Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Разработка методов и тест-систем ускоренной индикации Yersinia Enterocolitica в кормах и мясных продуктах на основе ДНК-диагностики

На правах рукописи

СВЕТЛИЧКИН ОЛЕГ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ И ТЕСТ-СИСТЕМ УСКОРЕННОЙ ИНДИКАЦИИ YERSINIA ENTEROCOLITICA В КОРМАХ И МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ НА ОСНОВЕ ДНК-ДИАГНОСТИКИ

16.00.06 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте . ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВИИИ13СГЭ РАСХН)

Научный руководитель: -кандидат биологический наук

А.Б. Кононенко (ГНУ ВНИИВСГЭ)

Официальные оппоненты: -заслуженный деятель науки РФ доктор ветеринарных наук, профессор

-кандидат биологических наук

М.П. Бутко (ГНУ ВНИИВСГЭ) A.M. Лысенко (Институт микробиологии РАМ)

Ведущая организации: Московский государственный университет прикладной биотехнологии (МГУПБ)

Защита состоится «_»_2004 г. в «_» часов на

заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, г. Москва, Звенигородское ш., д.5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.С. Майстренко

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Обеспечение населения высококачественной и безопасной продукцией животноводства является актуальной задачей современности. Эта актуальность обусловлена возрастанием экологического неблагополучия под действием различных факторов, приводящих к контаминации производств и продукции опасными для здоровья человека и животных возбудителями заболеваний.

Получение высококачественной животноводческой продукции тесно связано с созданием эффективной системы ветеринарно-санитарпого контроля всей «пищевой цепи» - от кормов до готовой продукции.

Микробиологические критерии традиционно являются одним из • главных показателей безопасности животноводческой продукции.

В последнее время все более актуальной проблемой становится индикация возбудителей кишечного иерсиниоза. Это заболевание регистрируется по всей территории Российской Федерации и в других странах. По данным ряда исследователей, кишечный нерсиниш по значимости среди пищевых зоонозов занимает второе место после сальмопеллеза (Ющенко Г.В. и др., 1993; Кононенко А.Б. и др., 2003; Basselt M. L. et al., 1990). .

Возбудителем кишечного иерспниоза является Y. enterocolitica. Иерсинии выделяют от грызунов, свиней, коров, диких животных и птицы, значительно реже от рыб, моллюсков.

Бактерии Y. enterocolitica встречаются в овощах, корнеплодах, зеленых кормах, в молоке.

Мясо может быть контамннировано в процессе убоя и разделки животных-бактерионосителей. В последнее время серьезное значение в инфицировании иерсиниямп приобретает водный фактор. Y. enterocolitica часто выделяют из открытых и закрытых водоемов, подземных вод, колодцев, питьевой воды, сточных вод.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИСЛИОГЕКА

Прямым следствием распространения перспнии в животноводческих хозяйствах является обсеменениость продуктов животноводства: молока (1,06,0%), мяса (1,0-6,0%), тушек цыплят (2,0-12,0%), поверхности яиц (0,5-8,0%) (Ющенко Г. 13., Дунаев В. И., 1987).

Существующие методы классического бактериологического анализа предусматривают выделение чистых культур на селективных питательных средах, с последующей их видовой идентификацией, что делает эти анализы длительными и трудоемкими (Скурихип И.М., Тутельян 13Д 1981; Сеитханова Б.Т., 2000; Miller et. al., 1991).

Кроме того, влияние различных факторов может, приводить к L-• трансформации в популяции микроорганизмов и появлению L-форм, которые трудно быстро выявить с помощью классических бактериологических методов (Прозоровский С.В. и др. 1981; Павлова И.Б. 2001).

Наиболее перспективными- в плане чувствительности и специфичности индикации и идентификации микроорганизмов показали себя методы генной диагностики (ДНК-гибридизация, амплификация генов) (Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., 1976; Антонов А. С. и др., 1980; Дрыгин Ю.Ф. и др., 1992; Долгов В.А. и др., 1997; Панин А.Н. и др., 1997; Лысенко А.М.Суходолец В.В., 1999; Обухов И.Л., Яковенко М.В;, 2000; Шаров А.Н. и др., 2000; Смирнов A.M. и др., 2001; Palva A.A., 1983; Erlich H.A., 1989; Haschimolo J. et. al., 1995; Loprestia D. et. al., 1997). Они позволяют выявлять микроорганизмы в смешанных культурах, обнаруживать L-формы бактерий и дифференцировать патогенные культуры от непатогенных (Гинцбург А.А., 1998; Воробьев А.А. и др., 2000; Falkow S., Moseley S., 1982; Hill W., Modclen J., 1983; Moseleu S.A., Hyg J., 1989; Rifai S. et. al., 1989; Juk J.M. et. al;1993; Jouie M. et. al., 1994; Chen Shy et. al., 1998).

В настоящее время, несмотря на определенные достижения в этой области,, разработка методов и тест-систем ускоренной индикации Y. enterocolit^^ продуктах и кормах на основе ДНК-диагностики остается

одной из важных задач ветерннарно-саннтарного контроля. Актуальным является адаптация методов к конкретным объектам и дифференциация патогенных форм бактерий.

Цель и задачи исследование». Целью исследований являлась разработки методов и тест-систем ускоренной индикации У. еп1егосо1Шса в кормах и мясных продуктах на основе ДНК-диагностики. В задачи исследований входило:

- разработать тест-систему индикации У.еЛетосоШса на основе 11ЦР; разработать методы и тест-системы индикации У.еЛетосоННса с

использованием ДНК-зондов, меченных биотипом и тритием;

- разработать метод индикации патогенных штаммов У. еМегосоИйса с использованием плазмидной ДНК;

- провести оценку методов и тест-систем ДНК-диагностики для выявления У. еП:егосо1Шса при мониторинге кормов и мясных продуктов.

Научная новизна. Разработаны тест-системы, индикации У.еп1егосо1Шса в кормах и мясных продуктах: с использованием ДНК-зондов, меченных биотипом, и ПЦР; разработана методика индикации вирулентных штаммов У. еПетосоННса с использованием плазмидной ДНК; разработана методики индикации патогенных и непатогенных штаммов У. еп1егосо1Шса на основе амплификации и ДНК-гибридизации.

Практическая ценность. На основании результатов исследований разработаны:

- Методические указания по индикации У. еп!егосо1Шса методом полимеразной цепной реакции (утверждены-Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 14.09.2000 г. № 13-5-2/196).

- Методические рекомендации по индикации У. еп!егосо1Шса в продуктах и кормах на основе ДНК-диагностики (утверждены Отделением ветеринарной медицины РЛСХН 18. 03. 2004 г).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены

на:

- Всероссийской научно-производственной конференции «Разработка и освоение производства нового поколения лекарственных средств для животных и их применение в ветеринарии» (Ставрополь, 2000);

- Международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИИТиБП РЛСХН ( Щелково, 2000 г.);

- Международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов» ВНИИТиБП. РЛСХН ( Щелково, 2001 г.);

- Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже • двух тысячелетий» ( Саранск, 2001 г.);

- заседаниях Ученого совета ВНПНВСГЭ (2000-2004 г.);

- межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2004 г.).

Публикации. Результаты исследований отражены в 7 научных

статьях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, предложений для практики, списка использованной литературы и приложении.

Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит II таблиц и 7 рисунков. Список литературы включает 142 источников отечественных и зарубежных авторов.

2.СОБСТВЕННЫЕИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Материалы и методы исследований. Работа проводилась в период с 1999 по 2004 гг. на основании плана научно-исследовательских работ ВНИИВСГЭ и является частью разделов 05.02.12.1, 05.02.8.2, 05.02.8.12. Экспериментальная часть выполнена в лаборатории санитарной микробиологии и в отделе сертификации ВНИИВСГЭ.

Праймеры получали на базе Центра пренатологии, акушерства и гинекологии РАМН.

Объектами исследовании служили образцы кормов и мясной продукции, отобранные для мониторинговых и сертификационных испытаний, а также экспериментальные образцы, искусственно контаминированные микроорганизмами.

В работе использовались непатогенные и патогенные штаммы Yersinia enterocolitica, содержащие плазмиду вирулентности, а также культуры Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella dublin,Salmonella enteritidis.

Выделение и очистку ДНК, постановку реакции гибридизации проводили по Маниатису Т. (1984). Получение ДНК-зондов и их мечение биотипом или тритием осуществляли в полимеразной цепной реакции, а также в реакции ник-трансляции.

Радиоактивность фильтров с гибридными молекулами определяли в жидкостном сцинтнлляционном счетчике «LKB» (Швеция) в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

МГУ им. М.В. Ломоносова.

• Интенсивность окрашивания фильтров с гибридными молекулами определяли визуально.

Выделение иерсиний бактериологическим методом осуществляли согласно руководства «Лабораторная диагностика псевдотуберкулеза и иерсипиоза» (Ценева Г.П., 1997).

Экспериментальные данные подвергали статистической обработке по Стыоденту.

2.2 Результаты исследовании

2.2.1 Разработка тест-системы индикации Y. enterocolitica на основе

ПЦР

На первом этапе исследовании была разработана тест-система для индикации псрспннп в кормах и мясных продуктах, которая включает этапы элюнровапия и концентрирования бактерии с помощью дифференциального центрифугирования и этапы индикации на основе реакции амплификации с применением набора для выделения ДНК с лизпрующим реагентом -гуанндинтиоизоционатом и сорбентом NucleoS™, набора для постановки ПЦР и реагентов для детектирования амплифицированной ДНК с помощью • электрофореза в агарозном геле. Для индикации искомых микроорганизмов коитампнпрованные иерснниямп образцы кормов и мясопродуктов измельчали, гомогенизировали и бактерии элюировали физиологическим раствором. Очистку от клеточного дебрнса и концентрирование бактерий осуществляли дифференциальным центрифугированием.

Гуанидиптиоизоционат способствовал лизису клеток, солюбилизации клеточного дебриса, а также денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии гуанйдинтиоизоционата ДНК активно связывается с сорбентом NucleoS™, входящим в состав набора, затем легко отмывается от белков и солен спиртовым раствором. Элюированная из сорбента ЭкстраГеном™ ДНК в дальнейшем была использована памп в ПЦР.

При разработке тест-системы в качестве праимеров использовали нуклеотидные последовательности ДНК Y.enterocolitica: Kwaga 38 (5'-GAACTCGATGATAACTGGG-3') и Feng 19 (5'-GGAGTATTCATATGAAGCGTC-3%).

В результате исследований были отработаны параметры полимеразной цепной реакции с использованием данных праимеров. Оптимальные режимы проведения амплификации для соответствующих этапов были следующими:

1) денатурация - 950С; 2) отжиг - 55°С; 3) элонгация - 72°С. Время проведения каждого этапа равнялось 30 секундам. Число циклов -35.

После проведения ПЦР с выделенными матричными ДНК и указанными праймерами полоса амплифнката наблюдалась только в реакционной смеси, содержащей ДНК Y.enteгocolitica. В системах с ДНК других бактерий амплификация не проходила. Полученные данные свидетельствовали о специфичности выбранных праймеров для индикации Y.enteгocolitica.

Подобранные праймеры использовали для индикации Y.enteгocolitica в искусственно контамннировапных образцах кормов, мяса и мясных продуктов. Чувствительность индикации Y.enteгocolitica с помощью разработанной тест-системы составляла 10-100 клеток в пробе без предварительного обогащения (табл.1.)

Таблица 1

Чувствительность индикации Y.enteгocolitica методом ПЦР

Разведение культуры У.еп1егосо1Шса в физрастворе Концентрация У. егиегосоПиса КОЕ/мл Результаты ПЦР

Исходное 1,2x108 +

10"' 1,0x107

10"2 1,3x106 +

10 ~3 1;2х105 +

ю-4 1,1 х 104 +

ю-3 1,4x10' +

Ю"6 1,1x10* +

Ю-7 10 +

10"® - I

(+) - наличие полосы амплификации ( - ) - отсутствие полосы амплификации

2.2 2 Разработка методов и тест-систем индикации Y.enterocolitica с использованием генных зондов

При разработке методов и тест-систем индикации Y.enterocolitica генные зонды получали и метили тритием или биотипом в полимеразной цепной реакции с использованием выбранных праймеров и меченых дезоксипуклсозпдтрифосфатов.

В случае тритиевой метки из проб, искусственно контаминнрованных Y.enterocolitica, выделяли бактериальные, клетки, которые обрабатывали лизоцимом и протеииазой. Затем проводили термическую денатурацию ДНК и иммобилизовали на мембранные фильтры с диаметром пор 0,45мкм. После проведения гибридизации с И3 ДНК - зондом, фильтры отмывали от неспецифнческой сорбции стандартно-солевым раствором и

радиоактивность фильтров определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике. В качестве отрицательных контролен использовали аналогичные образцы продукции, коитаминированные близкородственными микроорганизмами, а также пустые фильтры.

При использовании ДНК-зондов, меченных биотипом, после лизиса клеток проводили депротеинизацию додецилсульфатом натрия и хлороформом. ДНК осаждали этанолом и денатурировали тепловой обработкой. Затем ДНК иммобилизовали в виде точек на мембранные фильтры, проводили гибридизацию и реакции с конъюгатом, субстратом и красителем. Результаты оценивали по интенсивности окрашивания точек с гибридными молекулами ДНК.

Как показали исследования, с помощью ДНК-зондов удается определять ^ enterocolitica в исследуемых образцах. При этом специфичность анализа позволяет проводить индикацию Y.enterocolitica в бактериальных смесях (табл. 2).

Таблица 2

Результаты определения специфичности индикации Y. enterocolitica методом гибридизации с ДНК-зондами, меченными тритием и биотипом

Бактерия — контаминант Результаты гибридизации

С тритиевой меткой С биотшювой меткой

Имп/мпн -контроль сорбции Интенсивность окрашивания i

Y.enterocolitica 253+11 +++

Смесь Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis, S. enteritidis, E.coli, Proteus vulgaris (1:1:1:1:1) 262+14 +++

Смесь Y.pseudotuberculosis, S. enteritidis, E.coli, Proteus vulgaris (1:1:1:1) 0 i

S. enteritidis . 0 -

Proteus vulgaris 0 -

E.coli 0 -

Y.pseudotuberculosis 0 -

В таблице 3 представлены данные о чувствительности ДНК -гибридизации с использованием зондов, меченных биотипом и тритием.

Таблица 3

Результаты определения чувствительности индикации ^ enterocolitica методом ДНК - гибридизации

Разведение культуры У. егиегосоПиса в физрастворе Контаминация У. егиегосоПиса КОЕ/мл Результаты гибридизации

Зонд с тритиевой меткой Зонд с биотиновой меткой

Имп/мин - контроль сорбции Интенсивность окрашивания

Исходное 1,ЗхЮв 1572+43 1 1 1.1

ю-' 1,1х107 768+28 1 1 1 1

1<У2 . 1,2x106 354+11 +++

10° 1,3x103 193+7 ++

Ю-4 1,2х 104 67+3 +

Ю-5 1,1х103 62+4 -

ю-6 1,2х 102 64+2 -

Ю-7 10 58+4 -

Контроль* 55+3

Контроль - культура E.coli 10 КОЕ/мл

Чувствительность методики с трптиевыми ДНК-зондами составляла 105 клеток в пробе. Время анализа - 6-8 часов.

Чувствительность методики с биотинилированными ДНК-зондами равнялась 104 клеток в пробе. Время анализа - 8-12 часов.

Чувствительность индикации была на два - три порядка ниже, чем при использовании методики ПЦР.

Предварительное обогащение У. еМегосоШса при 4" С в течение 24 часов позволяло повысить чувствительность индикации ДНК- зондами до 10 - 100 клеток в пробе.

На следующем этапе была разработана тест-система индикации У. еп1егосо1Шса с использованием ДНК-зондов, меченных биотипом.

В комплект входят реагенты для выделения, денатурации и иммобилизации ДНК, постановки реакции гибридизации, отмывки от неспецифической сорбции, проведения реакций с конъюгатом, субстратом и красителем, а также положительный и отрицательный контроли, мембранные нитроцеллюлозные фильтры. Набор рассчитан на проведение 80 анализов и имеет срок хранения один год.

Для определения ДНК применяли слособ точечной гибридизации (дог-гибридизации) нуклеиновых кислот на твердой фазе с использованием ДНК-зонда, меченного биотипом.

Из исследуемых образцов выделяли суммарную ДНК. Суммарную ДНК, находящуюся в растворе, ДНК контрольного положительного и ДНК контрольного отрицательного образцов денатуририровали кипячением и фиксировали на нитроцеллюлозном фильтре. Иммобилизованные ДНК гибридизовали с предварительно денатурированными биотинилированными ДНК-зондами. Не связавшиеся зонды удаляли путем отмывок фильтра. На следующем этапе фильтр обрабатывали конъюгатом стрептавидин-фосфатазой. На заключительном этапе вносили растворы субстрата и красителя. Окрашивание соответствующих точек свидетельствовало о наличии искомой ДНК в исследуемом материале.

2.3.1. Разработка методик индикации патогенных штаммов Y.enterocolitica с использованием плазмидной ДНК Значительная биохимическая, антигенная и экологическая неоднородность этой группы микроорганизмов, их антигенные связи с другими энтеробактериямн и различия в патогенности существенно осложняют оценку этиологическою и эпидемиологического значения выделяемых штаммов иерсинии.

Известно, что патогенные свойства иерсинии частично контролируются генами плазмиды pY V (Grant Т. et al., 1998; Koomhof H.J., 1999).

У большинства патогенных штаммов содержится плазмида вирулентности pYV (ГШ). Создана отечественная коллекция ПВ+ и П13-• штаммов возбудителя, перспнноза основных сероваров (03,09 и др.). Разработан диагностический препарат-агглютинирующие, сыворотки СВИ для серологической идентификации патогенных иерсинии (Смирнов И.В., 1992).

При разработке метода дифференциации патогенных и непатогепных штаммов Y.enterocolitica плазмидную ДНК выделяли щелочным методом, после подращивания культуры. Плазмидную ДНК метили биотипом или тритием в реакции ник-трансляции.

При использовании тритиевой метки дифференциацию штаммов проводили па основе методики гибридизации колоний. Исследуемые пробы переносили на ннтроцеллюлозные фильтры, которые помещали на питательную среду и инкубировали до образования отдельных колоний, как предусмотрено методикой бактериологического анализа. Далее фильтры помещали на стопку фильтровальной бумаги, смоченной растворами для лизиса клеток, депротеиннзацни, щелочной денатурации и иммобилизации ДНК. Гибридизацию проводили с меченой плазмидной ДНК в присутствии декстрансульфата в течение 8-12 часов.

После гибридизации осуществляли отмывку от несиецифической сорбции. Радиоактивность гибридных молекул ДНК на фильтрах определяли в жидкостном сцинтилляционном счетчике.

Подращивание (на штатных средах)

Колонии на фильтрах

I

Обработка фильтров: Лизис клеток (лизоцим с сахарозой)

I

Депротеинизация (проназа) 1

Щелочная денатурация (NaOH) i

Нейтрализация (IM Трнс HCl) i

Иммобилизация (бхССР) . I

Гибридизация с ДНК-зондом, меченным тритием

Колонии на агаризованной среде

I

Сусиендирование колоний в лизирующем буфере (лизоцим с сахарозой)

I

I

Очистка Д11К в растворе (проназа)

I

Осаждение этанолом

I

Тепловая денатурация (100°С) 1

Точечная иммобилизация на фильтрах (ЮхССР)' I

Гибридизация с ДНК-зондом, меченным биотипом

Рис. 1 Схема индикации патогенных штаммов методом гибридизации с плазмидными ДНК- зондами

В случае использования биогиннлированых зондов колонии суспендировали в лизнрующем буфере, ДНК очищали с помощью пролазы, проводили тепловую денатурацию и иммобилизовали на мембранные нитроцеллюлозные фильтры в виде точек. Гибридизацию с биотинилировапным ДНК-зондом и регистрацию конечного результата проводили, как описано выше.

Результаты гибридизации показали возможность индикации патогенных штаммов У.еМегосоШса.

Методика индикации патогенных штаммов У.еМегосоШка с использованием в качестве зондов плазмидной ДНК обладает высокой . специфичностью и чувствительностью, не требует сложного оборудования, однако несколько длительна во времени. Эго связано с необходимостью подращивания культуры бактерий и увеличением времени гибридизации до 12 часов из-за малых концентраций плазмидной ДНК. В целях усовершенствования была разработана методика ускоренной дифференциации патогенных и непатогенных штаммов У.еп1егосо1Шса на основе амплификации и ДНК-гибридизации.

Бактерии элюировали из искусственно контаминированных образцов, концентрировали ' с помощью дифференциального центрифугирования, клетки лизнровалн и выделяли суммарную ДНК с помощью гуанидинизоционата. Далее проводили амплификацию ДНК методом рассеянной затравки в присутствии меченных тритием или биотипом дезокеппуклеозидтрнфосфатов. Меченную амплифицированную ДНК гибридизовали с предварительно иммобилизованными на фильтрах ДНК специфичных У.еп1егосо1Шса ампликонов или плазмидной ДНК У.еМегосоШюа, а также с хромосомными ДНК других бактерий. Гибридизация проходила только в гомологичных системах, содержащих аналогичные ДНК в исследуемых бактериях и иммобилизованные на фильтрах ДНК-зонды.

Таким образом, разработанная методика на основе амплификации методом рассеянной затравки с последующей гибридизацией со специфичными ДНК-зондами позволяет проводить индикацию Y.enterocolitica и дифференцировать патогенные и непатогенные штаммы. Чувствительность анализа детерминируется амплификацией и составляет 10100 клеток в пробе. Время анализа 8 часов.

2.3.3 Оценка методов и тест-систем ДНК-диагностики для выявления Y.enterocolitica при мониторинге кормив и мясной продукции

Как было отмечено, иерсинии относятся к'группе патогенных для человека и животных микроорганизмов, которые могут длительное время существовать и развиваться в окружающей среде: в воде, почве, растениях (Емельяненко Е.Н., 1997). Показано, что в ряде случаев термически необработанные зеленые овощи явились причиной вспышек заболеваний, вызываемых иерсиниями (Шубин Ф.Н., 1993).

Установлено, что иерсинии могут колонизироваться на растениях, прикрепляясь к ним или проникая внутрь (Венедиктов B.C., и др., 1989). Иерсинии не только сохраняются, но и успешно размножаются как на поверхности, так и внутри растений (Марков И.С., 1989). Бактериологический анализ суспендированных в физиологическом растворе мокрицы и пастушьей сумки позволил выделить культуры Y.enterocolitica в концентрации 1000 КОЕ/г зеленой массы, при отрицательных результатах посевов поверхностных смывов с растений.

Наличие психрофильных свойств позволяет иерсиниям накапливаться при хранении кормов при низких или постоянно меняющихся температурах и определяет возможность заражения через них животных и человека.

В качестве зеленых кормов мы использовали проращенную смесь семян травы, предназначенную для кошек и котят. Как следовало из

инструкции к корму, в емкость с семенами и субстратом для роста травы вносили дистиллированную воду до полного смачивания. Затем субстрат с семенами переносили в пластмассовые емкости. В одну из них вносили суспензию суточной культуры ^ enterocolitica в концентрации 106КОЕ/мл. Для контаминации использовали штамм ^ enterocolitica 09, содержащий специфическую плазмнду вирулентности. Проба без контаминантов служила контролем. После достижения величины травяного покрова 4-6 см корни и побеги отдельно гомогенизировали в ступках с буферным раствором и определяли наличие иереннин методами ДНК-диагностики и микробиологическим методом. Анализ контаминации частей растении проводили как непосредственно после взятия образца, так и после обогащения материала путем выдерживания суспензий отдельных частей растений в течение пяти дней при А 'С. В качестве методов ДНК-диагностики применяли полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и ДНК-гибридизацию.

Полоса амплификации и гибридные молекулы обнаруживались только в объектах, содержащих ДНК Y.enterocolitica, что указывает на специфичность выбранных праймеров и ДНК-зондов для индикации.

При этом ПЦР - анализ позволял выявлять искомую ДНК в нативном материале, а методы ДИК-гибридизации только после обогащения материала в течение 24 часов при 4°С.

Незначительные различия в результатах индикации Y.enterocolitica в корнях и побегах можно объяснить тем, что в корнях содержится суммарная фракция бактерий, включающая помимо эндогенных бактерий, экзогенную контаминацию за счет остатков среды для роста растений.

Результаты ДНК-диагностики коррелировали с данными микробилогического анализа.

Анализ результатов свидетельствовал о том, что трудность в обнаружении Y.enterocolitica в кормах может быть объяснена

незначительными концентрациями бактерий. Однако, при благоприятных условиях, например, при длительном хранении кормов при низких

температурах, происходит значительное накопление бактерий и вследствие этого можно проводить индикацию Y.enterocolitica методами ДНК-гибридизации.

Полученые нами данные свидетельствуют о корреляции результат» исследования при использовании тест-систем на основе ДНК-диагностики и микробиологического метода обнаружения ^ enterocolitica в кормах, мясе и мясных продуктах. При этом время индикации ^ enlerocolitica с использованием разработанных тест-систем составляло 6-12 часов, что на порядок меньше бактериологического метода индикации данных бактерий.

Таким образом, тест-системы на основе ДНК-диагностики позволяют проводить индикацию и идентификацию ^ enterocolitica с высокой чувствительностью и специфичностью и не требуют предварительного выделения чистых культур. При этом время исследования значительно сокращается по сравнению с существующим бактериологическим методом, что дает основание рекомендовать методы ДНК-диагностики для практического использования при ветерннарно-санитарной экспертизе и сертификационных испытаниях мяса, мясопродуктов и кормов.

ВЫВОДЫ

1. Разработаная тест-система индикации ^ enterocolitica в кормах и мясных продуктах, включающая набор для выделения Д1IK с лизирующим реагентом гуанидинтиоизоционатом и сорбентом NucleoS™, набор для постановки ПЦР и реагенты для детектирования амилифицированной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле, позволяют выявлять искомые бактерии в присутствии близкородственных видон бактерий с

чувствительностью 10-102 клеток в пробе в течение 6-8 часов бе) предварительного обогащения.

2. Разработанная методика индикации ^ enterocolilica в кормах и мясных Продуктах с использованием ДНК-зондов, меченных тритием, включающая этапы дифференциального центрифугирования для концентрирования бактерий, лизиса клеток с использованием лизоцима,

лепротспнмзацмп додсцилсульфатом натрия и протеиназой, гибридизации на фильтрах и детектирования гибридных молекул жидкостной сцинтилляцией, позволяет проводить индикацию 105 микробных клеток в пробе за 6-8 часов.

3.Разработанные методика и тест-система индикации ^ enterocolilica в кормах и мясных продуктах с использованием ДНК-зондов, меченных биотипом, включающая реагенты для лизиса клеток, депротеинизации ДНК додецилсульфатом натрия и хлороформом, постановки реакции точечной гибридизации, реакции с коньюгатом, субстратом и красителем на фильтрах и детектирования гибридных молекул по интенсивности окрашивания позволяет проводить индикацию с чувствительностью!О4 клеток в пробе за 8. 12 часов.

4. Предварительное обогащение культуры ^ enterocolitica при 4° С в течение 24 часов позволяет повысить чувствительность индикации ДНК-зомдами до 10 - 100 клеток в пробе.

5. Разработана методика на основе гибридизации колоний иерсиний с нлазмидой pYV, позволяющая выявлять патогенные штаммы ^ enterocolitica в течение 48 часов.

6. Разработана методика на основе ампплификации с помощью рассеянной затравки с мечеными дезоксннуклеозндтрифосфатами и последующей гибридизацией с иммобилизованными ДНК-зондами плазмидиых и хромосомных ДНК. Методика позволяет одновременно устанавливать наличие ^ enterocolitica и дифференцировать патогенные и непатогенпые штаммы в течение 8 часов без предварительного обогащения материала. Чувствительность анализа составляет 10-100 клеток в пробе.

"7. Высокая чувствительность и специфичность, корреляция с результатами бактериологического метода обнаружения иерсиний, значительное сокращение продолжительности анализа позволяют рекомендовать разработанные методы и тест-системы ДНК-диагностики для проведения мониторинговых исследований кормов и мясной продукции.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Для использования п научно-исследовательских учреждениях и диагностических ветеринарных лабораториях могут быть рекомендованы разработанные :

- Методические указания по индикации ^ cnleгocolilica методом иолнмеразной цепной реакций (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 14.09.2000 г., № 13-5-2/196);

- Методические рекомендации по индикации ^ enteгocolitica в продуктах и кормах на основе ДНК-диагностики (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 18.03.2004 г.). '

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Светличкин О.В. Разработка тест-систем обнаружения ^ enteгocolitica с использованием полимеразной цепной реакции и ДНК-зондов //Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, посвещенной 30-летию института «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2000, стр. 388.

2. Коионенко А.Б., Бритова СВ., Светличкин О.В., Белоусов А.В. Проблема иерсиниоза и пути совершенствования диагностики //Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, посвещенной 30-летию института «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2000, стр. 386-387.

3. Орлов А.В., Светлнчкин O.D., Макаров М.М., Белоусов В.И., Светличкин В.В. Методы генной диагностики при ветсанэкспертизе и сертификации продовольственного сырья и пищевых продуктов // Материалы Всероссийской научно-производственной конференции «Разработка и освоение производства нового поколения лекарственных

средств для животных н их применение в ветеринарии», Ставрополь, 2000, стр. 89.

4. Соетличюп! В.В., Кононенко А.Б., Доля Е.А., Мамаев М.А., Денисова ПА, Горяннова Г.М., Светличкнн О.В., Макаров М.М. Тест-системы и технические средства ДНК-дпагностикп объектов встсрииарпо-саннтариого и экологического контроля // Материалы Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий», Саранск, 2001, стр. 138-140.

5. Светличкип О.В., Кононенко А.Б., Светлнчкйн В.В., Белоусов В.И. Индикация и идентификация иерспний в объектах ветсринарпо-сапитарного контроля // Сборник докладов Международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2001, стр. 191-197.

6. Светлпчкин О.В. Индикация нерсинпй в зеленых кормах методами Д! 1К-дпагностики // Сборник трудов В1И111ВСГЭ "Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии", Москва, 2003,тД15,стр.184-188.

7. Кононенко А.Б., Бритова СВ., Бровкина А.Н., Светличкип О.В. Видовой состав микрофлоры кишечника птицы, персистенция иерсиний и степень распространения этих бактерий в птицеводческих хозяйствах // Сборник трудов ВМИИВСГЭ "Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии", Москва, 2003,т. 115,стр.93- 99.

ВИИИВСГЭ. г. Москва, Звенигородское шоссе, 5 Заказ 90/1 Тираж 80 экз.

Р1 05 84

Актуальность темы

Обеспечение населения высококачественной и безопасной продукцией является актуальной задачей современности. Эта актуальность обусловлена возрастанием экологического неблагополучия под действием различных факторов, приводящих к контаминации производств и продукции опасными для здоровья человека и животных возбудителями заболеваний.

Получение высококачественной животноводческой продукции тесно связано с созданием эффективной системы ветеринарно-санитарного контроля, всей «пищевой цепи» - от кормов до готовой продукции.

Микробиологические критерии традиционно являются одним из главных показателей безопасности животноводческой продукции.

В последнее время все более актуальной проблемой является индикация возбудителей кишечного иерсинеоза. Это заболевание регистрируется по всей территории РФ и в других странах. ( Ющук Н.Д. и др., 1987,2000; Ющенко Г.В., 2000; Кононенко А.Б. и др., 2000; Славчев Г., 1986,1989; Стефанов И., 1989). По данным ряда исследователей кишечный иерсиниоз по значимости среди пищевых зоонозов занимает вторе место после сальмонелеза.

Возбудителем кишечного иерсиниоза является Y. enterocolitica. Животные разных видов являются источниками возбудителя инфекции. Иерсинии выделены от грызунов, свиней, коров, диких животных и птицы (Кирьянов Е.А. и др., 1989; Каланадзе Е.П. и др., 1991).

Бактерии Y. enterocolitica встречаются в овощах, корнеплодах, зеленых кормах, в молоке ( Славчев Г., 1986,1989; Стефанов И., 1989 ).

Мясо может быть контаминировано в процессе убоя и разделки животных - бактерионосителях. В последнее время серьезное значение в инфицировании иерсиниями приобретает водный фактор. Y. enterocolitica часто выделяют из открытых и закрытых водоемов, подземных вод, колодцев, питьевой воды, сточных вод (Старыгина Г.А. и др., 1989).

Прямым следствием распространения иерсиний в животноводческих хозяйствах является обсемененность пищевых продуктов животноводства: молока (1,0-6,0%), мяса (1,0-6,0%), тушек цыплят (2,0-12,0%), поверхности яиц (0,5-8,0%) (Ющенко Г. В., Дунаев В. И., 1980).

Существующие методы классического бактериологического анализа, предусматривают выделение чистых культур на селективных питательных средах, что делает эти анализы длительными и трудоемкими.

Кроме того, влияние различных биотических и абиотических факторов может приводить к L-трансформации в популяции микроорганизмов и появлению L-форм, которые трудно быстро выявить с помощью классических бактериологических методов (Прозоровский С.В. и др., 1981; Павлова И.Б., 1999).

Наиболее перспективными в плане чувствительности и специфичности индикации и идентификации микроорганизмов показали себя методы генной диагностики (ДНК-гибридизация, амплификация генов) (Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., 1976; Антонов А. С. др., 1980; Панин А.Н. и др., 1997; Palva А.А., 1983; Hachimoto J. et al., 1995). Они позволяют выявлять микроорганизмы и вирусы в смешанных культурах, обнаруживать L-формы бактерий и дифференцировать патогенные культуры от непатогенных (Гинцбург А.А., 1998; Falkow S., Moseley S., 1982; Hill W., Modden J., 1983; Moseleu S.A., Hyg J., 1989; Rifai S. et. al., 1989).

Вследствие сказанного, разработка методов и тест-систем ускоренной индикации Y. enterocolitica в продуктах и кормах на основе ДНК-диагностики — одна из важных задач ветеринарно-санитарного контроля. Актуальным является адаптация методов к конкретным объектам и дифференциация патогенных форм бактерий.

Цель и задачи исследований Целью исследований являлась разработка методов и тест-систем ускоренной индикации Y. enterocolitica в кормах и мясных продуктах на основе ДНК-диагностики.

В задачи исследований входило: разработать тест-систему индикации Y.enterocolitica на основе ПЦР; разработать методы и тест-сиситемы индикации Y.enterocolitica с использованием ДНК-зондов, меченных биотином и тритием; разработать метод индикации патогенных штаммов Y. enterocolitica с использованием плазмидной ДНК; провести оценку методов и тест-систем ДНК-диагностики для выявления

Y. enterocolitica при мониторинге кормов и мясных продуктов. Научная новизна. Разработаны тест-сиситема индикации Y.enterocolitica в кормах и мясных продуктах с использованием ДНК-зондов, меченных биотином, и тест-сиситема на основе ПЦР; разработана методика индикации патогенных штаммов Y. enterocolitica с использованием плазмидной ДНК; разработана тест-сиситема индикации патогенных и непатогенных штаммов Y. enterocolitica на основе амплификации и ДНК-гибридизации. Практическая ценность. На основании результатов исследований разработаны:

- Методические указания по индикации Y. enterocolitica методом полимеразной цепной реакции (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 14.09.2000 г., № 13-5-2/196).

- Методические рекомендации по индикации Y. enterocolitica в продуктах и кормах на основе ДНК-диагностики (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 18. 03. 2004 г).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- Всероссийской научно-производственной конференции «Разработка и освоение производства нового поколения лекарственных средств для животных и их применение в ветеринарии» (г.Ставрополь, 2000);

- Международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (г. Щелково, 2000 г.);

- Международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов» ВНИТиБП РАСХН (г. Щелково, 2001 г.);

- Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г. Саранск, 2001 г.);

- заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2004 г.);

- межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2004 г.). Публикации. Результаты исследований отражены в 7 научных статьях.

выводы

1. Разработаная тест-система индикации Y. enterocolitica в кормах и мясных продуктах, включающая набор для выделения ДНК с лизирующим реагентом гуанидинтиоизоционатом и сорбентом NucleoS™, набор для постановки ПЦР и реагенты для детектирования амплифицированной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле, позволяют выявлять искомые бактерии в присутствии близкородственных видов бактерий с чувствительностью 10-10 клеток в пробе в течение 6-8 часов без предварительного обогащения.

2. Разработанная методика индикации Y. enterocolitica в кормах и мясных продуктах с использованием ДНК-зондов, меченных тритием, включающая этапы дифференциального центрифугирования для концентрирования бактерий, лизиса клеток с использованием лизоцима, депротеинизации додецилсульфатом натрия и протеиназой, гибридизации на фильтрах и детектирования гибридных молекул жидкостной сцинтилляцией, позволяет проводить индикацию 105 микробных клеток в пробе за 6-8 часов.

3. Разработанные методика и тест-система индикации Y. enterocolitica в кормах и мясных продуктах с использованием ДНК-зондов, меченных биотином, включающая реагенты для лизиса клеток, депротеинизации ДНК додецилсульфатом натрия и хлороформом, постановки реакции точечной гибридизации, реакции с коньюгатом, субстратом и красителем на фильтрах и детектирования гибридных молекул по интенсивности окрашивания позволяет проводить индикацию с чувствительностью!О4 клеток в пробе за 812 часов.

4. Предварительное обогащение культуры Y. enterocolitica при 4° С в течение 24 часов позволяет повысить чувствительность индикации ДНК-зондами до 10 - 100 клеток в пробе.

5.Разработана методика на основе гибридизации колоний иерсиний с плазмидой pYV, позволяющая выявлять патогенные штаммы Y. enterocolitica в течение 48 часов.

6. Разработана методика на основе ампплификации с помощью рассеянной затравки с мечеными дезоксинуклеозидтрифосфатами и последующей гибридизацией с иммобилизованными ДНК-зондами плазмидных и хромосомных ДНК. Методика позволяет одновременно устанавливать наличие Y. enterocolitica и дифференцировать патогенные и непатогенные штаммы в течение 8 часов без предварительного обогащения материала. Чувствительность анализа составляет 10-100 клеток в пробе.

7. Высокая чувствительность и специфичность, корреляция с результатами бактериологического метода обнаружения иерсиний, значительное сокращение продолжительности анализа позволяют рекомендовать разработанные методы и тест-системы ДНК-диагностики для проведения мониторинговых исследований кормов и мясной продукции.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании результатов исследований разработаны:

- Методические указания по индикации Y. enterocolitica методом полимеразной цепной реакции (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 14.09.2000 г. № 13-5-2/196).

- Методические рекомендации по индикации Y. enterocolitica в продуктах и кормах на основе ДНК-диагностики (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 18. 03. 2004 г).