Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Идентификация белков животного происхождения в пищевых продуктах электрофоретическим методом

■V

/

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

ПИСАРЕВА ВЕРА МИХАЙЛОВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

16.00.06 - Ветеринарная санитария и экология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Научный руководитель профессор,

доктор ветеринарных наук Родин В.И.

Москва 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ. ВВЕДЕНИЕ....................................................... 4

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................... 8

1.1. Методические приемы идентификации и контроля качества

мяса и рыбы....................................................... 11

1.1.1 .Органолептические методы исследования....... 11

1.1.2.Гистологические методы исследования.......... 14

1.1.3. Химические методы исследования................ 16

1.2 Метод электрофоретического разделения белков: принципы и использование в экспертизе пищевых продуктов............................................................. 20

1.2.1.Электрофорез в нативных и денатурирующих условиях.......................~.............................. 21

1.2.2. Изоэлектрофокусирование (ИЭФ)............... 23

1.2.3, Иммунохимические методы определения видовой специфичности образцов мяса............................ 28

1.3 Оценка дополнительных источников белка, используемых при производстве пищевых

продуктов. ......................... 30

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ .................. 38

2.1. Материалы и объекты исследования.................... 38

2.2. Методы исследования......................................... 38

2.2.1. Изоэлектрофокусирование............................................................38

2.2.2. ЗБЭ- электрофорез..................................................................................42

2.2.3. Денситометрия............................................................................................44

2.3. Результаты исследования........................................................................46

2.3.1. Анализ видовой принадлежности мяса

сельскохозяйственных животных, птицы и субпродуктов изоэлектрофокусированием........... 46

2. 3.1.1.Выбор условий солюбилизации белков из мясных продуктов......................................................... 46

2.3.1.2.Создание коллекции (атласа) электрофореграмм белков различных видов мяса и субпродуктов......... 48

2.3.1.3. Определение качественного и количественного

состава многокомпонентного фарша.......................... 55

2. 3.2. Анализ видовой принадлежности рыбы методом изоэлектрофокусирования.................................... 62

2.3.2.1.Выбор условий солюбилизации белков рыбы и создание коллекции (атласа) электрофореграмм белков различных видов рыбы..................................................... 62

2.3.2.2.Определение видовой специфичности и количественная

оценка составляющих рыбного фарша........V............. 67

2.3.3. Анализ термообработанных продуктов электрофорети-

ческими методами.............................................. 74

2.3.3.1 Анализ термообработанных продуктов методом 8Б8-электрофореза. .........................74

2.3.3.2. Разработка способа экстракции белков колбасных изделий для анализа их электрофокусированием в стандартных полиакриламидных гелях....................... 77

2.3.3.3. Выявление и полуколичественное определение

соевого наполнителя колбасного фарша.........................78

2.3.3.^Количественная оценка содержания соевых белков в колбасных изделиях.................................................81

III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...........................87

ВЫВОДЫ.......................................................... 92

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................94

ВВЕДЕНИЕ

Становление рыночных отношений, их дальнейшее развитие и совершенствование требуют чёткого подхода к характеристикам пищевых продуктов. В связи с этим проблема многостороннего изучения пищевых продуктов была и будет актуальной независимо от общественных формаций и производственных отношений.

Экспертное и ветеринарно-санитарное исследование пищевых продуктов включает в себя оценку видовых, качественных, количественных и стоимостных характеристик товара. Важнейшим элементом этой оценки является идентификация товаров.

Цель идентификации- выявление и подтверждение подлинности конкретного вида и наименования продукта, а также соответствия требованиям научно-технической документации и информации о нём, указанной на маркировке и товарно-сопроводительных документах. Конечный результат идентификации носит альтернативный характер: выявляется либо соответствие, либо несоответствие продукта определённым требованиям. ' Отрицательный результат при идентификации свидетельствует о фальсификации товара.

Используемые в настоящее время для идентификации пищевых продуктов органолептические, химические и гистологические методы позволяют осуществлять контроль качества товара (включая также ветеринарно-санитарный контроль), однако они имеют существенные ограничения в случае идентификации видовой принадлежности мясных и$и рыбных продуктов, особенно если дело касается близкородственных видов.

Значительные трудности представляет также идентификация различных белковых добавок в мясных изделиях, избыточное содержание которых приводит к значительному снижению

качественных показателей продуктов. С каждым годом ассортимент препаратов, используемых в качестве таких добавок все более расширяется. Это и вторичные продукты переработки молока (обрат), и боенская кровь (плазма, сыворотка), и белок масличных культур. Относительно низкая себестоимость этих добавок и стала причиной все более часто встречающихся случаев фальсификации пищевых продуктов, в частности, колбасных изделий, консервов и других мясопродуктов.

Перечисленные проблемы могут быть разрешены с использованием современных электрофоретических методов. Эти методы используются в научных исследованиях, однако для применения с целью экспертизы пищевых продуктов и внедрения их в практику экспертных лабораторий необходима разработка и стандартизация оптимальных условий экстракции белков из нативных и термообработанных пищевых продуктов, а также создание атласа (коллекции) электрофореграмм различных белковых продуктов животного и растительного происхождения, который может в дальнейшем использоваться для идентификации исследуемых образцов.

Это направление открывает широкие перспективы в практике ветеринарной санитарии и экологии, дает возможность наиболее качественного анализа продуктов питания. Решение этой проблемы имеет как научное, так и практическое значение.

Цель настоящей работы - идентификация видовой принадлежности мясных, рыбных и других белковых продуктов животного и растительного происхождения, а также количественная оценка различных составляющих в нативных и термообработанных многокомпонентных мясных и рыбных продуктах

электрофоретическими методами.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать оптимальные способы экстрации белков из колбасных изделий для последующего их анализа электрофоретическими методами..

2. Определить характеристические видоспецифические белковые зоны, по которым может быть проведена идентификация видовой принадлежности мяса или рыбы.

3. Создать атлас электрофореграмм белков мяса и субпродуктов различных видов животных.

4. Создать атлас электрофореграмм белков различных видов

рыбы.

5. Дать оценку содержания соевых добавок в колбасных изделиях.

На основе использования электрофоретических методов разработан новый способ анализа мясных и рыбных продуктов, позволяющий проводить определение видовой принадлежности исследуемых образцов мяса или рыбы, качественно и количественно оценивать составляющие многокомпонентного фарша, а также немясные белковые добавки в колбасных изделиях.

Создана коллекция электрофореграмм белков различных образцов мяса, рыбы и птицы. Установлены существенные различия в белковых спектрах мяса и субпродуктов различных видов животных, а также близкородственных видов рыбы. Определены видоспецифические «маркерные» белковые зоны, по которым проводится видовая идентификация.

Впервые метод изоэлектрофокусирования адаптирован для анализа вареных колбас. Это стало возможным благодаря разработке нового способа экстракции белков из термообработанных продуктов, заключающегося в обработке их 3% раствором Тритона X 100.

Разработанный метод существенно расширяет возможности сертификационных лабораторий и позволяет выявлять

- видовую фальсификацию мяса и рыбы (даже в тех случаях, когда тестируемые образцы лишены своих характерных морфологических признаков),

- видовую фальсификацию в продуктах переработки мяса и рыбы, в том числе в многокомпонентном фарше,

- оценивать содержание каждого из составляющих мясного или рыбного фарша,

- выявлять и оценивать содержание немясных добавок растительного происхождения в колбасных изделиях.

Результаты исследований вошли в "Методические рекомендации по определению видовой принадлежности белков животного и растительного происхождения в пищевых продуктах изоэлектрофокусированием", которые используются при проведении сертификационных испытаний мясных и рыбных продуктов в фирме «Тест».

: »

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Литературный обзор посвящен рассмотрению методов, используемых в отечественных сертификационных лабораториях для идентификации и контроля качества мясных, рыбных и других белковых продуктов животного и растительного происхождения. Во второй части обзора приведены принципы электрофоретических методов, а также некоторые примеры использования этих методов в лабораториях стран Организации Объединенных Наций, осуществляющих контроль пищевых продуктов в соответствии с «Пищевым кодексом» ('Codex Alimentarius'). В связи , с тем, что электрофоретические методы являются перспективными для определения различных немясных белковых добавок в мясных изделиях, в настоящий обзор включена также глава, в которой рассмотрены дополнительные источники белка, нашедшие применение в пищевой промышленности.

Рассматривая проблему фальсификации пищевых продуктов, следует обратить внимание на основные аспекты, тесно связанные с ней.

Экономический аспект.. Фальсификация подразумевает под собой действия, направленные на обман потребителя путём подделки объекта купли-продажи с корыстной целью, т.е. может приносить существенный материальный ущерб потребителю. Значительные потери вследствие фальсификации несёт не только индивидуальный потребитель, но и общество в целом. При фальсификации товаров нерационально .используются природные, сырьевые и трудовые ресурсы, так как на производство некачественных ' продуктов затрачиваются сырьё, топливно-энергетические ресурсы, природные материалы и труд людей.

Медицинский аспект фальсификации связан с риском потребителя и нанесением вреда его жизни и здоровью, если

фальсифицированные продукты в результате использования заменителей становятся опасными.

Этическая сторона фальсификации затрагивает отношения между людьми. Доверие покупателя попирается обманными действиями фальсификаторов, так как при выявлении незаконных действий, направленных на замену продуктов питания некачественными или дешевыми заменителями, утрачивается доверие потребителей к товару и фирме. Так, широкое распространение обмана путём фальсификации объектов купли-продажи является свидетельством падения морально-нравственных устоев общества.

И, наконец, религиозный аспект фальсификации связан с тем, что в различных религиях существуют ограничения или запреты некоторых продуктов питания. Так, например, у мусульман существует запрет на употребление свинины, индусы не употребляют говядину, считая корову священным животным. Следовательно, фальсификация продуктов питания может привести к обману верующих людей, следующих своим священным традициям.

Итак, в широком смысле фальсификация может рассматриваться как действия, направленные на ухудшение потребительских свойств товара или уменьшение его количества при сохранении наиболее характерных, но несущественных для его использования по назначению, свойств (Николаева М.А. и др., 1996).

При фальсификации обычно подвергается подделке одна или несколько характеристик продукта, что позволяет выделить несколько взаимосвязанных видов.фальсификации:

- ассортиментная (видовая), качественная, количественная, стоимостная, информационная.

Рассмотрим некоторые виды фальсификации, применительно к мясным и рыбным изделиям.

Мясо и продукты его переработки - колбасные изделия, мясокопчёности, консервы, полуфабрикаты относятся к наиболее ценным продуктам питания, поэтому они попадают в разряд наиболее часто фальсифицируемых по качеству и ассортиментной принадлежности, причем первый вид фальсификации наиболее распространен.

Качественная фальсификация мяса обусловлена тем, что на убой могут быть направлены животные со скрытыми формами хронических инфекций и инвазией или облученные. Кроме того, может реализовываться или использоваться для переработки мясо трупов животных или убитых в состоянии агонии. К сожалению, на неконтролируемом рынке покупатели продуктов убоя таких животных рискуют не только собственным здоровьем, но иногда даже жизнью. Качественная фальсификация мясных продуктов может производиться также путём частичной замены ценного сырья (мяса) менее ценными компонентами (костной мукой, соевым белком и т.п.) (Журавская Н.К. и др., 1985).

До недавнего времени качественная фальсификация рыбы была наиболее часто встречаемой. Из способов качественной фальсификации рыбы отметим возможную замену живой рыбы снулой и вялой, несоблюдение установленных схемой разделки требований, реализацию больной рыбы.

Видовой фальсификации чаще всего подвергается рыба семейства лососевых, которая неодинакова по пищевой ценности. Среди наиболее ценных ^ выделяются атлантические лососи, поэтому на практике наиболее часта замена атлантических лососей (семга) дальневосточными (кета, горбуша, чавыча, кижуч).

Отдельные виды лососевых рыб имеют свои отличительные признаки: горбуша отличается от кеты меньшими размерами, более

мелкой чешуей, большим числом ветвистых лучей в анальных плавниках; чавыча отличается от кеты и семги наличием темных мелких пятен на спине, боках выше боковой линии, на спинном и хвостовом плавниках, по пятнистости чавыча похожа на кижуча, но ее легко отличить от него по большим размерам тела и более низкому хвостовому стеблю (Переплетчик P.P., 1957; Сметанин К.А., 1957). Однако, если образцы лишены своих морфологических признаков, например, фарш или «нарезка», воспользоваться ими не представляется возможным.

Таким образом, : становится очевидной актуальность проблемы выявления фальсификации мясных и рыбных продуктов.

1.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЁМЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МЯСА и РЫБЫ.

1.1.1. Органолептические методы исследования.

Органолептические способы идентификации и оценки качества пищевых продуктов, хотя и являются самыми простыми, тем не менее, в ряде случаев они могут быть полезными и информативными при сертификации. Они позволяют быстро оценить внешний вид продукта, определить его цвет, консистенцию и запах, то есть в первом приближении служить основой для контроля качества (Алехина JT.B. и др., 1991; Журавская Н.К. и др., 1985., Снегирев И.А. и др., 1976).

Определение органолептических показателей и структурно-механических свойств мяса.

Окраска мяса обусловлена в основном наличием пигмента мышечной ткани - миоглобина. Красная окраска поверхности свежего мяса на глубину до 4 см образуется за счёт оксимиоглобина. Более глубокие слои мяса окрашены миоглобином в пурпурно-красный цвет.

и

При сильной бактериальной обсеменённости наряду с потемнением мяса вследствие образования метмиоглобина можно наблюдать его обесцвечивание или появление специфической окраски. Некоторые плесени придают мясу чёрный, белый и сине-зелёный цвет. Вид и цвет мышц в глубинных слоях мышечной ткани определяют на свежем разрезе (ГОСТ 7269-79; ГОСТ 9959-91).

Консистенция мяса при гниении из упругой становится дряблой. Это связано с изменением состояния белков актомиозинового комплекса. Консистенцию определяют лёгким надавливанием пальца на свежий разрез. При этом следят за выравниванием образовавшейся ямки.

Для определения запаха чистым ножом делают надрез и определяют запах в глубинных слоях, При этом особое внимание обращают на запах мышечной ткани, прилегающей к кости (Алехина Л.В. идр.,1991).

Определение органолептических показателей мяса птицы.

Мясо неблизкородственных видов птицы имеет различную окраску. Характеристическими являются также внешний вид и цвет клюва, слизистой оболочки ротовой полости, глазного яблока, поверхности тушки, подкожной и внутренней жировой ткани, грудобрюшной серозной оболочки (ГОСТ 23481-79, 28825 - 90).

Определение органолептических показателей рыбы.

Видовая принадлежность рыбы, а также ее качество могут быть установлены при исследовании внешнего вида рыбы. При этом оценивают форму тела, вид и состояние чешуи, плавников и зубов, цвета мяса. Перечисл�