Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Технология изготовления инактивированной противоящурной вакцины из новых штаммов AN1707(Армения-98) и О1 (Тайвань)

На правах рукописи Для служебного пользования , № 54 ДСП от 25.10.2000г. экз.№ /6 УДК 619:616.98:578.835.2:615.371

МИХАЛИШИН Дмитрий Валерьевич

ТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ПРОТИВОЯЩУРНОЙ ВАКЦИНЫ ИЗ НОВЫХ ШТАММОВ А№1707(Армения-98) и 01 (Тайвань)

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир -2000

Работа выполнена в ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных (ВНИИЗЖ) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации

Научный руководитель -Научный консультант-Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник ЗАХАРОВ В.М. доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник УЛУПОВ H.A. доктор ветеринарных наук, профессор РАХМАНОВ A.M. (ВНИИЗЖ, Г.Владимир)

доктор биологических наук, старший научный сотрудник ЕРЕМЕЦ В.^. (ВНИиТИБП, г.Щелково) Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВиМ, г.Покров).

Защита состоится декабря 2000 года в " Ш " часов на

заседании диссертационного совета Д 120.60.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных Минсельхоза России по адресу: 600900, г.Владимир, п/о Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ. Автореферат разослан ноября 2000 года

Ученый секретарь

диссертационного совета - Г.М.Семенова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эпизоотическая обстановка по ящуру в мире все еще остается довольно напряженной. В Российской Федерации ящур ликвидирован в конце 80-х годов. Благополучие по этому заболеванию достигнуто в значительной степени благодаря систематической вакцинации животных усовершенствованными средствами специфической профилактики.

В последние годы в Иране, Турции отмечена эпизоотия, обусловленная новым штаммом вируса типа А, который вызывал заболевание и у вакцинированных против ящура А22 животных. В 1998 году этот ящур был занесен и в Армению, при вспышке которого выделен штамм А№1707(Армения-98). Он имеет значительное отличие от производственного штамма А22, из которого готовится вакцина, применяемая для профилактики ящура в странах СНГ.

В 1997 году на Тайване получил широкое распространение среди свинопоголовья ящур типа О. При исследовании иммунобиологических свойств выделенного штамма было отмечено, что он отличается от производственного штамма, используемого для приготовления вакцины.

Вспышки ящура, вызванные типом 0,(Тайвань), отмечены в Южной Корее, Японии и России (Приморский край). В связи с этим возникла необходимость адаптации этих штаммов к системе культивирования.

Как известно, успех вакцинопрофилактики в первую очередь зависит от качества применяемых вакцин. В настоящее время в России используются сорбированные моно - и поливалентные вакцины для иммунизации КРС и MPC, а в случае прямой угрозы заноса ящура на свинофермы проводят также вакцинацию свиней, используя для этих целей эмульсионные вакцины (Дудников А.И., 1976).

Считается, что лучшими вакцинами для КРС и MPC являются сорбированные вакцины с сапонином, но они неэффективны для свиней. Эмульсионные препараты более универсальны, их можно использовать для вакцинации как свиней, так и MPC и КРС. Однако, приготовленные по типу эмульсии «вода в масле» при иммунизации КРС и MPC они вызывают значительные поражения на месте введения, а при многократном применении и аллергические реакции у привитых животных. При детальном анализе причин

появления нежелательных реакций у животных было установлено, что они зависят от качества, и свойств масляных адъювантов (Мамков Н.С., 1999). Различные адъюванты и механизм их действия описаны многими учеными.

Первым адъювантом в противоящурной вакцине был гидрат окиси алюминия, который применил Шмидт с сотр. (1936). Вальдман и Кебе (1938), Пиль (1953) показали роль химической структуры и адсорбционной активности ГОА в иммуногенности вакцин. Включение в противоящурные вакцины сапонина, как адъюванта,началось с работ Эспине (1959), Ривенсона (1958), Андреев^Е.В. с сотр.(1967).

Высокая иммуностимулирующая активность масляных эмульсий, которую установил Фрейнд (1947, 1948) привлекла внимание многих исследователей. Были показаны преимущества эмульсионных вакцин перед ГОА с сапонином в создании напряженного и продолжительного иммунитета у КРС (Леонов В.М.,1976).

В других исследованиях было отмечено, что противоящурные вакцины, способные формировать иммунитет у КРС, MPC и свиней, требуют новых методов очистки, концентрирования, инактивации вируса и подбора адъювантов. Это особенно относится к тем вакцинам, которые готовятся из штаммов вирусов, отличающихся по антигенным свойствам от производственных штаммов.

Цель научных исследований. Главной целью наших исследований явилась адаптация вновь выделенных штаммов вируса ящура А№1707 (Армения-98) и Oí (Тайвань) к системе репродукции и разработка промышленной технологии производства противоящурных вакцин с высокими иммунобиологическими свойствами, способных формировать иммунитет у КРС, MPC и свиней.

Для осуществления этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- адаптировать вновь выделенные штаммы вируса ящура А№1707 (Армения-98) и (^(Тайвань) к системе культивирования;

- отработать метод культивирования этих штаммов в промышленных масштабах;

- усовершенствовать метод очистки вируссодержащих суспензий для получения инактивированных вакцин;

- отработать режим инактивации вируса ящура, обеспечивающий сохранение 146S компонента и безопасность полученных препаратов;

- подобрать адъюванты, обеспечивающие получение иммуногенных и умеренно реактогенных вакцин;

- испытать иммуногенную эффективность полученных вакцин из этих штаммов в лабораторных условиях;

- провести испытание иммуногенности вакцин в производственных условиях; I

- разработать технологию получения сорбированной вакцины из новых штаммов;

- разработать технологию получения эмульсионной вакцины;

- изучить иммунобиологические свойства сорбированных и эмульсионных вакцин в лабораторных и производственных условиях;

- изучить сохраняемость 146S компонента вакцин в процессе хранения.

Научная новизна. Разработана технология изготовления противоящурных

инактивированных вакцин из новых штаммов вируса А№1707, О^Тайвань), формирующих напряженный иммунитет у КРС, MPC и свиней. Выделенные штаммы вируса ящура адаптированы к системе культивирования, разработан режим их культивирования в культуре клеток для промышленного изготовления вакцин.

Усовершенствован способ очистки и концентрирования антигена.

Отработан режим инактивации вируса ящура новых штаммов А№1707(Армения-98) и 0( (Тайвань).

Обоснована целесообразность использования полиакриловой кислоты (ПАК) как адъюванта при производстве высокоэффективной вакцины их этих штаммов вируса. Изучена иммуногенная эффективность вакцин. Определена эффективность адъювантов в составе противоящурных вакцин. Изучена сохраняемость эмульсионных вакцин.

Научная новизна подтверждена двумя патентами РФ №2143921, №2140452 и положительным решением на предполагаемый патент.

Практическое значение работы. Полученные результаты вошли в подготовленные нормативно-технические документы, которые одобрены ученым советом ВНИИЗЖ и утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза России;

1. Регламент по изготовлению и контролю вакцины против ящура эмульсионной моно- и поливалентной, утвержден директором института.

ТУ-9384-008-00495527-99. Вакцина против ящура эмульсионная моно- и поливалентная для профилактики ящура свиней (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21), утвержденный Департаментом ветеринарии.

2. -Регламент по изготовлению и контролю вакцины против ящура универсальной сорбированной моно- и поливалентной, а также сорбированной моно- и поливалентной утвержден директором института.

ТУ-9384-009-00495527-99. Вакцина против' ящура универсальная сорбированная моно- и поливалентная (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21), ТУ-9384-007-00495527-200. Вакцина против ящура сорбированная моно- и поливалентная (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21), утвержденные Департаментом ветеринарии.

Разработаны методические указания по изготовлению и контролю лротивоящурной вакцины с полиакриловой кислотой в качестве адъюванта, которые рассмотрены на ученом совете и утверждены директором ВНИИЗЖ. Оптимизированы условия культивирования штаммов вируса ящура А№1707 (Армения-98) и Oí (Тайвань) в суспензионной культуре ВНК-21.

Вопросы, выносимые на защиту.

1. Технология изготовления эффективной противоящурной вакцины из штаммов А№ 1707 (Армения-98) и Oí (Тайвань) вируса ящура.

2. Оптимизация условий культивирования эпизоотических изолятов вируса ящура.

2. Подготовка новых производственных штаммов для изготовления вакцин.

3. Методы очистки, концентрирования, инактивации штаммов вируса А№1707 (Армения-98) и От (Тайвань).

4. Способ изготовления противоящурной вакцины с ПАК в качестве адъюванта.

5. Эффективность разработанных вакцин против новых изолятов вируса ящура.

Публикация научных исследований. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, получено два патента и одно положительное решение на предполагаемый патент.

Материалы диссертации докладывались на Всероссийской научно-практической конференции (г.Щелково, 2000 г.), Международной научно-практической конференции (г.Минске, 2000г.) , на ученых советах ВНИИЗЖ в 1998-2000гг.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.

Диссертация иллюстрирована 29 таблицами. Список литературы включает 400 источников, из них иностранных - 222.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Вирусный материал и подопытные животные Штаммы вируса ящура. Экспериментальную работу проводили с использованием следующих типов и штаммов вируса ящура:

-культуральный вирус ящура 01№194, О^Тайвань), С>1№1734 (Уссурийский), А2г№550, Агг№1707 (Армения -98), репродуцированные в суспензии клеток ВНК-21, 5-6 пассажей каждый.

При проверке активности вакцин на морских свинках использовали адаптированные к ним штаммы вируса С>1№194, А2г№550.

При проверке активности вакцин на свиньях использовали адаптированные к свиньям вирусы С>1№194, А2г№550, А22№1707(Армения-98), О^Тайвань, 01№1734 (Уссурийский). 1

Подопытные животные. В опытах использовали следующих животных: -морских свинок, массой 450-500г для контроля иммуногенности вакцин; -КРС не моложе 18 месяцев, массой не менее 250 кг из благополучных по ящуру зон страны, где в течение последних двух лет не проводили вакцинацию против ящура;

-свиней крупной белой породы, массой 30-50кг из благополучных по ящуру

зон.

Приготовление суспензий вируссодержащего материала. Суспензию клеток после замены ростовой среды заражали посевным вирусом из расчета 0,5-0,001 ТЦД50 на клетку. Время инкубации составляло 10-19 часов. При гибели 90-95% клеток в рубашку культиватора подавали хладоагент и охлаждали суспензию до 4-6°С.

Очистка вируссодержащих суспензий. Вируссодержащую суспензию культурального вируса очищали с помощью МЦ в конечной концентрации 0,0070,02% с добавлением 0,2% хлороформа и эту смесь отстаивали для седиментации флокулированных белков в течение 24-48 часов. Надосадочную жидкость использовали в работе.

Концентрирование вируса и антигена. Концентрирование антигена осуществляли сорбцией на аэросиле, ГОА, полиэтиленгликолем и ультрфильтрацией.

Концентрирование сорбцией проводили следующим образом: к антигену рН 7,4-7,8 добавляли сорбент, смесь тщательно перемешивали и отстаивали в течение 12-28 часов. Надосадочную жидкость удаляли после центрифугирования или отстоя. При концентрировании ПЭГом его добавляли к антигену в количестве 8% и выдерживали при температуре 4-8°С 18-20 часов. По истечении указанного времени смесь центрифугировали. Осадок ресуспензировали в буферном растворе рН 7,4-7,8.

Концентрирование ультрафильтрацией осуществляли на установке ВНИИЗЖ с использованием трубчатых фильтров БТУ 0,5-2,0.Кратность концентрирования составляла 5-20 раз по объему.

Изготовление сорбированных вакцин. Лабораторные образцы вакцины готовили с целью контроля иммуногенной активности. Антиген после очистки и инактивации смешивали с сорбентом в отношении 2:1, после отстаивания сливали надосадочную жидкость в количестве, равном объему сорбента. Сапонин вносили до конечной концентрации 0,05%.

Производственные серии вакцины компановали согласно количеству 146Б компонента. При этом в прививном объеме вакцины должно содержаться не менее 6 мкг 1463 компонента каждого типа.

Изготовление эмульсионных вакцин. Эмульсионные вакцины готовили, смешивая равные количества суспензии антигена и масляного адъюванта, смесь эмульгировали на приборе «Эмульсор» двукратно или на коллоидной мельнице.

Контроль иммуногенности вакцин. При определении иммуногенности вакцин руководствовались ТУ 9384-007-00495527-200 «Вакцина против ящура сорбированная моно-и поливалентная (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21)», ТУ 9384-008-00495527-99 «Вакцина против ящура эмульсионная моно-и поливалентная для профилактики ящура свиней (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21)».

Контроль вакцин. Контроль эмульсионной и сорбированной форм противоящурных вакцин из штаммов А№1707 (Армения-98) и О1 (Тайвань) осуществляли определением стабильности, полноты инактивации, безвредности, антигенной и иммуногенной активности полученных препаратов.

Определение стерильности общей пробы вакцины проводили в соответствии с ГОСТом 280085-89 «Препараты биологические. Методы

бактериологического контроля стерильности». Вакцину считали стерильной при отсутствии роста микрофлоры в посевах.

Проверку на полноту инактивации осуществляли на культуре клеток СП путем заражения в 3-х последовательных пассажах. Отсутствие цитопатических изменений монослоя подтверждало авирулентность инактивированных препаратов.

Проверка на безвредность. Контроль вакцины на безвредность проводили в соответствии с ТУ 9384-007-00495527-200 и 9384-008-00495527-99.

За вакцинированными животными вели наблюдение в течение 10 дней. Вакцину считали безвредной, если все животные в течение указанного времени оставались клинически здоровыми и на месте введения вакцины не было чрезмерной воспалительной реакции.

Статистическая обработка результатов исследований. Для обработки результатов исследований использовали статистические методы, предложенные Кербером и модифицированные И.П.Ашмариным (1962), и применяемые в биологии.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка технологий изготовления эффективных противоящурных вакцин из инактивированных штаммов А№1707 (Армения-98) и 01 (Тайвань).

Культивирование вируса ящура штаммов А№1707(Армения-98) и О^Тайвань). В августе 1998 года патологический материал в виде эпителия афт КРС, полученный из хозяйств Амасийского района Армении, поступил в Региональную справочную лабораторию МЭБ по ящуру (ВНИИЗЖ) для проведения лабораторной . диагностики и идентификации выделенного возбудителя.

Из доставленного во ВНИИЗЖ патологического материала был выделен штамм вируса ящура , получивший название А№1707 (Армения-98). Методом прямого секвенирования в ПЦР первичной структуры гена и белка \/Р1 было установлено, что исследуемый изолят существенно отличается от всех выделенных ранее штаммов вируса, в том числе и от вируса А22, используемого в настоящее время в России и других странах СНГ для производства средств диагностики и специфической профилактики (В.М.Захаров и сотр., 1998).

В связи с этим необходимо было адаптировать штамм к суспензионной культуре клеток ВНК-21, оптимизировать процесс культивирования вируса в промышленном масштабе, изучить влияние режима инактивации, очистки на иммунизирующий антиген, изготовить вакцину и испытать её эффективность для восприимчивых животных. Вирус был освежен путем однократного пассирования на КРС, после чего адаптирован к перевиваемым клеткам ПСГК-30 и ВНК-21. Результаты адаптации представлены в таблице 1.

Таблица 1

Биологические свойства вируса ящура штамма А №1707

«Армения-98»

Система Время Кол-во Титр Вирусный белок

репродукции культиви- адапта- инфекцион- ОВБ 146 +75S

вируса рования ционных ности мкг/мл мкг/мл

М пассажей 1дТЦД5С/мл

19,0 2 7,25 0,23 -

ПСГК-30 19,0 3 8,25 0,33 -

19,0 4 7,25 0,43 -

19,0 5 7,5 0,4 -

М ±т 19+0 - 7,56±0,237 0,35±0,044

р<0,001 р<0,005

ВНК-21 16 1 7,25; 2,3; 1,61;

суспензион- 16,5 1 8,0; 2,6; 1,82;

ная КС-40 17,0 1 7,75 2,5 1,75

16,0 1 8,0; - -

16,0 1 8,0; - -

16,0 1 8,0 - -

М±т 16,25±0,196 7,83±0,12 2,46 ±0,09 1,72±0,05

р<0,001 р<0,001 р<0,005 р<0,001

ВНК-21 17,5 2 7,5; 2,24 1,21

суспензион- 17,5 2 8,0 2,29 1,33

ая КМ-2000 16,0 2 7,75 3,3 2,20

М±т 17,0+0,5 7,75+014 2,61 +0,34 1,58+0,31

р<0,001 р<0,001 р<0,025 I р<0,05

В суспензионной культуре клеток ВНК-21 в реакторах КМ-2000 за 17 часов

культивирования получали 2,61 мкг/мл общего вирусного белка , в том числе 1,58 мкг/мл 146+75Э компонентов, что экономически оправдывало получение эффективной вакцины.

В Приморском крае в апреле 2000г. диагностировали ящур среди свиней. Из доставленного во ВНИИЗЖ патологического материала был выделен штамм вируса ящура, идентичный штамму 01(Тайвань). Проведенные исследования в институте показали, что О^Тайвань) значительно отличается по иммунобиологическим свойствам от производственного штамма С>1№194.

Штамм был освежен на крупном рогатом скоте и адаптирован к монослойной культуре клеток ПСГК-30, а затем к суспензионной культуре клеток ВНК-21. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2

Биологические свойства вируса ящура штамма (^Тайвань

Система репродукции вируса Время культивирования (ч) Кол-во адаптационных пассажей Титр инфекцион-ности 1дТЦЦ¡//мл Вирусный белок

ОВБ 146..+75S

ПСГК-30 24 1 7,0 0,95

20 - 2 7,25 0,6

16,5 3 7,5 0,62 0,54

16,5 4 6,25 0,57

16,5 5 7,25 0,71

М±т 18,7±1,488 р<0,001 7,05+1,504 р<0,010 1 0,69±0,069 р<0,001

ВНК-21 суспензионная КС-40 24 1 7,0; 0,78 0,27

17,5 1 7,5; 1,1 0,46

17,5 1 7,5; 1,23 0,51

15,5 1 7,75; 1,95 1,65

16,0 1 7,5; 1,27 0,42

17,0 1 7,75; 2,07 1,62

М±т 17,9±1,261 р<0,001 7,5±0,112 р<0,001 1,4+0,206 р<0,005 0,82±0,253 р<0,025

ВНК-21 суспензионная КМ-2000 10,5 2 6,75 0,87 0,63

7,0 2 7,0 1,0 0,42

8,0 2 7,25 2,47 0,73

7,0 2 7,5 1,51 0,62

М±т 8,1+0,82 р<0,005 7,12+0,84 р<0,005 1,46 ±0,36 р<0,05 0,6 +0,06 р<0,005

Данные таблицы 2 показывают, что вирус адаптировали к культуре клеток ПСГК-30 в течение 3 последовательных пассажей. При культивировании в суспензии в аппаратах КС-40, где в качестве посевного вируса был вирус, полученный на монослое клеток ПСГК-30, выход 146+75Э компонента составил 58,6%.

Культивирование вируса в промышленных масштабах КМ-2000 показывало, что в тех случаях, когда посевным материалом служил вирус, полученный в суспензии клеток ВНК-21, то выход 146+753 компонента достигал

41%. В то же время для приготовления качественных вакцин необходимо иметь сырье с содержанием не менее 1 мкг/мл 146+753 компонентов.

Для повышения выхода иммунизирующего компонента испытывали уменьшенные дозы посевного вируса при заражении клеток. В первых опытах для заражения использовали вирусный материал, полученный в монослое клеток ПСГК-30. Результаты исследований представлены в таблице 3. Опыты провели с вирусом типа О1 (Тайвань).

Таблица 3

Оптимизация дозы заражения при культивировании вируса ящура

типа О1 (Тайвань) в суспензии клеток ВНК-21

№ п/ п Характеристика предпосевного вируса Доза заражения ТЦЦ/К1т Время культивирования М Титр инфекци-онности 1дТЦЦ50/мл ОВБ (мкг/мл) 146 +75Э компонент (мкг/мл) Выход 146+755 в%

1 6пПСГК-30 титр инфек. -7,0 1д ТЦДго/мл ОВБ -0,73мкг/мл 0,3 12 7,25 2,32 0,89 38,2

0,5 12 7,0 2,09 0,8 38,2

0,05 18,5 6,75 3,35 1,79 53,3

0,01 18,5 7,25 3,44 1,61 46,7

0,01 18 7,25 2,2 1,57 71,3

0,005 17,5 8,0 2,21 1,45 75,8

0,001 14 7,75 2,5 0,85 32

Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что с уменьшением дозы заражения в 10-30-100 раз увеличился процент выхода 146+753 компонентов до 75,8%. В то же время снижение дозы заражения увеличивало время культивирования. Оптимальная доза заражения находилась в пределах 0,010,005 ТЦЦ50 на клетку. Однако при культивировании вируса в объеме КМ-2000 трудно подготовить достаточное количество монослойного вируса, необходимого для заражения клеток.

В дальнейшем были проведены опыты по использованию посевного вируса, полученного в суспензионной культуре клеток ВНК-21. Посевной вирус получали в аппаратах КС-40 и использовали для заражения суспензии клеток в реакторах КМ-2000. Результаты исследований по подбору дозы заражения вирусом ящура О^Тайвань) представлены в таблице 4.

Таблица 4

Влияние дозы заражения вируса О^Тайвань) на выход вирусного белка при

культивировании

№ л/ф Характеристика посевного вируса Доза заражения, ТЦДц/кл Время культивирования (ч) Компонентный состав, мкг/мл % выхода 146+75S компонен та

ОВБ мкг/мл 146+75S мкг/мл

49 суспензионный 0,05 10 2,13 1,22 57,3

52 -«- 0,05 11 2,69 1,07 39,7 .

53 -«- 0,005 9 2,86 1,33 46,4

54 -«- 0,001 14 2,50 0,65 26,0

55 -«- 0,02 9 2,52 0,76 30,3

Данные таблицы 4 показывают, что оптимальной является доза заражения в пределах 0,05-0,005 ТЦД5о/кл. Процент выхода 146+75S компонента при дозе заражения 0,05 ТЦД50/КЛ не отличался от результатов, когда заражение проводили монослойным вирусом. В целом, уменьшение дозы заражения в 10 раз снижает количество используемого посевного вируса, поэтому

небольшие объемы его можно быстро замораживать и хранить в оптимальных условиях.

Оптимизация режима инактивации штаммов при изготовлении вакцин

При изготовлении противоящурных вакцин использовали различные методы инактивации вируса.

Данные литературы по инактивации вируса азиридинами свидетельствуют о том, что эти вещества инактивируют инфекционность по реакции первого порядка без существенного повреждения иммуногенных свойств вируса (Улупов H.A., 1998).

В наших опытах использовали вирус ящура шт. А№1707(Армения-98) и О^Тайвань), выращенный в суспензионной культуре клеток, который инактивировали аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ). Сравнивали вирулицидную активность АЭЭИ в зависимости от температуры инкубации при постоянном времени инактивации 24 часа.

Данные таблицы 5 показывают, что с увеличением температуры инактивации до 37°С вирулицидная активность АЭЭИ увеличилась для вируса ящура Oi (Тайвань) в 4 раза, а для вируса А№1707(Армения-98) - в 3,9 раза.

Существенных различий инактивирующего действия испытанных концентраций для различных типов вируса ящура не обнаружено.

Таблица 5

Влияние температуры инактивации на вирулицидную активность АЭЭИ

Температура К so (%)

инактивации (°С) О) (Тайвань) ANs 1707 (Армения-98)

36-37 0,0005 0,0004

0,0012 0,0012

0,0009 0,0008

М+т 0,000910,0002 0,0008±0,0002

р< 0,050 р< 0,050

27-28 0,0050 0,0035

0,0030 0,0050

0,0029 0,0040

М+т 0,0036±0,0007 0,0031±0,0009

р< 0,025 р< 0,050

Кроме того, нами была испытана вирулицидная активность АЭЭИ при температуре 37°С в зависимости от времени инактивации. Данные опытов приведены в таблице 6.

Таблица 6

Влияние времени инактивации на вирулицидную активность АЭЭИ

Время К50 (%)

инактивации (ч) Ог (Тайвань) А №1707(Армения-98)

24 0,0015 0,0014

0,0008 0,0009

0,0011 0,0012

М±т 0,0015±0,0001 0,0012+0,0001

р< 0,010 р< 0,010

12 0,0027 0,0031

0,0030 0,0030

0,0025 0,0025

М±т 0,0027+0,0001 0,0029±0,0001

р< 0,010 р< 0,010

Результаты, представленные в таблице 6, показывают, что с увеличением времени инактивации при постоянной температуре вирулицидная активность АЭЭИ возрастала для типа О в 1,8 раза, а типа А - в 2,4 раза.

Оптимизация условий очистки вируссодержащей суспензии Основным реагентом при очистке в промышленных условиях вируссодержащих суспензий вируса ящура остается хлороформ. Наряду с хлороформом для очистки вируса в наших опытах был использован высокомолекулярный полигуанидин (полигексометиленгуанидин), позволяющий повысить качество очистки культурального вируса. Результаты проведенных в этом направлении опытов представлены в таблице 7.

Данные таблицы 7 показывают, что увеличение концентрации МЦ от 0,001% до 0,0075% не снизило титр инфекционности вирусов ящура А№1707(Армения-98) . Однако произошло снижение титра инфекционности после обработки 0,0075% МЦ вируса О^Тайвань) на 0,92 1д.

Таблица 7

Влияние полигексаметиленгуанидина на инфекционные свойства

культурального вируса ящура

Тип Титр инфекционности вируса (1дТЦЦ/мл) в суспензии, обработанной

вируса ПГ в концентрации (%):

до очистки 0,001 0,005 0,0075

Аи07 7,13 7,25 7,5 7,25

(Армения) 7,50 7,50 7,25 7,5

7,23 7,0 7,18 7,13

7,33 7,31 7,25 7,33

М±т 7,29±0,0798 7,26±0,1031 7,29±0,0620 7,30±0,0776

р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001

о. 7,5 7,25 6,75 6,0

(Тайвань) 7,25 7,0 6,5 6,0

6,75 7.25 6,25 6,25

М±т 7,17±0,2205 7,17±0,0833 6,5±0,1443 6,25±0,1443

р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001 р< 0,001

В наших опытах очистку вирусодержащей суспензии МЦ проводили перед инактивацией. Однако, было замечено, что наибольший флокулирующий эффект балластных белков наблюдается, когда МЦ вносится в суспензию после окончания культивирования вируса, а затем добавляется АЭЭИ и 0,2% хлороформа.

В следующих опытах необходимо было выяснить, как влияет разработанный метод очистки на иммунизирующий компонент штаммов А№1707(Армения-98) и О^Тайвань). Результаты исследований представлены в таблице 8.

Таблица 8

Результаты очистки полуфабрикатов вируса ящура А№1707(Армения-98) и

О^Тайвань) полигуанидином перед инактивацией

Тип вируса Количество вирусного белка (мкг/мл) после

культивирования очистки и инактивации

ОВБ 146 +753 ОВБ 146. +75Э

А№1707 2,10 1,50 2,0 1,50

(Армения-98) 1,60 1,00 1,40 1,0

А9 1,90 1,30 1,70 1,10

М±т 1,87 ±0,145 1,27 ±0,145 1,7 ±0,226 1,20 ±0,153

р<0,010 р<0,025 р<0,025 р<0,025

О! (Тайвань) 0,91 0,45 0,83 0,45

- 1,13 0,65 0,98 0,30

1,04 0,55 1,10 0,25

М±т 1,03 ±0,064 0,55 ±0,058 0,97 ±0,078 0,33 ±0,060

р<0,005 р<0,025 р<0,010 р<0,050

Установлено, что в результате очистки вируса О^Тайвань) перед инактивацией снижалось количество 146Э компонента. В последующих опытах установили, что для вируса О1 (Тайвань) необходимо вносить МЦ после инактивации в охлажденную суспензию.

Для этого были проведены опыты по очистке этих вирусов полигуанидином после инактивации и охлаждения суспензии. В этом случае снижение 146Б компонента не наблюдали. Результаты опытов представлены в таблице 9.

Таблица 9

Результаты очистки вируссодержащей суспензии вируса ящура А№1707

(Армения-98) и О! (Тайвань) полигуанидином после инактивации

Тип вируса Количество вирусного белка (мкг/мл) после

культивирования очистки и инактивации

ОВБ 146 +75Э ОВБ 146 +753

А№170 7 2,10 1,50 1,91 1,49

(Армения-98) 1,60 1,00 1,53 1,11

1,90 1,30 1,65 1,21

М+т 1,87 ±0,145 1,27 ±0,145 1,7+0,112 1,20 ±0,114

р<0,010 р<0,025 р<0,005 р<0,010

О, (Тайвань) 0,91 0,45 0,89 0,55

1,13 0,65 0,91 0,50

1,04 0,55 1,10 0,64

М±т 1,03 ±0,064 0,55 ±0,058 1,0 ±0,071 0,56 +0,073

р<0,005 р<0,025 р<0,010 р<0,025

Как видно из результатов, представленных в таблице 9, количество 1465+753 компонента вируса О1 (Тайвань) после очистки практически не снизилось. В последующей работе очистку вируса ящура (^(Тайвань) проводили после инактивации и охлаждения до 4-6°С.

Усовершенствование способа концентрирования вируса. При концентрировании вируссодержащей суспензии способом ультрафильтрации в концентрате остаются все балластные белки. Присутствие этих белков в вакцине вызывает повышенную аллергенность и реактогенность препарата, к тому же они затрудняют изготовление эмульсионных вакцин.

В наших опытах для очистки концентратов, полученных после ультрафильтрации, использовали полигуанидин. Результаты опытов обобщены в таблице 10.

г Таблица 10

Результаты очистки концентрированного ультрафильтрацией вируса

ящура полигуанидином в производственных условиях

Тип вируса ящура № полуфабрикатов Кратность концентрирования (разы) ОВБ/146 +75Б мкг/мл в неочищ. концентрате ОВБ/146 +753 мкг/мл в очищенном концентрате % потерь ОВБ/146Э+758 после очистки

0-|№194 35 4,0 1,43/1,28 5,75/5,27 нет/нет

о. 59 10 1,74/0,8 17,0/8,5 2,3/нет

(Тайвань) 60 10 1,64/0,66 16,0/6,7 2,44/нет

69 10 1,91/0,7 19/7,1 0,52/нет

74 12 2,3/0,66 25,9/11,0 нет/нет

А№1707 81 5 2,81/2,24 13,79/10,97 1,85/3,66

(Армения- 88 5 1,61/1,14 7,81/5,53 2,98/2,98

98) 89 10 1,50/1,10 14,94/10,58 0,4/3,82

95 10 1,72/1,56 16,39/14,99 4,7/3,91

97 10 1,81/1,68 18,71/16,46 нет/2,02

Данные, представленные в таблице 10, показывают, что потери пру очистке концентратов полигуанидином не превышают 4,7% по общему вирусному белку и 3,9% по 146+753 компоненту.

Наиболее экономичным и щадящим методом концентрирования вирусоЕ является адсорбция на твердых сорбентах. В наших опытах для адсорбцм использовали гель гидрата окиси алюминия (ГОА). Концентрирование проводил!-

в присутствии ПЭГ. Вируссодержащую суспензию штамма А№1707 (Армения-98) адсорбировали до инактивации при температуре 8-10°С и рН 7,4-7,7.

В опытах установлено, что адсорбция вируса ящура в присутствии ПЭГ идет неэффективно, практически ГОА не снижает потери при адсорбции. Уровень осаждения ПЭГ остается главным и присутствие сорбента не увеличивает степень адсорбции вируса.

Метод адсорбции, несмотря на простоту исполнения и высокую эффективность, имеет отрицательную сторону. Процесс адсорбции является неспецифическим по отношению к вирусу. На твердых сорбентах адсорбируются все белковые молекулы в порядке их молекулярных масс. Так как количество вирусных частиц, по сравнению с клеточными белками, ничтожно мало, то основная масса адсорбированного белка представлена балластным клеточным белком. Этот белок повышает аллергенность вакцины и препятствует реализации вирусного белка. Нами были проведены опыты по отмывке концентрированного вируса, полученного методом адсорбции.

Для этого после адсорбции вируса на твердых сорбентах образцы центрифугировали, надосадочную жидкость удаляли и вносили до исходного уровня отмывочный раствор. Образцы интенсивно ресуспензировали и опять центрифугировали, затем процесс повторяли (всего трехкратно). В надосадочной жидкости исследовали общий вирусный белок и балластный в каждом смыве. Работу проводили с вирусом ящура А№1707 (Армения-98) и О^Тайвань). Отмывку концентратов проводили 0,05М ацетатным буфером рН-7,0-7,4 и дистиллированной водой. Антиген концентрировали до получения 7-8 мкг 1463+755 компонента в прививной дозе.

При анализе проведенных опытов отмечено, что в результате смывов осадка ГОА десорбции вирусного белка с сорбента не происходит.

Однако балластный белок удаляется значительно больше при использовании дистиллированной воды, чем при использовании 0,05М ацетатного буфера. Дополнительная очистка при использовании ацетатного буфера составила 60,2%, а при применении дистиллированной воды -87,4%.

Технология получения инактивированных сорбированных вакцин из штаммов А№1707 (Армения-98) и О^Тайвань). Известно, что высокомолекулярные синтетические полиэлектролиты при введении вместе с

антигенами в организм усиливают иммунный ответ, т.е. обладают адъювантным действием.

Из литературных источников (Петров Р.В. и др., 1983) известно, что эффективность ПАК зависит от молекулярной массы и количества в прививном объеме. Мы испытывали ПАК с различной молекулярной массой: 0,87ЮбД; 1,07ЮбД; 1,18Ю6Д; 1,40106Д; 4,010еД.

Определение адъювантной активности ПАК проводили на взрослых белых мышах. Ввиду того, что не было вируса штаммов А№1707 (Армения-98) и О^Тайвань), адаптированного к мышам, в качестве модели использовали производственный вирус Агг№550 и гомологичный индикаторный вирус, адаптированный к белым мышам.

Была приготовлена авирулентная очищенная суспензия культурального вируса ящура А2г№550, содержащая 1,74 мкг/мл , 146+75Б компонентов, из которой сделали разведения на фосфатно-буферном растворе: ц; 1:3; 1:9 и 1:27. В образцы цельной и ' разведенной суспензий добавляли ПАК до конечной концентрации, равной 0,01%. Приготовленными образцами вакцинировали мышей массой 18-20г в дозе 0,5 мл подкожно. Контролем служила эта же суспензия, в которую вместо ПАК вносили буферный раствор. Мыши получали адъювант в количестве 2,5-2,8 мг/кг.

Через 15 дней после вакцинации мышей заражали адаптированным вирусом ящура в дозе 104 ЛД5о/мл и через 7 дней проводили учет результатов и рассчитывали ИмД5о в мл по формуле Кербера в модификации Ашмарина. Результаты опытов обобщены в таблице 11.

Таблица 11 Определение адъювантной активности ПАК

Ызп/п Молекулярная масса ПАК ИмД5о/мл

1. 0,87- 10ЬД 0,08

2. 1,07-10ьД 0,13

3. 1,18-10ьД 0,15

4. 1,40-10ьД 0,10

5. 4,0-10ЬД 0,15

6. Контроль без ПАК 0,17

Результаты исследований, представленные в таблице 11, показали, что наибольшей адъювантной активностью обладала ПАК с М.м. '870 000 Д.

Иммуногенная активность вакцины с ПАК была в 2 раза выше контрольной. В следующих опытах на крупном рогатом скоте использовали ПАК с М.м. 900 000Д.

В связи с тем, что рН водных растворов ПАК равняется 3,0 , а рН готовых вакцин должен быть в пределах 7,4-7,8, ПАК перед применением подщелачивали до рН, равной 7,0-7,2. При этом вязкость раствора увеличивалась в десятки раз.

Опытным путем установили, что концентрация ПАК в вакцине не может превышать 3%, в противном случае вязкость вакцины становится неприемлемой для введения.

Учитывая вышесказанное, мы разработали способ изготовления вакцины, который заключается в следующем: 1) очистка инактивированного антигена флокулянтом ПГ; 2) концентрирование с помощью минимального количества ГОА; Занесение в концентрированный антиген ПАК до концентрации 3%.

Была изготовлена моновалентная вакцина, содержащая в прививной дозе 2мл: 60 мг ПАК, 40 мг ГОА и бмкг 146+75S компонентов. Вакциной привили 5 голов КРС массой 200-300 кг, т.е. доза ПАК равнялась 0,2-0,3 мг/кг. Несмотря на то, что такая концентрация ПАК в литературных источниках даже не упоминалась в качестве иммуностимулирующей, в нашем опыте она стимулировала выработку антител до уровня, достаточного для защиты животных при контрольном заражении.

В последующем испытали эффективность сорбированной вакцины из вируса А№1707 (Армения-98), содержащей различное количество антигена и постоянное количество ПАК, равное 150 мг в прививной дозе 5мл.

Антигена (146+75S компонентов) в одной прививной дозе вакцины было 2,9мкг, ею привили подкожно 2 головы КРС. Вторая вакцина содержала 5,8 мкг, ею привили 3 головы КРС подкожно. ВНА исследовали через 10 и 21 день после вакцинации. Через 21 день провели контрольное заражение афтозным вирусом А№1707 (Армения-98) в дозе Ю4ИД50 в объеме 0,2 мл в две точки слизистой оболочки языка. Наблюдение за животными вели в течение 7 дней.

Иммунный ответ КРС по титру ВНА в сыворотке крови свидетельствует о том, что при одинаковом количестве адъюванта величина титров ВНА различалась на столько, на сколько различалось количество антигена в вакцине, т.е. в два раза. Устойчивость КРС к заражению афтозным вирусом ящура была одинаковой у всех животных. Все привитые КРС при контрольном заражении противостояли развитию генерализованной формы ящура. Следовательно,

вакцина, содержащая в прививном объеме 2,9 мкг антигена и 150 мг адъюванта, защищала животных при контрольном заражении.

В следующих опытах сравнивали иммунный ответ КРС на вакцины с ПАК и сапонином в качестве адъювантов. В опыте использовали 10 голов КРС. Первую группу в количестве 5 голов прививали бивалентной вакциной, содержащей 2% ГОА, 0,075% сапонина и по бмкг 146+75S компонентов каждого типа. Вторую группу вакцинировали бивалентной вакциной, содержащей 2% ГОА, 3% ПАК и по 6 мкг 146+75S компонентов по каждой валентности. Животных прививали подкожно в дозе 2 мл. Сыворотки крови на наличие ВНА исследовали через 10, 21, 32, 41, 51 день после вакцинации. Результаты исследований в течение 51 дня показали, что уровень ВНА после прививки вакциной, содержащей ПАК, выше, чем после иммунизации вакциной с сапонином как по типу А, так и по типу О.

Технология получения стабильных эмульсионных вакцин из новых штаммов. Высокая эффективность эмульсионных противоящурных вакцин показана многолетними исследованиями.

Разработанный во ВНИИЗЖ масляный адъювант дает эмульсию типа «вода в масле», сохраняющую свою стабильность и фракционный состав в течение 2 лет (срок наблюдения). Для получения вакцин с таким типом эмульсий был разработан производительный аппарат «Эмульсор» , с помощью которого устранялись недостатки, присущие коллоидной мельнице при изготовлении эмульсий.

В 1998 году институт закупил партию масляных адъювантов ISA-70 и ISA-206фирмы «Сеппик» (Франция), которые мы использовали в своих исследованиях.

Адъювант ISA-70 стерилизовали при 121°С в течение 1 часа. Режим изготовления эмульсий отрабатывали на аппарате «Эмульсор» с соотношением водной и масляной фаз 50:50 и 40:60. Стабильность эмульсий определяли центрифугированием со скоростью 3000 об./мин в течение 20 минут и хранением при температуре 37°С в течение 14 суток.

Установлено, что с помощью аппарата «Эмульсор» при однократном цикле эмульгирования стабильные эмульсии были получены только при использовании масляного адъюванта ВНИИЗЖ.

Стабильные эмульсии с адъювантом ISA-70 получили только при двукратном цикле эмульгирования и скорости протока 700 л/ч. Оптимальным соотношением фаз при смешивании было 40% водного антигена и 60% масляного адъюванта.

Для изготовления сложных эмульсий использовали адъювант ISA-206, который стерилизовали при 121°С в течение 15 минут. Соотношение фаз при эмульгировании составляло 50% водного антигена и 50% масляного адъюванта. Скорость протока эмульсии на «Эмульсоре» при 12°С составляла бООл/ч. Г1ри изготовлении эмульсий на «Эмульсоре» с адъювантом ISA-206 не удалось получить стабильных препаратов.

Однородные и стабильные по составу эмульсии получили только тогда, когда смесь эмульгировали двукратно с помощью коллоидной мельницы при температуре 19°С в соотношении фаз 40:60.

Технология получения стабильных эмульсий с использованием различных адъювантов была отработана, после чего приступили к сравнению их иммуногенной активности на лабораторных животных.

С этой целью были приготовлены эмульсионные вакцины из культурального антигена А№1707(Армения-98) с использованием адъювантов ВНИИЗЖ, ISA-70 и ISA-206. Каждой вакциной привили по 5 кроликов массой 1,52,0 кг подкожно в дозе 2 мл. Титры ВНА определяли через 10, 20, 30, 60 дней после вакцинации в реакции нейтрализации.

Установлено, что ВНА нарастают медленно на вакцину «вода в масле», в которой использован отечественный адъювант. Через 10 дней после вакцинации титры ВНА были в 1,47 и 3,37 раза ниже, чем на вакцину, содержащую адъювант ISA-70 и вакцину, содержащую адъювант ISA-206. При этом необходимо отметить постепенное нарастание титров вируснейтрализующих антител на все вакцины типа « вода в масле» и пик их приходился на 30-60 день после вакцинации.

Опыты по скорости нарастания иммунитета на эмульсионные вакцины из вируса А№1707 (Армения-98) с «прямым» и «обратным» типом эмульсии были поставлены на подсвинках массой 30-50кг. Взятые вакцины содержали по 7мкг 146+75S компонентов в прививной дозе 2 мл.

Обе вакцины раститровали на подсвинках, на каждое разведение вакцины использовали по 4 животных, которых прививали внутримышечно. Разведение

вакцины «вода в масле» готовили на адъюванте ISA-70, а препарат «масло в воде» - на адъюванте ISA-206.

Уровень иммунитета у вакцинированных свиней определяли через 10, 21, 55 дней после иммунизации в реакции нейтрализации. Через 55 дней провели контрольное заражение гомологичным, адаптированным к свиньям вирусом в дозе 104 ИД50 /0,2 мл под слизистую оболочку языка. Учет результатов проводили через 7 дней после заражения. Результаты опытов приведены в таблице 12.

Таблица 12

Уровень гуморального иммунитета у подсвинков, привитых эмульсионной вакциной из культурального вируса ящура А№1707

(Армения-98)

Характеристика вакцины, адъювант Прививная доза (мл ) Кол-во 146+75S, е дозе (мкг) Титры BHA (Л022) в сыворотке крови на Результаты контрольного заражения

10ДПВ 21ДПВ 1 55ДПВ

Эмульсионная вакцина типа "вода в масле", ISA-70 2,0 0,78 2,06±0,53 р<0,05 2,19±0,57 р<0,05 6,12±0,52 р<0,005 4/4

2,33 2,69±0,29 р<0,005 3,56±0,62 р<0,025 6,94±0,26 р<0,001 4/4

Эмульсионная вакцина типа "масло в воде", ISA-206 2,0 0,78 1,69+0,26 р<0,01 2,44 ±0,31 р<0,005 6,25±0,41 р<0,001 4/4

2,33 2,25±0,63 р<0,05 3,17±0,71 р<0,05 7,17±0,60 р<0,01 4/4

Примечание: числитель- количество защищенных животных;

знаменатель - количество взятых в опыт животных.

Опыты показывают, что уровни вируснейтрализующих антител на обе вакцины как с «прямым», так и «обратным» типом эмульсии нарастали постепенно до 55 дня исследований и различались незначительно и были достаточными, чтобы защитить животных от генерализации процесса при контрольном заражении через 55 дней после вакцинации. В данном случае определяющим был не тип эмульсии, а количество антигена в прививной дозе.

Аналогичные опыты были поставлены на крупном рогатом скоте. Две группы животных по 5 голов вакцинировали подкожно в дозе 2 мл вакцинами с типом эмульсии «вода в масле» и «масло в воде». Вакцины в прививном объеме содержали по 7мкг 146+753 компонентов.

Проведенные опыты показали, что значительных различий в нарастании-

титров антител не обнаружено. Однако, титры ВНА на вакцину «масло в воде» были несколько выше.

Проверка свойств инактивированных вакцин из новых штаммов в производственных условиях. Для этой цели была изготовлена эмульсионная вакцина из вируса ящура типа Oi№194 с использованием адъюванта ISA-70. Этой вакциной прививали подсвинков массой 30 кг внутримышечно в дозе 2 мл с различными количествами антигена в прививной дозе. Титры ВНА определяли против 100-500 доз О^Тайвань), Oi№194.

Три группы животных по 5 голов вакцинировали эмульсионной вакциной из вируса Oi№194 с содержанием антигена 0,3; 0,8 и 3,0 мкг в дозе. Четвертую группу животных в количестве 5-ти голов вакцинировали эмульсионной вакциной из вируса О^Тайвань) в дозе 2 мл с содержанием антигена 1 мкг в дозе. Кровь для исследований отбирали через 11 и 21 день после вакцинации.

Исследования показали, что титры ВНА в первой и второй группах животных против вируса О^Тайвань) невысокие и недостаточные для защиты подсвинков от контрольного заражения. Это указывает на значительное антигенное различие штаммов 0)№194 и 0](Тайвань). В третьей группе титры ВНА против гомологичного вируса Oi№194 через 11 дней после вакцинации колебались от 5,69 до 6,42 лог2, уровень их зависел от количества антигена в дозе.

В четвертой группе титры ВНА против гомологичного вируса О^Тайвань) через 11 и 21 день были 6,31 и 7,44 соответственно. Такие уровни ВНА в крови должны защищать животных при контрольном заражении и в полевых условиях.

В следующем опыте испытывали возможность защиты животных от ящура вакциной, изготовленной из антигена Oi№194 с использованием адъювантов ISA-70 и ISA-206 при заражении вирусом Oi№1734 (Уссурийский). Подсвинков вакцинировали внутримышечно в дозе 2 мл в разведениях 1:3; 1:9; 1:27. Контрольное заражение провели через 21 день после вакцинации изолятом, адаптированным к свиньям, в дозе 10Hflso/0,2 мл в две точки под слизистую оболочку языка.

Было установлено, что ИМД50 вакцины, изготовленной с использованием адъюванта ISA-70, была равна 0,06 мл, тогда как ИмД50 вакцины, изготовленной с адъювантом ISA-206, только 0,15мл. Это указывает на то, что вакцина «вода в

масле», изготовленная с ISA-70, в 2,5 раза эффективнее, чем вакцина, изготовленная с ISA-206.

Сыворотки крови от животных, привитых вакциной в разведении 1:3, исследовали в реакции нейтрализации против вирусов Oi№194, Oi№1734 (Уссурийский) и О^Тайвань) через 21 день после вакцинации.

Установлено, что производственный штамм Oi№194 отличается от Oi№1734 (Уссурийский) и (^(Тайвань), что и было подтверждено исследованиями с использованием молекулярно-биологических методов, проведенных сотрудниками лаборатории молекулярной биологии ВНИИЗЖ. Титры ВНА после вакцинации эмульсионным препаратом, изготовленным с адъювантом ISA-70, были выше, чем после иммунизации вакциной, изготовленной с адъювантом ISA-206.

Проведенные исследования показали, что для эффективной защиты животных от вируса ящура О^Тайвань) необходимо готовить вакцину из аналогичного вируса с использованием адъюванта ISA-70.

Были изготовлены две производственные серии эмульсионной вакцины с адъювантом ISA-70 из вируса (^(Тайвань), которыми привили свиней. Для вакцинации использовали разведение вакцины 1:3. Титры ВНА определяли в сыворотке крови свиней через 10, 21, 34 дня против 100-500 доз вируса (^(Тайвань).

В опытах показано, что титры ВНА возрастали до 34 дня после вакцинации (срок наблюдения), но уже через 10 дней после вакцинации они были достаточными для защиты животных от ящура.

Эффективность вакцины (серия 435 и 341), изготовленной из штамма О^Тайвань), была испытана при вспышке ящура среди свиней в Приморском крае.

Свиноферма деревни «Элитное» Уссурийского района Приморского края, где был установлен ящур, находится в 50-100 м от частных дворов (40 дворов). Весь обслуживающий свиноферму персонал (21 человек) живет в д.Элитное. В каждом дворе имеются КРС и свиньи ( более 300 свиней).

Все свиньи частного сектора были привиты эмульсионной вакциной H3v штамма О^Тайвань) и случаев заболевания среди них не наблюдали. Затем была проведена ревакцинация свинопоголовья.

Все восприимчивые животные в пяти районах, прилегающих к очагу, были привиты дважды. Дальнейшего распространения заболевания не произошло. В данной ситуации вакцина зарекомендовала себя высокоэффективным средством борьбы с заболеванием, вызванным штаммом С>1№1734.

Изучение сохраняемости вакцин. В опытах исследовали количество

146+75Б компонента в готовых эмульсионных вакцинах через сутки после

изготовления и после хранения в течение 5; 7; 8; 17; 19 месяцев. Готовые \

вакцины (эмульсии) разрушали хлороформом и центрифугировали, отбирали отделившуюся водную фазу и в ней определяли количество 146+753 компонентов. Не установлено снижения содержания 146+75Э компонентов в течение всего срока хранения.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны технологии изготовления сорбированной и эмульсионной противоящурных вакцин из вируса ящура новых штаммов А№1707 (Армения-98) и (^(Тайвань), репродуцированных в культуре клеток ВНК-21.

2. Эмульсионная противоящурная вакцина из штаммов А№1707 и С>1(Тайвань) была авирулентна, умеренно реактогенна, безвредна и иммуногенна для свиней и КРС.

3. Проведена адаптация вируса к культуре клеток ВНК-21 и изучены иммунобиологические свойства штаммов вируса ящура А№1707(Армения-98) и О^Тайвань).

4. Установлено, что доза заражения вирусом ящура культуры клеток, равная 0,050-0,001 ТЦД50 на клетку, обеспечивает высокое накопление вируса при репродукции.

5. Отработаны условия очистки вируссодержащей суспензии полигуанидином в концентрации от 0,001% до 0,0075%, которая не снижает иммунобилогические свойства штаммов А№1707(Армения-98) и О^Тайвань).

6. Показано, что при инактивации вирусов А№1707 (Армения-98) и О^Тайвань) АЭЭИ в концентрации 0,025% в присутствии полигуанидиа и хлороформа концентрация иммунизирующих компонентов вируса

ящура не снижается, и при этом обеспечивается высокий уровень безопасности изготавливаемых вакцин.

7. Отработаны условия очистки концентрированного вируса ящура с помощью ГОА путем промывки осадка дистиллированной водой или ацетатным буфером. При этом в первом случае удаляется 84,4% , а во втором - 60,2% балластных белков при сохранении исходных количеств специфического белка.

8. Предложен новый универсальный адъювант - полиакриловая кислота (ПАК) в составе противоящурной вакцины, которая в концентрации 3% обеспечивает повышение иммунного ответа на введение вакцины у КРС и свиней.

9. В опытах на КРС установлено, что уровень вируснейтрализующих антител после прививки вакциной с новым адъювантом (ПАК) был выше, чем после иммунизации вакциной, в которой в качестве адьюванта использован сапонин.

10. Показано, что эмульсионные вакцины, изготовленные с использованием в качестве адъювантов ISA-70 и ISA-206, обладали высокой иммуногенностью при вакцинации как КРС, так и свиней.

11. Установлено, что иммуногенность эмульсионных вакцин из вируса А№1707 (Армения-98) и О^Тайвань) при температуре 2-8°С сохранялась в течение 19 месяцев (срок наблюдения).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются нормативно-технические документы по изготовлению и контролю вакцин против ящура, утвержденные директором ВНИИЗЖ и Департаментом ветеринарии МСХ РФ.

■ Регламент по изготовлению и контролю вакцины против ящура эмульсионной моно- и поливалентной и ТУ на эту вакцину.

■ Регламент по изготовлению и контролю вакцины против ящура универсальной сорбированной моно- и поливалентной, а также сорбированной моно- и поливалентной и ТУ на эти вакцины.

Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ от 02.10.2000г. «Методические указания по изготовлению и контролю противоящурной вакцины с полиакриловой кислотой в качестве адъюванта».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пат. 2140452 РФ, МПК6 C12N7/00 Штамм №1707 «Армения-98» вируса ящура типа А для изготовления диагностических и вакцинных препаратов / Захаров В.М., Спирин В.К., Гриценко А.И., Маслова Н.С., Гусев A.A., Михалишин Д.В., Кошецян Т.Ф., Дрыгин В.В., Щербаков A.B., Кругликов Б.А., Нерсесян С.Е. Заявл. 15.03.99г.; Опубл. 27.10.99г.

2. Пат. 2143921 РФ, МПК7А61К 39/135 . Вакцина против ящура типа А и способ её изготовления / Михалишин В.В., Улупов H.A., Лезова Т.Н., Гусев A.A., Захаров В.М., Михалишин Д.В. Заявл. 21.04.99г. Опубл. 10.01.00г.

3. Лезова Т.Н., Михалишин В.В., Улупов H.A., Михалишин Д.В., Инактивация микрофлоры в вируссодержащих суспензиях // Пробл. инфекц. патологии с.-х. животных: Тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия ящура.-Владимир, 1997.-С.197.

4. Михалишин В.В., Захаров В.М., Лезова Т.Н., Улупов H.A., Шажко Ж.А., Михалишин Д.В., Гусев A.A., Нерсесян С.Е. Изучение иммуногенных свойств вируса ящура типа А, выделенного в Армении в 1998 году // Совр. аспекты патологии ж-ных: Матер, конф., посвящ. 40-летию ВНИИЗЖ.-Владимир,1998.-С.38-41.

5. Гусев A.A., Михалишин В.В., Захаров В.М., Лезова Т.Н., Улупов H.A., Шажко Ж.А., Михалишин Д.В., Нерсесян С.Е. Изучение иммуногенных свойств вируса ящура типа А, выделенного в Армении в 1998 году II Совр. аспекты патологии ж-ных: Докл. конф., посвящ. 40-летию ВНИИЗЖ.-Владимир, 1999.-С.67-71.

6. Михалишин Д.В., Караулов А.К. Эффективность противоящурной ГОА-сапонинвакцины из культурального вируса ящура типа А (Армения-98) // Науч. основы произв-ва вет. биол. преп.: Тез. докл. Всерос. научно-практ. конф,- Щелково, 2000.-С.48-49.

7. Михалишин Д.В. Сравнение иммуногенной активности эмульсионной вакцины с «прямым» и «обратным» типом эмульсии // Науч. основы произв-ва вет. биол. преп.: Тез. докл. Всерос. научно-практ. конф.-Щелково, 2000.-С.50-51.

8. Лезова Т.Н., Улупов H.A., Михалишин Д.В., Михалишин В.В. Испытание на крупном рогатом скоте вакцины с синтетическим адъювантом // Актуал. пробл. патол. с.-х. жив-ных: Матер, междунар. научно-практ. конф.-Минск, 2000.-С.135-137.

9. Михалишин Д.В., Беляев Н.Е. Культивирование вируса ящура типа А «Армения-98» //Актуал. пробл. патол. с.-х. жив-ных: Матер, междунар. научно-практ. конф.-Минск,2000-С. 152-153.

10. Михалишин Д.В., Беляев Н.Е., Манин Г.Л. Подбор оптимальной дозы вируса ящура для заражения суспензии клеток ВЩ-2"\ Н Актуал. пробл. патол. с.-х. жив-ных: Матер, междунар. научно-практ. конф.-Минск,2000-С.154-155.

Отпечатано на полиграфической базе отдела координации научных исследований, информации и международных связей ВНИИЗЖ Тираж 90 экз., ноябрь 2000г.