Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Разработка метода идентификации сырья и продуктов животного и растительного происхождения на основе SDS-электрофореза
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 16.00.06
Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Разработка метода идентификации сырья и продуктов животного и растительного происхождения на основе SDS-электрофореза
На правах рукописи
Горожанина Елена Сергеевна
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ИДЕНТИФИКАЦИИ СЫРЬЯ И ПРОДУКТОВ ЖИВОТНОГО И РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА ОСНОВЕ БОБ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
16.00.06 - Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва-2007
003057346
Работа выполнена в отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН), производственной химико-бактериологической лаборатории ОАО «Черкизовский мясоперерабатывающий завод» и в Главном экспертно-аналитическом центре «СОЭКС» Автономной некоммерческой организации «Союзэкспертиза» Торгово-промышленной палаты Российской Федерации.
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Вячеслав Владимирович Светличкин
(ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)
Научный консультант:
доктор ветеринарных наук Чолпонкул Кыдырмышевич Авылов
ОАО «Черкизовский мясоперерабатывающий
завод»
Официальные оппоненты:
- доктор ветеринарных наук, профессор
- кандидат биологических наук
Владимир Ильич Родин (МГУПБ) Анна Борисовна Кононенко (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)
Ведущая организация: Государственное научное учреждение
Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.
Защита состоится « 23 » мая 2007 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии.
Автореферат разослан «_»_2007 г.
Ученый секретарь л
диссертационного совета (шС Е.С. Майстренко
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
В последние годы широко применяются белковые добавки животного и растительного происхождения. Введение соевых белков позволяет стабилизировать функционально-технологические свойства и качество мясного сырья, обогащает продукт полноценным белком и улучшает органолептические показатели (консистенция, внешний вид, сочность). Уменьшение потерь при термообработке у хранении, увеличение выхода готовой продукции при использовании соевого белка значительно снижает ее себестоимость, а низкая себестоимость может являться причиной фальсификации продукции.
Увеличение поступления на потребительский рынок различной по составу мясной продукции требует всестороннего комплексного контроля её качества, соответствия её потребительским требованиям и представленной технической документации.
Все продукты, поступающие на потребительский рынок, проходят проверку на безопасность и подтверждение соответствия. Идентификация продукции в свете закона «О техническом регулировании» является одним из главных и основных элементов сертификации, которая не должна «вводить в заблуждение погребите л я».
Поэтому в практике при оценке качества мясного продукта возникает необходимость проведения идентификации его реального состава в соответствии с декларированными нормативными документами.
Целью подобной идентификации является определение и подтверждение подлинности конкретного вида и наименования товара, а также соответствие определенным требованиям или информации, указанной на этикетке или в товарно-сопроводительных документах.
Применение химических, физико-химических и биохимических методов позволяет получить только часть необходимой информации о качестве мясопродуктов.
В мировой практике для выяснения состава пищевых продуктов опробованы различные методы: иммукофермешного анализа, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью, хроматографического анализа, обладающего большой чувствительностью и быстротой исполнения. Однако они не позволяют выявить замену мышечной ткани другими животными компонентами - легкими, печенью, выменем.
Ценную информацию о качестве продукта позволяет получить гистологический метод - метод прямого определения состава сырья. Микроскопические исследования позволяют судить как о составе продукта в целом, так и дифференцировать особенности тканевых и клеточных структур. Работа с биологическими объектами в пищевых продуктах имеет определенную специфику, поскольку исследованию подвергаются материалы после различных технологических воздействий. Гистологический метод трудоемок и требует специального оборудования, что вызывает определенные трудности его использования.
Проблема видовой идентификации может быть решена с использованием современных электроф' еретических методов. Эти методы давно используются в научных исследованиях. Однако, для применения их с целью экспертизы пищевых продуктов и внедрения в практику экспертных лабораторий необходима разработка и стандартизация оптимальных условий экстракции белков из нативных и термообработанных продуктов, использование определенных видов гелей и разработка условий проведения процесса электрофореза.
Это направление весьма перспективно в практике ветеринарной санитарии и дает возможность наиболее качественного анализа продуктов питания. Решение этой проблемы имеет научное и практическое значение.
Цель настоящей работы - разработка метода идентификации сырья и продуктов животного и растительного происхождения на основе БОБ-электрофореза.
Задачи исследования:
1. Разработка оптимальных способов экстракции белков из нативных и термообработанных пищевых продуктов для последующего анализа их элекгрофоретическим методом.
2. Разработка метода видовой идентификации по выявлению видоспецифических маркерных белковых зон на электрофоретических спектрах.
3. Разработка методики количественной оценки компонентов смешанных фаршей.
4. Разработка метода качественного и количественного определения сои в смешанных фаршах.
5. Идентификация сои в составе колбасных изделий.
6. Идентификация сои в составе стерилизованных мясорастительных консервов на основе ДНК-диагностики.
7. Разработка схемы анализа видовой принадлежности продуктов животного и растительного происхождения.
8. Проведение лабораторных мониторинговых исследований пищевой продукции с использованием разработанных методов.
Научная новизна:
На основе использования электрофореза в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия (8Б8) разработан способ анализа мясных продуктов, позволяющий проводить определение видовой принадлежности белка, количественно оценивать составляющие многокомпонентного фарша, в том числе белковые добавки растительного происхождения.
Определены характерные видоспецифические маркерные белковые зоны, по которым может быть проведена идентификация видовой принадлежности белка в составе пищевого продукта. Создана коллекция электрофореграмм белков животного и растительного происхождения.
Проведена адаптация метода полимеразно-цепной реакции с детекцией гибридизационно-иммуноферментным анализом (ПЦР-ГИФА)
для анализа мясных и мясорастительных консервов с целью идентификации в них сои.
Практическая ценность.
Разработанные методы расширяют возможности ветеринарных и сертификационных лабораторий и позволяют определять видовую принадлежность сырья, выявлять наличие белковых добавок животного и растительного происхождения в многокомпонентных нативных и термообработанных пищевых продуктах и оценивать их количество.
Результаты работы используются при проведении исследований пищевых продуктов в Главном экспертно-аналитическом центре «СОЭКС» Автономной некоммерческой организации «Союзэкспертиза» Торгово-промышленной палаты РФ.
На основании результатов исследований разработаны:
- методические рекомендации «Определение видового состава продуктов методом SDS-электрофореза» (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 19.01.2007 г.),
- методические рекомендации «Определение видового состава продуктов методом SDS-электрофореза» (утверждены Торгово-промышленной палатой РФ 10.04.2007 г.)
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
- Международной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва A.A. (Воронеж, 2006 г.)
- заседании Ученого совета ГНУ ВНИИВСГЭ (2007 г.)
Публикации. Результаты исследований отражены в 8 научных
статьях.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических
предложений, списка использованной литературы и приложений.
Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 114 источников отечественных и зарубежных авторов.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы и методы исследований.
Работа проводилась в период с 2000 г. по 2006 г.
Работа выполнена в отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии, производственной химико-бактериологической лаборатории ОАО «Черкизовский мясоперерабатывающий завод и в Главном экспертно-аналитическом центре «СОЭКС» Автономной некоммерческой организации «Союзэкспертиза» Торгово-промышленной палаты Российской Федерации.
Для анализа в настоящей работе были использованы нативные образцы говядины, свинины, мяса курицы и мяса индейки, термообработанные мясные продукты (колбасы, колбасные изделия), стерилизованные мясные и мясорастительные консервы. С целью количественной оценки составляющих белковых компонентов использовали модельные смеси из различных образцов мяса, которые готовили на Черкизовском мясоперерабатывающем заводе.
Для идентификации соевых добавок, используемых в производстве колбас, а также в составе полуфабрикатов рубленных мясных изделий, использовали образцы промышленных партий соевых изолятов и концентратов, соевой муки и текстурированного соевого белка.
Анализ белкового состава проводился методами SDS-электрофореза с использованием автоматизированной системы «PhastSystem» (Pharmacia) на различных видах полиакриламидных гелей.
Для определения доли каждого компонента в многокомпонентном
фарше проводили денситометрию электрофореграмм с использованием лазерного сканирующего денситометра «EPSON PERFECTION3200» (Epson). По соотношению пиков маркерных видоспецифических белков можно вычислить долю каждого компонента (в процентах) по формуле: С = В/Ах 100%, где:
А - величина маркерного пика в индивидуальном образце,
В - величина того же маркерного пика в смешанном фарше,
С - процентная доля анализируемого компонента в смешанном фарше.
Денситометрию использовали также для количественной оценки содержания соевого белка в колбасных изделиях.
Для исследований стерилизованных продуктов использовали наборы серии SureFood на основе ПЦР с детекцией по методу ГИФА («Elise») (Германия). Исследования проводили с использованием амплификатора «Mastercycler personal» (Eppendorf), планшетного фотометра "Sunrise" (Tecan).
2.2. Результаты исследований.
2.2.1. Разработка оптимальных способов экстракции белков из нативных и термообработанных пищевых продуктов для последующего анализа их электрофоретическим методом.
Электрофорез в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия (SDS) характеризуется тем, что в системе суммарный заряд белка «маскируется», т.е. SDS окутывает белки облаком отрицательных зарядов.
Комплексы SDS-белок имеют одинаковый заряд, поэтому процесс разделения происходит только по одному параметру - размеру молекул.
Строгое соблюдение условий проведения электрофореза и предфорезной обработки образцов является обязательным для возможности сравнения электрофореграмм, полученных в разное время. С этой целью в работе был проведен подбор оптимальных условий экстракции из нативных образцов мяса и выбор диапазона градиента плотности в гелях,
который обеспечивал бы чёткое и воспроизводимое разделение белковых зон мясных экстрактов.
Буферный раствор.
Опытным путём было установлено, что для экстракции белков оптимально использование солюбилизирующего буфера рН 8, содержащего 0,01 М трис НС1, 0,001 М ЭДТА, 1% SDS и 5% й-меркаптоэтанола и последующее прогревание гомогенатов при 96°С.
Для экстракции белков использовали различные соотношения образца и солюбилизирующего буфера. Оказалось, что наилучшее разделение белковых зон происходит в тех случаях, когда схожие по молекулярной массе белки на электрофореграммах представлены отдельными зонами. Это достигается при соотношении образца и солюбилизирующего буфера 1:2.
Градиент плотности в геле.
SDS-электрофорез первоначально проводили в гелях с градиентом 1015% и Homogeneous 7,5%; 12,5%; 20%. Как те, так и другие гели были приемлемы для электрофоретического разделения белков. Однако в дальнейшем предпочтение было отдано гелям с градиентом 10-15% (концентрация акриламида в разделяющем геле). Использование градиента плотности геля позволило четко и воспроизводимо провести электрофорез денатурированных белков. Наилучшие результаты были получены при аппликации образцов вблизи катода.
2.2.2. Разработка метода видовой идентификации по выявлению видосиецифических маркерных белковых зон на электрофоретических спектрах.
Экстракты различных видов пищевых продуктов после их электрофоретического разделения имеют различные белковые спектры. На этих спектрах присутствуют белковые зоны, общие для различных видов, а также белковые зоны, характерные только для определенных видов животных или растений - видоспецифические белки. Именно по этим
белковым зонам можно проводить идентификацию видов мяса и каких-либо белковых добавок. Поэтому им условно дано название - маркерные зоны. Для идентификаций свинины и говядины, сравнивая электрофореграммы исследуемых образцов (рис,]), выявляли видоспепифические маркерные зоны свинины и говядины.
Расстояние от анода, усл. ед.
Рис. ) ВодоспеЦифические маркерные зоны говядины и свинины на геле и девеитограмме.
Можно увидеть, что наряду с белками, общими для свинины и говядины, имеются белковые зоны, преобладающий В определенном виде мяса. В частности видно, что зона А преобладает в говядине, а зона Б в сиинине.
2.2.3. Разработка методики количественной оценки компонентов смешанных фаршей.
Были изготовлены модельные системы - смешанные фарши, содержащие в своем составе говядину и свинину в различных соотношениях.
Электрофоре™ чес кус разделение белков и денситометрия полученных гелей показывает, что с уменьшением количества говядины наблюдается уменьшение площади пика А и увеличение площади пика Б.
Денситометрия электрофоре грамм белков показала, что отношение площадей пиков А и Б имеет прямую зависимость от концентрации составляющих компонентов фарша (рис. 2).
у"
■5© .: 1 ■:■ К
щ Ш Ш Ш •Щ- Ш гг»
йае
' -л ■ДОС» гтс»сго
Рис. 2 Отношение площадей маркерных пиков говядины и свинины.
Аналогично, сравни пая электрофореграммы белков мяса курицы и мяса индейки, выявляли в идо с п е ци ф ически е маркерные зоны и проводили количественную оценку компонентов в смешанных фаршах.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что метод Б08 -электрофореза может быть успешно использован для видовой идентификации различных составляющих многокомпонентных мясных смееей, а в сочетании с деиситометрией - для их количественной оценки.
Из 27 проанализированных образцов мяса и фаршей в 8 образцах, декларируемых как говядина, подтвержден состав в й образцах и выявлено наличие говядины и мяса птицы механической обвалки в 2. В 5 образцах, декларируемых как говядина и свинина, подтвержден состав. В 9 образцах, декларируемых как мясо курицы, выявлено наличие мяса курицы и
индейки в 2 и подтвержден состав в 7. В 5 образцах, декларируемых как мясо индейки, подтвержден состав.
2.2.4. Разработка метода качественного и количественного определения сои в смешанных фаршах.
С каждым годом растет ассортимент добавок, используемых в качестве замены дорогостоящего сырья в пищевых продуктах при их производстве. Относительно низкая стоимость этих добавок и стала причиной встречающихся случаев фальсификации пищевых продуктов, в частности фаршевых изделий и полуфабрикатов. Идентификация белковых добавок, в частности сои, в мясных изделиях на примере рубленых полуфабрикатов и фаршевых изделий стала целью нашего следующего исследования.
Рекомендуемое количество гидратированной соевой муки в рецептурах рубленых полуфабрикатов и фарша 20-50% (1-5% соевого белка от состава продукта). При гидратации соевая мука, содержащая 50-54% белка, связывает 3,5-4,5 части воды, поэтому в гидратированном состоянии добавка содержит около 10-15% белка.
При производстве фаршевых изделий (пельменей, фаршей, рубленых полуфабрикатов) в зависимости от технологических особенностей используются различные виды соевых белковых препаратов: изоляты, концентраты, текстураты и мука.
В рамках поставленной задачи, прежде всего, необходимо было получить и сравнить белковые спектры перечисленных выше белковых препаратов. Для этого проведен ЯОЗ-электрофорсз различных образцов сои. Были проанализированы: соевый изолят, соевый концентрат, белок соевый текстурированный, мясо соевое текстурированное и соевая мука. Показано, что различные образцы соевого наполнителя сходны по своим электрофоретическим спектрам. Сравнение с белковыми спектрами животных белков (говядины, свинины) показало, что доминантные
белковые зоны различных образцов сои отсутствуют в мясных экстрактах, следовательно, являются специфичными для сои растительными белками и могут быть использованы в качестве маркерных зон при выявлении их н мясных экстракта* полуфабрикатов (рис. 3).
Расстояние от анода, усл. ед.
Рис. 3 В и доспецифи чески е маркерные белковые зоны говядины и сии.
Проведение анализа мясных экстрактов полуфабрикатов требовало специфической обработки образца. Пробоподготовка перед электрофорезом в данном случае имела большое значение, так как составляющие компоненты продукта (жир. соли) будут мешать и искажать процесс разделения белков. Она заключалась в обработке (¡робы органическими растворителями и доведении до воздушно-сухого состояния. Лликвоту образца трижды обрабатывали охлажденным до - 20°С ацетоном, затем серным эфиром.
Для солюбилизации белков также использовали трис-НС1 буфер рН 8,0, содержащий додецилсульфат и 8-мерка! поэта но л. Для четкого разделения на геле, подобрана оптимальная концентрация образца в солтобилизируюшем буфере 2,5-3,0 мг/мл.
Чёткая идентификация маркерной зоны сои в мясных изделиях
позволила нам разработать метод количественной оценки этой добавки в составе фаршей. С этой целыо были приготовлены модельные системы в виде сырого говяжьего фарша с добавками различного количества сосной муки. Добавки сои в со с та не фаршевых изделий (полуфабрикатов) составляют от 1 до 5 % (замена по белку от 10 до 50 %), исходя из этого, были приготовлены модельные системы: говядина 80%, соя 20%; говядина 70%, соя 30%; говядина 60%, соя 40%; говядина 50%, соя 50%. Для количественной оценки сои в смешанном фарше выбраны маркерные пики А, Б, В, Пик А принадлежит г овядине, пики Ь и В - только сое. Отношение площадей пиков в смешанных модельных фаршах, принадлежащих говядине и сое зависит от концентрации Компонентов фарша (рис. 4).
Рис. 4 Отношение площадей маркерных зон говядины и сои в смешанных фаршах при различном содержании компонентов.
Другим способом оценки количества сои в фаршевых изделиях является построение калибровочной кривой. С этой целыо готовили несколько образцов с концентрацией соевого белка 0,1-0,4 мг/м;г (что соответствует 10 - 40 % замене мясного белка соевым).
При одновременном нанесении на гель исследуемого фарша или полуфабриката и сосвого белка в нескольких известных кои центрациях
можно оценить соотношение составных компонентов продукта.
Из полученных результатов видно, что если оценку содержания сои в составе продукта проводить по методу определения коэффициента отношения площадей пиков А/Б, то нанесение на гель калибровочных смесей одновременно с определяемыми образцами не требуется. В случае определения содержания сои по калибровочной кривой необходимо одновременное нанесение на гель не менее трех точек калибровочной смеси и исследуемых экстрактов.
Из 51 проанализированного образца смешанных фаршей и полуфабрикатов (котлет, пельменей и др.) в составе 20 идентифицировано только мясное сырьё, в 7 - добавка соевого белка до 1,0 % от общего состава продукта (до 10 % замены белка), в 24 содержание соевого белка 1-5% (это составляет 10-50% замены мясного белка). В 17 образцах из 31 информация о наличии соевого белка не вынесена на этикетку.
2.2.5. Идентификация сои в составе колбасных изделий.
Для солюбилизации белков термообработанных продуктов использование ранее описанного буфера является обязательным. Наличие ионного детергента додецилсульфата и 6-меркаптоэтанола способствует диссоциации дисульфидных мостиков в денатурированных белках, обеспечивая их солюбилизацию.
Предварительная пробоподготовка состояла в обезжиривании и обессоливании образцов, необходимых для качественного разделения белков в геле.
Предфорезная обработка солюбилизатов заключается в прогревании гомогенатов при 96°С в течение трёх минут и последующем центрифугировании. Отработано соотношение буфера и образца, которое составило 3,5-4,0 мг/мл.
Объектами исследования являлись колбаса докторская оригинальная, изготовленная в соответствии с ТУ 9213-283-17471666-01, содержащая в составе сою и сардельки говяжьи, изготовленные по ГОСТ Р 521596-2003,
не содержащие в своем составе сою. Основным мясным компонентом в обоих объектах являлась говядина. Поэтому на гель были нанесены пробы исследуемых образцов колбас, говядины и соевого белка.
Сравнение белковых спектров подтвердило состав, вынесенный па этикетку. Показано наличие соевого белка в колбасе «докторской оригинальной» и отсутствие его в сардельках говяжьих. Промышленная термическая обработка не оказывает влияния на качественный состав белковых фракций (рис.5).
Расстояние от анода, усл. ед.
Рис. 5 Разделение белков колбасных изделий и сои на денситограмме и геле.
Электрофоретический анализ белков колбасных изделий показал, что этот метод гриемлем для видовой идентификации белков животного и растительного происхождения в составе многокомпонентного продукта.
№ 86 проанализированных образцов колбасных изделий в составе 48 идентифицировано только мясное сырье, в 24 - добавка соевого белка до 1,0% от Общего состава продукта (до 8 % замены белка), л 14 содержание соевого белка - 1-5% (это составляет 20-30% замены мясного белка). В 14 образцах из 38 информация о наличии соевого белка не вынесена на этикетку.
На этикетках колбасных изделий, в состав которых введены комплексные добавки животного происхождения, часто не указываются их составляющие. В силу указанных причин для идентификации состава исследуемых продуктов (колбасных изделий, комплексных пищевых добавок) одновременно проводили электрофоретическое разделение экстрактов исследуемых образцов и наиболее часто употребляемых добавок животного происхождения. Таковыми являются: сухое обезжиренное молоко, сублимированная кровь крупного рогатого скота, яичный и бычий альбумин.
Специфичные для сои растительные белки были с успехом использованы в качестве маркерных зон при исследовании состава сублимированных продуктов (яичный порошок, сухое молоко и др.).
2.2.6. Идентификация сои в составе стерилизованных консервов.
В качестве белкового наполнителя в мясных стерилизованных консервах часто используется соевый белок. Рекомендуемое количество гидратированной соевой муки в рецептурах консервов - до 35% (до 5% соевого белка от состава продукта).
Стерилизованные консервы - это продукты, подвергнутые наиболее жесткой термической обработке. Температурные воздействия составляют 110-120°С в течение 40-60 минут. При этом в макромолекулах белков происходят необратимые изменения пространственной конфигурации, в результате чего пептидные цепочки формируют случайные агрегационные состояния.
Для солюбилизации таких молекул в качестве детергента используют тритон 100, додецилсульфат с 13-меркаптоэтанолом и растворы мочевины высокой концентрации (7-8 М). Использование 3% раствора тритона не дало четко выраженных белковых зон на электрофореграмме. Такие же результаты были получены с использованием буфера, содержащего додецилсульфат и В-меркаптоэтанол. Использование в качестве солюбилизата 7,7 М раствора мочевины приводило к получению белкового
раствора нужной концентрации. Однако, использование этого солюбилизата не было возможным из-за условий проведения электрофореза в системе PhastSystem, так как концентрирование образца на старте и разделение его в геле идет при температуре 12-15°С. При такой температуре раствор мочевины кристаллизовался на старте.
В силу указанных обстоятельств и необходимости отработки метода определения сои в стерилизованных консервах, мы применили метод ПЦР-ГИФА. Он основан на ферментативной амплификации интересующего участка ДНК. Молекула ДНК представляет собой наиболее удобный объект для анализа. Основное её преимущество перед другими биологическими макромолекулами - стабильность. ДНК не разрушается при автоклавировании и переносит длительное хранение.
Выделение ДНК и амплификацию проводили с использованием тест-комплектов под общей маркой SureFood, предназначенных для быстрого и эффективного выделения, идентификации и определения ДНК различного происхождения в продовольственном сырье и готовых пищевых продуктах. Благодаря короткому размеру ПЦР-продукта (1ес-ген имеет 118 пар оснований), определение видоспецифичной ДНК может выполняться и на образцах, подвергнутых термической обработке.
Проведение анализа включало следующие стадии: изоляция и очистка ДНК в исследуемой пробе с использованием набора SureFood PREP Plant/PlantX; ПЦР-амплификация и детекция 1ес-гена с помощью специфических биотинилированных праймеров.
Результат исследования на наличие сои в образце интерпретируется как положительный, если величина оптической плотности (ОП) в лунках с ампликонами пробы, гибридизованньши на детектируемый 1ес-ген, включая лунку контроля ингибирования, больше 0,2 (таблица 1).
Исходя из выше изложенного, можем заключить, что образцы 2 и 3 содержат соевый белок, а в образце 1 — соевый белок отсутствует.
Высокая специфичность и чувствительность метода ГИФА
позволила выявить низкие концентрации растительного белка (от 0,5%) сои среди большого количества других веществ.
Таблица 1
Оптическая плотность в лунках ИФА-планшета при исследовании образцов
на наличие сои.
Контроль Образец №1 Образец №2 Образец №3
Контроль эффективности, ДНКконтр. 1,439
Контроль контаминации, раствор без ДНК 0,065 - - -
Контроль ингибиро-вания, ДНКобр.4 ДНКконтр. 1,229 1,298 1,306
ДНКобр. 0,013 0,643 0,679
НуЬ(-) 0,017
НуЬ(+) 1,121 - - -
Из 117 проанализированных образцов стерилизованных консервов (фарш сосисочный, любительский, консервы мясорастительные) в составе 65 идентифицировано только мясное сырьё, в 52 выявлено наличие соевого белка. В 16 образцах из 52 информация о наличии соевого белка не вынесена на этикетку.
2.2.7. Схема анализа видовой принадлежности продуктов животного и растительного происхождения.
В результате анализа состава пищевых продуктов нами была предложена схема проведения идентификации видовой принадлежности белков животного и растительного происхождения (рис. 6), которая учитывает разрешающую способность тех или иных методов для анализа нативных, термобработанных и стерилизованных образцов.
Рис. 6 Схема проведения идентификации видовой принадлежности белковых продуктов животного и растительного происхождения.
2.2.8. Лабораторные мониторинговые исследования продукции с использованием разработанных методов.
За время выполнения работы были проведены мониторинговые исследования 281 образца различных пищевых продуктов и пищевого сырья.
Из 27 проанализированных образцов мяса и фаршей в 8 образцах, декларируемых как говядина, подтвержден состав в 6 образцах и выявлено наличие говядины и мяса птицы механической обвалки в 2. В 5 образцах, декларируемых как говядина и свинина, подтвержден состав. В 9 образцах, декларируемых как мясо курицы, выявлено наличие мяса курицы и индейки в 2 и подтвержден состав в 7. В 5 образцах, декларируемых как мясо индейки, подтвержден состав.
Из 51 проанализированного образца смешанных фаршей и полуфабрикатов (котлет, пельменей и др.) в составе 20 идентифицировано только мясное сырьё, в 7 - добавка соевого белка до 1,0 % от общего состава продукта (до 10 % замены белка), в 24 содержание соевого белка 1-5% (это составляет 10-50% замены мясного белка). В 17 образцах из 31 информация о наличии соевого белка не вынесена на этикетку.
Из 86 проанализированных образцов колбасных изделий в составе 48 идентифицировано только мясное сырьё, в 24 — добавка соевого белка до 1,0% от общего состава продукта (до 8 % замены белка), в 14 содержание соевого белка - 1-5% (это составляет 20-30% замены мясного белка). В 14 образцах из 38 информация о наличии соевого белка не вынесена на этикетку.
Из 117 проанализированных образцов стерилизованных консервов (фарш сосисочный, любительский, консервы мясорастительные) в составе 65 идентифицировано только мясное сырьё, в 52 выявлено наличие соевого белка. В 16 образцах из 52 информация о наличии соевого белка не вынесена на этикетку.
Таблица 2
Результаты исследований пищевых продуктов.
Образцы Общее количество образцов В составе только мясное сырьё Добавка соевого белка до 1,0% от состава продукта Добавка соевого белка 1-5% от состава продукта Соевый белок не декларирован
Фарши и полуфабрикаты 51 20 7 24 17
Колбасные изделия 86 48 24 14 14
Консервы (фарш сосисочный, любительский, консервы мясорастительные) 117 65 52 16
Мониторинговые исследования пищевой продукции в ассортименте показали возможность эффективного применения разработанных методов видовой идентификации белков животного и растительного происхождения.
Выводы:
1. Использование метода ЗОБ-элекгрофореза позволяет с высокой точностью идентифицировать видовую принадлежность белков животного и растительного происхождения в сырье и термообработанных колбасных изделиях.
2. Подобраные оптимальные способы экстракции белков из нативных и термообработанных пищевых продуктов (трис-НС1 буфер рН 8,0, содержащий 1% додецилсульфата и 5% В-меркаптоэтанола) обеспечивают оптимальную экстракцию белков, необходимую для анализа в системе Р1^8у81ет. Наилучшее разделение достигается с использованием гелей с градиентом 10-15% при апликации образцов вблизи катода.
3. На основании метода БОБ-электрофореза в сочетании с
денситометрией разработан способ качественной оценки различных составляющих в многокомпонентных пищевых продуктах (фаршевые изделия и термообработанные пищевые продукты) по выявлению на электрофореграмме видоспецифических маркерных белковых зон, по которым может быть проведена идентификация видовой принадлежности белка в составе пищевого продукта.
4. Разработанные модифицированные методики качественного и количественного анализа белков позволяют определять сою в многокомпонентных пищевых системах.
5. Для определения наличия соевых добавок в стерилизованных мясных и мясорастительных консервах целесообразно использовать ПЦР.
6. На основании полученных результатов предложена последовательная система методов идентификации видовой принадлежности продуктов животного и растительного происхождения на основе SDS-электрофореза, изоэлектрофокусировки и ПЦР.
7. Мониторинговые исследования пищевой продукции с применением разработанных методов исследования видовой идентификации показали возможность выявления недекларированных компонентов растительного и животного происхожденияих.
8. Разработанные методы могут быть использованы для скрининговых тестов и количественного определения отдельных составляющих в многокомпонентных смесях животного и растительного происхождения.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
1. Горожанина Е.С. / Идентификация белковых добавок в составе колбасных изделий // Практик: научно-практический информационный журн. / Учредитель и издатель НПО «Петролазер»/ двухмес., 2005, № 7-8, с. 4-7, 5000 экз.
2. Горожанина Е.С., Тихомирова Т.А., Светличкин В.В., Писарева В.М. / Идентификация белковых добавок в составе рубленых
полуфабрикатов и фаршевых изделий // Практик: научно-практический информационный журн. / Учредитель и издатель НПО «Петролазер»/ двухмес., 2005, № 9-10, с. 26-29, 5000 экз.
3. Горожанина Е.С. / Идентификация видовой принадлежности белка с использованием SDS-электрофореза // Материалы международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва A.A. 22-23 июня 2006 года г. Воронеж / Воронеж, «Научная книга», ISBN 5-98222-1260,2006, с. 1041-1044,200 экз.
4. Каверин A.B., Рошупкина JI.B., Горожанина Е.С., Бутко М.П. / Тестирование сои в стерилизованных консервах на основе ПЦР, ДНК-гибридизации и ИФА. // Материалы 5-ой международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения», МГУПБ, Москва, 2006, с. 42-47,800 экз.
5. Каверин A.B., Рощупкина Л.В., Горожанина Е.С., Галкин A.B./ Использование метода ПЦР в экспертизе пищевых продуктов для видовой идентификации сырья животного происхождения. // Материалы 5-ой международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения», МГУПБ, Москва, 2006, с. 48-52, 800 экз.
6. Тихомирова Т.А., Горожанина Е.С. / Проблемы мониторинга ГМО: практика лаборатории // Методы оценки соответствия: научно-практический журн./ Учредитель и издатель ООО «РИА «Стандарты и качество»/ ежемес. ISSN 1990-7850, 2006, №10(4), с. 17-19,1500 экз.
7. Горожанина Е.С., Нохрина Н.В., Крючкова Ю.Г. / Экспериментальные подходы к оценке безопасности и качества мясной продукции // Мясные технологии: журн./ Издатель: ЗАО «Отраслевые ведомости», 2006, №11, с. 4-6,4000 экз.
8. Тихомирова Т.А., Горожанина Е.С., Ефремова A.C., Авылов Ч.К. / Идентификация сырья и продуктов животного и растительного происхождения методом SDS-электрофореза. // Все о мясе: журн./ Учредитель и издатель «Мясной союз России», 2007, №3, с. 15-17,900 экз.
ВНИИВСГЭ, 2007, г. Москва, Звенигородское ш., 5, Заказ 235/3, тираж 80 экз.
Оглавление диссертации Горожанина, Елена Сергеевна :: 2007 :: Москва
ВВЕДЕНИЕ.
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
1.1. Техническое регулирование и подтверждение соответствия продукции.
1.2. Дополнительные источники белка, используемые при 12 изготовлении пищевых продуктов.
1.3. Аспекты фальсификации пищевых продуктов.
1.4. Методические приемы идентификации и контроля качества сырья и пищевых продуктов.
1.5. Метод электрофоретического разделения белков: принципы и использование в экспертизе пищевых продуктов.
Введение диссертации по теме "Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза", Горожанина, Елена Сергеевна, автореферат
Актуальность темы.
Проблема многостороннего изучения пищевых продуктов, в частности, их идентификация, является наиболее актуальной, поскольку современная технология их производства претерпела существенные изменения. Они касаются исходного сырья и вспомогательных материалов, используемых на всех этапах производства продукции. Это и новые технологии производства белковых продуктов из растительного сырья, а также введение в продовольственное сырье и продукты питания пищевых добавок искусственного происхождения.
В последние годы широко применяются белковые добавки животного (субпродукты, кровь и ее фракции, казеинаты, меланж и др.) и растительного (соевые белки, белки масличных культур) происхождения. Введение соевых белков позволяет стабилизировать функционально-технологические свойства мясного сырья, обогащает продукт полноценным белком и улучшает консистенцию, внешний вид и сочность готовых мясных изделий. Уменьшение потерь при термообработке и хранении, увеличение выхода готовой продукции при использовании соевого белка значительно снижает ее себестоимость. Избыточное содержание добавок растительного происхождения приводит к снижению качества мясных изделий, а низкая себестоимость становится причиной фальсификации продуктов.
Увеличение поступления на потребительский рынок различной по составу мясной продукции требует всестороннего комплексного контроля её качества, соответствия её потребительским требованиям и представленной технической документации.
Все продукты, поступающие на потребительский рынок, проходят проверку на безопасность и подтверждение соответствия. Идентификация продукции в свете закона «О техническом регулировании» является одним из главных и основных элементов сертификации, которая не должна «вводить в заблуждение потребителя».
Поэтому в практике при оценке качества мясного продукта возникает необходимость проведения идентификации его реального состава в соответствии с декларированными нормативными документами.
Целью подобной идентификации является определение и подтверждение подлинности конкретного вида и наименования товара, а также соответствие определенным требованиям или информации, указанной на этикетке или в товарно-сопроводительных документах.
Применение химических, физико-химических и биохимических методов позволяет получить только часть необходимой информации о качестве мясопродуктов.
В мировой практике для выяснения состава пищевых продуктов опробованы различные методы: иммуноферментного анализа, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью, хроматографического анализа, обладающий большой чувствительностью и быстротой исполнения. Однако они не позволяют выявить замену мышечной ткани другими животными компонентами - легкими, печенью, выменем.
Ценную информацию о качестве продукта позволяет получить гистологический метод - метод прямого определения состава сырья. Микроскопические исследования позволяют судить как о составе продукта в целом, так и дифференцировать особенности тканевых и клеточных структур. Работа с биологическими объектами в пищевых продуктах имеет определенную специфику, поскольку исследованию подвергаются материалы после различных технологических воздействий. Гистологический метод трудоемок и требует специального оборудования, что вызывает определенные трудности его использования.
Проблема видовой идентификации может быть решена с использованием современных электрофоретических методов. Эти методы давно используются в научных исследованиях. Однако для применения их с целью экспертизы пищевых продуктов и внедрения в практику экспертных лабораторий необходима разработка и стандартизация оптимальных условий экстракции белков из нативных и термообработанных продуктов, использование определенных видов гелей и разработка условий проведения процесса электрофореза.
Это направление весьма перспективно в практике ветеринарной санитарии и экологии и дает возможность наиболее качественного анализа продуктов питания. Решение этой проблемы имеет научное и практическое значение.
Цель настоящей работы - разработка метода идентификации сырья и продуктов животного и растительного происхождения на основе SDS-электрофореза.
Задачи исследования:
1. Разработка оптимальных способов экстракции белков из нативных и термообработанных пищевых продуктов для последующего анализа их электрофоретическим методом.
2. Разработка метода видовой идентификации по выявлению видоспецифических маркерных белковых зон на электрофоретических спектрах.
3. Разработка методики количественной оценки компонентов смешанных фаршей.
4. Разработка метода качественного и количественного определения сои в смешанных фаршах.
5. Идентификация сои в составе колбасных изделий.
6. Идентификация сои в составе стерилизованных мясорастительных консервов на основе ДНК-диагностики.
7. Разработка схемы анализа видовой принадлежности продуктов животного и растительного происхождения.
8. Проведение лабораторных мониторинговых исследований пищевой продукции с использованием разработанных методов.
Научная новизна:
На основе использования электрофореза в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия (SDS) разработан способ анализа мясных продуктов, позволяющий проводить определение видовой принадлежности белка, количественно оценивать составляющие многокомпонентного фарша, в том числе белковые добавки растительного происхождения.
Определены характерные видоспецифические маркерные белковые зоны, по которым может быть проведена идентификация видовой принадлежности белка в составе пищевого продукта. Создана коллекция электрофореграмм белков животного и растительного происхождения.
Проведена адаптация метода полимеразно-цепной реакции с детекцией гибридизационно-иммуноферментным анализом (ПЦР-ГИФА) для анализа мясных и мясорастительных консервов с целью идентификации в них сои.
Практическая ценность.
Разработанные методы расширяют возможности ветеринарных и сертификационных лабораторий и позволяют определять видовую принадлежность сырья, выявлять наличие белковых добавок животного и растительного происхождения в многокомпонентных нативных и термообработанных пищевых продуктах и оценивать их количество.
Результаты работы используются при проведении исследований пищевых продуктов в Главном экспертно-аналитическом центре «СОЭКС» Автономной некоммерческой организации «Союзэкспертиза» Торгово-промышленной палаты РФ.
На основании результатов исследований разработаны:
- методические рекомендации «Определение видового состава продуктов методом SDS-электрофореза» (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 19.01.2007 г.),
- методические рекомендации «Определение видового состава продуктов методом SDS-электрофореза» (утверждены Торгово-промышленной палатой РФ 10.04.2007 г.)
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
- Международной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва А. А. (Воронеж, 2006 г.)
- заседании Ученого совета ГНУ ВНИИВСГЭ (2007 г.)
Публикации. Результаты исследований отражены в 8 научных статьях.
Положения, выносимые на защиту.
1. Разработка оптимальных способов экстракции белков из нативных и термообработанных пищевых продуктов для последующего анализа их электрофоретическими методами.
2. Оптимизация электрофоретического разделения белков с использованием различных гелей с целью высокой степени воспроизводимости.
3. Идентификация белков животного и растительного происхождения по видоспецифическим маркерным белковым зонам.
4. Разработка метода количественного определения компонентов в многокомпонентных пищевых системах с использованием метода SDS-электрофореза в сочетании с денситометрией.
5. Идентификация сои в составе стерилизованных мясорастительных консервов на основе ДНК-диагностики.
6. Проведение мониторинговых исследований по видовой идентификации и выявлению фальсифицирующих примесей в пищевых продуктах.
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка метода идентификации сырья и продуктов животного и растительного происхождения на основе SDS-электрофореза"
ВЫВОДЫ:
1. Использование метода SDS-электрофореза позволяет с высокой точностью идентифицировать видовую принадлежность белков животного и растительного происхождения в сырье и термообработанных колбасных изделиях.
2. Подобраные оптимальные способы экстракции белков из нативных и термообработанных пищевых продуктов (трис-HCI буфер рН 8,0, содержащий 1% додецилсульфата и 5% В-меркаптоэтанола) обеспечивают оптимальную экстракцию белков, необходимую для анализа в системе PhastSystem. Наилучшее разделение достигается с использованием гелей с градиентом 10-15 при апликации образцов вблизи катода.
3. На основании метода SDS-электрофореза в сочетании с денситометрией разработан способ качественной оценки различных составляющих в многокомпонентных пищевых продуктах (фаршевые изделия и термообработанные пищевые продукты) по выявлению на электрофореграмме видоспецифических маркерных белковых зон, по которым может быть проведена идентификация видовой принадлежности белка в составе пищевого продукта.
4. Разработанные модифицированные методики качественного и количественного анализа белков позволяют определять сою в многокомпонентных пищевых системах.
5. Для определения наличия соевых добавок в стерилизованных мясных и мясорастительных консервах показана необходимость использования ПЦР-метода.
6. На основании полученных результатов предложена последовательная система методов идентификации видовой принадлежности продуктов животного и растительного происхождения на основе SDS-электрофореза, изоэлектрофокусировки и ПЦР.
7. Мониторинговые исследования пищевой продукции с применением разработанных методов исследования видовой идентификации показали возможность выявления недекларированных компонентов растительного и животного происхожденияих.
8. Разработанные методы могут быть использованы для скрининговых тестов и количественного определения отдельных составляющих в многокомпонентных смесях животного и растительного происхождения.
Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2007 года, Горожанина, Елена Сергеевна
1. Аксюк И.Н., Пятницкая И.Н., Сомин В.И. Химический состав новых источников пищи и их биологическая ценность. Журнал всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева. - 1978, Т. 23, №4, с. 435-442.
2. Александрова Н.А. и др. Методы оценки качества мяса и мясопродуктов за рубежом // М., 1997, с. 156.
3. Антипова Л.В., Глотова И.А. Основы рационального использования вторичного коллагенсодержащего сырья мясной промышленности. -Воронеж. ВГТА, 1997, 37 с.
4. Антипова Л.В., Глотова И.А., Рогов И.А. Методы исследования мяса и мясных продуктов. М.: Колос, 2001, с.31.
5. Ахмичева О.В. Использование энзимов при производстве мясных изделий. // Мясная индустрия, 2005, №1, с. 35.
6. Алехина Л.В., Андреенко В.И., Ивашов В.И. Современные методы анализа качества мяса и мясопродуктов // Мясная промышленность, АгроНИИТЭИММП, М„ 1991, с. 35.
7. Базарнова Ю.Г., Соскин В.И. Повышение пищевой ценности мясных продуктов. // Мясная индустрия, 2005, №2, с. 42-43.
8. Белова В.Ю. Пищевые ингредиенты забота о качестве. // Мясная индустрия, 2005, №1, с. 69-72.
9. Браудо Е.Е. Растительный белок: новые перспективы / Под ред. Е.Е. Браудо М.: Пищепромиздат, 2000, 27 с.
10. Бутко М.П., Шапкина Л.П. Санитарно-гигиенические проблемы экспертизы мяса пернатой дичи // Сб. трудов 7-го Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России» Москва, 2003, с. 90.
11. Вильфрид Штельтер, Николаев А.С. Представляем новые комплексные пищевые ингредиенты. // Мясная индустрия, 2005, №1, с. 41.
12. Витт С.В., Сапоровская М.Б., Беликов В.Н. Об анализе аминокислот методом газо-жидкосткой хроматографии // Журнал аналитической химии, 1966, т. 21, №2, с. 227-231.
13. Галкин А.В., Комаров В.Н., Иванова Е.А. Иммуноферментный метод экспресс контроля продовольственного сырья и пищевых продуктов на содержание потенциально опасных химических соединений. // Хранение и переработка сельхозсырья., №5, 1998, с. 21-24.
14. Горовой В.И., Есейчик В.И., Хиль Г.Н. Основные направления использования вторичных ресурсов на предприятиях пищевой промышленности. В: Пищевая промышленность, Агро НИИТЭИММП, М., 1987, с. 14-17.
15. ГОСТ 23392-78 Мясо. Методы химического и микроскопического анализа свежести.
16. ГОСТ 23481-79 Мясо птицы. Метод гистологического анализа.
17. ГОСТ 25011-81 Мясо и мясные продукты. Методы определения белка.
18. ГОСТ 7269-79 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести.
19. ГОСТ Р 50453-92 ИСО 937-78 Мясо и мясные продукты. Определение содержания азота (арбитражный метод).
20. Гутник Б.Е., Сметанина Л.Б. и др. Соевая мука стабильного качества для мясных продуктов. // Мясная индустрия, 2005, №2, с. 63-65.
21. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М., Мир, 1976, 364 с.
22. Долгов В.А., Лавина С.А. Методические аспекты оценки качества и безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья // Сб.трудов 7-го всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России» Москва, 2003, с. 162.
23. Донченко J1.B., Надыкта В.Д. Безопасность пищевого сырья и продуктов питания М., Пищепромиздат, 1999, с. 352.
24. Донченко J1.B., Надыкта В.Д. Безопасность пищевой продукции // М., Пищепромиздат, 2001, с.525.
25. Доценко С.М., Скрипко О.В. Парфенова С.Н. Полуфабрикаты из мясорастительного фарша. // Мясная индустрия, 2005, №2, с. 28-30.
26. Жаринов А.И., Хлебников И.В., Мадалиев И.К. Вторичное белоксодержащее сырье: способы обработки и использования. // Мясная промышленность, 1993, №2, с. 22-24.
27. Журавская Н.К., Алехина J1.T., Опряшенкова J1.M. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов // М., Агропромиздат, 1985, с. 296.
28. Заяс Ю.Ф. Качество мяса и мясопродуктов М., Легкая и пищевая промышленность, 1981, с. 312.
29. Красуля О.Н., Краснов А.Е. и др. Моделирование рецептур мясных продуктов в условиях информационной неопределенности. // Мясная индустрия, 2005, №1, с.43-46.
30. Икач М., Маликова В.И., Гутник Б.Е. и др. Рекомендации по применению соевой муки нового поколения компании «Сояпротеин». // Мясная индустрия, 2005, №1, с. 35.
31. Кудряшов J1.C., Грикшас, Орлова Г.В. Перспективы использования сыворотки в реструктурированных изделиях. / Мясная индустрия, 2005, №2, с.20-22.
32. Кузнецова Т.Г. Оценка морфологических свойств мясного сырья и колбасных изделий по микроструктурным показателям // М., Автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук, 1997.
33. Кузнецова Т.Г., Белоусов А.А. и др. Микроструктурные изменения свинины при биотехнологических воздействиях. // Мясная индустрия, 2001, №6, с. 33-35.
34. Лабораторные исследования в ветеринарии: химико-токсикологические методы. Под ред. Антонова Б.И. // М.: Агропромиздат, 1989, с. 319.
35. Ленинджер А. Биохимия, М., Мир, 1974, с.94-99.
36. Лори Т.А. Наука о мясе // М., Пищевая промышленность, 1973, с.198.
37. Лугас Э.В., Ки Чун Ри Руководство по переработке и использованию сои. М.: Колос, 2001, 31 с.
38. Лушников К.В., Патрушев М.В., Возняк М.В., Возняк В.М. Использование иммуноферментного анализа для определения генетически-модифицированных источников в пищевой продукции. // Партнеры и конкуренты, 2004, № 9 , с. 36-39.
39. Маурер Г.Р. Диск-электрофорез. М., Мир, 1969, 247 с.
40. Николаева М.А., Лычников Д.С., Неверов А.Н. Идентификация и фальсификация пищевых продуктов М., Экономика, 1996, с. 84-95.
41. Остерман М.Б. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М., Наука, 1981, 288 с.
42. Остерман М.Б. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами М., Наука, 1983, с. 4-45.
43. Переплетчик P.P. Замораживание, упаковка и хранение мороженой рыбы. ППИ, М„ 1957, с. 12-15.
44. Писарева В.М. Электрофоретический метод в анализе пищевых продуктов // Вопросы питания, 1998, №3, с. 41-42.
45. Писарева В.М. Способы выделения соевого белка в колбасныхизделиях //Вопросы питания, 1998,№4, с. 43-44.
46. Писарева В.М. Идентификация белков животного происхождения в пищевых продуктах электрофоретическим методом // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва 1999.
47. Покровский А.А. Некоторые проблемы биохимии питания. // Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева, 1965, Т. 10, №3, с. 247-256.
48. Попелло И.А., Гурова Н.В. О роли нативности соевых белков при оценке функционально-технологических свойств белковых препаратов. // Мясная индустрия. 1999, №5, с. 12-13.
49. Производственно-технический контроль и методы оценки качества мяса и птицепродуктов. Под ред. Горбатова В.М. М., «Пищевая промышленность», 1974, с. 274.
50. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. Под редакцией Скурихина И.М., Тутеляна В.А. М., Изд. «Брандес», « Медицина», 1998, с. 232.
51. Румянцева Г.Н., Осадько М.И. Свойства белков сои и гороха, полученных биотехнологическим способом. // Мясная индустрия, 2005, №2, с. 44-45.
52. Серкл С.Д., Смит А.К. Соевые бобы: переработка и продукты. В.: «Источники пищевого белка», М.: Колос, 1979, с. 67-87.
53. Скалинский Е.И., Белоусов А.А. Микроструктура мяса. // Пищевая промышленность, 1978, с. 155-175.
54. Сметанин Н.А. Основные показатели мирового рыболовства. // Рыбное хозяйство, 1967, №10, с. 69-74.
55. Соколов А А. Физико-химические и биохимические основы технологии мясопродуктов. М.: Пищевая промышленность, 1965, 490 с.
56. Стрекозов Н.И., Фомичев Ю.П., Горбунов В.И., Никанова JI.A., Маркелова В.Н., Веротченко М.А., Шайдуллина Р.Г., Кошелева Г.Н., Чернушенко В.К., Панкина Г.В., Поповец Г.И., Кораблина Л.В., Гуденко
57. Н.Д., Пышечкин Н.П. Сертификация и требования к качеству продукции агропромышленного комплекса России Дубровицы, 1998, с. 357.
58. Тертон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. и др. Новые методы иммуноанализа. Пер. санг. - М.: Мир, 1991, 280 с.
59. Толстогузов В.Б. Искусственные продукты питания. М.: Наука, 1979, 232 с.
60. Толстогузов В.Б. Новые формы белковой пищи. М.: Агропромиздат, 1987, 303 с.
61. Хвыля С.И., Авилов В.В., Кузнецова Т.Г. Практическое применение гистологических методов анализа // Мясная промышленность, 1994, №6, с. 911.
62. Хубертус Вагнер. Химия мяса как пищевого продукта. // Новое мясное дело, 2005, №1, с. 48-50.
63. Шляпников С.В., Карпейский М.Я. и др. Применение метода газожидкостной хроматографии для количественного анализа аминокислот. // Биохимия, 1965, т. 30, №3, с. 457-462.
64. Araki Н. Et al. Histochemical properties of muscle fiber in breiler chickens // Jap. Soc of Sci Fish. 1993, v.34, № 2, p. 137-144.
65. Baldwin A.R. Summary of the world soy protein conference. J.American Chem. Oil Soc., vol. 48, 1971, p. 484.
66. Beisiegel U. Protein blotting. // Electrophoresis, №7, 1986, p. 1-18.
67. Bennet H.S. The structure and functional muscle // Academic Press, New York, v. 1, 1960, p. 137.
68. Blay K., Darbe A. Getting of flu amino acids for gas chromatography. // Biochemical J., v. 60, 1964, № 7, p. 8327-8333.
69. Blay K., Darbe A. Some problems quantity aminoacid analysis by gas chromatography. // Chem. Analyt., v. 47, 1965, №12, p. 631-633.
70. Codex Alimentarius // Vol. 10, FAO, WHO, 1991, 223 p.
71. Codex Alimentarius Volume Thirteen. Methods of analysis and sampling // Vol. 13, FAO, WHO, 1994, 134 p.
72. Codex Alimentarius Volume Ten. Meat and meat products including soups and broths // Vol. 10, FAO, WHO, 1994, 222 p.
73. Cruickshank P. A, Sheehan J.C. The gas chromatography of methyl ether from amino acids. // Analyt. Chem., v. 36, 1964, №7, p. 1191-1197.
74. FAO-WHO. Amino acid content of food and biological date on protein. -//Nutritional Stud., 1970, №24, p. 24-32.
75. Fleming I., Lumbley J. Validation of new techniques for the analysis of foods // Food Sciens and technology today, v. 9., № 2, 1995, p. 84-85.
76. Gershoni J.M., Palade G.E. Electrophoretic transfer of Proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to positively charged membrane filter. - Anal. Biochem., v. 124, 1982, p. 396-405.
77. Gershoni J.M., Palade G.E. Protein blotting: Principles and applications. //Anal. Biochem., v.131, 1983, p. 1-15.
78. Hauri H.P., Bucher K. Immunoblotting with monoclonal antibodies: Importance of the blocking solution. Anal. Biochem., v. 159, 1986, p.386-389.
79. Hermansson A.M., Akesson C. Functional properties of added proteins correlated with properties of meat system. // J. Food Sci., v. 40, 1975, p. 595-610.
80. Hermansson A.M. Physico-chemical aspects of soy proteins structure formation. // J.Texture Stud., 1978, №9, p. 33-37
81. Hoffmann K. Identification and determination of meat and foreign proteins by means of dodecylsulfat poliacrylamid gel electrophoresis // Ann. Nutr. Alim., v. 31, № 2, 1997, p. 207-215.
82. Hoffmann K., Penny I.T. Methode zur identifizierung und quantitatizen Bestimmund von Fleisch und Fremdeiness mit Hilfe de SDS. Polyacrylamid -Electrophorese anf Flachgelen. // Fleischwirtschafi, v.53, 1973, p. 252-254.
83. ISO 9001. Quality systems models for quality assurance in design, 1987, pp. 6-8.
84. Jannsen E. Method adapted to PhastSystem // Z. Lebensm. Unterrs. Forsh.-1986.-v. 182,-p.479-483.
85. King N.L. Kurt L. Analysis of raw beef samples for adulterant meat species by enzyme staining of isoelectric focusing gels // J. Food Sci.,—1982.-v.47, p. 1608-1612.
86. Kofoth M. Aktuelles aus der international Fleischforschung // Fleischwirtschaft, 1999, № 8, p. 68-69.
87. Laemmli U.K. Cleavade of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriofage TH. // Nature, v. 227, 1970, p. 680.
88. Lamaire W.A. Food in the year 2000. Food Ingineering, v. 90,1985, № 5, p. 34-38.
89. Ludke H., Bargholz J., Leiterer M. Wertbestimmende und Einige toxische Inhaltsstoffe in Fleisch und Verarbeitungsprodukten von Pute und Schwein. Schr.-R // Verb. Dt. Landw. Unters. Forsch. -Anst., Darmstadt, 1993, № 37, S. 669672.
90. Marchylo B.A. Fast gorizontal sodium dodecil sulphat gradient polyacrilamide gel electrophoresis for rapid wheat cultivar identification and analysis of high molecular weight glutenin subunits. // Cereal Chem., 1989, v. 66, № 3, p. 186-192.
91. Mattil F. Karl. Compositional, nutritional and functional properties, and quality criteria of soy protein concentrates and soy protein isolates. J. American Oil Chem. Soc., v. 51, 1974, p. 81 A.
92. Meyer J.A., Brown W.L. et al. Effects of emulsifiers on stability of sausage emulsions. // Food Techol., v.8 1964, p. 1796-1800.
93. Moio L., DiLuccia A., Addeo F. Fast isoelectric focusing of milk proteins on small ultrathin polyacrylamide gel containing urea // Electrophoresis. 1989, v.10, p.535-539.
94. Moio L., Sasso M.L., Chianese L., Addeo F. Rapid detection of bovin milk in ovine, caprine and water buffalo milk or cheese by gel isoelectric focusing on PhastSystem. // Ital. J. Food Sci., 1990, v.3, p. 71-176.
95. Moor S., Stein W.H. Detection of protein composition by colon chromatography. // J. Biol. Chem., v. 211, 1954. p. 893
96. Morei M.H. Separation of durum wheat proteins by ultrathin layer isoelectric focusing. // Electrophoresis, 1990, v.l 1, p. 392-399.
97. New analytical system to improve food quality management // Int. Labmate, 2001, 25, № 7, p. 36.
98. Patterson R.M., Whittaker R.H., Spencer T.L. Improved species identification of raw meat by double sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. // J. Sci. Food Agric., vol. 35, 1984, p. 1018-1023.
99. Righetty P.G., Drysdale J.W. Isoelectric focusing in gels. J. Chromatogr., v.98, 1974, p. 271-321.
100. Rehben H. Electrophoretic techniques for species identification of fichery products. // Z, Lebensm. Unters Forsch., 1990, v. 191, p. 1-10.
101. Ronald G. Berger, Richard P. Magean et al. Detection of Poultry and Pork in Cooked and Canned Meat Foods by Enzyme-linlked Immunosorbent Assays. //J. Assoc. off Anal. Chem, vol. 71, №2, 1988, p. 406-409.
102. Sarivis C.A. Improved blocking of monospecific antibody binding sites on nitrocellulose membranes. // Electrophoresis, №5, 1984, p. 54-55.
103. Seymour C. Electrophoresis technology: food and reverage analysis. // Food Tech. Europe, 1993, Sept/Nov., p. 127-152.
104. Scorpes R.K., Penny I.F. Subunit sizes of muscle proteins as determined by sodium dodecylsulfat gel electroforesis. // Biochim. Biophys. Alta, 1979, p. 409-415.
105. Towbin H. et al. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad., v. 76, 1979, p. 4350-4354.
106. Van-Heekken D.L., Thompson M.P. Application of PhastSystem to the resolution of bovine mill proteins on urea-polyacrylamide gel electrophoresis. // J. Dairy Sci., 1992, v.75, p. 204-210.
107. Weiss H., Postel J., Gorg H. Barley cultivar discrimination: 2. Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis and isoeletric focusing with immobilized pH gradients. Electrophoresis, 1991, v.12, p. 323-338.
108. Williams K.W., Soderberg L. A carrier ampholyte for isoelectric focusing. // International Laboratory, № 96, 1979, h. 263-278.
109. Wilson C.M. Studies and critique of Amido Black 10B, Coomassie Blue R and Fast Green FCF as stain for proteins after polyacrylamide gel electrophoresis. // Anal. Biochem., № 96, 1979, p. 263-278
110. Winter L. M. The identification of amino asids by gas chromatography. // Gas chromatogr., v. 2, № 1, 1964, p. I -6.
111. Wolf W.I. Soybean proteins: their production, properties and food uses. // J. Amer. Oil Chem. Soc., 1971, p. 484.
112. Yman I. M. Meat and fish species identification by isoelectric focusing // Food laboratory news, v.6, №2, 1990, p. 28-31.
113. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
114. Горожанина Е.С. / Идентификация белковых добавок в составеколбасных изделий // Практик: научно-практический информационный журн. / Учредитель и издатель НПО «Петролазер»/ двухмес., 2005, № 7-8, с. 4-7, 5000 экз.
115. Тихомирова Т.А., Горожанина Е.С. / Проблемы мониторинга ГМО: практика лаборатории // Методы оценки соответствия: научно-практический журн./ Учредитель и издатель ООО «РИА «Стандарты и качество»/ ежемес. ISSN 1990-7850, 2006, №10(4), с. 17-19, 1500 экз.
116. Горожанина Е.С., Нохрина Н.В., Крючкова Ю.Г. /
117. Экспериментальные подходы к оценке безопасности и качества мясной продукции // Мясные технологии: журн./ Издатель: ЗАО «Отраслевые ведомости», 2006, №11, с. 4-6,4000 экз.
118. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК Отделение ветеринарной медицины1. УТВЕРЖДАЮ
119. Академик-секретарь отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемииr^XU m1. К^ЬШщг/.о1. A.M. Смирнов1. СЗ 200 ^г.
120. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ по видовой идентификации белков животного и растительного происхождения методом SDS-электрофореза1. Москва 2007 г.
121. АНО «Союзэкспертиза» ТПП РФ Л^^^^В.А. Голицын1. О » a h-jUu+A- 2007 г.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИпо определению видового состава продуктов методом SDS-электрофореза1. Москва 2007 г.s s 31. Общие положения.
122. Для определения количественного состава многокомпонентных смесей проводят денситометрию полученных электрофореграмм.
123. Методика идентификации белков животного и растительного происхождения методом SDS-электрофореза.
124. Центрифугаты наносят на гребенку с шестью ячейками по 3,5 мкл каждого образца. Использование гребенки с большим количеством ячеек усложняет количественный обсчет результатов.
125. Для определения доли каждого компонента в многокомпонентном фарше (мясном, мясорастительном) проводят денситометрию электрофореграмм экстрактов фарша и индивидуальных его компонентов с использованием лазерного сканирующего денситометра.
126. По соотношению пиков маркерных видоспецифических белков виндивидуальных образцах мяса и в образцах смешанных фаршей можно вычислить долю каждого компонента (в процентах) по формуле: С=В/А х 100%, где:
127. За результат принимается среднее арифметическое значение определений, выполненных для 3-х параллельных электрофореграмм исследуемого продукта.