Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Факторы, обеспечивающие жизнеспособность и сохранение потенциала вирулентности Yersinia enterocolitica при контаминации мясных продуктов и субстратов агрокомплекса

4848877

На правах рукописи

Дробящснко Мария Андреевна

Факторы, обеспечивающие жизнеспособность и сохранение потенциала вирулентности Yersinia enterocolitica при контаминации мясных продуктов и субстратов агрокомплекса

14.02.02. - Эпидемиология;

06.02.02 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 КЮН 2011

Москва-2011.

4848877

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России)

Научные руководители:

Доктор биологических наук Пушкарева Валентина Ивановна Кандидат биологических наук Логинов Игорь Андреевич

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Ющенко Галина Васильевна

Доктор ветеринарных наук, профессор Скляров Олег Дмитриевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российская медицинская академия последипломного образования (РМАПО) Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «10» июня 2011 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.130.02 в ФГБУ(«НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан liJUf' апреля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Русакова Е.В.

Актуальность проблемы.

Иерсиниоз - острая кишечная инфекция (с частыми внекишечными осложнениями) из класса сапронозов, с алиментарным путем заражения, возбудитель которой - Yersinia enterocolitica сероваров 03; 05; 09. Иерсинии убиквитарно распространены во внешней среде, отличаясь полигостальностыо, т.е. чрезвычайно широким кругом хозяев в почвенных, водных и наземных экосистемах (от простейших, гидробионтов, грызунов до приматов и человека) (Литвин В.Ю. и др., 1998, 2010; Сомов Г.П. и др., 1991; Пушкарева В.И., 1994, 2010). Г.В. Ющенко (1986) установила значительную роль грызунов в агрокомплексах, которые инфицируют субстраты (воду, корма, подстилку), представляя угрозу для сельскохозяйственных животных.

Признано, что в агрокомплексах основным хозяином иерсиний являются свиньи. Взрослые животные переносят инфекцию почти бессимптомно, поросята, напротив, испытывают диарею, обезвоживание организма, учащение дыхания и сердцебиения, судороги.

Несмотря на отсутствие официальной регистрации заболеваний в России, по отдельным публикациям можно представить распространение иерсиниоза в отдельных регионах. Это Вологодская, Саратовская, Нижегородская, Тюменская области, где показатели варьируют от нескольких десятков до 2000 случаев в год с неуклонным ростом (Киселева И.С., 2005; Мамлеева Д.А., 2008; Соколов П.Н. и др., 2009). Ретроспективный анализ заболеваемости по материалам ЦГСЭН Вологодской области с 1991 по 2002 гг. выявил в разные годы от нескольких десятков до 400 - 600 случаев кишечного иерсиниоза. При этом у 22% больных заболевания были связаны с употреблением продуктов животного происхождения или контактом с сельскохозяйственными животными (Макарова В.Н., 2006). По данным Центра гигиены и эпидемиологии Тюменской области заболеваемость псевдотуберкулезом и кишечным иерсиниозом стабильно высокая и регистрируется практически повсеместно (12,3 случая на 100000 человек в 2008 г.). Бактериологические исследования

з

на иерсинии 3831 пробы продуктов и смывов с оборудования пищевых предприятий выявили 3% положительных результатов, причем Y. enterocolilica составляли 70,7% (Соколов П.Н. и др., 2009).

В Скандинавских странах, близких к нам по климатическим условиям, кишечному иерсиниозу отводится третье место после сальмонеллеза и кампилобактериоза (Ahvonen P. et al., 1973; Fredriksson-Ahomaa М. et al., 2000; Grahek-Ogden D. et al., 2007).

Можно предположить, что в масштабе России среди острых кишечных инфекций и пищевых токсикоинфекций неясной этиологии (по данным Федерального центра гигиены и эпидемиологии 481409 случаев за 2009 год) определенную долю составляет кишечный иерсиниоз.

Известно, что одним из ведущих факторов передачи Y. enterocolilica человеку служат мясные продукты (Ющенко Г.В., 1986; Киселева И.С., 2005; Boer Е., 1987; Lake R. J., 2000). Г.В. Ющенко (1986) показала, что различное сырье на мясокомбинатах инфицировано в 4 - 12% случаях, полуфабрикаты - в 10,7%, мясо и готовая продукция на предприятиях торговли - в 5 - 10 %.

Глобализация экономики обусловливает трансконтинентальное перемещение огромных объемов мяса, которое в современных условиях может бесконтрольно вовлекаться в технологический процесс.

Особую эпидемиологическую значимость при этом представляют психрофильные свойства У. enterocolitica (Сомов Г.П. и др., 1991). Процессы переработки, хранения, перевозки продуктов осуществляются при низких температурах - в промышленных холодильниках, рефрижераторах, цехах по приготовлению полуфабрикатов, что создает благоприятные условия существования иерсинии. Влияние абиотических факторов на эпидемиологически важные свойства У. enterocolitica в процессах производства и хранения мясных продуктов изучено крайне слабо. О способности иерсиний формировать биопленки на мясе имеются лишь единичные и противоречивые сведения (Atkinson S. et al., 2009; Kim T.J. et al., 2008). Длительность и формы существования иерсиний в субстратах

агрокомплекса не изучались. Растущее эпидемиологическое и эпизоотологическое значение иерсиниозов определяет актуальность исследований в этом направлении.

Цель работы - экспериментальная оценка воздействия основных абиотических факторов на численность, размножение, устойчивое сохранение, вирулентность и формирование биопленок Yersinia enterocolitica на мясных продуктах, а также субстратах агрокомплекса.

Задачи:

1. Выявить возможные источники и пути распространения иерсиний в агрокомплексе (на примере крупной свинофермы).

2. Разработать методические подходы для оценки популяционной динамики иерсиний в агрокомплексе и в мясных продуктах при условиях, имитирующих реальные технологии хранения, переработки и реализации.

3. Оценить численность, вирулентность популяции Y. enterocolitica в субстратах свинокомплекса и мясных продуктах при действии реальных абиотических факторов (температура, вакуум, рН, влажность).

4. Изучить возможность и условия формирования биопленок У. enterocolitica на кормах для животных и мясных продуктах при реальных температурах их хранения.

5. Выявить изменчивость основных фенотипических свойств иерсиний, изолированных из разных объектов.

6. Методами трансмиссионной и сканирующей микроскопии продемонстрировать стратегию существования иерсиний (адгезия, колонизация, размножение, формирование биопленок) на мясных продуктах и кормах животных. С помощью витальных красителей оценить жизнеспособность иерсиний в биопленках.

Научная новизна:

Крупный свинокомплекс является мощным источником распространения иерсиний и других условно-патогенных бактерий в окружающей среде и представляет потенциальную эпидемиологическую и

эпизоотологическую опасность, что было подтверждено на основе применения современных методов диагностики и индикации иерсиний.

В длительных опытах (210 суток) установлено устойчивое существование У. enterocolitica в концентрациях, близких к исходным, в ряде мясных продуктов при температурах их хранения в промышленных холодильниках (-20°С).

Впервые с помощью трансмиссионной электронной микроскопии выявлена колонизация и размножение У. enterocolitica 09 в продуктах из свинины при современных технологиях изготовления, а также в кормах для животных.

Впервые установлено, что воздействие ряда факторов (вакуума, температуры и влажности) создает интегративный эффект, который приводит к резкому увеличению концентрации кишечных иерсиний на контаминированных мясных изделиях.

Установлено изменение культуральных свойств У. enterocolitica (ускорение биохимических реакций: уреазы, каталазы, ферментации Сахаров; сохранение агглютинабельности, цитопатогенности и плазмиды вирулентности р45).

Впервые показано формирование биопленок У. enterocolitica на мясе и кормах для животных, изученных с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Практическая значимость

Предложенная витальная окраска является экспресс-методом для выявления жизнеспособных микробных клеток как в планктонном состоянии, так и в биопленках. Оригинальный метод, представленный в диссертации, оформлен в виде Методических рекомендаций: «Оценка жизнеспособности биопленок, сформированных У. enterocolitica двухкомпонентным ультрафиолетовым красителем Live/Dead» (2011), утвержденных на совете по внедрению научных достижений в практику в

ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России (протокол № 14 от 07.04.2011 г.).

Материалы диссертации представлены: на IV Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2005); на XV Московском Международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2007); Н-м Ежегодном Всероссийском инфекционном конгрессе (Москва, 2010), на Ш-м Ежегодном Всероссийском инфекционном конгрессе (Москва, 2011).

Материалы диссертации отмечены: грамотой на IV Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2005); дипломом на XV Московском Международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2007); грамотой на конкурсе молодых ученых на Н-м Ежегодном Всероссийском инфекционном конгрессе (Москва, 2010).

Материалы диссертации используются при чтении лекций по специальным курсам на кафедре инфектологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Материалы диссертации используются при чтении лекций по специальным курсам студентам ветеринарно-санитарного факультета ГОУ ВПО МГУПБ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Эпидемическая угроза распространения иерсиний связана с животными, субстратами агрокомплекса, а также последующей переработкой, хранением и реализацией мясных продуктов.

2. Эпидемиологическая и диагностическая значимость современного методического комплекса для индикации иерсиний в кормах и мясном сырье, сохранения потенциала вирулентности и оценки возможности заражения человека.

3. Эпидемиологическая опасность формирования биопленок в условиях пищевой индустрии.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов эпидемиологии и природноочаговых инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России 22 февраля 2011 года.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 5 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (79 отечественных и 90 зарубежных источников). Работа изложена на 112 страницах, проиллюстрирована 3 таблицами и 30 рисунками.

Работа выполнена в лаборатории экологии возбудителей инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России. Ультраструктуру биопленок изучали с использованием сканирующего и трансмиссионного электронных микроскопов под руководством д.б.н., проф. В.Ю. Полякова (НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ им. М. В. Ломоносова).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

В экспериментах использовали:

музейные вирулентные штаммы Y. enterocolitica 03; 08; 09; генетически маркированный штамм Y.enterocolitica 09 (рифампицинрезистентный мутант),

аксеническая культура инфузорий Tetrahymena pyriformis;

гипериммунная гомологичная сыворотка (титр 1:2560), предоставленные лабораторией экологии возбудителей инфекции ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

Для постановки кератоконъюнктивальной пробы использовали морских свинок весом 300 - 350 г (виварий ФГУ ВГНКИ).

Фоновую микрофлору мясных изделий и субстратов агрокомплекса определяли на селективных средах: Эндо, цитримид-агаре (Serva), стафилококковом агаре (Serva), среде Сабуро (Serva), клебсиелла-агаре (Serva), салмонелла-шигелла агаре (Serva), MRS (лактобациллы), среде Блаурокка (бифидобактерии), иерсиниозном И-агаре и И-бульоне (Hi-Media).

Для культивирования мутантных штаммов использовали высокоселективную среду с рифампицином, концентрация которого составляла 100 мкг/мл среды. При высевах из нестерильных субстратов полностью подавлялся рост бактерий, составляющих фоновую микрофлору, тогда как рифампицинрезистентные иерсинии не испытывали ингибирующего действия антибиотика.

Идентификацию и оценку биохимической активности изолятов, полученных в ходе опытов, а также представителей фоновой микрофлоры проводили на тест-системах API 20Е, NE, Staph (BIO-Merieux, Франция).

Отбор и подготовка проб для экспериментальных исследований

Образцы субстратов агрокомплекса (воды из поилок, комбикорма и подстилки) отбирали в агрокомплексе и исследовали по общепринятой методике (ГОСТ-27662; 13496.0-80; Р57808-2001, Р1811-2001, МУ 13-72/1759, «Методические рекомендации по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах»).

Для исследования были взяты корма СК1 и СК5 (для различных возрастных групп свиней), в состав которых входят растительные компоненты (ячмень, овес фуражный, шрот соевый, кукуруза, жмых

подсолнечный и др.). Предварительно исследованные на наличие фоновой микрофлоры образцы воды, подстилки, свиного корма, контаминировали из расчета 103 м.к. иерсиний на 1 г образца.

Отбор образцов и исследование мяса, фарша, мясных изделий проводили в соответствии с ГОСТ 21237-75 «Мясо. Методы бактериологического анализа», ГОСТ 26668-85. Образцы свинины, свиного фарша, мясных продуктов после предварительного исследования на наличие фоновой микрофлоры контаминировали инжектором из расчета 105 м.к. иерсиний на 100 г мяса, а изделия в вакуумной упаковке - 103 м.к. на 1 г изделия, сохраняя вакуум.

Гомогенизированный материал последовательно разводили в изотоническом растворе NaCl (от 10"1 до 10~8) и суспензию высевали на агар Хоттингера, содержащий 100 мкг рифампицина на 1 мл. Бактериологические исследования проводили в динамике после инфицирования образцов и хранения их при температурах, соответствующих задачам опытов.

Подготовка проб и постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Наличие плазмиды вирулентности pCad оценивали с помощью ПЦР. При ее постановке использовали праймеры с последовательностями Yers 1: GTAGGGAAAGTAAACTTTACTGC, Yers 2: CCCATCAAATGTTTGTGTTAATCAC плазмидного гена уорА.

Цитопатогенное действие (ЦПД) изолятов иерсиний оценивали в тесте на аксенической культуре инфузорий Tetrahymena pyriformis по 5 бальной шкале (В.И. Пушкарева, 1994).

Постановка кератоконъюнктивальной пробы

Заражение морских свинок проводили введением за веко 1 капли суспензии культуры свежевыделенного изолята Y. enterocolitica, содержащего не менее 104 м.к. по оптическому стандарту; второй глаз служил отрицательным контролем (реакцию оценивали в крестах).

Получение биопленок, сформированных Y. enterocolitica

Для скрининговых исследований штаммов Y. enterocolitica с целью отбора культур, продуцирующих достаточную биомассу биопленки, были использованы плоскодонные пластиковые планшеты для иммуноферментного анализа емкостью 3 мл, что соответствует общепринятой методике (O'Toole G.A. and Kolter R., 1998). Для этого ночные культуры исследуемого штамма разводили в LB бульоне до концентрации 107 м.к./мл (по оптическому стандарту мутности) и стерильно вносили в лунки. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 28°С.

Для получения биопленок на кормах для животных, образцы, отобранные в агрокомплексе предварительно контаминировали из расчета 107м.к. на 1 г и заливали LB бульоном или МПА и культивировали при 25°С в пробирках «Эппендорф» емкостью 2 мл.

Биопленки на продуктах, приобретавшихся в торговых сетях г. Москвы, получали после контаминирования образцов иерсиниями из расчета 109 м.к. на 100 г образца и инкубировании их при температурах 10°С и 28 -30°С в плоскодонных пластиковых контейнерах, емкостью 50 мл.

Для выращивания биопленки на полимерных материалах, применяемых на мини-заводах по производству мясных изделий, фрагменты полимера помещали в чашки Петри или пластиковые контейнеры, которые заливали ночной культурой иерсиний, разведенной пептонной водой или LB бульоном до концентрации 107 м.к./мл. Контейнеры выдерживали при температурах 10°С и 28 - 30°С.

Витальная окраска биопленок

Окраску проводили двумя методами:

1) Нативные препараты микроскопировали с помощью микроскопа Olympus EX 71, а иерсинии из биопленок, предварительно окрашенных витальным красителем акридиновым оранжевым (в разведении 1:500000), в течение 1 часа, люминесцентной и фазово-контрастной микроскопией на микроскопе Люмам-И2 с выборочной фоторегистрацией.

2) Окраску биопленок осуществляли двухкомпонентным ультрафиолетовым красителем Live/Dead (Invitrogen, США), состоящим из CYTO 9 (зеленый цвет) и пропидиум йодида (красный цвет) готовили ех tempore, разбавляя в 1 мл деионизированной воды. Готовый к употреблению раствор наносили на образцы в равном соотношении с биопленкой и инкубировали при комнатной температуре в течение часа. Образцы микроскопировали в УФ-микроскопе Opton (Carl Zeiss, Германия), фоторегистрацию проводили с помощью цифровой камеры GMS - 510 (США) с программным обеспечением SkopePhoto (SkopeTek, США). Погибшие клетки окрашивались красным цветом, жизнеспособные -зеленым.

Электронная трансмиссионная микроскопия

Для электронной микроскопии зараженные иерсиниями кусочки ветчины диаметром 4 - 8 мм фиксировали в течение 2 часов при 4°С в 3% растворе глутарового альдегида, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере с 0,2 М сахарозой (рН 7,4), затем дополнительно фиксировали 1 - 2 часа в 1% растворе 0s04 на 0,1 М фосфатном буфере. После обезвоживания в серии этиловых спиртов возрастающей концентрации и ацетоне, ткани заключали в эпон-аралдит, делали полутонкие и ультратонкие срезы на ультрамикротоме Ultracut Е (Reichert), помещали их на бленды, покрытые формоваровой пленкой-подложкой, и контрастировали в растворах уранил-ацетата (Уикли Б., 1975) и цитрата свинца (Reynolds E.S., 1963).Срезы просматривали и фотографировали на трансмиссионном электронном микроскопе Hitachi Н-500 (Япония).

Электронная сканирующая микроскопия

Для сканирующей электронной микроскопии контаминированные иерсиниями образцы корма, мясных изделий фиксировали в течение 2 часов при 4°С в 3 % растворе глутарового альдегида, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере с 0,2 М сахарозой (рН 7,4), затем обезвоживали в серии этиловых спиртов возрастающей концентрации и ацетоне. Далее проводили

сушку образца в жидком СОг методом критической точки и наносили на предметный столик с последующим напылением золотом. Срезы просматривали и фотографировали на сканирующем электронном микроскопе JSM 6380 (Япония).

Объем экспериментальных исследований. В работе использовали 15 образцов субстратов агрокомплекса; 57 образцов мясных продуктов (г. Москва); 9 морских свинок.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку осуществляли по программе Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, 2007). Все эксперименты, за исключением сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии, повторяли троекратно.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Роль субстратов свинокомплекса в существовании Y. enterocolitica

Агропромышленный комплекс расположен на сельхозугодьях (Московская область), представлен помещениями для выращивания и откорма сельскохозяйственных животных (в нашей работе - свиньи). В зависимости от физиологического состояния животные распределены по изолированным секциям. Предусмотрены «отстойники» для последующего использования стоков на полях; складские помещения для кормов и подстилочного материала, а также канализация, система водо- и теплоснабжения и др.

Наши исследования начались с определения микробного пейзажа в кормах, технологической воде и подстилочном материале. Родовой состав микроорганизмов был представлен энтеробактериями, неферментирующими микроорганизмами, грибами и другими условно патогенными бактериями (табл. 1).

Таблица 1. Частота изоляции потенциально патогенных микроорганизмов из субстратов агрокомплекса.

Роды микроорганизмов Число культур (из 5 проб)

Корма Вода из Подстилка с

СК1 СК5 поилок экскрементами

Yersinia 0 0 0 1

Salmonella 0 0 0 0

Escherichia 0 0 2 5

Klebsiella 0 0 3 5

Proteus 0 0 2 5

Citrobacter 0 0 1 5

Enterobacter 0 0 5 5

Pseudomonas 2 1 5 5

Proteus 0 0 1 5

Hafnia 0 0 2 0

Serralia 0 0 3 5

Aeromonas 0 0 1 5

Micrococcus 0 0 0 3

Acinetobacter 0 0 3 0

Flavobacterium 0 0 1 0

Actinomyces, Candida 5 5 5 5

Staphylococcus 0 0 3 5

Bacillus 0 0 5 5

Moraxella 4 3 0 0

С целью изучения динамики численности иерсиний сухие корма для свиней предварительно увлажняли водой в соотношении 1:1, что является оптимальной влажностью для длительного существования иерсиний (Максименкова И.А., 1987). Уже в первые сутки после контаминации в дозе 103 м.к./г отмечали рост концентрации Y. enterocolitica, которая к четвертым суткам достигала 104 КОЕ/г и на протяжении срока наблюдения (7 суток) оставалась неизменной (рис. 1).

012 3 45678 Время, сутки.

Рис. 1. Динамика численности Y. enterocolitica в корме, 25°С.

Ультраструктурный анализ контаминированных кормов при помощи метода СЭМ уже через сутки выявил микробные клетки, адгезировавшие поверхность и проникшие внутрь образца; отмечены делящиеся иерсинии и отдельные структуры матрикса в виде нитей. В контрольном образце (интактные иерсинии) также видны делящиеся клетки (рис. 2).

г

Рис. 2: А - корм, контаминированный У. enterocolitica (24 часов, 25°С). Б - контроль (интактные иерсинии).

1 - делящиеся клетки, 2 - структуры биопленки; > - делящиеся клетки

Важным фактором в распространении иерсиний может являться вода, подаваемая животным централизованно, либо в индивидуальные поилки. После попадания иерсиний в воду их концентрация достигала пика на 5-е сутки 106 КОЕ/мл, после чего стабилизировалась до конца опыта (рис.3).

9 1 8 Si 7 § ы Л е о 6 § * Е Sf 5 в & 4 3 <

>1 2 3 4 5 6 7 ? Время, сутки.

Рис. 3. Динамика численности К enterocolitica в воде поилок, 25°С.

Подстилочный материал, представляющий собой солому злаковых культур, опилки, древесные стружки и т. д. По мере увлажнения экскрементами животных подстилку постепенно заменяют, но, тем не менее, создаются благоприятные условия для накопления микроорганизмов (высокая влажность и температура от 15 до 40°С).

В экспериментальных условиях, численность У. enterocolitica после контаминации подстилки достигала 105 КОЕ/г и оставалась на том же уровне в течение 7 суток (рис. 4), несмотря на высокое ОМЧ сопутствующей микрофлоры.

Время, сутки

Рис. 4. Динамика численности Y. enterocolitica в подстилке, 25°С.

***

Таким образом, показано, что иерсинии способны длительное время не только сохраняться, но и размножаться в субстратах агрокомплекса (корме, воде, подстилке), при этом возрастала активность ряда биохимических реакций (уреазы, каталазы, р-галактозидазы, утилизация Сахаров).

Следует отметить эпизоотологическую значимость сохранения потенциала вирулентности кишечных иерсиний, что продемонстрировано в ПЦР (наличие плазмиды вирулентности) (рис.5), а также в протистоцидном тесте на клетках инфузорий Tetrahymenapyriformis.

Рис. 5. Наличие плазмиды вирулентности у иерсиний,

изолированных из различных субстратов агрокомплекса. 1 - маркерная ДНК 1 kb (Fermentas), 2 - в воде, 3 - в корме СК1,4 - в корме СК5, 5 - в подстилке, 6 -положительный контроль, 7 -отрицательный контроль.

Сочетаниое воздействие вакуума, влажности и низкой положительной температуры (4°С) на Y. enterocolitica в готовых изделиях

В опытах использовали образцы готовых мясных изделий в вакуумной

упаковке.

В течение первых суток после контаминации отмечали рост концентрации Y. enterocolitica, которая к третьим суткам достигала 108 КОЕ/г, т.е. возрастала в 100000 раз (рис.б).

012345678

Время, сутки

Рис. 6. Динамика концентрации Yersinia enterocolitica при 4°С в мясных продуктах в вакуумной упаковке.

При ультраструктурном анализе контаминированной ветчины уже через сутки обнаруживали микробные клетки, адгезировавшие поверхность и проникшие внутрь образца; отмечены делящиеся иерсинии. Результаты свидетельствуют о колонизации и размножении Y. enterocolitica в данном продукте. Контрольный образец (интактные иерсинии) был представлен делящимися клетками (рис. 7).

Рис. 7. А - контамииированная ветчина при 4°С (12 часов) х 10 ООО. Б - контроль (интактные иерсинии) х 15 ООО. > -делящиеся клетки Y. enterocolitica

Влияние температуры на длительность существования Yersinia enterocolitica в мясе при длительном хранении

В мясопродуктах, хранящихся при -20°С, что соответствует условиям промышленных холодильников, иерсинии сохраняли численность близкую к исходной на протяжении 210 суток - (время, регламентированное ГОСТ) (рис.8).

к О 'X

С1

■J

о н

о

е

о

<и

Z

щ

&

7 j ■ б

4 |" 3

О

—ь

50

100

150

Время, cjttkii

200

250

Рис. 8. Численность К enterocolitica в мясе при длительном хранении (-20°С).

Выдерживание контаминированного мяса при 4 и 10°С (температуры торговых прилавков и бытовых холодильников) привело к росту концентрации иерсиний с пиком 107 КОЕ/г уже на 3 — 4 сутки хранения, после чего наблюдалось некоторое снижение и к концу опыта (7 суток) Y. enterocolitica возвращались к исходной концентрации - 105 КОЕ/г (рис.9)

Время, сутки

Рис. 9. Динамика численности Y. enterocolitica в мясе при температуре 4 и 10° С.

Кератоконъюнктивальная биопроба у морских вызывала развитие острого кератоконьюнктивита (Рис. 10).

Выборочное исследование клонов иерсиний, изолированных в различные сроки хранения продуктов, в ГПДР выявило во всех пробах наличие плазмиды вирулентности р45 (Рис.11). Протистоцидный тест продемонстрировал выраженное цитопатогенное воздействие иерсиний на клетки инфузорий (Рис. 12).

Рис. 10. Кератоконъюнктивальная проба суспензией изолятов К enterocolitica из мясных продуктов: 1 - больной глаз, 2 - здоровый глаз.

„ MMMf ЩШШ 'ШШвШ ЩЩйШ Ш8ЖЖ ЩШШШ

1 23456785

Рис. 11. Наличие плазмиды вирулентности у иерсиний, изолированных из продуктов в разные сроки хранения. 1 - маркерная ДНК 1 kb (Fermentas), 2-30 суток, 3 -90 суток ,4-120 суток, 5-150 суток, 6-180 суток, 7-210 суток, 8 - при хранении под вакуумом, 9 - положительный контроль, 10- отрицательный контроль.

Рис. 12. ЦПД +++.

Таким образом, кишечные иерсинии, так или иначе, контаминировавшие мясную продукцию, при хранении в условиях низких температур (положительных и отрицательных) способны длительно существовать в опасных концентрациях, сохраняя при этом исходный потенциал вирулентности.

Эпидемиологическая опасность формирования биопленок в условиях пищевого производства

Биопленки, выращенные на полимерных материалах, при 28 - 30°С формировались в течение 2 суток, что характерно и для других возбудителей пищевых инфекций. При понижении температуры до 10°С (условия производства) накопление биомассы биопленки происходило значительно дольше (более 5 суток), причем все стадии формирования замедлялись (рис. 13, 14).

Рис 13. Биопленка, сформированная Y. enterocolitica на поверхности оборудования (28 - 30°С, 2 суток) х500

I - зрелая биопленка, 2 - планктонные клетки.

Рис. 14. Биопленка, сформированная К enterocolitica на поверхности оборудования (10°С, 7 суток) х500.

Визуальная оценка с помощью витального красителя Live/Dead выявила наличие зрелых биопленок, причем, в основном, иерсинии, погруженные в матрикс, сохраняли жизнеспособность, о чем свидетельствовала зеленая окраска препаратов. В поздние сроки (7-9 суток) наблюдали открепившиеся (планктонные) клетки, которые выходили в окружающую среду - цикл развития биопленок завершался (рис. 15).

Рис. 15. Плактонные клетки У. enterocolitica, открепившиеся от матрикса (9 суток, 10°С) х500.

Формирование биопленки на мясных продуктах

Нестерильный фарш или образцы мяса, выдержанные в пептонном

бульоне, а затем контаминированные иерсиниями, покрывались биопленкой в течение двух суток при температуре 28 - 30°С и значительно медленнее (5 суток) при температуре холодильника (10°С). Следует отметить, что при низкой положительной температуре биопленки не только медленнее созревали, достигая максимума лишь через 5 суток, но и труднее разрушались при физическом воздействии. Бактерии адгезировали

поверхность мяса с последующей колонизацией, отмечены делящиеся бактерии, погруженные в матрикс (рис.16, 17). В контрольном образце, представленном интактными иерсиниями, также наблюдались делящиеся клетки (рис. 18).

Рис. 16. Биопленка, сформированная У. enterocolitica на свином фарше (10°С, 7суток). —► - зрелая биопленка

Рис. 17. Биопленка, сформированная У.enterocolitica на мясе (10°С, Scyток). 1 - биопленка, 2 - бактерии-контаминанты, 3 - делящиеся клетки У. enterocolitica.

Рис. 18. Контроль. Интактныс иерсинии. * - делящиеся клетки Y. enterocolitica.

Вполне очевидно, что У. enterocolitica, а возможно, и другие патогенные бактерии при контаминации мяса и мясных продуктов колонизируют их, образуя биопленки, способствующие устойчивому существованию бактерий. Наибольшую эпидемиологическую опасность могут представлять микроорганизмы с психрофильными свойствами, успешно размножающиеся и сохраняющие жизнеспособность и вирулентность при низких температурах.

Полученные результаты укладываются в рамки концепции техногенной очаговости сапронозов, сформулированной Литвиным В.Ю. (1998). Создавая объекты обеспечения для себя, человек, тем самым, формирует новые местообитания и оптимальные условия существования для возбудителей сапронозов. Высокие концентрации микроорганизмов в этих условиях, их активная циркуляция, регулярность контактов с ними людей создают эпидемиологические ситуации, гораздо более опасные, чем в иных очагах, обуславливая заболеваемость людей и эпидемические вспышки.

Выводы

1. Показано, что Yersinia enterocolitica способны существовать и размножаться в различных субстратах агрокомплекса (корма, вода поилок, подстилочный материал), достигая в течение 7 суток значительной концентрации (104- Ю6КОЕ) и сохраняя потенциал вирулентности.

2. Установлено, что сочетание вакуума, влажности и низкой положительной температуры в готовых мясных продуктах увеличивает концентрацию иерсиний за трое суток в 100000 раз, что обусловлено интегративным эффектом действующих факторов.

3. Ультраструктурный анализ контаминированных продуктов выявил адгезию кишечных иерсиний на мясных волокнах с дальнейшей колонизацией и размножением бактерий.

4. В длительных опытах (210 суток) при температуре хранения туш в промышленных морозильниках (-20°С) показано близкое к исходной сохранение концентрации иерсиний (5х104 - 105 КОЕ/г). Выдерживание такого мяса при низких положительных температурах (4, 10°С), характерных для торговых и бытовых холодильников, приводило к росту концентрации иерсинии до 107 КОЕ/г.

5. С помощью сканирующей электронной микроскопии продемонстрировано формирование биопленок Y. enterocolitica на кормах для животных, мясных продуктах и материалах оборудования как при 25 -30°С, так и при 10°С. Созревание биопленок при низкой температуре замедлялось с 2 суток до 5 — 9 суток.

6. Эпидемиологически важно сохранение потенциала вирулентности у Y. enterocolitica в процессе длительного хранения мясного сырья и готовых изделий при низких температурах. Это доказано наличием плазмиды вирулентности р45 у выделенных в разные сроки культур иерсиний, положительной кератоконъюнктивальной пробой на морских свинках, а также цитопатогенностью в тесте на клетках инфузорий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Дробященко М.А. Совершенствование питательных сред для микробиологического анализа продуктов // Материалы IV Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения».2005. С. 225.

2. Дробященко М.А., Пушкарева В.И. Кишечные иерсинии в мясных продуктах (экспериментальное исследование) // Материалы II Ежегодного Всеросийского Конгресса по инфекционным болезням. 2010. Том 8. Приложение № 1. С. 98- 100.

3. Дробященко М.А., Пушкарева В.И., Юров Д.С., Поляков В.Ю. Колонизация и размножение Yersinia enterocolitica 09 в пищевых продуктах, изготовленных в современных технологических условиях // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010. № 4. С. 51 - 57.

4. Дробященко М.А., Пушкарева В.И., Поляков В.Ю. Ультраструктурные основы существования кишечных иерсиний в мясных продуктах и кормах // Мясная индустрия. 2010. № 10. С. 30-32.

5. Дробященко М.А., Пушкарева В.И. Потенциальная роль субстратов агрокомплекса в заражении свиней иерсиниозом // Ветеринария и кормление. 2011. №1. С. 35-36.

6. Дробященко М.А., Пушкарева В.И., Литвин В.Ю., Логинов И.А., Юров Д.С., Поляков В.Ю. Потенциальная эпидемиологическая опасность биопленок, сформированных Yersinia enterocolitica на мясных продуктах // Материалы III Ежегодного Всеросийского Конгресса по инфекционным болезням. 2011. Том 9 Приложение № 1. С.110.

7. Пушкарева В.И., Литвин В.Ю., Дробященко М.А., Поляков В.Ю., Мухачев А.Я. «Эпидемиологическая опасность формирования биопленок в условиях пищевого производства» // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011. №2. С. 21-27.

8. Дробященко М.А., Пушкарева В.И. Возможная роль субстратов агрокомплекса в заражении свиней иерсиниозом // Ветеринария. 2011. № 6. С. 33 -35.

Подписано в печать:

20.04.2011

Заказ № 5371 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Иерсиниоз - острая кишечная инфекция (с частыми внекишечными осложнениями) из класса сапронозов, с алиментарным- путем, заражения*, возбудитель которой - Yersinia enterocolitica сероваров 03; 05; 09. Иерсинии убиквитарно распространены.во внешней среде, отличаясь полигостальностью, т.е.- чрезвычайно широким кругом, хозяев, в, почвенных, водных и наземных экосистемах (от простейших, гидробионтов, грызунов до приматов и человека) (Литвин В.Ю. и др., 1998, 2010; Сомов Г.П. и др., 1991; Пушкарева В.И., 1994, 2010). Г.В. Ющенко (1986) установила значительную роль грызунов в агрокомплексах, которые инфицируют субстраты (воду, корма, подстилку), представляя угрозу для сельскохозяйственных животных.

Признано, что в агрокомплексах основным хозяином иерсиний* являются свиньи. Взрослые животные переносят инфекцию почти бессимптомно, поросята, напротив, испытывают диарею, обезвоживание организма, учащение дыхания и сердцебиения, судороги.

Несмотря на отсутствие официальной регистрации заболеваний в России, по отдельным публикациям можно представить распространение иерсиниоза в отдельных регионах. Это Вологодская, Саратовская, Нижегородская, Тюменская области, где показатели варьируют от нескольких десятков до 2000 случаев в год с неуклонным ростом (Киселева И.С., 2005; Мамлеева Д.А., 2008; Соколов П.Н. и др., 2009).

По данным Федерального центра гигиены и эпидемиологии за 2009 год в России зарегистрировано 677577 случаев острых кишечных инфекций и пищевых токсикоинфекций (за исключением сальмонеллеза и шигеллеза); из которых около 500000 с неустановленной этиологией (Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Федеральный центр гигиены и эпидемиологии). Можно предположить, что среди этих случаев определенную долю составляет кишечный, иерсиниоз.

В Скандинавских странах, близких к нам по климатическим условиям, кишечному иерсиниозу отводится третье место после сальмонеллеза и кампилобактериоза (Ahvonen P. et al., 1973; Fredriksson-Ahomaa М., et al., 2000; Grahek-Ogden D. et al., 2007).

Известно, что одним из ведущих факторов^ передачи. Y enterocolitica человеку служат мясные продукты*(Ющенко Г.В:, 1986; Киселева И:С., 2005; Boer Е., 1987; Lake R. J., 2000). Глобализация экономики обусловливает трансконтинентальное перемещение огромных объемов мяса,, которое в современных условиях может бесконтрольно вовлекаться в технологический процесс.

Особую эпидемиологическую значимость при этом представляют психрофильные свойства Y. enterocolitica (Сомов Г.П. и др., 1991). Процессы переработки, хранения, перевозки продуктов осуществляются при низких температурах - в промышленных холодильниках, рефрижераторах, цехах по приготовлению полуфабрикатов, что создает благоприятные условия существования иерсинии. Влияние абиотических факторов на эпидемиологически важные свойства Y. enterocolitica в процессах производства и хранения мясных продуктов изучено крайне слабо. О способности иерсиний формировать биопленки на мясе имеются лишь единичные и противоречивые сведения (Atkinson S. et al., 2009; Kim T.J. et al., 2008). Длительность и формы существования иерсиний в субстратах агрокомплекса не изучались. Растущее эпидемиологическое и эпизоотологическое значение иерсиниозов определяет актуальность исследований в этом направлении.

Цель работы — экспериментальная оценка воздействия основных абиотических факторов на численность, размножение, устойчивое сохранение, вирулентность и формирование биопленок Yersinia enterocolitica на мясных продуктах, а также субстратах агрокомплекса. 7

Задачи:

1. Выявить возможные источники и пути распространения иерсиний в агрокомплексе (на примере крупной свинофермы).

2. Разработать методические подходы для оценки популяционной динамики иерсиний- в агрокомплексе и в мясных продуктах при условиях, имитирующих реальные технологии хранения, переработки иреализации.

3. Оценить численность, вирулентность популяции У. еЫегосоИНса в субстратах свинокомплекса и мясных продуктах при действии реальных абиотических факторов (температура, вакуум, рН, влажность).

4. Изучить возможность и условия формирования биопленок. У. еШегосоНИса на кормах для животных и мясных продуктах при реальных температурах их хранения.

5. Выявить изменчивость основных фенотипических свойств иерсиний, изолированных из разных объектов.

6. Методами трансмиссионной и сканирующей микроскопии продемонстрировать стратегию существования иерсиний (адгезия, колонизация, размножение, формирование биопленок) на мясных продуктах и кормах животных. С помощью витальных красителей оценить жизнеспособность иерсиний в биопленках.

Научная новизна: Крупный свинокомплекс является мощным источником распространения иерсиний и других условно-патогенных бактерий в окружающей, среде и, представляет потенциальную эпидемиологическую и эпизоотологическую опасность, что было подтверждено на основе применения современных методов диагностики и индикации иерсиний.

В длительных опытах (210 суток) установлено устойчивое существование Г. еЫегосоИйса в концентрациях, близких к исходным, в ряде мясных продуктов при температурах их хранения в промышленных холодильниках (-20°С).

Впервые с помощью трансмиссионной электронной микроскопии выявлена колонизация и размножение К enterocolitica 09 в продуктах из-свинины при современных технологиях изготовления; а также в кормах для животных.

Впервые установлено, что воздействие ряда факторов (вакуума, температуры и-влажности) создает интегративный эффект, который приводит к» резкому увеличению концентрации кишечных иерсиний на контаминированных мясных изделиях.

Установлено изменение культуральных свойств Y. enterocolitica (ускорение биохимических реакций: уреазы, каталазы, ферментации Сахаров; сохранение агглютинабельности, цитопатогенности и плазмидьъ вирулентности Р45).

Впервые показано формирование биопленок Y. enterocolitica на мясе и кормах для животных, изученных с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Практическая значимость

Предложенная витальная окраска является экспресс-методом для выявления жизнеспособных микробных клеток как в планктонном состоянии, так и в биопленках. Оригинальный метод, представленный в диссертации; оформлен в виде Методических рекомендаций: «Оценка жизнеспособности биопленок, сформированных Г. enterocolitica двухкомпонентным ультрафиолетовым красителем Live/Dead» (2011), утвержденных на совете по внедрению научных достижений в практику в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России (протокол № 14 от 07.04.2011 г.).

Материалы диссертации представлены: на IV Международною научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2005); на XV Московском Международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2007); П-м Ежегодном Всероссийском инфекционном конгрессе (Москва, 2010), на Ш-м Ежегодном Всероссийском инфекционном конгрессе (Москва, 2011).

Материалы диссертации отмечены: грамотой на IV Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2005); дипломом на XV Московском Международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2007); грамотой на конкурсе молодых ученых на П-м Ежегодном Всероссийском инфекционном конгрессе (Москва, 2010).

Материалы диссертации используются при чтении лекций по специальным курсам на кафедре инфектологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, а также студентам ветеринарно-санитарного факультета ГОУ ВПО МГУПБ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Эпидемическая угроза распространения иерсиний связана с животными, субстратами агрокомплекса, а также последующей переработкой, хранением и реализацией мясных продуктов.

2. Эпидемиологическая и диагностическая значимость современного методического комплекса для индикации иерсиний, в кормах и мясном сырье, сохранения потенциала вирулентности и оценки возможности заражения человека.

3. Эпидемиологическая опасность формирования биопленок в условиях пищевой индустрии.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов эпидемиологии и природноочаговых инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России 22 февраля 2011 года.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 5 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Работа выполнена в лаборатории экологии возбудителей инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России. Ультраструктуру биопленок изучали с использованием сканирующего и трансмиссионного электронных микроскопов под руководством д.б.н., проф. В.Ю. Полякова (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. Показано, что Yersinia enterocolitica способны существовать и размножаться в различных субстратах агрокомплекса (корма, вода поилок, подстилочный материал), достигая в течение 7 суток значительной концентрации (104 - Ю6КОЕ) и сохраняя потенциал вирулентности.

2. Установлено, что сочетание вакуума, влажности и низкой положительной температуры в готовых мясных продуктах увеличивает концентрацию иерсиний за трое суток в 100000 раз, что обусловлено интегративным эффектом действующих факторов.

3. Ультраструктурный анализ контаминированных продуктов выявил адгезию кишечных иерсиний на мясных волокнах с дальнейшей колонизацией и размножением бактерий.

4. В длительных опытах (210 суток) при температуре хранения туш в промышленных морозильниках (-20°С) показано близкое к исходной сохранение концентрации иерсиний (5x104 - 105 КОЕ/г). Выдерживание такого мяса при низких положительных температурах (4, 10°С), характерных для торговых и бытовых холодильников, приводило к росту концентрации иерсинии до

10'КОЕ/г.

5. С помощью сканирующей электронной микроскопии продемонстрировано формирование биопленок Y. enterocolitica на кормах для животных, мясных продуктах и материалах оборудования как при 25 — 30°С, так и при 10°С. Созревание биопленок при низкой температуре замедлялось с 2 суток до 5 - 9 суток.

6. Эпидемиологически важно сохранение потенциала вирулентности у К еШегосоИИса в процессе длительного хранения мясного сырья и готовых изделий при низких температурах. Это доказано наличием плазмиды вирулентности р45 у выделенных в разные сроки культур иерсиний, положительной кератоконъюнктивальной пробой на морских свинках, а также цитопатогенностью в тесте на клетках инфузорий.