 г.

3. Разработанный метод лабораторной диагностики болезни включен в «Инструкцию о мероприятиях по предупреждению и ликвидации чумы плотоядных», утвержденной Департаментом ветеринарии МСХиП РФ Na 13-4-2/911 от 25/1V—97 г.

Список основных опубликованных работ по теме диссертации:

1. Сазонкин В.Н. Тест-система для прижизненной диагностики чумы плотоядных. // Suilaikincs Veteriniyons Problemas, Kaisiadorys — 1993, с. 33—35.

2. Сазонкин В.Н., Уласов., Логунова Л.Б. Экспресс-диагностика чумы плотоядных с помощью иммуноферментного метода. // Ветеринария — 1994, № 7, с. 48—49.

3. Сазонкин В.Н., Уласов В.И. Чума плотоядных. Диагностика и профилактика / Патогенез, диагностика и лечение вирусных заболеваний мелких домашних животных. // Сб. докл. Научно-практического биологического центра «ЧИН» — Санкт-Петербург, 1995, в. 1, с. 5—11.

4. Сазонкин В.Н. Чума собак. Клинические проявления болезни, новые направления в диагностике. // Мир колли. — Москва, 1996, в. 2, с. 74—75.

5. Сазонкин В.Н., Уласов В.И. Новое в борьбе с чумой собак. Теория и практика в диагностике, профилактике и лечении. И Проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных: Материалы IV Международной конференции — Москва, 1996.

6. Уласов В.И., Сазонкин В.Н. и др. Изучение вирусных инфекций диких животных. // Вопросы прикладной экологии (природопользования), охотоведения и звероводства: Материалы научной конференции — Киров,

1997, с. 332—333.

7. Сазонкин В.Н., Рахманина М.М., Элизбарашвили Э.И. Диагностика, специфическая профилактика и лечение чумы и парвовирусных инфекций плотоядных. // Материалы VI Международной конференции — Москва,

1998.

ЗАО «ИПК Робин», г. Москва, 3-й Колобовский пер., строение 4, д. 8. Заказ 1972. Тираж 75 экз.