Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка методов бактериологической диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных

На правах рукописи

РГБ ОД

И ¿яг —

ПОМЕРАНЦЕВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ КИШЕЧНОГО ИЕРСЙНИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология. ,

г ^

/

I

/ '

\ к V

\)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

ч

Ульяновск - 2000

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотол 'пш и ветерннарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сел скохочяйствепной академии.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич.

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник ВНИИЗЖ Русалеев Владимир Сергеевич.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ульяновского государственного Университета Генинг Татьяна Петровна

кандидат биологических наук, ведущий научны? сотрудник ВГНКИ Обухов Игорь Леонидович

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вир\ солопш и микробиологии РАСХН. ' .

Защита состоится « /6 » 2000 года в /О часов на заседани

диссертационного совета К 120.82.03 при-Ульяновской государственной сель скохозяйственной академии. '■• "

Адрес: г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке УГСХА.

Автореферат разослан « /Л » 2000г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук, доцент Козин А.И

. Ф

/7$ 7*1,34'

OGimiíi характеристика работы. Актуальность темы. За последние 50 лет отмечено расширение круга микроорганизмов, которые обуславливают кишечные заболевания. Наряду е известными, хорошо изученными болезнями сельскохозяйственных животных, появляются «новые» болезни, этиологический а1 ент которых не изучали. К числу таких болезней относится кишечный иерсиниоз людей и животных, возбудителем которого является бактерия Yersinia enterocolitica.

Первые сведения о возбудителе кишечного йерсиниоза получены в США, где с 1923 но 1957 год было выявлено от людей около'lí>'штаммов бактерий, но в то время они были отнесены к атипичным вариантам псевдотуберкулёзного микроба и не рассматривались как причина заболевания. В дальнейшем кишечный иерсиниоз как инфекционная болезнь людей появился в Западной Европе -Франции, Бельгии, Голландии, Германии, Швейцарии в Т060 году и первоначально была названа Pasteurella X. Позднее она появилась в Швеции, Финляндии, Венгрии.

В данное время в Нидерландах, Бельгии, Германии, Канаде, Австралии иерсиниоз занимает третье место среди пищевых зоонозов, после сальмонеллё-за и кампилобактериоза (I.Bockeinuhl, 1995).

В России ирсиниоз занимает второе место среди пищевых зоонозов, после сальмонеллёза, в 1993 году зарегистрировано 3876 случаев иерсиниоза или 2,6 на 100 тысяч населения (Черкасский Б.Л., Подунова Л.Г., Акулова Н.К., 1995).

Опасность иерсиниоза усугубляется чрезвычайной распространённостью возбудителя Yersinia enterocolitica в'природе. Как отмечают (Ленченко K.M., Куликовский А.П., Павлова И.Б., 1998; Собакин A.C., Зыкин Л.Ф., 1998; Покровский В.И.,1986; Ющенко Г.В., Í984) бактерии Yersinia enterocolitica выделены практически от всех видов млекопитающих, птиц, рыб, земноводных, моллюсков и насекомых. Кроме того, Yersinia enterocolitica обнаружены в воде, почве, сточных водах, продуктах животного происхождения.

Изучение распространения иерсиниоза среди животных затруднено, так как эта болезнь в РФ не подлежит обязательному учёту как самостоятельная нозологическая единица. До сих пор не разработана система мероприятий по диагностике, профилактике и лечению животных, больных кишечным иерсиниозом. Фаготипирование, как один из методов диагностики бактерий не изучался.

Цели » задачи исследования. Целью работы являлась разработка ускоренного метода выделения и идентификации бактерий вида Yersinia enterocolitica. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Провести сравнительную оценку существующих методов выделения и идентификации бактерий Yersinia enterocolitica.

2) Разработать и предложить схему и методы бактериологического выделения и идентификации Yersinia enterocolitica.

3) Выделить бактериофаги Yersinia enterocolitica.

4) Изучить основные биологические свойства фагов Yersinia enterocolitica.

5) Исследовать возможность фаготипирования бактерий Y.enterocolitica для целей идентификации.

Научная иовизиа. Усовершенствована разработанная методическая схема бактериологического выделения и идентификации Y.enterocolitica. Впервые в ветеринарной практике выделены бактериофаги Y.enterocolitica для целей идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов Y.enterocolitica. Доказана возможность использования бактериофагов Y.enterocolitica для идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза. ,

Практическая значимость работы. Для врачей бактериологов предложены методические указания пб ускоренному выделению и идентификации бактерий Y.enterocolitica, позволяющие в более короткие сроки поставить диагноз на заболевание кишечным иерсиниозом1.'

Доказана возможность использования бактерирфагов Y.enterocolitica для целей идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза. Основные положения выдвигаемые па защиту;' Схема бактериологического выделения и идентификации Y.enterocolitica. Схема выделения бактериофагов Y.enterocolitica .

Биологические свойства выделенных бактериофагов Y.enterocolitica .Доказательство возможности использований бактериофагов для идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседаниях учёного совета факультета ветеринарной медицины УГСХА (1998-1999), на научно-практических конференциях в Ульяновской ГСХА (1997-1999), семинарах проводимыми Ульяновским областным управлением ветеринарии (1997-1999), на межкафедральном заседании профессорско-преподавательского состава Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (2000).

Материалы диссертации опубликованы в 7 научных статьях. Объём и структура работы. Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы содержащий 182 отечественных и зарубежных источника. Диссертация имеет 17 таблиц и 6 фотографий.

Собственные исследования.

Материалы Ii методы.

Работа выполнялась в период с 1996 - 2000 г. на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и петерипарно-санитарной экспертизы Ульяновской Государственной сельскохозяйственной академии.

Для бактериологического исследования в работе были использованы 24 штамма бактерий Y.enterocolitica. По антигенному строению штаммы Y.enterocolitica распределились следующим образом: серовар 0:3 - 4 штамма; 0:5 — 2 штамма; 0:5,27 - 3 штамма; 0:4,32 - 6 штаммов; 0:6,30 - 2 штамма; 0:6,31 - 2 штамма; 0:8 - 2 штамма: 0:9 - 3 штамма. Помимо этого, при определении специфичности бактериофагов использовались 62 штамма других видов бактерий - представители родов: Proteus, Citrobacter, Escherichia, Morganella, Klebssiella, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas.

Методы:

1) Исрснниоз сельскохозяйственных животных (диагностика и профилактика). //Методические рекомендации ВАСХНИЛ М., 1989г.

2) Эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов, организация и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий // Инструкция МЗ СССР от 30.10:1990г.

3) Методические указания «по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энте-робактериями» утверждёнными ГУВ МСХиП СССР 12.11.1991г.

4) Методические указания «по . выявлению У.егиегосоКиса и У.рзеи(1ои1Ьегси1оз18 в пищевых продуктах животного происхождения» утверждёнными ДВ МСХиП РФ 23.09.1998г.

Исследования фагов проводили общепринятыми методами Грация (1936), М. Адаме (1961);И.М.Табрилович (1973).

Объектами исследования являлись музейные штаммы бактерий и фаги У.еп1егосо1шса, выделенные нами из сточных вод животноводческих хозяйств Ульяновской области.

Питательные среды и реактивы. Для выделения и исследования биологических свойств бактериофагов У.егиегосоН^са использовали мясо-пептонный бульон (рН 7,4 - 7,6); 1,5% и 0,7% мясо-пептонный агар (рН 7,4 -7,6). При работе с бактериями использовали: в качестве сред накопления ФБР, СФБР; агары Эндо, Серова, БТС, МПА; МПБ, для определения биохимических свойств цветной ряд Гисса. Все посевы инкубировались при температуре 26°С в течении 24-48 часов, а при работе с бактериофагами в течении 18-20 часов. Оборудование: термостаты ТС-80М-2; микроскопы МБИ-3, лупа бинокулярная МБС-9, ультратермостаты УТ-15У4,2; вакуумный насос МегтоЫсе (Чехословакия), бактериальные фильтры Ь-З свечи Шамберлана, центрифуги лабораторные ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3; аппарат ультрафиолетового облучателя крови «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8-1; холодильники бытовые, колбы мерные, пипетки пастеровские, пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 см3, флаконы ёмкостью 50, 100 см3, стёкла-покровные, стёкла предметные, чашки Петри, пробирки, стандарты мутности, на 0,5 и 1,0 млрд. микробных клеток. Статистическая обработка результатов исследований. Цифровые данные подвергали статистической обработке средних величин и их ошибок. Достоверность определяли по разностному методу Стыодента-Фишера.

Результаты исследований. Сравнительная оценка используемых методик.

С целью использования в наших исследованиях оптимального метода выделения и идентификации бактерий У.еМегосоНПса мы провели сравнительное изучение различных схем. В результате проведённых опытов выявили ряд принадлежащих им недостатков. Методические указания «по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» не позволяют точно тигшровать иер-синии, так как предлагаемые для этого тесты не являются для бактерий

Y.enterocolitica основными, отсутствует этап обогащения, не предлагаются специальные дифференциально-диагностические среды.

Используя методические указания «по выявлению Y.entcrocolitica и Y.pseudotuberculosis в пищевых продуктах животного происхождения», мы установили, что предлагаемую схему можно с определённым успехом использовать, только при работе с чистыми культурами бактерий. Рекомендуемые 18 биохимических тестов требуют значительного времени и средств, что задерживает получение результатов исследования. В инструкции МЗ и методических рекомендациях ВАСХНИЛ используется мало эффективная среда накопления и для определения биохимических свойств предлагается большой и сложный набор тестов, в результате сроки выделения и идентификации занимают не менее 2-3-х недель. Всё это обусловило необходимость заняться исследованиями по разработке оптимальной схемы выделения Y.enterocolitica.

Создание оптимальной схемы выделения бактерий Yersinia cnterocolitica.

При первичной обработке^ любого исследуемого материала, в качестве приёма увеличивающего процент высеваемост бактериц в,ида .Y.enterocolitica мы предложили изменить состав, среды . накопления солевого фосфатно-буферного раствора добавив 0,1 % раствора генцианвиолета. Это позволило ин-гибировать сопутствующую грамположительную и часть грамотрицателыгой микрофлоры. ■ г

Эффективность сконструированной среды накопления для бактерий вида Y.enterocolitica была проверена в серии из 26 опытов на референс штаммах Высевы со сред накопления проводили через 48 часов инкубации при 4°С в условиях холодильника. Посевы инкубировались в течении 24 - 48 часов при 26°С. Результаты этих опытов отображены в таблице 1.

Таблица№1

Количество выросших колоний референс штаммов Y.enterocolitica

Среды накопления Кол-во выросших колоний

СФБР 28 ± 1,0

СФБР с генцианвиолетом 26 ±1,2

Из табличных данных видно, что добавление водного раствора генцианвиолета существенно не отражается на размножении иерсиний.

Для определения эффективности среды накопления с добавлением генцианвиолета проводили исследование сточных вод животноводческих хозяйств, дополнительно контаминированных штаммами Y.enterocc>liuca. Таблица 2.

'ьь 1 Таблица№2

Сравнительная оценка сред накопления при исследовании сточных вод

! Среды накопления Выросло Y.enterocolitica Других бактерий 1

СФБР • 10,8 ±0,6 51,0 ± 1,3 j

1 СФБР с генцианвиолетом 11,3 ±0,7 36±1,1 i

Для определения оптимального времени выдерживания пробирок со средой накопления с посевами в холодильнике при 4°С мы производили высевы на плотную дифференциально-диагностическую среду Серова через каждые 12 часов в течении 5-ти суток. В результате исследования мы определили, что наиболее оптимальным является выдерживание при 4°С в течении 48 часов, дальнейшее выдерживание хотя и положительно сказывается на ингибировании сопутствующей микрофлоры, но увеличивает сроки исследования, являясь следовательно не целесообразным, так как значительная часть микрофлоры ингиби-руется в первые двое суток.

Было проведено сравнение наиболее часто употребляемых сред рекомендуемых для выделения бактерий У.ешегосоНиса: агара Эндо, агар Серова, агар с бромтимоловым-синим (БТС).

Была изучена селективность сравниваемых сред при высеве на них фильтрата сточных вод животноводческих хозяйств дополнительно контаминирован-ных суточными культурами иерсиний. В результате проведённых исследований мы определили, что выделить бактерии У.егиегосоНЦса из сточных вод можно только при помощи агара Серова. Агар Эндо полностью зарастал бактериями находящимися в сточных водах. Агар с бромтимоловым-синим (БТС) тоже зарастал, причём цвет среды из травянисто-зелёного менялся на жёлтый и обнаружить колонии голубого цвета уже не представлялось возможным.

Важно отметить, что на агаре Серова бактерии У.етегосоПиса удаётся обнаружить благодаря тому, что на данной среде у них своеобразная, отличительная от других бактерий морфология колоний. Они образовывали колонии тёмно-красного цвета, с матовой суховатой поверхностью и чуть сосцевидно-выпуклым центром, диаметр колоний составлял 2,0-5,0 мм. Колонии других видов кишечных бактерий образовывали большие, более 5,0 мм в диаметре, блестящие и яркие колонии.

Биохимическая идентификация. На основании известных биохимических свойств бактерий этого вида мы сконструировали оптимальную схему идентификации кишечного иерсиниоза до вида. За основу межродовой идентификации, внутри семейства энтеробактерий были взяты следующие тесты: расщепление мочевины, ферментация без образования газа глюкозы, ферментация арабинозы и инозита.

Изучение морфологических н биохимических свойств

исключаем Escherichia, Edwardsie/la. * Citrobacter, Salmonella. Enterobacter, Hafnia.

—►исключаем роды Proteus и Serratia. исключаем род Klebssiellp.

положительная уреазная активность

ферментация глюкозы

оез ооразо^ания газа ферментация агабинозы ферментация инозита -

положительная ферментация сахарозы, вид

целлобиозы, сорбита и отрицательная ^"Yersinia cntcrocolitica.

рамнозы, мелибиозы, рафинозы.

Внутриродовую идентификацию проводили по следующим тестам: ферментация сахарозы, целлобиозы, сорбита и отрицательные показатели ферментации рамнозы, рафинозы, мелибиозы и подвижность при 25°С.

Внутри видовую дифференциацию выделенных культур Y.enterocolitica делали с целью типирования биоваров и проводили по следующим тестам: салицин, индол, ксилоза, трегалоза.

Таким образом, предложенная схема дала нам возможность вести целенаправленное исследование на обнаружение возбудителя кишечного иерси-ниоза в любом материале, значительно сокращая объём и время работы. Это позволило наработать необходимое количество штаммов Y.enterocolitica для проведения дальнейшие исследований по бактериофагам.

Методика выделения бактериофагов и селекция клонов фагов.

Первым этапом нашей работы была попытка выделить бактериофаги Y.enterocolitica из имеющихся у нас штаммов бактерий Y.enterocolitica. Мы надеялись обнаружить лизогенные культуры, так как бактериофаги, выделенные из таких культур, обладают более выраженной специфичностью Mollaret (1967); B.Nilehn и P.Nicolle (1969); Т.Ч.Жугова (1985). ,

Выделить лизогенные бактериофаги из имеющихся у. нас культур Y.enterocolitica мы пробовали различными методами. Выявление лизогенных культур проводили путём перекрёстного испытания на чашках с 1,5% питательным агаром методом агавовых слоев A.Gracia (1936), И.М.Габрилович (1973). Все изучавшиеся штаммы исследовались как индикаторные и как «лизогенные». •,•'•.

В первой серии опытов, -исследуемые культуры изучались по методике И.М. Габриловича (1973).

Во второй серии опытов использовали методику используемую И.В. До-марадским (1971).

В третьей серии опытов применяли общепринятую методику для выделения бактериофагов энтеробаКтерий использованную В.Я. Ганюшкиным (1988) и С.Н. Золотухиным (1994).

Проведя эти исследования в 42 опытах с 118 пробами, нам не удалось выделить бактериофаги Y.enterocolitica из имеющихся у нас штаммов бактерий Y.enterocolitica. у

Таким образом, не обнаружив явления лизогении у имеющихся штаммов бактерий, мы решили выделить • бактериофаги Y.enterocolitica из объектов внешней среды. Для этого мы брали сточные воды в свиноводческих хозяйствах и молочно-товарных фермах в различных хозяйствах Ульяновской области. В колбу содержащую МПБ -вносили фильтрат сточных вод и все имеющиеся у нас штаммы бактерий Y.enterocolitica. Колбу инкубировали 10 суток

при 26°С. После этого, содержимое колбы центрифугировали при 2000 g в течении 30 минут. Надосадочную жидкость исследовали методом агаровых слоев по A.Gracia ( 1936).

Наличие негативных'.колоний или зон лизиса на газоне роста индикаторной культуры свидетельствовало о присутствии в исследуемом материале бактериофага. При этом отмечалось следующее: а) полный лизис индикаторной культуры; б) слившиеся негативные колонии; в) единичные негативные колонии. В случае положительного результата негативные колонии или участок-лизиса отвивали в мясо-пептонный бульон с индикаторной культурой. Для получения чистой линии фага проводили до пяти пассажей из изолированных негативных колоний.

Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили с помощью пассирования фага на индикаторной культуре с периодической отвивкой типичных негативных колоний по методике, описанной Dulbeio и Vogt (1954) и использованной И.М.Габриловичем (1972), С.Н.Золотухиным (1994).

В результате проведённых опытов нами были выделены и изолированы 6 штаммов бактериофагов Yersinia enterocolitica.

Характеристика фагов Yersinia enterocolitica.

Изучение биологических свойств фагов проводили в соответствии с современными схемами классификации бактериофагов M.Adams (1961); D.Bradley (1965); А.С.Тихоненко (1968); Т.Г.Чинашвили (1968); H.W.Ackermann (1969); И.М.Габрилович (1973); D.Reanney и Н.-W.Ackermann (1982).

Исследовались следующие свойства фагов Yersinia enterocolitica:

а) морфология негативных колоний;

б) литическая активность;

в) спектр литической активности;

г) специфичность действия;

д) температурная устойчивость;

е) устойчивость к хлороформу;

ж) взаимодействие с микробной клеткой.

а) Морфология негативных колоний. Морфология негативных колоний изучалась при посевах фагов методом агаровых слоев по Грация на питательном агаре. Учёт производился через 18-20 часов инкубации при температуре 26°С. Отмечались величина негативной колонии, её форма, степень прозрачности, наличие вторичного роста, характер краёв колонии, наличие и величина зоны неполного лизиса.

Негативные колонии, образуемые изученными бактериофагами разделены на три типа. Колонии типа «а» у 3 фагов, они образуют мелкие, круглые, прозрачные негативные колонии, с чёткими краями от 1,3 до 2,0 мм в диаметре. У двух бактериофагов Y.enterocolitica отмечались негативные колонии типа «в» величиной 2,0-3,0 мм в диаметре, прозрачные с ясным центром и хорошо

Ill

выраженной зоной неполного лизиса. Один бактериофаг образовывал круп ные, круглые прозрачные с четкими краями негативные колонии, от 4,0 до 5,( мм в диаметре - тип «с».

б) Литическая активность бактериофагов Y. enterocolitica. Культуры бактерий Y.enterocolitica на которых мы определяли литическую активность бак териофагов выращивали на стандартном мясо-псптонном бульоне и использо вали их в логарифмической фазе роста.

Литическую активность селекционированных бактериофагов проводил! по методу Аппельмана и Грация Д.М.Гольдфарб (1961).

Данные о литической активности селекционированных бактериофага! Yersinia enterocolitica представлены в таблице 3

Таблица №2

Литическая активность бактериофагов Y.enterocolitica._

Литическая активность

№ Фаги по Грация по Аппельману

1. YE/CB-42 3 106 8 104

2. YE/CB-5 7 107 6 105

3. YE/CB-6 4,2 108 2,6 106

4. YE/KP-3 2,4 10* 3,1 105

5. YE/KP-8 5,2 107 8,2 105

6. . YE/KP-9 6,4 106 4,1 104

Из табличных данных видно, что литическая активность селекционированных фагов находится в диапазоне от 3 10'' до 4,2 108 по Грация и от 4,1 104 до 2,6 106 по Аппельману. Наибольшей литической активностью по отношению к изучаемым культурам обладает фаг УЕ/СВ-6.

в) Спектр литической активности бактериофагов У.еШегосоПйса. Для изучения спектра литической активности шести селекционированных фагов (УЕ/СВ-5, УЕ/СВ-42, УЕ/СВ-6, YE/KP-3, УЕ/КР-8, УЕ/КР-9) мы использовали 24 штамма У.еШегосоП^са следующих серологических групп: 0:3; 0:4,32; 0:5; 0:5,27; 0:6,30; 0:6,31; 0:8; 0:9 - сюда входят музейные, референс и эпизоотические штаммы бактерий. Для характеристики спектра действия фагов определяли долю штаммов от числа изученных, чувствительных к фагу (индекс спектра действия) и круг хозяев - группу штаммов, чувствительных к данному фагу. Результаты опыта показали, что изученные фаги характеризуются различным спектром литической активности. Нужно отметить, что бактериофагов, лизн-руюишх только один штамм, обнаружено не было. Наиболее широким спектром литического действия но отношению к изучаемым культурам обладает штамм фага УЕ/СВ-42. Из 24 штаммов У.етсгосоПпса он лизировал 11 и обладает сравнительно высоким спектром действия 0,46. Три штамма бактерий, относящиеся к серологической группе 0:4,32 оказалтеь фагорезистентнымы. Всего из 24 штаммов У.еп1егосо1шса лизировались фагами 21 штамм, то есть 87,5%, Результаты опыта отображены в таблице 4.

Таб;шца№4

Диапазон литической активности иерсиниозных фагов по отношению к штаммам бактерий Y.enterocolitica.

Кол-во Из них Лизируемые: ..-Индекс % лизи-

№ Фаги испытан. чувстшГг. Серовары i: : Спектра руемых

штаммов к фагу- Действия штаммов

0:4,32;

1. YE/CB-42 24 11 0:6,30; 0:6,31; 0:9 0,46 45,8

1 YE/CB-5 24 5 0:5; 0:5,27 0,2 20,8

3. YE/CB-6 24 4 • 0:6,30; 0:6,31 0,17 16,7

4. YE/KP-3 24 7 0:3; 0:6,30 о,з 29,2

5. YE/KP-8 24 2. 0:8 0,08 8,3

6- YE/KP-9 24 j 0:9 ОД 2 12,5

. г) Специфичность действия бактериофагов Y.enterocolitica. Определение видовой специфичности 6-ти изучаемых бактериофагов Y.enterocolitica (YE/CB-5, YE/CB-42, YE/CB-6, YE/KP-3, YE/KP-8, YE/KP-9) проводили на агаровых средах путём накалывания фага на газон культуры. В результате изучения специфичности шести бактериофагов Y.enterocolitica (YE/CB-5, YK/CB-42, YE/CB-6, YE/KP-3, YE/KP-8, YE/KP-9) по отношению к представителям родов Proteus vulgaris 6 штаммов, Citrobacter 6 штаммов, Escherichia coli 14 штаммов, Morganella morganii 12 штаммов, Klebssiella pneumoniae 5 штаммов. Salmonella 8 штаммов, Staphylococcus pyogenes 3 штамма, Pseudomonas aeruginosa 8 штаммов - установлено, что ни одна из испытуемых культур других видов бактерий данными фагами не лизировалась. На основании полученных результатов можно сделать вывод, о том что селекционированные фаги являются специфичными и не активны к представителям других родов бактерий.

д) Температурная устойчивость бактериофагов Y.enterocolitica. Изучение термочувствительности селекционированных бактериофагов проводили в . питательном бульоне М.Адаме (1961); И.М.Габрилович (1973).

С целью определения оптимальных условий приготовления фаговых суспензий проведено изучение термочувствительности всех шести бактериофагов Y.enterocolitica (YE/CB-5, YE/CB-42, YE/CB-6, YE/KP-3, YE/KP-8, YE/KP-9) в сравнении» с чувствительностью индикаторных штаммов бактерий Y.enterocolitica. При прогревании в течении 30 минут при температуре 40°С наблюдалась 100% выживаемость фагов и бактерий, выдерживание при температуре 65°С при той же экспозиции приводило практически к полной гибели фагов и бактерий. В дальнейшем с целью определения критериев разграничения бактериофагов была определена термочувствителыюсть всех изученных фагов при температуре 55°С и 60°С в течении 30 минут. Между шестью испытанными бактериофагами существенных различий в чувствительности к

температуре не имеется. Все испытанные бактериофаги У.сШегосоПиса (УЕ/СВ-5, УЕ/СВ-42, УЕ/СВ-6, УЕ/КР-З, УЕ/КР-8, УЕ/КР-9) являются высоко чувствительными к воздействию температуры. Наибольшей чувствительностью к температуре 55°С обладает бактериофаг УЕ/КР-З (К=0,12 мин-1), а наименьшей УЕ/СВ-5 (К=0,029 мин-1). К температуре 60°С наибольшей чувствительностью обладают бактериофаги УЕ/КР-8 и УЕ/КР-9 (К=0,18 мин -1 и 0,22 мин-1), а наименьшей УЕ/СВ-5 и УЕ/СВ-6 (К=0,11 мин-1 и 0,14 мин-1). У всех бактериофагов инактивация наблюдалась в основном в первые 12 минут, а в последующие 18 минут инактивировался незначительный процент фагов.

Результаты этих исследований приводятся в таблице 5.

Таблица№5

_____Температурная устойчивость фагов У.еп1егосо1Шса._

1 Инактивация при 55°С Инактивация при 60°С

№ | Фаги % выживае- % выживае-

1 мости фага К, мин"1 мости фага К, мин"1

1 1 (Х±м) (Х±м)

1. ' УЕ/СВ-42 13,9 ±0,82 0,065 1,9 ±0,02 0,13

2. | УЕ/СВ-5 41,6 ±5,9 0,029 4,3 ± 0,9 0,11

3. . | УЕ/СВ-6 4. | УЕ/КР-З 5. | УЕ/КР-8 6. . ■ УЕ/КР-9 12,6 ±1,07 1,2 ±0,012 10,9 ±3,86 14,0 ± 1,6 0,068 0,12 0,073 0,065 1,4 ±0,26 0,29 ± 0,02 . 0,21 ± 0,02 0,24 ±0,01 0,14 0,17 0,18 - о ; .1 '

Результаты исследований позволяют сделать следующие выводы: а) исследованные бактериофаги У.е^егосоМса являются термолабильными, по скорости инактивации они мало отличаются между, собой; б) несмотря на почти полную инактивацию индикаторных штаммов метод прогревания фаголиза-та для устранения из него бактерии - хозяина неприменим.

е) Устойчивость бактериофагов У.еШегосоПИса к воздействию хлороформом. Определение чувствительности бактериофагов и бактерий к хлороформу проводили путём обработки фаговой суспензии или бульонной культуры, содержащей в 1 мл около 107 частиц фага или бактерий, хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании. Затем, определяли процент активного фага в сравнении с контрольной пробой, не подвергавшейся воздействию хлороформа и вычисляли константу скорости инактивации.

Обработка бактерий У.етегосоПпса из индикаторных штаммов: ЕВ-0:5.27; М-0:3, ЕВ-0:9 в течении 15 минут хлороформом приводила к их полной гибели. Бактериофаги оказались менее чувствительными к воздействию хлороформа и их выживаемость составляла; фага УЕ/СВ-5, 20,5 ± 4,1% (К=0,13 мин1); фага УЕ/СВ-6 22,4 ± 2,8% (К=0,14 мин'1); фага УЕ/СВ-42 28,2 ± 11.4% (К=0,12 мин'); фага УЕ/КР-З 25,6± 3,5% (К=0,13 мин"1); фага УЕ/КР-8 40,8 ± 7,6% (К=0,09 мин"1); фага УЕ/КР-9 53,7 ± 5,9% (К=0,06 мин"1).

Воздействие хлороформом, на бактерии испытуемых штаммов в течении 10 минут при постоянном встряхивании, выявило что их выживаемость со-

ставляет 0,1 ± 0,006% и таким образом происходит практически полная их гибель. Тем не менее, значительная инактивация бактериофагов указывала на невозможность использования хлороформа для приготовления фагавых суспензий.

Обработка селекционированных бактериофагов У.еМегосоМса хлороформом выявила различную их чувствительность к этому агенту. Результаты этих исследований представлены в таблице 6

Таблица№6

Устойчивость бактериофагов Y.enterocolitica к _воздействию хлороформом.___

Обработка 15 минут Обработка 10 минут

№ Фаги % выживае- % выживае-

мости фага К, мин"1 мости фага К, мин"1

(Х±м) (Х±м)

1. YE/CB-42 28,2 ± 11,4 0,12 38,5 ±5,6 0,09

2. YE/CB-5 20,5 ±4,1 0,13 25,7 ±3,6 0,13 !

3. 4. 5. 6. YE/CB-6 YE/KP-3 YE/KP-8 YE/KP-9 22,4 ± 2,8 25.6 ±3,5 40,8 ± 7,6. 53.7 ±5,9 0,14 0,13 0,09 0,06 26,1 ±3,6 40,9 ± 7,9 70,1 ±8,8 64,6 ±2,7 0,13 ; 0,09 0,034 0,04

Таким образом, проведя данное исследование, мы разделили селекционированные фаги Y.enterocolitica на 2 группы. В первую группу вошли фаги YE/KP-8 и YE/KP-9 их выживаемость при обработке хлороформом в течении 10 минут составила более 50%. Во вторую группу мы отнесли остальные 4 фага, так как их выживаемость была менее 50%.

ж) Взаимодействие бактериофагов Y.enterocolitica с микробной клеткой. Взаимодействие бактериофагов с микробной клеткой включает в себя различные фазы: а) адсорбция фага на клетке; б) фаза латентного периода; в) выход фага или его урожай. Так же мы проводили исследование по определению сво-эодного литического фермента индуцируемого в клетке бактериофагами Yersinia enterocolitica.

Фазы взаимодействия бактериофагов Y.enterocolitica с микробной клеткой.

Фазы взаимодействия бактериофагов с бактериальными клетками V.enterocolitica определяли по суммарному количеству неадсорбированного и зновь образовавшегося фага, описанной М.Адамсом (1961) и использованной М.Габриловичем (1973); Т.Ч.Жуговой (1985).

Изученные бактериофаги различаются между собой по скорости ад-юрбцин, продолжительности латентного периода и среднему урожаю. Минимальное значение константы скорости адсорбции (0,23 10 ~и) мл/мин) у фага (ГЕ/СВ-42 более, чем в 20 раз меньше максимального (4,75 10 мл/мин) у фага ^Е/КР-8. Все бактериофаги характеризуются сравнительно невысоким процентом адсорбции. У двух из всех изученных бактериофагов адсорбция составляла :выше 70%, причём максимальный процент адсорбированного фага YE/KP-8

был 77.5%. Средний процент адсорбции 58,0%. Продолжительность латентно го периода варьирует от 10 до 65 минут. Результаты данных исследований ото бражены в таблице 7.

ТаблицаЖ

Фазы взаимодействия с >агов Y.enterocolitica с микробной клеткой.

средний % Константы ско- Латентный Средний

№ Фаги адсорбиро- рости адсорб- период, урожай на

ванного фага ции мин Клетку

10"10 мл/мин

1. YE/CB-42 53,6 0,23 ±0,018 50-55 3,1-4,0

2, YE/CB-5 65,6 2,1 ±0,9 10-15 4,2-5,7

3. YE/CB-6 72,4 0,27 ±0,15 60-65 4,1-5,9

4. YE/KP-3 47,8 3,36 ±0,48 10-15 4,2-4,6

5. YE/KP-8 77,5 4,75 ±1,08 15-20 5,1-5,6

6. YE/KP-9 31,2 0,88 ± 0,2 20-25 2,9-4,3

Таким образом, можно сделать вывод, что показатели одиночного цикла развития не могут быть использоваиы при дифференциации бактериофагов Yersinia enlerocolitica.

Исследование свободного литического фермента бактериофагов Y. enterocolitica.

Литический фермент, образующийся в бактериальной клетке, проявляется на плотной питательной среде в виде ореолов вокруг негативных колоний, обработанных хлороформом. Отмечено, что характер ореолов имеет таксономическое значение для ряда бактериофагов И.М.Габрилович (1970), Т.Ч.Жугова (1985).

Определение свободного литического фермента мы проводили по методике описанной Д.М.Гольдфарбом и В.А.Зуевым (1963) и использованной Т.Ч.Жуговой (1985). Бактериофаг титровали методом агаровых слоев. В каждом опыте измеряли по 10 негативных колоний бактериофага до и после обработки хлороформом. Для количественной оценки литической активности определяли разность между диаметром ореола, образовавшимся после хлороформирования и диаметром бляшки, определяемым до наслаивания хлороформа (величина е.). Результаты данных исследований отображены в таблице 8.

Таблица№8

Ореолообразование вокруг негативных колоний фагов Y.enterocolitica

Средний диаметр, мм ,е

№ фаги Негативных колоний Ореолов мм

I. . YE/CB-42 1,7 3,5 1,8

2. YE/CB-5 - - -

3. YE/CB-6 2,0 4,0 2,0

4. YE/KP-3 . 2,5 5,0 2,5

5. YE/KP-8 - - -

6. YE/KP-9 4,5 7,0 2,5

Образование ореолов вокруг негативных колоний отмечено у четырёх фагов. По характеру проявления литического фермента они однотипные и образуют вокруг негативных колоний ореолы средних размеров, величина е в пределах от 1,8 до 2,5 мм. Какой-либо связи между способностью образования литического фермента и типом негативной колонии (а, в, с) не отмечено.

У бактериофагов УЕ/СВ-5 и УЕ/КР-З образования ореолов вокруг негативных колоний не отмечено.

По признаку образования свободного литического фермента фаги У.етегосоНпса распределены нами в 2 группы. В первую вошли 2 фага, у которых не отмечалось образования ореолов вокруг негативных колоний. Во вторую мы отнесли остальные четыре фага, по характеру проявления свободного литического фермента они однотипны и образуют вокруг негативных колоний ореолы средних размеров, величина е находится в пределах 1,8 - 2,5мм.

Для выяснения роли бактериального хозяина и вируса в определении функции ореолообразования были изучены комбинации включающие различных хозяев и один и тот же бактериофаг и наоборот, одинакового хозяина и различные бактериофаги. Исследованные бактериофаги обладали различной величиной литической активности при использовании одного и того же хозяина. Таблица 9.

ТаблицаЛЗД

Проявление литического фермента (величена е) бактериофагов

У.егИегосоМпса в зависимости от использованного бактериального хозяина.

Л'<! Фаги Штаммы бактерий

0:4,32 0:6,30 0:6,31 0:5 0:3 0:8 0:9

1. УЕ/СВ-42 1,8 1,2 1,5 - - 1,8

2. УЕ/СВ-5 - - - - - - -

-I УЕ/СВ-6 - 2,0 2,2 - - - 1

4. УЕ/КР-З - 1,8 - - 2,5 - 1

5. УЕ/КР-8 - - - - - !

6. УЕ/КР-9 - - - - - 2,5 !

Таким образом, можно сделать заключение, что признак образования :вободного литического фермента определяется геном фага, но бактерия хозя-ш влияет на интенсивность ореолообразования на плотной среде.

В результате изучения основных свойств селекционированных нами бактериофагов У.еп1егосо1Шса установление, что они являются высоко специфичными в отношении к бактериям У.еп1егосоП11са, не отличаются между со->ой по термочувствительности, параметрам взаимодействия с чувствнтсльны-1И микробными клетками. Различаются между собой по морфологии негативах колоний, литической активности, спектру литического действия, чувстви-ельностн к хлороформу и способности образовывать свободный литический >ермеит.

В результате проведённых исследований показана возможность пепо.п,-оиания селекционированных и изученных нами фагов с целью гшшрокамия

бактерий Y.enterocolitica, результаты исследований дали возможность предложить предварительную схему фагогипирования культур Y.enterocolitica.

ВЫВОДЫ.

1. Прсдложенна схема ускоренного выделения и идентификации бактери? Yersinia enterocolitica позволяющая вести целенаправленное исследование не обнаружение возбудителя кишечного иерсиниоза в любом материале и значительно сокращающая объём и время работы до 5-ти -6-ти дней.

2. Из объектов внешней среды выделены и селекционированны 6 бактериофагов Yersinia enterocolitica.

3. Селекционированные бактериофаги Yersinia enterocolitica обладают следующими биологическими свойствами: , . .!

- образуют негативные колонии 3 типов;

-' являются термолабильными и не различаются между собой по чувствительности к температуре; .

- чувствительны к хлороформу;

- характеризуются медленной адсорбцией на чувствительных клетках, константы скорости адсорбции их составляют 0,23-4,75 10"|П мл/мин. Латентный период равен 10-65 минут. А средний урожай,на одну клетку 4,5 инфекционных центров; > . .

- обладают выраженной специфичностью они лизируют лишь штаммы данного вида и не проявляют активности против культур других родов семейства Энтеробактерий; • . ..¡.т. . •

- являются литически активными, их активность составляет по Грация от 2,4 10'6 до 4,2 10 s по Аппелеьмацу от 4,1 10"4 до 2,6 10"6.

4. На основании изученных основных биологических свойств предложен набор специфических бактериофагов доказывающий возможность идентификации бактерий Yersinia enterocolitica.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для врачей бактериологов предложены методические указания по ускоренному выделению и идентификации бактерий Y.enterocolitica, позволяющие в болёе короткие сроки поставить диагноз на заболевание кишечным иерси-ниозом.

Доказана возможность использования бактериофагов Y.enterocolitica для целей идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Померанцев Д. А., Васильев Д. A. Yersinia enterocolitica как возможный этиологический агент при желудочно-кишечных заболеваниях сельскохозяйственных животных. // Сб. науч. работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Вып 3. Ульяновск, 1998. с. 103117.

!. Васильев Д.А., Померанцев Д.А. Схема бактериологического выделения и идентификации Yersinia enterocolitica. // Методы частной бактериологии. Ульяновск, 1999. с. 147-152.

>. Нафеев А.А., Никишина Н.М., Померанцев Д.А., Васильев Д.А. Некоторые вопросы лабораторной диагностики и распространения иерсиниозов в Ульяновской области. // Сб. науч. работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Вып 4. Ульяновск, 2000. с. 16-19.

1. Померанцев Д.А., Васильев Д.А., Золотухин С.Н. Разработка ускоренной схемы выделения и идентификации бактерий вида Yersinia enterocolitica. // Сб. науч. работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Вып 4. Ульяновск, 2000. с. 19-21.

. Померанцев Д.А., Васильев Д.А., Золотухин С.Н. Биологические свойства бактериофагов Yersinia enterocolitica выделенных из объектов внешней среды. // Сб. науч. работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Вып 4. Ульяновск, 2000. с. 21-23.

. Кожаева Д.К., Померанцев Д.А. Разработка оптимальной схемы выделения Y.enterocolitica из мясопродуктов. // Сб. науч. работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Вып 4. Ульяновск, 2000. с. 23-25.

. Кожаева Д.К., Померанцев Д.А., Коритняк Б.А. Определение пороговых показателей термической инактивации бактерий 1.. monocytogenes и Y.enterocolitica. . // Сб. науч. работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Вып 4. Ульяновск. 2000. с. 32.

За последние 50 лет отмечено расширение круга микроорганизмов, которые обуславливают кишечные заболевания. Наряду с известными, хорошо изученными болезнями сельскохозяйственных животных, появляются «новые» болезни, вызываемые микроорганизмами, расцениваемыми ранее как условно патогенные. К числу таких болезней относится кишечный иерсиниоз людей и животных, возбудителем которого является бактерия Yersinia enterocolitica.

Первые сведения о возбудителе кишечного иерсиниоза получены в США, где с 1923 по 1957 год было выявлено от людей около 15 штаммов бактерий, но в то время они были отнесены к атипичным вариантам псевдотуберкулёзного микроба и не рассматривались как причина заболевания. В дальнейшем кишечный иерсиниоз как инфекционная болезнь людей появился в Западной Европе -Франции, Бельгии, Голландии, Германии, Швейцарии в 1960 году и первоначально была названа Pastenrella X. Позднее она появилась в Швеции, Финляндии, Венгрии. В последующие годы бактерию выделяли и за пределами Европе в США в 1965 году, Канаде и Южной Африке в 1966, Бельгийском Конго в 1967, Бразилии в 1969, Японии 1972, Иране 1976 году (H.H.Mollaret, 1995).

В данное время в Нидерландах, Бельгии, Германии, Канаде, Австралии иерсиниоз занимает третье место среди пищевых зоонозов, после сальмонеллё-за и кампилобактериоза (I.Bockemuhl, 1995).

В России ирсиниоз занимает второе место среди пищевых зоонозов, после сальмонеллёза, в 1993 году зарегистрировано 3876 случаев иерсиниоза или 2,6 на 100 тысяч населения (Черкасский Б.Л., Подунова Л.Г., Акулова Н.К., 1995).

Опасность иерсиниоза усугубляется чрезвычайной распространённостью возбудителя Yersinia enterocolitica в природе. Как отмечают (Ленченко Е.М., Куликовский А.П., Павлова И.Б., 1998; Собакин A.C., Зыкин А.Ф, 1998; Покровский В.И.,1986; Ющенко Г.В., 1984) бактерии Yersinia enterocolitica выделены практически от всех видов млекопитающих, птиц, рыб, земноводных, моллюсков и насекомых. Кроме того, Yersinia enterocolitica обнаружены в воде, почве, сточных водах, продуктах животного происхождения.

Широкое распространение иерсиниоза, многообразие клиники и трудоёмкость в постановке диагноза сделали актуальной проблему кишечного иерсиниоза в мировом масштабе. Изучение распространения иерсиниоза среди животных затруднено, так как эта болезнь в РФ не подлежит обязательному учёту как самостоятельная нозологическая единица. До сих пор не разработана система мероприятий по диагностике, профилактике и лечению животных, больных кишечным иерсиниозом. Фаготипирование, как один из методов диагностики, позволяет быстро и точно определить принадлежность исследуемой бактерии не только к определённому виду, но и к различным фаготипам в пределах вида. Способность иерсиний расти при низких температурах обуславливается особой биохимической адаптацией - психрофильностью, в основе неё лежит ферментативный механизм.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлась разработка ускоренного метода выделения и идентификации бактерий вида Yersinia enterocolitica.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Провести сравнительную оценку существующих методов выделения и идентификации бактерий Yersinia enterocolitica.

2) Разработать и предложить схему и методы бактериологического выделения и идентификации Yersinia enterocolitica.

3) Выделить бактериофаги Yersinia enterocolitica.

4) Изучить основные биологические свойства фагов Yersinia enterocolitica.

5) Исследовать возможность фаготипирования бактерий Yersinia enterocolitica для целей идентификации. 6

Научная новизна. Впервые в ветеринарной практике разработаны методические указания по схеме бактериологического выделения и идентификации Yersinia enterocolitica.

Впервые в ветеринарной практике выделены бактериофаги Yersinia enterocolitica для целей идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза.

Изучены основные биологические свойства бактериофагов Yersinia enterocolitica.

Доказана возможность использования бактериофагов Yersinia enterocolitica для идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза.

Практическое значение работы. Для врачей бактериологов предложены методические указания по ускоренному выделению и идентификации бактерий Yersinia enterocolitica, позволяющие в более короткие сроки поставить диагноз на заболевание кишечным иерсиниозом.

Доказана возможность использования бактериофагов Yersinia enterocolitica для целей идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза.

V Выводы.

1. Предложении схема ускоренного выделения и идентификации бактерий Yersinia enterocolitica позволяющая вести целенаправленное исследование на обнаружение возбудителя кишечного иерсиниоза в любом материале и значительно сокращающая объём и время работы до 5-ти -6-ти дней.

2. Выделены и селекционированны 6 бактериофагов Yersinia enterocolitica.

3. Селекционированные бактериофаги Yersinia enterocolitica обладают следующими биологическими свойствами:

- образуют негативные колонии 3 типов;

- являются термолабильными и не различаются между собой по чувствительности к температуре;

- чувствительны к хлороформу;

- характеризуются медленной адсорбцией на чувствительных клетках, константы скорости адсорбции их составляют 0,23-4,75 10 10 мл/мин. Латентный период равен 10-70 минут. А средний урожай на одну клетку 4,5 инфекционных центров;

- обдадают выраженной специфичностью они лизируют лишь штаммы данного вида и не проявляют активности против культур других родов семейства Энтеробактерий;

- являются литически активными, их активность составляет по Грация 2,4 10-6-4,2 10-8 по Аппелеьману 4,1 10-4—2,6 10-6.

4. На основании изученных основных биологических свойств предложен набор специфических бактериофагов доказывающий возможность идентификации бактерий Yersinia enterocolitica.

94

Заключение:

В результате изучения основных свойств селекционированных нами бактериофагов Yersinia enterocolitica установленно, что они являются высоко специфичными в отношении к бактериям Yersinia enterocolitica, не отличаются между собой по термочувствительности, параметрам взаимодействия с чувствительными микробными клетками. Различаются между собой по морфологии негативных колоний, литической активности, спектру литического действия, чувствительности к хлороформу и способности образовывать свободный лити-ческий фермент.

IV Обсуждение полученных результатов.

В последнее время всё большее значение в ветеринарной практике приобретают кишечные иерсиниозы. Лабораторная диагностика этого заболевания ещё недостаточна совершенна и в связи с этим часто возникают трудности в диагностике данного заболевания вызываемого бактериями Yersinia enterocolitica. Целью нашей работы была разработка метода позволяющего в более короткие сроки выделять и типировать данного возбудителя.

Нами было проведено сравнительное изучение ряда методов во выделению бактерий Y. enterocolitica из исследуемого материала. Цель этих исследований заключалась в выборе метода, который бы в наибольшей степени соответствовал поставленной перед нами задаче - выделению штаммов бактерий Y. enterocolitica из исследуемого материала, чтобы в дальнейшем его можно было усовершенствовать с целью сокращения сроков выделения данных бактерий.

Анализируя литературные данные мы нашли следующие методические рекомендации:

1) Иерсиниоз сельскохозяйственных животных (диагностика и профилактика). //Методические рекомендации ВАСХНИЛ. М., 1989г.

2) Эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов, организация и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятийю // Инструкция МЗ СССР от 30.10.1990г.

3) Методические указания «по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энте-робактериями» утверждёнными ГУВ МСХиП СССР 12.11.1991г.

4) Методические указания «по выявлению Y. enterocolitica и Y.pseudotuberculosis в пищевых продуктах животного происхождения» утверждёнными ДВ МСХиП РФ 23.09.1998г.

Проведя сравнительное изучение данных методик, мы пришли к выводу, что, в методических указаниях «по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» отсутствует этап холодового обогащения исследуемого материала, в качестве дифференциально-диагностической среды рекомендуется использовать агар Эндо. Такой метод бактериологического исследования материала по выделению иерсиний неприемлем и это было подтверждено нашими опытами. При смешанной кишечной инфекции прямой посев исследуемого материала на агар Эндо не позволяет обнаружить иерсинии, так как вырастает другая микрофлора. На агаре Эндо культуры бактерий Yersinia enterocolitica вообще очень сложно отличить от других энтеробактерий, так как иерсинии через 24 часа инкубации формируют очень мелкие 0,2 - 0,5 мм в диаметре колонии лактозоот-рицательных бактерий. Предлагаемый набор тестов по биохимической дифференциации бактерий на основании их ферментативных свойств: основные тесты - расщепление глюкозы, лактозы, сахарозы, маннита, мальтозы, рост на агаре Симмонса, образование индола, образование сероводорода, расщепление мочевины, разжижение желатины, дезаминирование фенилаланина и использование дополнительных - реакция с метилротом, реакция Фогес-Проскауэра, определение подвижности не позволяют точно типировать иерсинии, так как эти тесты не являются для бактерий Yersinia enterocolitica основными.

Используя методические указания «по выявлению Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis в пищевых продуктах животного происхождения», мы установили, что предлагаемая схема также имеет недостатки заключающиеся в том, что - первое, в качестве дифференциально-диагностической питательной среды для выделения возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулёза предлагаются агар с бромтимоловым синим (БТС) или агар Эндо. Сложность состоит в том, что приходится работать с материалом контаминирован-ным не только иерсиниями, но и другими видами бактерий. Недостатки агара Эндо были показаны ранее. На агаре с бромтимоловым синим, бактерии не расщепляющие мочевину в качестве питательного вещества используют глюкозу изменяя этим самым кислотность среды, на это изменение реагирует индикатор бромтимоловый синий и агар становится жёлтым, поэтому обнаружить иерсинии на изменившемся агаре становится сложнее и это делает данную среду мало пригодной для исследования. По результатам наших исследований данную среду можно с определённым успехом использовать, только при работе с чистыми культурами бактерий. Второе, предлагаемые биохимические тесты (18 штук) занимают много затрат времени и средств, что задерживает получение результатов исследования.

Методические рекомендации «иерсиниоз сельскохозяйственных животных (диагностика и профилактика)» и инструкция «эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов, организация и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий» МЗ СССР по данным наших исследований являются наиболее подходящими для выделения и идентификации бактерий вида Yersinia enterocolitica и мы с успехом ими пользовались в своих исследованиях. Но в процессе дальнейшей работы мы внесли в них ряд дополнений и изменений.

При первичной обработке любого исследуемого материала, в качестве приёма увеличивающего процент высеваемости бактерий вида Y.enterocolitica мы предложили изменить состав среды накопления солевого фосфатно-буферного раствора добавив 0,1% раствора генцианвиолета. Это позволило ин-гибировать сопутствующую грамположительную и часть грамотрицательной микрофлоры.

Для определения эффективности среды накопления с добавлением генцианвиолета проводили исследование сточных вод животноводческих хозяйств, дополнительно контаминированных штаммами Y.enterocolitica.

Проведенное сравнение наиболее часто употребляемых сред рекомендуемых для выделения бактерий Y.enterocolitica: агара Эндо, агар Серова, агар с бромтимоловым-синим (БТС).

Была изучена селективность сравниваемых сред при высеве на них фильтрата сточных вод животноводческих хозяйств дополнительно контаминированных суточными культурами иерсиний. В результате проведённых исследований мы определили, что выделить бактерии Y.enterocolitica из сточных вод можно только при помощи агара Серова. Агар Эндо полностью зарастал бактериями находящимися в сточных водах. Агар с бромтимоловым-синим (БТС) тоже зарастал, причём цвет среды из травянисто-зелёного менялся на жёлтый и обнаружить колонии голубого цвета уже не представлялось возможным.

Важно отметить, что на агаре Серова бактерии Y.enterocolitica удаётся обнаружить благодаря тому, что на данной среде у них своеобразная, отличительная от других бактерий морфология колоний. Они образовывали колонии тёмно-красного цвета, с матовой суховатой поверхностью и чуть сосцевидно-выпуклым центром, диаметр колоний составлял 2,0-5,0 мм. Колонии других видов кишечных бактерий образовывали большие, более 5,0 мм в диаметре, блестящие и яркие колонии.

Биохимическая идентификация. На основании известных биохимических свойств бактерий этого вида мы сконструировали оптимальную схему идентификации кишечного иерсиниоза до вида. За основу межродовой идентификации, внутри семейства энтеробактерий были взяты следующие тесты: расщепление мочевины, ферментация без образования газа глюкозы, ферментация арабинозы и инозита.

Внутриродовую идентификацию проводили по следующим тестам: ферментация сахарозы, целлобиозы, сорбита и отрицательные показатели ферментации рамнозы, рафинозы, мелибиозы и подвижность при 25°С.

Внутри видовую дифференциацию выделенных культур Y.enterocolitica делали с целью типирования биоваров и проводили по следующим тестам: салицин, индол, ксилоза, трегалоза.

Таким образом, предложенная схема дала нам возможность вести целенаправленное исследование на обнаружение возбудителя кишечного иерсиниоза в любом материале, значительно сокращая объём и время работы. Это позволило наработать необходимое количество штаммов Y.enterocolitica для проведения дальнейших исследований по бактериофагам.

Второй основной задачей проведённых исследований являлось выделение и изучение бактериофагов с типоспецифическими свойствами в отношении бактерий Yersinia enterocolitica с целью создания схемы внутривидовой дифференциации данных бактерий. Выделение бактериофагов проводилось из объектов внешней среды, а именно для этих целей использовались сточные воды животноводческих хозяйств. В результате нами было выделено и селекционированно 6 бактериофагов. Они были изучены по основным свойствам, могущих иметь таксономическое значение: 1) морфологии негативных колоний; 2) специфичности действия; 3) литической активности; 4) спектру литической активности; 5) температурной устойчивости; 6) чувствительности к хлороформу; 7) взаимодействию с микробной клеткой.

Изученные бактериофаги различались по морфологии образуемых на индикаторных штаммах негативных колоний. Однако, было установлено, что этот признак не является стабильным и варьирует в различных условиях. Исходя из этого, был сделан вывод, что морфология негативных колоний является незаменимым признаком при селекции отдельных штаммов бактериофагов Yersinia enterocolitica для таксономии же она играет второстепенную роль.

Изученные бактериофаги оказались высокоспецифичными и лизировали только штаммы Yersinia enterocolitica. Они проявили себя не активными в отношении 46 штаммов других представителей семейства Enterobacteriaceae. Эти данные согласуются с результатами H.MoIlaret и P.Nicolle (1965), P.Nicolle и соавт.(1967), B.Nilehn и C.Ericson (1969), Т.Ч.Жуговой (1985). По отношению к штаммом бактерий Yersinia enterocolitica бактериофаги различались спектром действия. Выделенные бактериофаги лизировали различные серовары бактерий Yersinia enterocolitica.

При изучении чувствительности бактериофагов Yersinia enterocolitica к воздействию температуры не было выявлено существенной разницы между изученными фагами по отношению к данному фактору. Все бактериофаги являются термолабильными и их инактивация начинается уже при температуре

42°С. Однако, наши опыты имеют прикладное значение. Сделан вывод о том, что несмотря на практически полную инактивацию бактериального хозяина, температурное воздействие нельзя использовать для приготовления фаговых суспензий. Термочувствительность изученных фагов соответствует данным, полученным B.Nilehn (1973) и J.Kawaoka (1982).

Изученные бактериофаги проявили различную чувствительность к воздействию хлороформа. 50% фагов проявили устойчивость к воздействию данного соединения. Следовательно, данный признак может иметь определённое таксономическое значение для изученных бактериофагов Yersinia enterocolitica. Так как часть фагов в достаточной степени (на 70-80%) инактивируется хлороформом, можно предположить наличие у этих вирусов каких-то структур содержащих липиды.

Изучение фаз взаимодействия бактериофагов Yersinia enterocolitica с микробной клеткой показало самые разнообразные параметры одиночного цикла размножения, что не может быть положено в основу классификации изученных фагов. Было выяснено, что оптимальной температурой для репродукции изученных бактериофагов является 26°С. Результаты наших опытов также подтверждают мнение P.Nicolle (1967) о том, что на константу скорости адсорбции влияет в более значительной степени инкубационная температура, чем температура адсорбционной среды.

При изучении наличия свободного литического фермента, индуцируемого в клетке бактериофагами Yersinia enterocolitica было выяснено, что два бактериофага не обладают его наличием.

Метод фаготипирования может оказаться полезным при эпидемиологическом анализе вспышек заболевания.

Представленный в настоящей работе материал представляет разработанные методы выделения и идентификации бактерий Yersinia enterocolitica из исследуемого материала.

93