Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка промышленной технологии изготовления вакцины против некробактериоза животных

На правах рукописи

МЕНЬШЕНИН Владимир Викторович

РАЗРАБОТКА ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА ЖИВОТНЫХ

Специальность 16. 00. 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва, 1998

Работа выполнена во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и Краснодарской биофабрике.

Научный руководитель

- Заслуженный деятель наук РФ, доктор ветеринарных наук профессор Л. В. Кириллов.

Официальные оппоненты:

- Заслуженный деятель наук РФ, доктор ветеринарных наук профессор Ю. А. Малахов (ВГНКИ);

-доктор ветеринарных наук, профессор А. А. Сидорчу* (МГАВМиБ).

Ведущее учреждение

- Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности.

Защита диссертации состоится 10 декабря 1998года в 14 часов н; заседании диссертационного совета Д. 120. 85. 01 при Всероссийскои государственном научно-исследовательском институте контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов по адресу

Москва, Звенигородское шоссе 5, ВГНКИ ветпрепаратов.

С диссертации можно ознакомится в библиотеке ВГНК1' ветпрепаратов

Автореферат разослан

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы.

Среди болезней, продолжающих наносить значительный ущерб животноводству, важное место принадлежит инфекционным болезням конечностей и прежде всего некробактериозу животных. Эта проблема в молочном скотоводстве, по своей значимости, стоит непосредственно после маститов и бесплодия.

Некробактериоз регистрируется у всех видов животных, во всех странах мира, включая и высокоразвитые, встречается он и у человека.

По данным официальной ветеринарной отчётности некробактериоз ежегодно поражает до 19% поголовья северных оленей, 18% овец и около 10% крупного рогатого скота.

Экономический ущерб, причиняемый этой инфекцией весьма значителен и складывается из затрат, связанных с профилактикой и лечением больных живот пых, их гибелью или преждевременной выбраковкой на мясо, сокращением продуктивности и других расходов, обусловленных проведением мероприятий по профилактике и лечению болезни.

До недавнего времени средства специфической профилактики некробактериоза отсутствовали как в нашей стране, так и за рубежом, несмотря на то, что их разработкой занимались такие учёные как: Cesari Е., 1923; Р.Гарнах, 1927; Ф.И.Каган, Я.Р.Коваленко, 19331954; С. М. Муромцев, 1935; Ф. И. Ревнивых, 1940; Roberts, 1970; Qarcia М. et al., 1975; Clark В. et al., 1986; Emery et al., 1986 и др.

Б 1990 году на Краснодарской биофабрике впервые изготовили опытно-промышленную партию вакцины по технологии научно-исследовательского института сельского хозяйства (НИИСХ) Крайнего Севера. В ходе промышленного освоения препарата было установлено, что предложенная институтом технология изготовления вакцины не может быть полностью воспроизведена в биофабричных условиях из-за высокой трудоёмкости и сложности выполнения отдельных её звеньев и требует существенной технологической доработки с проведением значительных дополнительных исследований.

Одновременно возникла необходимость и в разработке более дешёвой питательной среды для выращивания производственных штаммов некробактерий и оптимальных режимов их культивирования в реакторах.

1. 2. Цель и задачи исследований.

Целью настоящих исследований явилась разработка промышленной технологии изготовления вакцины против некробактериоза животных

и испытание её эффективности в хозяйствах Российской Федерации.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Разработать более экономичную питательную среду для выращивания некробактерий в реакторах и предложить оптимальный регламент их промышленного культивирования.

2. Изучить влияние некоторых наиболее трудоёмких и длительных технологических операций на специфическую активность вакцины с целью возможного их исключения или замены.

3. Предложить более рациональный способ извлечения комплексных соматических водорастворимых антигенов из клеток производственных штаммов бактерий некроза, установить оптимальные условия их сорбции.

4. Изготовить по разработанной технологии опытно-промышленные и промышленные серии вакцины, провести их производственные испытания в хозяйствах, неблагополучных по некробактериозу животных.

5. Разработать и утвердить в соответствующем порядке комплект нормативной документации (инструкцию по изготовлению и контролю, технические условия и наставление по применению) на вакцину инактивированную против некробактериоза животных.

1.3. Научная новизна.

Впервые установлена возможность получения соматических антигенов бактерий некроза с помощью ферментативного гидролиза биомассы микроорганизмов с дальнейшей инактивацией их формалином и сорбцией растворимых антигенов на геле гидрата окиси алюминия.

1.4. Практическая значимость.

Впервые разработана и внедрена на Краснодарской биофабрике промышленная технология изготовления инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против некробактериоза животных на основе комплексных соматических антигенов, извлекаемых из микробных клеток путём ферментативного гидролиза их оболочки.

Вакцина испытана на большом поголовье животных в неблагополучных хозяйствах различных регионов Российской Федерации.

1.5. Апробация и внедрение.

Материалы диссертации доложены на Учёном Совете Кранодарской НИВС (1996г.), на межлабораторном совещании сотрудников ВГНКИ ветпрепаратов (199^'.).

По результатам проведённых исследований разработаны и

утверждены следующие нормативные документы:

1. Наставление по применению вакцины против некробактериоза животных (Ы 13-4-2-233) - утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 17. 01. 1995г.

2. Технические условия (ТУ 9384-055-00494185-95), согласованные с Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ и утверждённые директором ВГНКИ 01. 05. 1995г.

Основные этапы технологии изготовления препарата легли в основу "Инструкции по изготовлению вакцины против некробактериоза животных", утверждённой директором биофабрики 17 января 1995г.

В настоящее время вакцина против некробактериоза животных выпускается Краснодарской биофабрикой по разработанной нами технологии и широко применяется в животноводческих хозяйствах различных регионов России. Ежегодно иммунизации подвергается около 1.0 млн. голов крупного рогатого скота.

1.6. Публикации.

По материалам диссертации получен патент, две работы опубликованы в периодической печати.

1.7. На защиту выносятся основные положения разработки технологии промышленного изготовления вакцины против некробактериоза животных.

1.8. Структура и объём диссертации.

Диссертация изложена на 183 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы и приложения. Список литературы содержит 207 названий работ отечественных и иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами. В приложении к диссертации представлены копии 20 документов, подтверждающих достоверность материала.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Настоящие исследования выполнены в периоде 1992 по 1996 гг. в производственных цехах Краснодарской биофабрики, животноводческих хозяйствах Краснодарского края, НИИСХ Крайнего Севера и в лаборатории контроля и стандартизации препаратов против анаэробных болезней животных ВГНКИ.

В работе использованы 4 производственных штамма F. песгор-horum, выделенных от северных оленей и крупного рогатого скота.

При выполнении работы были использованы следующие материалы:

1. Питательные среды на основе: перевара Хоттингера (ОПХ), ферментолизата биомассы микроорганизмов (ФБМ), а также среды на основе следующих ферментативных гидролизатов: мясо - печёночно - казеинового (МПКГ ), казеиново - эритроцитарного (КЭГ) и соево-эритроцитарного (СЭГ).

2. Лабораторные, опытно - промышленные и промышленные партии вакцин против некробактериоза животных, полученные разными способами.

При изготовлении гидролизатов для расщепления белка использовали фарш поджелудочной железы, панкреатин, растительные ферменты. Гидролиз вели в течение 2-6 суток, с периодическим отбором проб для исследований.

При изучении химического и биологического состава питательных сред и культуральных жидкостей (КЖ) определяли:

- аминный азот-методом формольного титрования по Серенсену-Гаврилову;

- общий азот-методом Къельдаля;

- белок - по Лоури;

- полипептиды - методом гельфильтрации на сефадексе Q-15;

- пептон - биуретовой пробой;

- аминокислоты - хроматографией на КЛА-ЗБ "Хитачи".

Коэффициент гидролиза белка вычисляли по отношению количества

аминного азота к общему.

Биологическую полноценность питательных сред оценивали при культивировавши на них тест штаммов (Staph, aureus - "Лоссманов";

Str. pioqenes Dick -1; Shiq. flexneri- 8516; E. coli 675, Cor . diph-theroidesl9v; Str. Faecalis) и производственных штаммов некробактерий по степени накопления микробных тел и морфологии клеток.

О потреблении культурами производственных штаммов азотистых веществ, в том числе аминокислот, судили по разнице их содержания в питательных средах и в культуральных жидкостях после 24 и 36 часов выращивания.

В процессе культивирования производственных штаммов определялись: чистота расплодок культур и посевов в реакторах на МППБ, МПБ, МПА, микроскопией мазков, окрашенных по Граму; величина pH питательных сред и культуральных жидкостей, антигенов и вакцин - потенциометрически; концентрация микробных тел в культуральных жидкостях - по оптической плотности путём

фотоэлектрокалориметрии против испытуемой питательной среды до засева в неё штаммов некробактерий.

Отделение бактериальной массы от культуральных жидкостей производили на центрифуге (УГР-101, отделение антигена от клеточных дериватов - на центрифуге с угловым ротором и ОТР-101. Соматические антигены бактерий получали как из биомассы^ трижды обработанной ацетоном, так и из нативной. Соматические антигены использовали в вакцине очищенными путём диализа против воды и без диализа.

Разрушение клеток производили механическим способом при помощи гомогенизаторов разных объёмов, пресса, автоклава, мельниц сдобавлением стеклянного песка и методом ферментативного гидролиза. Инактивацию антигенов осуществляли формалином.

В качестве адъюванта и адсорбентов испытывали латекс, масляно-ланолиновый адъювант, минеральное масло, полиэтиленгликоль-400 и гель гидрата окиси алюминия.

Оптимальные соотношения адсорбента и антигена устанавливали в опытах, варьируя величиной рН, количеством адсорбента и временем адсорбции. Контроль полноты сорбции осуществляли в реакции диффузной преципитации (РДП) и определением в смеси антиген -адсорбент количества свободного белка. Иммуногенность опытных партий вакцин проверяли при иммунизации кроликов с последующим изучением специфической активности сывороток в РДП и реакции агглютинации (РА). Иммунизирующую дозу вакцины для крупного рогатого скота и кратность её применения устанавливали путём одно -и двукратного введения препарата с разным содержанием белка в дозе и последующим взятием крови для изучения динамики антителообразования через 14, 28, 56 дней и 6 месяцев после иммунизации в реакции агглютинации и по эпизоотической эффективности вакцинации в неблагополучных хозяйствах.

Безвредность вакцин проверяли на белых мышах, кроликах и крупном рогатом скоте.

Стерильность - посевами на МППБ, МПБ, МПА, среду Сабуро.

Активность - по соответствию содержания белка в растворах соматических антигенов иммунизирующей дозе и при постановке РА с сыворотками крови двукратно вакцинированных кроликов.

Результаты опытов обрабатывались по методу Стьюдента с учётом рекомендаций Р. Ф. Лакина (1980).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Характеристика производственных штаммов.

Для изготовления вакцины в качестве производственных были использованы 4 штамма Б. песгорЬогит, выделенные от северных оленей и крупного рогатого скота и обладающие следующими свойствами:

- Морфология. Грамотрицательные разной длины палочки и нити. В культурах, свежевыделенных от больных животных, микроб растёт в виде длинных, сплетающихся в клубки нитей и палочек с хорошо выраженной зернистостью;

- Культуральные свойства. Оптимальная реакция среды выращивания 7, 6-7, 8; температура культивирования 36-37,5° С. На среде Китт - Тароцци растут с равномерным помутнением среды и выпадением на вторые сутки выращивания рыхлого осадка на дне пробирки. Рост культур сопровождается умеренным газообразованием, гнилостным запахом;

- Ферментативная активность. И. песгорЬогит разлагают с образованием кислоты и газа глюкозу, сахарозу, рафинозу, лактозу, манит, мальтозу, фруктозу, очень слабо - дульцит, глицерин, сорбит, галактозу, арабинозу; образуют индол и сероводород. Не восстанавливают нитраты в нитриты;

- Патогенность. Все производственные штаммы патогенны для кроликов и белых мышей.

3.2. Определение оптимальных условий культивирования производственных культур.

В качестве одного из основных источников энергии, необходимого для синтеза клеточных структур, использовали глюкозу в установленных оптимальных количествах, составляющих 1,5-2% (в пересчёте на сухое вещество) к объёму питательной среды.

С целью определения зависимости между накоплением микробной массы и концентраций водородных ионов среды нами было проведено выращивание 2-х культур некробактерий на бульоне Хоттингера при значении рН в пределах от 7,0 до 7,9.

Результаты эксперимента показали, что наиболее благоприятные условия для накопления микробной массы при рН = 7,6 - 7,8 и продолжительности роста в течение 27-36 часов. В дальнейшем рост клеток приостанавливается и они частично лизируются. Повышение или понижение величины рН среды , выходящие за найденные пределы, ведёт к существенному снижению накопления микробных клеток, и в дальнейшем к их гибели.

3.3. Подбор питательных сред для промышленного культивирования производственных штаммов.

Большинство исследователей считают, что для нормальной жизнедеятельности F. necrophorum нуждается в питательных средах, изготовленных на основе белковых гидролизатов определённой степени расщепления и содержащих пептоны, полипептиды и свободные аминокислоты.

Для установления оптимальной степени расщепления белка, необходимой при культивировании некробактерий, нами были приготовлены 10 партий экспериментальных питательных сред на основе переваров Хоттингера (ОПХ), с различной продолжительностью гидролиза (48 и 144 часа). К каждой из этих сред добавляли 0,5% сухого пептона, 5% печёночного экстракта и 0,5% поваренной соли. Содержание аминного азота устанавливали в пределах 160-180 мг%, рН 7,6 - 7,8 .

Как показали исследования, более высокое накопление биомассы некробактерий отмечено на средах, изготовленных из 2-х суточного перевара Хоттингера, содержащего 1303,0 + 7,4 мг% общего и 730,0 + 4,8 мг % аминного азота, 4,3 % + 0,03 белка, 2,7% +0,04 полипептидов, коэффициент гидролиза 0,56 + 0,02 и более высокое количество лизина, аргинина, серина, глутаминовой кислоты, пролина, метионина и фенилаланина, чем в 6 суточных переварах.

В дальнейшем эта рецептура питательной среды использовалась как контрольная при сравнении ростовых свойств некробактерий на других разрабатываемых нами средах.

Учитывая высокую стоимость и дефицит мясных продуктов, мы пошли по пути замены их белковыми субстратами казеина и кормовых дрожжей (БВК).

Мясо - печёночный казеиновый гидролизат (МПКГ) готовили путём смешивания 2 частей казеинового (КГ) и 1 части мясо - печёночного гидролизата (МПГ), состоящего из равных частей мясного фарша и печени. Гидролиз вели 2 % фаршем поджелудочной железы или 0,2 % раствором панкреатина, при рН 8,0-8,2, температуре 42-45°С до накопления аминного азота 180-200 мг% в КГ и 77-80 мг% в МПГ.

Ферментативный гидролиз БВК проводили с помощью растительных ферментов - протосубтилина, протомезентерина, лизосубтилина, а также с помощью фарша поджелудочной железы или панкреатина.

Изучение химического состава ОПХ, МПКГ и ферментолизата биомассы микроорганизмов (ФБМ) показали, что по содержанию компонентов азота МПКГ близок к ОПХ, в то время как ФБМ отличается более низким содержанием белка-2,81 % вместо 4,3 % и 4,1%

в ОПХ и МПКГ, соответственно.

Так же МПКГ близок к ОПХ по качественному, количественному и суммарному содержанию аминокислот, а ФБМ содержит в 1,4 раза больше тирозина и лейцина^в 1,3- аланина, изолейцина, фенилаланина, в 1,1- глутаминовой и аспарагиновой кислот, в 1,8 раза меньше серина, в 1,4 - аргинина, в 1,3 - лизина и метионина.

На данных гидролизатах были изготовлены питательные среды.

При этом в МПКГ добавляли 2% пептона, 0,5% поваренной соли, 0,3 % двузамещенного фосфата натрия и водопроводную воду до получения требуемого уровня аминного азота, к ФБМ - 0,5 % сухого пептона, 0,5 % пептона Мартена и 0,5 % поваренной соли.

Реакцию питательных сред устанавливали на уровне 7,6-7,8, содержание аминного азота-в пределах 160-180мг%.

Проведённые опыты показали, что питательные среды, изготовленные на основе ОПХ и МПКГ, в достаточной мере обеспечивают рост и размножение не только тест - культур, но и производственных штаммов И . песгорЬогат. Накопление некробактерий в единице объёма культуральной жидкости было выше на средах, изготовленных на основе ОПХ и МПКГ, чем на ФБМ. Морфология микробных клеток в окрашенных мазках была типичной в виде длинных нитей для сред с основами из ОПХ и МПКГ и очень коротких палочек - на средах с ФБМ.

Для более глубокого изучения метаболизма некрокультур и выявления их ростовых потребностей нами было определено качественное и количественное содержание аминокислот не только в питательной среде, но и пробах культуральных жидкостей, полученных в процессе выращивания трёх производственных штаммов некробактерий.

Данные, характеризующие количественное содержание аминокислот в среде до посева; условно принимали за 100 % и по отношению к ним вычисляли убыль (в %) отдельных аминокислот после роста бактерий.

При этом установлено наибольшее потребление всеми штаммами следующих аминокислот: гистидина на 90-100%; лизина на 90-97 %; треонина на 80-90%; серина на 86-98%. По 2-м штаммам (8929 и НКЛ) количество аспарагиновой и глутаминовой кислот уменьшилось на 88-98 %, пролина и метионина на 35-40 %, остальных аминокислот - на 10-20% от исходного уровня.

Изучение фракционного состава полипептидов, содержащихся в среде и культуральной жидкости в процессе роста некробактерий, показало постепенное нарастание количества высокомолекулярной фракции пептидов (М. м. 1000-1500) к 36 часам роста до 32,0 %.

Среднемолекулярная фракция (М. м. 500-1000) снижалась на 17%. По-видимому, это происходило с одной стороны за счёт использования данной фракции пептидов растущей культурой, а с другой - за счёт расщепления до низкомолекулярной фракции (М. м. 0-500), количество которой к концу роста увеличилось до 25%.

Высокий расход при изготовлении питательных сред таких дефицитных и дорогостоящих продуктов, как мясо, печень и казеин настоятельно требовал решения вопроса дальнейшего удешевления сред за счёт использования белоксодержащих субстратов непищевого назначения. С этой целью нами было испытано несколько гидролизатов из отходов сывороточного производства - эритроцитарная масса, а также из растительного сырья - соевый шрот.

Условия изготовления эритроцитарных гидролизатов (ЭГ) отличались продолжительностью гидролиза (2-6 суток), температурой (4548 °С), соотношением фермента и субстрата (1:5до1: 15). Химический анализ показал, что полученные гидролизаты имеют степень расщепления 0,33-0,57 и отличаются друг от друга количеством аминного и общего азота, а также пептонов.

Изучение ростобеспечивающих свойств на средах, изготовленных только из этих гидролизатов, показало низкое накопление на них биомассы микробных клеток, наиболее высокое на средах с продолжительностью гидролиза 4 суток. Для повышения этого важного показателя нами была приготовлена и успешно испытана питательная среда из смеси казеинового и эритроцитарного гидролизатов (КЭГ).

В качестве источника белков растительного происхождения (для замены дорогостоящего казеина) мы использовали 6-72 часовые гидролизаты соевого шрота с добавлением эритроцитарного гидролизата, пептона Мартена, хлорида натрия, фосфата натрия, сернокислого магния и глюкозы. В результате проведённых опытов было установлено, что наиболее приемлемой по накоплению микробных клеток оказалась среда с использованием в ней в качестве белковой основы 48-часового гидролизата соевого шрота с добавлением эритроцитарного гидролизата.

Обе среды (казеиново - эритроцитарная и соево -эритроцитарная), несмотря на некоторые различия в химическом составе, обеспечивали практически равное накопление биомассы некробактерий, близкое к средам, изготовленным на основе ОПХ и МПКГ (таблица 1).

Проведённые нами исследования на средах, включающих ОПХ,

МПКГ, ФБМ, КЭГ, СЭГ по показателям рН, азотистого, пептидного, аминокислотного состава и накоплению биомассы при выращивании некробактерий позволили предложить для

промышленного изготовления вакцины несколько вариантов питательных сред. Наиболее пригодной оказалась соево -эритроцитарная среда, как по экономическим показателям, так и по накоплению микробной массы и клеточного бактериального белка.

Замена соево-эритроцитарным гидролизатом основного перевара Хоттингера и мясо-печёночно-казеинового гидролизата позволяет экономить до 150 млн. руб. на каждую тысячу изготовленных литров вакцины против некробактериоза животных (в ценах января - июня 1996г.).

3.4. Подготовка и получение бактериальной массы.

Согласно технологии НИИСХ Крайнего Севера биомассу, после отделения культуральной жидкости, необходимо трижды в течение суток обработать ацетоном, отделяя его после каждой экспозиции центрифугированием. Такая обработка промышленных объёмов биомассы микроорганизмов оказалась неприемлемой из-за высокой трудоёмкости, ухудшений условий труда и техники безопасности на производстве.

Для выяснения возможности исключения из технологического цикла изготовления вакцины обработки биомассы ацетоном и последующего диализа полученных антигенов против водной среды, нами было изготовлено и испытано на северных оленях шесть лабораторных партий вакцины, изготовленных на основе комплексных водорастворимых антигенов, извлекаемых как из нативной биомассы, так и из бакмассы, предварительно обработанной ацетоном.

Было установлено, что все вакцины оказались безвредными для кроликов и вызывали у них при введении образование антител в титрах от 1:800- 1:1600 и выше.

Испытания на оленях показали, что "ацетоновые" вакцины по профилактической эффективности практически не отличаются от вакцин, получаемых при разрушении нативной биомассы, что позволило нам в дальнейшем полностью отказаться от применения ацетона.

3.5. Извлечение соматических антигенов некробактерий.

При изготовлении лабораторных и первых опытно- промышленных партий вакцины биомассу некробактерий разрушали механическим путём в гомогенизаторах, на лабораторной мельнице "Циклон", шаровой мельнице и с помощью ультразвука. Как показали проведённые исследования, используемые способы извлечения соматических антигенов оказались неприемлемыми для промышленной технологии либо из-за чрезвычайно малой производительности и большой трудоёмкости, либо из-за низкого выхода микробного белка, несмотря на то, что вакцины, полученные с их помощью, обладали достаточной профилактической эффективностью.

Химические и биологические показатели питательных сред и К/К в процессе роста некробактерий (п= 12, Р<0,05, XI+8X1)

Среды изготовленные на основе рн аминный азот мг, % пептон, % белок, % Накопление в ед.оптической плотности Морфология клеток

До засева 24 час кж 36 час кж До засева 24 час кж 36 час кж До засева 24 час кж 36 час кж До засева 24 час кж 36 час кж 24 чао кж 36 час кж кж 24 36

опх 7,8 + 0,05 6,4 + 0,03 5,8 ± 0,06 180 + 0,14 196 + 0,13 150 + 0,08 0,74 + 0,02 0,96 ± 0,03 0,7 ± 0,02 3.3 ± 0,04 3,05 + 0,02 2,9 + 0,04 1,9 ± 0,06 2,78 ± 0,12 Типичная

мпкг 7,75 + 0,03 6,35 + 0,04 5,7 + 0,04 175 + 0,12 188 + 0,12 159 + 0,11 0,64 + 0,01 1,1 + 0,04 0,98 + 0,02 3,6 ± 0,03 3,24 + 0,01 3,16 + 0,09 2,02 + 0,09 2,85 + 0,14 Типичная

ФБМ 7,8 + 0,04 6,6 + 0,03 6,05 ± 0,05 179 + 0,08 174 + 0,11 162 + 0,10 0,70 ± 0,03 0,78 + 0,03 0,68 ± 0,03 2,15 + 0,04 1,79 + 0,08 1,67 ± 0,03 1,13 + 0,04 1,14 + 0,05 Короткие палочки, коккооб-разной формы

КЭГ 7,8 + 0,06 6,7 + 0,04 5,2 + 0,04 202 + 0,14 244 + 0,13 219 + 0,15 0,485 + 0,07 0,34 + 0,05 0,312 ±0,06 3,05 + 0,04 2,83 ± 0,03 2,55 + 0,03 2,3 + 0,04 2,6 ± 0,05 Типичная

сэг 7,85 + 0,05 6,3 + 0,03 5,3 + 0,04 204 + 0,12 231 + 0,14 210 + 0,13 0,62 + 0,08 0,59 + 0,09 0,54 + 0,04 3,12 + 0,02 1,96 + 0,01 1,82 + 0,03 2,17 + 0,03 2,74 + 0,05 Типичная

В связи с этим нами была изучена возможность извлечения соматических антигенов с помощью ферментов животного и растительного происхождения. Гидролиз клеточной оболочки микроорганизмов вели при оптимальной для каждого фермента рН и температуре, при контакте фермента с клеточным субстратом в пределах от 30 минут до 3,5 часов. Анализ полученных материалов позволил сделать вывод, что наиболее активно разрушают оболочку клеток некробактерий панкреатин и ферменты растительного

происхождения.

С целью проверки эффективности "ферментных" и "механических" антигенов было изготовлено семь лабораторных партий вакцин на основе антигенов, полученных при воздействии на микробную клетку: панкреатина, протомезентерина, протосубтилина и с помощью обработки биомассы микроорганизмов на коллоидной мельнице. Содержание белка во всех вакцинах было одинаковым. Вакцину вводили кроликам внутрибрюшинно в дозе 3,0см3 и через 14-21 денье момента вакцинации проводили исследование сывороток их крови в РА.

Данные опыта показали, что все серии вакцины, независимо от способа дезинтеграции микробной клетки, обладают практически одинаковой специфической активностью при оценке их по высоте тигра антител в РА.

Первоначально, в соответствии с инструкцией НИИСХ Крайнего Севера, соматический антиген сорбировали латексом, затем объединяли с масляно - ланолиновым или полиэтиленгликолем - 400 и другими адъювантами.

Нами была проведена проверка адсорбционных свойств этих препаратов, а также адъювантов ВГНКИ и ВНИИЯИ, взятых в отдельности и с латексом. Полнота сорбции определялась в реакции диффузной преципитации в агаровом геле и при определении количества несорбированного микробного белка в смесях адсорбент-антиген.

Результаты исследований показали, что ни один из препаратов, используемых в качестве адсорбента, не обеспечивал полной сорбции соматических антигенов, все они, в той или иной степени, вступали в реакцию преципитации с сывороткой и только латекс в комбинации с масляно - ланолиновым адъювантом достаточно полно сорбировали микробный белок.

Однако такая двухэтапная сорбция антигена в промышленных условиях является малоприемлемой. Поэтому встал вопрос о подборе другого сорбента, в качестве которого нами был взят 3% гель гидрата окиси алюминия.

Известно, что полнота сорбции антигена тем или иным

адсорбентом зависит от концентрации антигена, количества добавленного сорбента, реакции среды, температуры и времени сорбции. Определению оптимальных значений этих параметров и были посвящены наши дальнейшие исследования.

Концентрация антигена во всех случаях была взята одинаковой, сорбцию вели при значениях рН 5,3; 6,0 и 7,0 в течение 4 дней при комнатной температуре.

Как показали результаты опытов, адсорбция прошла полнее при добавлении 30 % ГОА к объёму материала, чем с тем же сорбентом взятым в объёмах 25% и 15% и полнее при рН = 5,3, чем при рН = 6,0 и 7,0. Это подтвердилось данными по определению количества несорбированного гелем гидрата окиси алюминия микробного белка (таблица 2).

С целью сравнения иммуногенной активности препаратов, полученных с использованием гидроокиси алюминия и эмульгаторов, нами было приготовлено четыре лабораторных партии вакцины. Опыты на кроликах показали, что вакцины не-существенно отличались друг от друга по антигенной активности. Гидроокисьалюминиевая вакцина была несколько более иммуногенной при внутрибрюшинном введении, а эмульгированная - при подкожном.

Таблица 2

Зависимость полноты сорбции некробактериального соматического антигена от концентрации ГОА, рИ и времени адсорбции

Кол-во 3% ГОА, в %% к объему материала Время сорбции, (сутки) Количество несорбированного белка при сорбции с рН

5,3 6,0 7,0

мг/мл %% мг/мл %% мг/мл %%

1 0,95 15,8 1,19 19,8 1,34 22,3

15,0 2 0,90 15,0 1,12 18,7 1,20 20,0

3 0,83 13,8 1,06 17,7 1,12 18,7

4 0,82 13,7 1,06 17,7 1,12 18,7

1 0,54 9,0 0,62 10,3 1,07 17,8

25,0 2 0,50 8,3 0,60 10,0 1,00 16,7

3 0,46 7,7 0,53 8,8 0,90 15,0

4 0,46 7,7 0,53 8,8 0,91 15,2

1 0,42 7,0 0,52 8,7 0,80 13,3

30,0 2 0,40 6,7 0,50 8,3 0,67 11,2

3 0,39 6,5 0,48 8,0 0,65 10,8

4 0,39 6,5 0,48 8,0 0,64 10,7

15

Таким образом, в результате проведенных экспериментов была впервые установлена возможность использования метода ферментативного гидролиза оболочек клеток некробактерий для получения бактериального белка в промышленных объёмах. В сочетании с новым набором питательных сред, используемых для культивирования производственных штаммов некробактерий, исключением из процесса изготовления вакцины таких этапов, как обработка культуры ацетоном, диализ полученных антигенов и двухэтапной сорбции, была создана новая промышленная технология, что позволило Краснодарской биофабрике, начиная с 1993 года, приступить к широкомасштабному выпуску вакцины против

некробактериоза животных.

3.6. Производственные испытания.

Прежде чем приступить к производственным испытаниям была установлена иммунизирующая доза вакцины для крупного рогатого скота. С этой целью вакцинировали 3 группы волов (по 6 голов в группе). Животным первой группы ввели 3,0 см3, второй - 5,0 см3, третьей-8,0 см3 вакцины, содержащей одинаковое количество микробного белка в 1 мл. В свою очередь, в каждой группе половина животных вакцинировалось однократно, другая половина - двукратно, с интервалом в 28 дней. Кровь для исследования бралась перед иммунизацией, через 28 дней после первого и второго введения вакцины и затем через 6 месяцев. Сыворотка крови исследовалась на наличие антител в реакции агглютинации (таблица 3).

При этом было установлено, что доза вакцины в 3,0 см3 по интенсивности антителообразования уступала дозе, равной 5,0 см3. Увеличение прививочной дозы до 8,0 см3 не вызывало адекватного повышения титра антител. Исходя из этого, за иммунизирующую дозу взяли объём вакцины, равный 5 - 6,0 см3.

В апреле 1992 года были подготовлены и утверждены ГУБ Минсельхозпрода РФ Технические условия на опытно-промышленную партию вакцины и Наставление по её применению. Своим распоряжением от 22.04.92 г. Главное управление ветеринарии России разрешило использование опытно-промышленной партии вакцины на ограниченном поголовье крупного рогатого скота в хозяйствах Краснодарского края.

Приказом от 6 мая 1992 года отдел ветеринарии Краснодарского края создал комиссию по производственной проверке эффективности вакцины, в состав которой вошли представители ветслужбы края, НИИСХ Крайнего Севера, ВГНКИ ветпрепаратов и Краснодарской биофабрики.

Динамика антителообразования при разных дозах и кратности введения вакцины крупному рогатому скоту

Доза вакцины Кратность введения Номер животных Титры антител (РА)

До иммунизации Через 14 дней Через 28 дней Через 56 дней Через 6 мес.

1 2 -> 4 5 6 7 8

1 1:80 1:1280 1:2560 1:1280 1:640

I 2 1:80 1:1280 1:1280 1:1280 1:640

3 мл 3 1:80 1:1280 1:1280 1:640 1:320

4 1:160 1:1280 1:2560 1:1280 1:640

П 5 1:80 1:1280 1:2560 1:2560 1:1280

6 1:40 1:640 1:1280 1:2560 1:1280

7 1:320 1:5120 1:5120 1:2560 1:1280

I 8 1:40 1:2560 1:1280 1:1280 1:640

5 мл 9 1:160 1:1280 1:2560 1:1280 1:1280

10 1:160 1:2560 1:2560 1:5120 1:2560

П 11 1:40 1:1280 1:2560 1:2560 1:1280

12 1:320 1:2560 1:5120 1:10240 1:5120

13 1:160 1:2560 1:2560 1:5120 1:2560

I 14 1:160 1:2560 1:5120 1:2560 1:1280

8 мл 15 1:80 1:1280 1:2560 1:2560 1:1280

16 1:320 1:5120 1:5120 1:10240 1:5120

п 17 1:180 1:1280 1:2560 1:5120 1:1280

18 1:160 1:2560 1:2560 1:2560 1:1280

Для производственных испытаний изготовили вакцины из биомассы, разрушенной механическим и ферментативным способами.

В шести хозяйствах Краснодарского края и республики Адыгея было привито около 15 тыс. голов крупного рогатого скота разного возраста. Вакцина вводилась подкожно в дозе 6,0 см3. Поствакцинальных осложнений как общего, так и местного характера при этом не было отмечено.

Все хозяйства в течение ряда лет были неблагополучны по некробактериозу. Ежегодно заболевало от 20 до 30 и более процентов поголовья.

Проверка иммунизирующих свойств препарата показала, что все серии вакцины обладали высокой профилактической эффективностью практически в равной степени, снижая заболеваемость животных в хозяйствах в 17-50 раз, либо предохраняя от заражения некробактериозом 100% привитых животных (таблица 4).

Эффективность иммунизации крупного рогатого скота в хозяйствах Краснодарского края

заболеваемость вакцинировано ГОЛОВ заболело

Хозяйства Краснодарского края

ДО в сериях при кратности обработки

иммунизации "механическая" "ферментная" "механическая" "ферментная"

в% I П

АО "Нива", Динской район 20-30 - 810 0 10 0 10

"Хакуратге", Адыгея 25-30 - 800 0 0 0 0

Колхоз "Русь" Приморско-Ах-тарского района более 30 1414 960 0 0 0 0

АО "Дружба" Приморско-Ах-тарского района более 30 5310 1690 357 0 357 0

АО "Черноерков-ский" 20 - 1723 0 0 0 0

АО "Нива" Усть- Лабинского района Итого Всего, % 30 498 7222 620 6603 0 357 7 17 0 357 4,9 7 17 0,25

Среди животных, привитых двукратно с интервалом в 24-28 дней, заболело 0,25 %, при однократной вакцинации - 4,9 % животных. В числе вакцинированных было более 125 животных с клиникой некробактериоза. Следует отметить, что 104 из них после иммунизации выздоровели даже без медикаментозного лечения.

По данным многих главврачей хозяйств особо большая поражаемость невакцинированных коров отмечалась сразу после отела (около 50%). Применение вакцины позволило предотвратить или свести до минимума заболеваемость некробактериозом среди отелившихся коров.

В декабре 1994 года результаты производственных испытаний вакцины были доложены и одобрены Государственной

межведомственной комиссией по испытанию ветеринарных биологических препаратов, что послужило основанием для последующего утверждения Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ постоянно действующих технических условий (ТУ 9384-055004944185-95) и Наставления по применению инактивированной ГОА формолвакцины против некробактериоза животных.

К этому времени Краснодарская биофабрика приступила к серийному производству вакцины, и за период с 1993 по 1996 г. г. включительно было изготовлено около 3,2 млн. доз препарата при отсутствии рекламаций на качество вакцины с мест её применения.

Анализ результатов широкого применения вакцины против некробактериоза животных подтверждает высокую профилактическую эффективность препарата. Положительные отзывы получены из хозяйств Краснодарского края, Оренбургской и Иркутской областей, где иммунизация крупного рогатого скота позволила снизить в целом заболеваемость животных некробактериозом с 15-70% до 0,3-1,2 %.

Большой объём внедрения вакцины выполнен в Башкортостане. С 1993 по 1995 г. там вакцинировано 161657 голов крупного рогатого скота. Если на момент начала применения вакцины заболеваемость составляла 25 - 30 и более процентов , то после двукратной иммунизации она в среднем составила 2 %. Во многих хозяйствах, где одновременно с вакцинацией проводили общий комплекс оздоровительных мероприятий, заболеваемость животных практически полностью прекратилась.

Объём производства вакцины на Краснодарской биофабрике растёт в соответствии с коммерческим спросом на препарат. Неуклонно растёт и число регионов, где её применяют. Так, если в 1992 году вакцину использовали преимущественно в хозяйствах Краснодарского края, то в 1993 году её применяли уже в 14 регионах Российской Федерации, в 1994 году - в 28, а в настоящее время - в 36 областях, краях и республиках Российской Федерации.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана промышленная технология изготовления гидроокисьалюминиевой формолвакцины против некробактериоза животных на основе соматических антигенов, извлекаемых с помощью ферментативного гидролиза клеточной оболочки некробактерий.

2. Предложенный ферментативный способ дезинтеграции клеток некробактерий позволил существенно сократить время на приготовление

соматических антигенов и значительно повысить технологичность производства вакцины без снижения её профилактической эффективности.

3. Питательные среды, разработанные для промышленного культивирования производственных штаммов Б. песгорЬогит, изготовленные на основе ферментативных гидролизатов соевого шрота и эритроцитарной массы с добавлением факторов роста и солей (глюкозы, пептона Мартена, хлорида и фосфата натрия, сернокислого магния) в достаточной мере обеспечивают ростовые потребности возбудителя некробактериоза, " урожайность" культур и полноценность антигенного состава. Использование их в значительной степени снижает себестоимость изготовления вакцины.

4. Подтверждено, что замена двухэтапной обработки соматических антигенов (сорбция латексом с последующим эмульгированием в водно - масляной среде) сорбцией на геле гидроокиси алюминия не ведет к снижению иммуногенности вакцины и повышению её реактогенности, несмотря на некоторое повышение содержания несорбированного белка в препарате.

5. Установлено, что исключение из технологического цикла изготовления вакцины против некробактериоза животных таких этапов, как многократная обработка бакмассы ацетоном, диализ полученного антигена против водопроводной воды, предусмотренных лабораторным регламентом изготовления препарата, практически не приводит к снижению профилактической эффективности вакцины.

6. Производственные испытания вакцины, изготовленной по разработанной технологии показали, что в хозяйствах, неблагополучных по некробактериозу крупного рогатого скота, свиней и северных оленей, она обладает высокой профилактической эффективностью, предохраняя от заболевания 95-100 % вакцинированных животных.

7. Вакцину против некробактериоза животных вводят подкожно, крупному рогатому скоту и свиньям двукратно с интервалом 2528 дней, - северным оленям однократно перед ожидаемой вспышкой заболевания.

8. По итогам выполненных исследований и комиссионных производственных испытаний разработаны и утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России технические условия (9384-055-04941-85-95 от 01.05.95 г.), Наставление по применению вакцины (№ 13-4-2-233 от 17.01.95г.) и Инструкция по её изготовлению.

Практические предложения

Разработаны и внедрены в биофабричное и сельскохозяйственное производство:

1. Новые питательные среды для промышленного культивирования производственных штаммов Б. песгорЬогиш, обеспечивающие ростовые потребности некробактерий, высокую "урожайность" культур и получение полноценных антигенов.

2. Технология промышленного изготовления гидроокисьалюми-ниевой формолвакцины против некробактериоза животных, обладающей высокой профилактической эффективностью и защищенной патентом Российской Федерации.

3. Технические условия ТУ 938-055-004941-85-95, согласованные с Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России и утверждённые директором ВГНКИ ветпрепаратов 01.05.95 года.

4. Инструкция по изготовлению вакцины против некробактериоза животных, утверждённая директором Краснодарской биофабрики 17.01.95 года.

5. Наставление по применению вакцины против некробактериоза животных № 13-4-2-233, утверждённое Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 17.01.95 года.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Патент № 1828593 "Способ получения вакцины против некробактериоза сельскохозяйственных животных". Зарегистрирован в

государственном Реестре Российской Федерации.

2. Питательные среды для промышленного культивирования Р. песгорЬогиш. Журнал "Ветеринария" №3, 1997 г.

3. Профилактика некробактериоза животных. Журнал "Ветеринария" № 5, 1997 г.