Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка новых методов генодиагностики болезни Марека и определение их роли в системе противоэпизоотических мероприятий

На правах рукописи

□03452439

ГОРОДОВ ВЛАДИМИР СЕРГЕЕВИЧ

Разработка новых методов генодиагностики Болезни Марека и определение их роли в системе противоэпизоотических мероприятий

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2008

003452439

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии.

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Юшков Юрий Георгиевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Масычева Валентина Ивановна

доктор ветеринарных наук Кушнир Анатолий Тимофеевич

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-

исследовательский ветеринарный институт птицеводства

Защита состоится и^/^сЛ 2008 г. в « /5~» часов на заседании диссертационного совета/Д.006.045.01 при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии по адресу: 630500, Новосибирская обл., Новосибирский р-н, пос. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 34844-62.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО Россельхозакадемии.

э

Автореферат разослан «хУ» ¿сг^^^Л*/ 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Г.М. Стеблева

1.0БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Болезнь Марека (БМ) - инфекционное, высоко кон-тагиозное, хроническое заболевание кур, широко распространенное во всем мире, характеризующееся развитием массовых лимфоидных новообразований, снижением иммунитета и гибелью птицы (Ш.К. Куляшбекова и соавт., 2001).

Возбудитель относиться к семейству Herpesviridae, роду Mardi-virus. Пато-генным для кур является вирус первого серотипа. Вирусы второго и третьего серотипов для кур не патогенны и используются для изготовления вакцин.

Диагностика болезни основана на оценке патологоанатомиче-ских призна-ков, подтвержденных гистологическими методами, хран Окончательный диагноз ус-танавливается лабораторными методами, согласно ГОСТ 25586-83, предусматривающему, в частности, обнаружение антигенов вируса в РДП, выделение ви-руса и идентификацию в чувствительных биологических системах (куриные эмбрионы и культуры клеток).

В связи с тем, что стандартные методы диагностики трудоемки, продолжи-тельны по времени и требуют значительных экономических затрат, большое распространение получает диагностика на основе полимеразной цепной реак-ции (ПЦР), как более чувствительная и оперативная. Однако, существующие методики постановки ПЦР не позволяют проводить дифференциацию различ-ных серотипов вируса в одной реакции (R.F. Silva, 1992; Y. Becker et all, 1993), либо требуют проведения реакции в режиме «nested»-IIIJ,P (C.B. По-лехин, 2002), что связанно с необходимостью использования дополнительных пар праймеров.

Учитывая нестабильность ДНК вируса в пробах биоматериала, большое значение имеет соблюдение жестких условий их отбора, транспортировки и хранения при пониженных температурах.

Поскольку различные серотипы ВБМ имеют сходные антигенные детер-минанты, затрудняющие серотипирование, возникает необходимость разработ-ки методов, позволяющих оперативно определять серотип циркулирующего вируса.

Основной причиной возникновения вспышек БМ считают низкую эффек-тивность проведенной вакцинации, обусловленную нарушением условий транспортировки и хранения вакцинного препарата, процессов оттаивания и разведения, временных интервалов между разведением и введением вакцины птице (Р.Н. Коровин и со-

авт., 2001). Также эффективность вакцинации против БМ, в той или иной степени зависит от наличия и циркуляции других инфекционных агентов (вирусы инфекционной анемии птиц, инфекционной бурсальной болезни и др.).

Используемые в настоящее время методы контроля качества проведенной вакцинации требуют наличия определенных реагентов (антигенов вируса, мо-но-клональных антивидовых антител), недоступных большинству диагностиче-ских лабораторий (Е.И. Ярыгина, 2005).

Таким образом, в настоящее время возникает потребность в методах, по-зволяющих не только оперативно осуществлять диагностику болезни, но и оп-ределять генотип соответствующего сероти-па вируса, а также проводить оцен-ку качества проведенной иммунизации на конкретной популяции птицы и изучать.

Цель исследований. Разработать различные варианты ПЦР для выявления и идентификации вируса болезни Марека (ВБМ), позволяющий осуществлять контроль эффективности специфической профилактики болезни Марека.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

Разработать метод отбора и хранения материала, обеспечивающие его пригодность для генодиагностических исследований, в условиях птицефабрики.

Провести подбор праймеров и оптимальных параметров проведения диагностической ПЦР, определить ее чувствительность и специфичность, типировать соответствующие серотипы вируса при помощи ПЦР-ПДРФ анализа, а также оценить возможность ее использования при контроле качества вакцинации птицы.

Разработать количественную ПЦР в режиме «реального времени» и определить возможность ее использования для предварительной оценки качества вакцинных препаратов.

Изучить пригодность методов генодиагностики для оценки эффективности специфической профилактики БМ в эпизоотических очагах, с ассоциированным течением инфекций, вызванных адено- и герпесвирусами птиц.

Научная новизна. Разработан метод отбора и хранения материала для генодиагностических исследований, адаптированный к полевым условиям.

Разработана диагностическая ПЦР, где в качестве мишени использована последовательность гена дрС ВБМ, позволяющая опре-

делить серотип вируса при помощи ПЦР-ПДРФ анализа; показана возможность ее использования при контроле качества вакцинации птицы.

Разработана количественная ПЦР в режиме «реального времени» и определена возможность ее использования для предварительной оценки качества вакцинных препаратов.

В производственных условиях установлено влияние сочетанно-го течения адено- и герпесвирусных инфекций птиц на интенсивность проявления БМ.

Научная новизна подтверждена патентом Российской Федерации.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований создают перспективы использования ПЦР не только в диагностике БМ, но и в системе мер противоэпизоотиче-ских мероприятий при данной болезни. Полученные данные расширяют современные представления о факторах, спо-собствующих снижению уровня эффективности вакцинации птиц против БМ.

Материалы диссертации использованы при составлении методических рекомендаций «Оценка эффективности качества вакцинации против болезни Марека с использованием методов генодиагностики», утвержденных ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО Рос-сельхозакадемии, подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока», отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (прот. №1 от 12.03.2007).

Разработанная система отбора биоматериала для ПЦР исследований может найти широкое применение в практической деятельности.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на: Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» (Владимир, 2004); VI Сибирской ветеринарной конференции «Актуальные проблемы вете-ринарной медицины» (Новосибирск, 2006); III Российской конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006);

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 8 научных статей, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования РФ («Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 105 стр. и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полеченных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, приложений. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 10 таблицами, список литературы включает 227 источников.

Внедрение результатов исследований. Материалы диссертации использованы при составлении методических рекомендаций: «Оценка эффективности вакцинации кур против болезни Марека с использованием методов генодиагностики», утвержденных Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии и подсекцией «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №1 от 12.03.2007г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

Разработка и оценка возможностей использования методов генодиагностики при контроле эффективности специфической профилактики болезни Марека.

Результаты изучения влияния аденовирусного гепатита и инфекционного ларинготрахеита на проявление болезни Марека у птиц, вакцинированной против БМ, в эпизоотических очагах, в том числе при ассоциированном течении болезней.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в лаборатории болезней птиц ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии. Специфичность разработанных ПЦР определялась путем реакции с ДНК выделенной из следующих биологических препаратов: «ВНИИЗЖ» (SB-1, 3004), Авивак («Авивак Марек 1», «Авивак Марек 2», «Авивак Марек 3», In-tervet (CVI-988, FC-126), вируса инфекционного ларинготрахеита (штамм «О»; штамм «НТ»), аденовирусов (штамм EDS-76), различных бактерий.

Для постановки ПЦР использовали готовые смеси производства «Интерлабсервис», Taq-ДНК полимеразу («НИИБХ»), ферменты рестрикции («Сибэнзим»), В работе использованы разработанные авторами праймеры: для индикации генома ВБМ всех трех сероти-

пов; для индикации ВБМ первого серотипа; для индикации аденовирусов кур.

Качественные ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик». Количественные реал-тайм ПЦР с красителем SYBR Green проводили на реалтайм амплификаторе «Minioptikon» фирмы «Biorad».

Выделение суммарной ДНК из различных материалов проводили с использованием наборов «ДНК-сорб-Б» («Интерлабсервис»), матриц IsoCode Stix («Schleicher & Schuell, Inc»), а также по оригинальной методике (см. соответствующий раздел диссертации).

Электрофорез ПЦР продуктов проводили в 1.8% геле агарозы. Гели окрашивали бромистым этидием. Для более точного определения размеров молекул ДНК и анализа продуктов рестрикции проводили вертикальный электрофорез в 6% полиакриламидном геле, с последующей окраской бромистым этидием. Визуализацию гелей осуществляли в ультрафиолетовых лучах с использованием трансиллюминатора и видеосистемы «Vitran-foto».

Для разработки праймеров, компьютерного моделирования реакций, анализа полученных данных были использованы следующие программные пакеты: Vector NTI 10.0, DNAstar, GelAnaliser, Prime Premier 5.0.

Эксперименты по моделированию некачественной вакцинации осуществляли путем вакцинации 50 голов цыплят вакциной «Rismavak» (штамм ВБМ-1 CVI-988) производства «Интервет».

Патогистологические исследования биоматериала на БМ и инк-люзионный гепатит проводили с использованием традиционных методов.

Определение уровня антител к вирусу ИЛТ в сыворотке крови цыплят проводили с использованием наборов «ILT Elisa» (BioChek).

Оценку эффективности специфической профилактики БМ с помощью разработанных методов оценивали в условиях птицефабрик Сибирского региона (общим поголовьем более 300000 голов птиц яичных и бройлерных кроссов), в эпизоотических очагах, в т.ч. с ассоциированном течении БМ с инфекционным ларинготрахеитом и аденовирусным гепатитом.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Методы отбора, хранения патологического материала и выделения из него ДНК для генодиагностики

Целью настоящего раздела была разработка методики отбора проб биоматериала, содержащего вирус, непосредственно на птицефабрике, обеспечивающего сохранность ДНК вируса при длительном хранении при комнатной температуре.

В разработанном нами методе патологический материал сорбировался на бумажный носитель (в процессе его прикладывания к поверхности разреза органа). После чего носитель помещали в герметичную пробирку. Консервация материала обеспечивалась добавлением смеси органических спиртов, позволяла хранить материал при комнатной температуре, без немедленного высушивания носителя. После доставки в лабораторию носитель дважды промывался солевым раствором и высушивался при температуре 60°С. Элюцгао ДНК в раствор проводили в термостате при температуре 60°С.

В комиссионном опыте изучили эффективность выделения ДНК разработанным нами методом в сравнении с набором «ДНК-сорб-Б» (производства «Интерлабсервис»). Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о полном совпадении результатов ПЦР с ДНК, выделенной на наборах «ДНК-сорб-Б», с результатами ПЦР с ДНК, выделенной по разработанной нами методике. Кроме того, была подтверждена возможность хранения материала, сорбированного на бумажный носитель, в течении 3-х недель при комнатной температуре. Такой возможности нет при использовании наборов «ДНК-сорб-Б», так как в наставлении по их использованию жестко регламентировано хранение патоло-гического материала при температуре ниже 0°С.

Таким образом, разработанный нами метод позволяет осуществлять отбор материала в условиях птицефабрики и обеспечивает возможность хранения биоматериала, для последующего выделения ДНК, при комнатной температуре, в течение трех недель, что позволяет осуществлять доставку на длительные расстояния.

Таблица 1 - Результаты исследования проб биоматериала на наличие геномной ДНК ВБМ, подготовленных двумя разными методами

№п/п

Наименование материала

Результаты ПЦР с ДНК, выделенной согласно наставлению по применению наборов «ДНКсорб Б»

Результаты ПЦР с ДНК, выделенной с использованием сорбции на бумажный носитель

Проба печени индейки (№1)

2 Проба печени индейки (№2)

3 Проба печени индейки (№3)

4 Проба печени цыпленка (№4)

5 Проба печени цыпленка (№5)

6 Проба печени цыпленка (№6)

7 Проба печени цыпленка (№7) Положительный контроль

_Отрицательный контроль

2.2.2 Методы индикации ВБМ методом ПЦР

2.2.2.1 Методы индикации ВБМ методом ПЦР, с возможностью последующего определения генотипа, специфичного для различных серотипов вируса, методом ПДРФ

Для создания ПЦР, позволяющей выявлять ВБМ всех серотипов в одной реакции, использовали ген гликопротеида С (gC), как один из наиболее консервативных между различными штаммами одного серотипа вируса (С.Е. Shamblin et all, 2003).

С целью определения консервативных участков ДНК провели выравнивание нуклеотидных последовательностей гена gC, принадлежащих к различным серотипам вируса: GA, Md-5, ВС-1, CVI988 (относящиеся к 1-му серотипу ВБМ); HPRS-24, SB-1 (относящиеся ко 2-му серотипу); FC-126 (относящийся к 3-му серотипу), взятых из базы данных нуклеотидных последовательностей На-ционального центра биотехнологической информации (NCBI), США.

Результат выравнивания нуклеотидных последовательностей показал, что между штаммами, принадлежащими к различным серотипам вируса имеются как консервативные, так и вариабельные участки, открывающие возможности для дальнейшего генотипирования соответствующего серотипа вируса.

В процессе построения моделей ПЦР с использованием программы Primer Premier 5.0 была отобрана одна пара праймеров,

имеющая высокую расчетную температуру и специфичность отжига:

5 '-ATCGCGATGGAAGTTTTGGTG-3'

5'-ATGCGGCTGAGGAGATTTC -У

Для повышения специфичности и чувствительности реакции был оптимизирован ряд параметров: реакционная смесь содержала ПЦР буфер lx, MgCb 2,5мМ, dNTP's 0,2мМ, Taq ДНК-полимеразу до концентрации 0,05и/мкл, воду до 15 мкл, 10 мкл пробы ДНК. Темпе-ратурно-временной режим реакции был следующим: 95° - пауза; сорок циклов по: 95o-1 мин; 63o-1 мин; 12°-1 мин; один цикл 12°- 5 мин.

Для определения чувствительности ПЦР в лабораторных условиях использовали вакцинный штамм ВБМ «CVI-988», с инфекционным титром ЮбФОЕ/мл, который подвергли титрованию путем десятикратных разведений, до конечного разведения 10"3 , а затем амплифицировали в ПЦР. Чувствительность разработанной нами реакции составила 10 ФОЕ/мл.

Специфичность реакции определяли постановкой ПЦР с ДНК выделен-ной из биологических препаратов, описанных в п. 2.1. При постановке реакции с ДНК, выделенной из различных штаммов всех трех серотипов вируса, получали ампликон размером 358 пн, что соответствовало проведенным расчетам.

Полученные результаты подтвердили высокую специфичность и чувствительность разработанного метода.

Согласно проведенным расчетам, амшшконы, специфичные для ВБМ первого серотипа, подвергаются гидролизу рестриктазой Alul, с образованием 3-х фрагментов длинной 43, 114 и 201 пн. Амплико-ны, специфичные для ВБМ третьего серотипа, подвергаются гидролизу рестриктазой Alul с образованием 2-х фрагментов размером 157 и 201 пн. Ампликоны, специфичные для ВБМ второго серотипа, не подвергаются гидролизу. Специфичность реакции была проверена на ДНК, выделенной из вакцинных препаратов, и на ДНК, выделенной из органов цыплят, иммунизированных различными вакцинными штаммами ВБМ.

Таким образом, подобранные праймеры на нуклеотидную последовательность gpC ВБМ и отработанные параметры постановки ПЦР позволяют эффективно выявлять ДНК вируса БМ, а также определять серотип вируса в соответствии с его генотипом методом ПДРФ.

Для изучения чувствительности ПЦР in vivo был проведен опыт на цыплятах, получивших различные дозы вакцины. Для этого цып-

лята суточного возраста были разделены на 3 группы, по 10 голов каждая, и иммунизированы против БМ 0,01; 0,001 дозой вакцины соответственно. Цыплята третьей группы остались невакцинирован-ными. По истечении 10 дней, у цыплят был отобран материал (пробы печени), и исследован методом ПЦР на наличие геномной ДНК ВБМ.

Согласно данным, приведенным в таблице 2, разработанная ПЦР выявля-ла наличие генома вируса спустя 10 суток после иммунизации в пробах биома-териала от цыплят, получивших 0,01 дозы вакцины (10 ФОБ), и в 40% случаев - в биоматериале от цыплят, получивших 0,001 дозы вакцины (1 ФОЕ).

Таблица 2 - Результаты исследования проб биоматериала в ПЦР от цыплят, привитых различными дозами вакцины против болезни Марека

№ птицы Группа 2 Группа 3 Группа 4

0,01 дозы 0,001 дозы Контроль

1 + -

2 + -

3 + + -

4 + - -

5 + + -

6 + -

7 8 + + + -

9 + + -

10 + - -

Чувствительность 100% 40% 0%

2.2.2.2 Количественная ПЦР в реальном времени, с красителем

SYBR Green

Принципиальной качественной характеристикой живой вакцины является инфекционная активность. Официально она определяется методом титрования в культуре клеток фибробластов СПФ эмбрионов кур. Метод требует наличия подготовленных помещений, специального оборудования, квалифицированного персонала, значительного времени исследования. В этой связи возникает потребность в быстром, доступном методе оценки инфекционной активности препарата.

За основу при разработке такого метода нами была выбрана ПЦР «в реальном времени», на основе красителя SYBR Green, позволяющая дать количественную характеристику ДНК матрицы в исследуемом материале.

Для реакции рассчитаны праймеры, специфичные к ДНК ВБМ, первого серотипа, имеющие высокую температуру отжига: 5' TTGATAGTACTCAAAACTCCTGACGSA 5' CGCTATCATAAGTATCACGATTCATSA При постановке реакции с целью повышения ее специфичности и чувствительности был оптимизирован ее состав: 50мМ Tris, pH 8,5, ЗмМ MgC12, 500мкг/мл БСА, 0,2мМ каждого динуклеозид три-фосфата, 0,1мМ праймеров и 0,05и/мкл Taq полимеразы. SYBR Green I использовали в разведении 1:20000. Объем ПЦР смеси составлял 25мкл, объем матрицы составлял Юмкл. Для реак-ции был подобран следующий температурный режим: 96°С - 3 мин; 38 циклов по 96°С - 10 сек, 6ГС-10 сек, 72°С-10сек, 84°С-5сек (детекция флуоресценции на канале FAM).

После проведения реакции с образцами ДНК, выделенной из вакцины «Rismavac» (штамм «CVI-988»), кривая плавления ампли-кона характеризовалась наличием однородных, воспроизводимых пиков, с экстремумом 86,0±0,3°С (рис.1). Размер полученного в ходе реакции ампликона составил 130 пн, что соответствует проведенным расчетам. Специфичность реакции определяли постановкой ПЦР с ДНК выделенной из биологических препаратов, описанных в п. 2.1. Чувствительность реакции составила 10 ФОЕ/мл.

в 5 "70 75__80 8 5

[Tnmpnrnrtiirr:|

Рисунок 1 - Кривые плавления специфических ПЦР продуктов, в 3-х реакциях. Ось у -уровень флуоресценции; ось х - температура. При температуре 86,0оС наблюдаются однородные пики увеличения флуоресценции. Три графика соответствуют трем разведениям вакцинного препарата.

Количественный учет реакции проводили по пороговому циклу. При постановке реакции с ДНК, выделенной из вакцины с известным количеством ФОБ и трех 10-ти кратных разведений вакцинного препарата, наблюдалась линейная зависимость порогового цикла от уровня флуоресценции (рис.2), которую использовали при построении калибровочной кривой. При этом г = 0.996; уравнение наклона кривой: у = - 3,151 х + 28,17.

Выявленная линейная зависимость значения порогового цикла от уровня разведения вакцинного препарата позволяет определять количественные характеристики инфекционной активности вакцинного препарата в пределах, соответствующих четырем десятичным логарифмам ФОЕ.

Рисунок 2 - Калибровочная кривая количественной ПЦР на ВБМ 1-го серотипа. Ось х - количество % ФОЕ, соответствующее разведению препарата. Ось у - измеренный пороговый цикл

2.2.3 Использование методов генодиагностики для контроля эффективности специфической профилактики БМ

2.2.3.1 Использование количественной ПЦР, на основе красителя SYBR Green, для оценки качества вакцинных препаратов

против БМ

В данном разделе приведены результаты изучения возможности использования разработанного нами метода для определения биологической активности вакцины против БМ, хранившейся в условиях, не соответствующих наставлению.

Из ампулы вакцины, хранящейся при комнатной температуре, отбирали материал для выделения ДНК и производили подсчет количества клеток фибробластов эмбрионов кур в единице объема (табл.3).

Таблица 3 - Зависимость количества клеток эмбрионов фибробластов кур в вакцинном препарате и его инфекционной активности, определенной методом количественной ПЦР, от хранения препарата при комнатной температуре.

Время хранения (часов) Количество клеток ФЭК (млн/мл) Процент мертвых клеток ФЭК (млн/ мл) ДОС)Е50/мл

0 18,0 4% 6,0

0,5 17,5 32% 6,0

1 15,3 57% 5,9

3 14,2 91% 5,5

7 12,1 100% 5,2

12 7,4 100% 5,1

24 2,3 100% 4,5

Из таблицы видно, что измеренная нами инфекционная активность снижается до показателя менее 6,0 1яООЕ (количество, соответствующее критерию пригодности вакцины к применению) уже спустя 1 час после несоблюдения условий хранения. При этом общее количество клеток в вакцинном препарате соответствует заявленному производителем количеству, однако значительно -превышено количество мертвых клеток.

Таким образом, разработанная нами методика оценки инфекционной активности вакцинного препарата дополняет существующие методы и позволяет значительно быстрее получить предварительную информацию о качестве используемой вакцины.

2.2.3.2 Оценка качества вакцинации птиц против БМ в ПЦР

Основной причиной вспышек БМ на птицефабриках является некачественно проведенная вакцинация птиц. В ней, наряду с условиями хранения и транспортировки вакцины, очевидна роль человеческого фактора в процессе введения вакцинного препарата. При методически правильном введении качественной вакцины цыплятам в возрасте одни сутки максимальная концентрация вакцинного вируса выявляется на 10-е сутки в печени и лимфоидных органах у 100% иммунизированной птицы (Gimeno et all, 2004). Учитывая недоступность методов определения инфекционной активности вакцинного вируса, провели опыт по изучению пригодности метода ПЦР для выявления вируса в печени иммунизированных цыплят на 10 день после вакцинации.

Для оценки эффективности разработанной ПЦР в контроле качества проводимой вакцинации птиц против БМ нами был проведен комиссионный опыт. Детекцию генома ВБМ осуществляли в биоматериале от птицы, вакцинированной и невакцинированной против БМ. В опыте использовали 20 суточных цыплят, из которых сформировали 2 группы по 10 гол. Птиц первой группы иммунизировали против БМ вакциной в полной дозе, цыплята второй группы остались невакцинированными. По истечении 10 суток у цыплят разработанным нами методом был отобран биоматериал, который исследовали в ПЦР на наличие геномной ДНК ВБМ (табл. 4).

Таблица 4 - Определение ДНК ВБМ в биоматериале от птиц, вакцинированных и не-вакцинированных против БМ

№ Группа 1 Группа 2

п/л 1 доза Контроль

1 ПОЛОЖИТЕЛЬНО ОТРИЦАТЕЛЬНО

2 ПОЛОЖИТЕЛЬНО ОТРИЦАТЕЛЬНО

3 ПОЛОЖИТЕЛЬНО ОТРИЦАТЕЛЬНО

4 ПОЛОЖИТЕЛЬНО ОТРИЦАТЕЛЬНО

5 ПОЛОЖИТЕЛЬНО ОТРИЦАТЕЛЬНО

6 ПОЛОЖИТЕЛЬНО ОТРИЦАТЕЛЬНО

7 ПОЛОЖИТЕЛЬНО ОТРИЦАТЕЛЬНО

8 ПОЛОЖИТЕЛЬНО ОТРИЦАТЕЛЬНО

9 ПОЛОЖИТЕЛЬНО ОТРИЦАТЕЛЬНО

10 ПОЛОЖИТЕЛЬНО ОТРИЦАТЕЛЬНО

% пол. Реакций 100% 0%

Результаты исследований показали, что при методически правильном введении вакцины суточным цыплятам геном вируса БМ в печени выявляли у 100% иммунизированных цыплят через 10 дней после иммунизации. Результаты исследований проб печени птиц контрольной группы были отрицательными.

Таким образом, отсутствие генома вакцинного вируса БМ в печени иммунизированных цыплят на 10 день после введения вакцины, позволяет предположить неэффективность проведенной вакцинации.

2.2.4 Использование ПЦР для оценки эффективности специфической профилактики БМ в эпизоотических очагах, в том числе с ассоциированным течением инфекций

2.2.4.1 Эффективность специфической профилактики БМ в эпизоотических очагах при ассоциированном проявлении БМ и аденовирусного гепатита

При проведении исследований, направленных на оценку эффективности проведенной вакцинации птиц против БМ, на одной из птицефабрик сибирского региона наблюдалось отсутствие ДНК ВБМ в ПЦР у цыплят в возрасте 25-50 суток. При этом вся птица была иммунизирована вакциной на основе второго и третьего серо-типов ВБМ. Количество отрицательных проб составляло до 40% выборки.

В ряде корпусов на фоне отрицательных результатов ПЦР у вакциниро-ванной против БМ птицы наблюдали эпизоотические вспышки аденовирусного гепатита-гидроперикардита и 70-100% наличие ДНК аденовирусов птиц в мате-риале этих же выборок (таб.5).

Аналогичную ситуацию наблюдали на других фабриках региона. При проведении гистологических исследований патологического материала от птиц корпусов с ассоциированным течением БМ и аденовирусного гепатита, нами не было обнаружено ни одного гис-топрепарата, где можно было одновременно наблюдать характерные для обоих заболеваний патологии. Однако, в препаратах, где были отмечены опухолевые изменения, характерные для БМ, нами отмечались склеротические и фиброзные изменения, свидетельствующие о перенесенных ранее альтеративных процессах. Более то-

го, образующиеся опухоли локализовались преимущественно в пораженных участках.

Таблица 5 - Уровень инфицированности вакцинным ВБМ, в зависимости от инфициро-ванности аденовирусами птиц

Группа Количество проб, от корпуса Процент инфицированности ВБМ Патогисто-логический диагноз Процент инфицированности аденовирусами птиц

1 10 100 -

2 10 100 -

3 10 100 -

4 10 60 ИГ-ГП 80

5 10 100 -

6 10 50 ИГ-ГП 100

7 10 70 ИГ-ГП 70

Полученная информация свидетельствует о том, что инфицирование птицы вирусом ИГ-ГП приводит к снижению вакцинного иммунитета против БМ. Отсутствие регистрации ДНК ВБМ методом ПЦР у такой птицы свидетельствует о вытеснении вакцинных штаммов вирусом аденовирусного гепатита кур.

2.2.4.2 Влияние инфекции вирусом инфекционного ларинготрахеита на проявление БМ

На одной из птицефабрик сибирского региона у птицы, иммунизированной вакцинами на основе второго и третьего серотипов ВБМ, в пяти корпусах нами было обнаружено наличие вируса, относящихся к первому серотипу. При этом, в единичных случаях наблюдали патологоанатомические признаки, характерные для БМ.

Одновременно с этим проводили серомониторинг уровней антител к инфекционному ларинготрахеиту в ИФА. У птиц из корпусов, где отсутствовали патологоанатомические признаки, характерные для БМ, выявляли в ИФА высокие уровни титров антител к вирусу инфекционного ларинготрахеита, подтверждающие их иммунизацию в возрасте 80 суток вакциной против ИЛТ. У птицы корпусов, среди которых наблюдали поражения, характерные для БМ, титры антител к вирусу инфекционного ларинготрахеита отсутствовали, поскольку иммунизация против ИЛТ не проводилась (табл.6).

Таблица 6 - Наличие тиров антител и процент падежа от болезни Марека, у птицы в возрасте 150 суток

Номер Средний титр антител к Процент падежа птицы от БМ к

группы вирусу ИЛТ 150 суткам

1 5778 cv(372%) 0,01

2 396 cv(62.4%) 0,055

3 4584 cv(41.5%) -

4 284 cv(73 3%) 0,06

5 4752 cv(39 7%) 0,02

Примечание: cv- коэффициент вариации.

Также в одном из птицехозяйств наблюдали вспышку БМ у птиц, вакцинированных вакцинами на основе второго и третьего серотипов вируса при отмене вакцинации против инфекционного ларинготрахеита.

В другом случае регистрировали клинические и патологоанато-мические признаки БМ, у птицы старше 100 дней, в течение нескольких месяцев. Характерные лимфоидные новообразования отмечали преимущественно в стенке же-лезистого желудка. Одновременно среди поголовья нескольких корпусов птиц отмечали признаки наличия ИЛТ, с последующим повышением титров антител в ИФА. При этом признаки БМ регистрировались исключительно среди поголовья, на котором не регистрировалось наличие ИЛТ и не наблюдалось положительных титров.

Таким образом, нами установлен факт пониженного проявления характерных для БМ патологоанатомических признаков на фоне инфицированности птиц вирусом инфекционного ларинготрахеита.

3. ВЫВОДЫ

1.Разработан метод отбора и хранения биоматериала, сорбированного на бумажном носителе, позволяющий осуществлять доставку проб на длительные расстояния без использования криоконсерва-ции, длительно хранить пробы (не менее трех недель) при комнатной температуре и обеспечивающий эффективное выделение ДНК, пригодной для исследования методами генодиагностики.

2.ПЦР с праймерами на участок гена гликопротеида С позволяет выявлять геном вируса болезни Марека, с последующим определением принадлежности ампликонов к различным серотипам вируса с помощью ПДРФ анализа. Чувствительность реакции составляет 10

ФОЕ/мл вируса. В результате амплификации образуется ампликон размером 358 пи. При гидролизе ампликона, специфичного для ВБМ первого серотипа, ферментом рестрикции Alul образуются три фрагмента длиной 43, 114 и 201 пн; для третьего серотипа - два фрагмента, размером 157 и 201 пн соответственно. Ампликон, полученный после взаимодействия с ДНК ВБМ второго серотипа, не гидролизуются ферментом рестрикции Alul.

3.Метод количественной ПЦР для выявления вируса болезни Марека первого серотипа в режиме реального времени, с красителем SYBR Green обладает линейностью, позволяющей оценивать количество геномэквивалентов ВБМ в концентрации, соответствующей 3,0-6,0 lg®OE.

4.Выявление генома вируса БМ в печени у 100% иммунизированных цыплят на 10 день после введения вакцины, свидетельствует о качественно проведенной иммунизации. Отсутствие генома вируса БМ в печени иммунизированных цыплят в эти сроки, свидетельствует о нарушениях наставления при хранении, либо при введении вакцинного препарата, и неэффективности про веденной вакцинации.

5.Разработанный метод количественной ПЦР в реальном времени выявляет зависимость между количеством геномных эквивалентов и условиями хранения вакцинного препарата, что позволяет быстро получить предварительную информацию о качестве вакцины против БМ.

6.При определении фрагмента гена гликопротеида С, генома ВБМ, методом ПЦР, в биоматериале от птицы пораженной аденовирусами 1 группы (возбудители ИГГП), число отрицательных результатов достигает 50% выборки, что может свидетельствовать о вытеснении вакцинных вирусов БМ, с последующим снижением вакцинного иммунитета.

7.Среди поголовья птиц, вакцинированных против БМ вакцинами на основе второго и третьего серотипов и инфицированных вирулентными изолятами первого серотипа и вирусами инфекционного ларинготрахеита число павших птиц, имеющих на вскрытии патиз-менения, характерные для болезни Марека сократилось с 0,06 до 0,01%, по сравнению с корпусами, где отсутствуют положительные уровни титров антител сыворотки крови к ИЛТ, что свидетельствует о повышении устойчивости птиц к ВБМ.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанный метод оценки эффективности вакцинации против болезни Марека методом ПЦР рекомендуется для практической лабораторной работы, при контроле эпизоотического благополучия птицефабрик. При получении отрицательных результатов в ПЦР проведенную вакцинацию следует считать не эффективной и проводить дополнительные мероприятия, направленные на повышение противоэпизоотического эффекта.

ПЦР-ПДРФ анализ рекомендуется для выявления носительст-ва вирулентных вирусов в стадах птиц при проведении дифференциальных исследований, а также при изучении молекулярной эпизоотологии.

Разработанный способ отбора проб и выделения ДНК рекомендуется использовать для практической лабораторной работы, с возможностью после-дующего исследования методами генодиагностики.

5. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Учет ПЦР-реакций и перспективы интеграции метода ПЦР в ветеринарную практику / Соавт.: Ю.Г. Юшков, В.Н. Афонюшкин // БИО.-2004.-№Ю.-С. 31-32.

2.Модификация методики ISOCODE с целью выделения больших объемов проб ДНК/ Соавт.: Ю.Г. Юшков, В.Н. Афонюшкин, C.B. Леонов // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: матер. Междунар. науч. конф. молодых ученых, 24-25 марта 2004 г. - Владимир, 2004 г. - С. 146 -149.

3.Результаты использования компьютерного моделирования с целью разработки ПЦР-системы оптимальной для скрининговых технологий контроля болезни Марека / Соавт.: Ю.Г. Юшков, В.Н. Афонюшкин // Сибирский вестник с.-х. науки. - 2005. - № 2. - С. 69-74.

4.Скрининговая оценка инфицированности поголовья птицы микроорганизмами рода Salmonella и вирусом болезни Марека с помощью мультиплексной ПЦР / Соавт.: Ю.Г. Юшков, В.Н. Афонюшкин // БИО. - 2005. - № 5. - С. 16-17.

5.Новые научные направления в изучении патологии сельскохозяйственной птицы / Соавт.: Ю.Г. Юшков, В.Н. Афонюшкин, C.B.

Леонов, В. А. Молчанов, Е.В. Дударева // БИО. - 2005. - № 9. - С. 2021.

б.Отработка системы изучения конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК с использованием ПЦР продукта ВБМ/ Вестник НГАУ. -2006. - № 3, приложение Матер. VI сибирской ветеринарной конф. «Актуальные проблемы Ветеринарной медицины». - С. 89.

7.Контроль болезни Марека на основе комплекса генодиагностики и традиционных методов исследования / Соавт.: Ю.Г. Юшков, В.Н. Афонюшкин // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: Матер. III Российской науч. конф. с международным участием (27-29 сентября 2006). - Новосибирск, - 2006. - С. 286.

8.Разработка модели системы ранней диагностики и прогнозирования эпизоотии болезни Марека на основе комплекса генодиагностики и традиционных методов исследований / Соавт.: Ю.Г. Юшков, В.Н. Афонюшкин // Вестник с.-х. науки Казахстана. - 2006. - № 6. - С. 44-46.

9.Патент 2332235 С2 Российская федерация, МПК А61К 39/255 (2006.01). Способ контроля качества вакцинации цыплят против болезни Марека / Соавт.: В.Н. Афонюшкин, Ю.Г. Юшков // заявитель и патентообладатель ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии. -№2006115401/13; заявл. 04.05.2006; опубл. 27.08.2008, Бюл. №24.

Подписано в печать 14 08.2008 г. Формат 60х84'/16 Объем 1 пл. Тираж 100экз Заказ№129

Отпечатано в ООО ИПФ «Агрос» 630501, Новосибирская обл., пос Краснообск

Актуальность темы. Болезнь Марека (БМ) - инфекционное, высоко контагиозное, хроническое заболевание кур, широко распространенное во всем мире, характеризующееся развитием массовых лимфоидных новообразований, снижением иммунитета и гибелью птицы (Ш.К. Куляшбекова и со-авт., 2001).

Возбудитель относиться к семейству Herpesviridae, роду Mardivirus. Патогенным для кур является вирус первого серотипа. Вирусы второго и третьего серотипов для кур не патогенны и используются для изготовления вакцин.

Диагностика болезни основана на оценке патологоанатомических признаков, подтвержденных гистологическими методами. Окончательный диагноз устанавливается лабораторными методами, согласно ГОСТ 25586-83, предусматривающему, в частности, обнаружение антигенов вируса в РДП, выделение вируса и идентификацию в чувствительных биологических системах (куриные эмбрионы и культуры клеток).

В связи с тем, что стандартные методы диагностики трудоемки, продолжительны по времени и требуют значительных экономических затрат, большое распространение получает диагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПНР), как более чувствительная и оперативная. Однако, существующие методики постановки ПЦР не позволяют проводить дифференциацию различных серотипов вируса в одной реакции (R.F. Silva, 1992; Y. Becker et all, 1993), либо требуют проведения реакции в режиме «nested»-ПЦР (С.В. Полехин, 2002), что связанно с необходимостью использования дополнительных пар праймеров.

Учитывая нестабильность ДНК вируса в пробах биоматериала, большое значение имеет соблюдение жестких условий их отбора, транспортировки и хранения при пониженных температурах.

Поскольку различные серотипы ВБМ имеют сходные антигенные детерминанты, затрудняющие серотипирование, возникает необходимость разработки методов, позволяющих оперативно определять серотип циркулирующего вируса.

Основной причиной возникновения вспышек БМ считают низкую эффективность проведенной вакцинации, обусловленную нарушением условий транспортировки и хранения вакцинного препарата, процессов оттаивания и разведения, временных интервалов между разведением и введением вакцины птице (Р.Н. Коровин и соавт., 2001). Также эффективность вакцинации против БМ, в той или иной степени зависит от наличия и циркуляции других инфекционных агентов (вирусы инфекционной анемии птиц, инфекционной бурсальной болезни и др.).

Используемые в настоящее время методы контроля качества проведенной вакцинации требуют наличия определенных реагентов (антигенов вируса, моноклональных антивидовых антител), недоступных большинству диагностических лабораторий (Е.И. Ярыгина, 2005).

Таким образом, в настоящее время возникает потребность в методах, позволяющих не только оперативно осуществлять диагностику болезни, но и определять генотип соответствующего серотипа вируса, а также проводить оценку качества проведенной иммунизации на конкретной популяции птицы и изучать влияние сочетанных инфекций на проявление БМ.

Цель исследований. Разработать различные варианты ПЦР для выявления и идентификации вируса болезни Марека (ВБМ), позволяющий осуществлять контроль эффективности специфической профилактики болезни Марека.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод отбора и хранения материала, обеспечивающие его пригодность для генодиагностических исследований, в условиях птицефабрики.

2. Провести подбор праймеров и оптимальных параметров проведения диагностической ПЦР, определить ее чувствительность и специфичность, типировать соответствующие серотипы вируса при помощи ПЦР-ПДРФ анализа, а также оценить возможность ее использования при контроле качества вакцинации птицы.

3. Разработать количественную ПЦР в режиме «реального времени» и определить возможность ее использования для предварительной оценки качества вакцинных препаратов.

4. Изучить пригодность методов генодиагностики для оценки эффективности специфической профилактики БМ в эпизоотических очагах, с ассоциированным течением инфекций, вызванных адено- и герпесвирусами птиц.

Научная новизна. Разработан метод отбора и хранения материала для генодиагностических исследований, адаптированный к полевым условиям.

Разработана диагностическая ПЦР, где в качестве мишени использована последовательность гена gpC ВБМ, позволяющая определить серотип вируса при помощи ПЦР-ПДРФ анализа; показана возможность ее использования при контроле качества вакцинации птицы.

Разработана количественная ПЦР в режиме «реального времени» и определена возможность ее использования для предварительной оценки качества вакцинных препаратов.

В производственных условиях установлено влияние сочетанного течения адено- и герпесвирусных инфекций птиц на интенсивность проявления БМ.

Научная новизна подтверждена патентом Российской Федерации.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований создают перспективы использования ПЦР не только в диагностике БМ, но и в системе мер противоэпизоотических мероприятий при данной болезни. Полученные данные расширяют современные представления о факторах, способствующих снижению уровня эффективности вакцинации птиц против БМ.

Материалы диссертации использованы при составлении методических рекомендаций «Оценка эффективности качества вакцинации против болезни Марека с использованием методов генодиагностики», утвержденных ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии, подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока», отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (прот. №1 от 12.03.2007).

Разработанная система отбора биоматериала для ПЦР исследований может найти широкое применение в практической деятельности.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на: Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» (Владимир, 2004); VI Сибирской ветеринарной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2006); III Российской конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006);

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 8 научных статей, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК Минобразования РФ («Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 105 стр. и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, приложений. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 10 таблицами, список литературы включает 227 источников.

4. Выводы

1. Разработан метод отбора и хранения биоматериала, сорбированного на бумажном носителе, позволяющий осуществлять доставку проб на длительные расстояния без использования криоконсервации, длительно хранить пробы (не менее трех недель) при комнатной температуре и обеспечивающий эффективное выделение ДНК, пригодной для исследования методами генодиагностики.

2. ПЦР с праймерами на участок гена гликопротеида С позволяет выявлять геном вируса болезни Марека, с последующим определением принадлежности ампликонов к различным серотипам вируса с помощью ПДРФ анализа. Чувствительность реакции составляет 10 ФОЕ/мл вируса. В результате амплификации образуется ампликон размером 358 пн. При гидролизе ампли-кона, специфичного для ВБМ первого серотипа, ферментом рестрикции Alul образуются три фрагмента длиной 43, 114 и 201 пн; для третьего серотипа — два фрагмента, размером 157 и 201 пн соответственно. Ампликон, полученный после взаимодействия с ДНК ВБМ второго серотипа, не гидролизуются ферментом рестрикции Alul.

3. Метод количественной ПЦР для выявления вируса болезни Марека первого серотипа в режиме реального времени, с красителем SYBR Green обладает линейностью, позволяющей оценивать количество геномэквивалентов ВБМ в концентрации, соответствующей 3,0-6,0 ^ФОЕ/мл.

4. Выявление генома вируса БМ в печени у 100% иммунизированных цыплят на 10 день после введения вакцины, свидетельствует о качественно проведенной иммунизации. Отсутствие генома вируса БМ в печени иммунизированных цыплят в эти сроки, свидетельствует о нарушениях наставления при хранении, либо при введении вакцинного препарата, и неэффективности проведенной вакцинации.

5. Разработанный метод количественной ПЦР в реальном времени выявляет зависимость между количеством геномных эквивалентов и условиями хранения вакцинного препарата, что позволяет быстро получить предварительную информацию о качестве вакцины против БМ.

6. При определении фрагмента гена гликопротеида С, генома ВБМ, методом ПЦР, в биоматериале от птицы пораженной аденовирусами 1 группы (возбудители ИГГП), число отрицательных результатов достигает 50% выборки, что может свидетельствовать о вытеснении вакцинных вирусов БМ, с последующим снижением вакцинного иммунитета.

7. Среди поголовья птиц, вакцинированных против БМ вакцинами на основе второго и третьего серотипов и инфицированных вирулентными изо-лятами первого серотипа и вирусами инфекционного ларинготрахеита число павших птиц, имеющих на вскрытии патизменения, характерные для болезни Марека сократилось с 0,06 до 0,01%, по сравнению с корпусами, где отсутствуют положительные уровни титров антител сыворотки крови к ИЛТ, что свидетельствует о повышении устойчивости птиц к ВБМ.

5. Практические предложения

Разработанный метод оценки эффективности вакцинации против болезни Марека методом ПЦР рекомендуется для практической лабораторной работы, при контроле эпизоотического благополучия птицефабрик. При получении отрицательных результатов в ПЦР проведенную вакцинацию следует считать не эффективной и проводить дополнительные мероприятия, направленные на повышение противоэпизоотического эффекта.

ПЦР-ПДРФ анализ рекомендуется для выявления носительства вирулентных вирусов БМ в стадах птиц при проведении дифференциальных исследований, а также при изучении молекулярной эпизоотологии.

Разработанный способ отбора проб и выделения ДНК рекомендуется использовать для практической лабораторной работы, с возможностью последующего исследования методами генодиагностики.