Совершенствование определения компонентного состава сырья и продуктов животного и растительного происхождения

Рощупкина, Луиза Владимировна

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Совершенствование определения компонентного состава сырья и продуктов животного и растительного происхождения

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Рощупкина, Луиза Владимировна Москва 2009 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 16.00.06

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Совершенствование определения компонентного состава сырья и продуктов животного и растительного происхождения

На правах рукописи

Рощупкина Луиза Владимировна

003471443

«Совершенствование определения компонентного состава сырья и продуктов животного и растительного происхождения»

16.00.06 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003471443

Работа выполнена в отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Светличкин

Вячеслав Владимирович (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Долгов Виктор Андреевич

(ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)

кандидат биологических наук Хоменец Николай Геннадиевич

(РУДН)

Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии

Защита состоится 0(~> 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии.

.у с

Автореферат разослан « ' Э » 0 0_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Н.С. Павлова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В соответствии с законом о «Техническом регулировании» производитель и продавец не должны вводить в заблуждение покупателя о составе своей продукции. Продукция должна отвечать всем требованиям технического регламента и соответствующего стандарта. Однако в некоторых случаях недобросовестные производители фальсифицируют продукцию.

В последние годы значительно увеличился ассортимент мясной продукции, в которой используются растительные добавки, при этом в качестве растительных компонентов могут применяться генно-модифицированные источники (ГМИ).

Объемы продукции, которая содержит компоненты животного и растительного происхождения, постоянно увеличиваются.

Продукция, содержащая белок или ДНК генно-модифицированных источников, должна соответствующим образом маркироваться. Сырье и продукция, содержащие компоненты животного и растительного происхождения, отличающиеся от декларированного содержания компонентов в нормативных документах (технических условиях, международных национальных и отраслевых стандартах), являются фальсифицированными.

Подтверждение соответствия сырья и продукции нормативным документам является важным элементом закона «О техническом регулировании» и проводится на разных стадиях оборота продукции: от производства до реализации в торговых точках. Естественно, что хорошо оснащенные аккредитованные Испытательные лаборатории могут осуществлять контроль с помощью высокочувствительных и специфичных методов на стадиях сертификации и регистрации сырья и продукции. Однако практические лаборатории ветеринарно-санитарного контроля нуждаются также и в экспрессных скрининговых методах.

В связи с этим актуальным является разработка и совершенствование методов, позволяющих проводить определение компонентного состава на

основе анализа белка или ДНК при скрининговых или арбитражных исследованиях. Наиболее перспективными в этом направлении являются методы ДНК- и иммунодиагностики (И.Н. Комарова, 2004; A.M. Смирнов и др., 2005; В.В. Светличкин, 2005; С.С. Huang, Т.М. Pan, 2005).

Цель и задачи исследований

Целью исследований являлось совершенствование определения компонентного состава сырья и продуктов животного и растительного происхождения.

В задачи исследований входило:

- разработать методику последовательного разделения белков и ДНК, позволяющую проводить параллельное определение компонентного состава продукции на основе анализа белка или нуклеиновых кислот;

- усовершенствовать методику определения компонентного состава сырья и продукции на основе иммунодиффузии для идентификации животных и растительных компонентов;

- усовершенствовать методику определения растительных и животных компонентов на основе ДНК-зондов;

- усовершенствовать методику определения компонентного состава сырья и продукции на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией;

провести сравнительное изучение методов определения компонентного состава сырья, термообработанных и нетермообработанных полуфабрикатов и мясных изделий, содержащих животные и растительные компоненты.

Научная новизиа

выявлять животные и растительные компоненты, включая компоненты из генно-модифицированных источников. При этом разработана модификация метода иммунодиффузии с фильтрами, пропитанными отечественными сыворотками, расширяющая спектр определяемых компонентов, включающий растительные белки, оленину, конину, лосятину и позволяющая проводить идентификацию в нетермообработанных полуфабрикатах с чувствительностью 4%.

Усовершенствована методика определения растительных и животных компонентов на основе ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с биотинилированными зондами с чувствительностью 1 %.

Усовершенствована методика определения компонентного состава продуктов, состоящих из ингредиентов животного и растительного происхождения, на основе ПЦР, включающая ускоренную пробоподготовку с применением детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида) и иммуномагнитосепарации, амплификацию ДНК и детектирование ампликонов по иммуноферментному типу с чувствительностью определения ДНК животного происхождения и ДНК ГМИ растений 0,1%.

Проведена сравнительная оценка методов, показавшая высокую чувствительность методов на основе ПЦР, а также специфичность, позволяющих проводить анализ в смешанных фаршах, полуфабрикатах и термообработанных мясорастительных колбасах.

Практическая ценность На основании результатов исследований разработаны «Методические рекомендации по определению состава сырья и продукции, состоящих из мясных и растительных компонентов с помощью реакции ДНК и иммунодиагностики» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 07.04.2008 г.).

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на: - Международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва A.A. (Воронеж, 2006 г.);

- Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007 г.);

- межлабораторном совещании ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии (2009 г.).

Публикации Результаты исследований отражены в 4 научных статьях, из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения.

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 7 рисунков. Список литературы включает 163 источника отечественных и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

Работа проводилась в период с 2005 по 2009 гг. Диссертационная работа выполнена на основании плана научно-исследовательских работ ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии и включает часть темы 08.05.02.03.

В работе использовались сырье и термообработанные и нетермообработанные полуфабрикаты: говядина, свинина, конина, оленина, лосятина, полуфабрикаты мясные рубленые быстрозамороженные (ТУ 9214003-53124469-2002. Шницель); пельмени быстрозамороженные «Тройные» (ТУ 9214-002-53124469-2002) из говядины, свинины, баранины; пельмени быстрозамороженные «Двойные» (ТУ 9214-002-53124469-2002) из говядины, свинины; фарши для приготовления колбас, состоящие из растительных и животных компонентов; колбаса полукопченая из конины «Конская особенная» высший сорт (ТУ 9213-068-52924334-05); колбаса «Докторская» (ГОСТ Р 52196-2003).

В работе использовались методы иммунопреципитации по Оухтерлони (Ouchterlony О., 1958); методы выделения ДНК по Мармуру (Marmur J., 1959); методы ДНК-гибридизации на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах (Denhardt D.T.,1966); методика определения видовой принадлежности мяса с использованием тест-систем ORBIT, PRIME, SOFT, PROFIT (США) (Морозова Е.Н., 2005), а также усовершенствованные методы на основе ДНК-и иммунодиагностики.

Результаты исследований

1. Разработка методики последовательного разделения белков и ДНК, позволяющей проводить параллельное определение компонентного состава продукции на основе анализа белка или нуклеиновых кислот

Нами разработана методика идентификации многокомпонентных смесей, содержащих компоненты растительного и животного происхождения, которая заключается в последовательной экстракции белков для анализа на основе иммунодиффузии.

После экстракции белков проводили выделение ДНК для определения видовой принадлежности компонентов, включая ГМИ, на основе различных методов ДНК-диагностики.

Схема определения компонентного состава представлена на рис. 1. Экстракцию белков проводили элюирукнцими буферами, выделение ДНК осуществляли с помощью детергента СТАВ и иммуномагнитосепарации с сорбентами «Silica» (Si02).

Для пробоподготовки многокомпонентных смесей на основе методов идентификации с помощью ДНК- и иммунодиагностики необходимо одновременно выделить и нативные белки, и очищенную ДНК. Выделение белковых фракций для последующей постановки иммунодиффузии осуществляли путем экстракции различными буферными системами (Трис-буфер и др.).

Исследуемая продукция

Гомогенизирование

Экстрагирование белков ТРИС-буфером

Определение компонентного состава методом иммунодиффузии

Осаждение центрифугированием 5 мин. при 2000 g. Осадок

Очистка ДНК с помощью детергента СТАВ и иммуномагнитосепарации

Определение компонентного состава ингредиентов животного и растительного происхождения на основе гибридизации с ДНК-зондами, меченными биотипом

Идентификация животных и растительных компонентов, включая ГМО, с последующей гибридизацией и детектированием гибридных молекул по иммуноферментному типу

Рис 1. Общая схема определения компонентного состава

В соответствии со схемой пробоподготовки пробу гомогенизировали, из одной части пробы экстрагировали белки ТРИС-буфером для последующей идентификации с помощью иммуноферментного анализа.

Г'омогенат осаждали центрифугированием и выделяли ДНК растительных и животных компонентов по методу Мармура, а также с использованием детергента СТАВ и иммуномагнитосепарации.

В таблице 1 представлены результаты очистки ДНК и время анализа различными методами выделения ДНК по сравнению классической методикой Мармура.

Таблица 1

Результаты сравнительных исследований методик выделения ДНК

Выделение

ДНК из модельных смешанных

образцов животного и растительного происхождения

Видовая принадлежность ДНК

Отношение оптических плотностей

ДНК-СТАВ

ДНК-СТАВ+ иммуно-магнито-сепарация

Модифицированный

метод Мармура

Необходимое время для выделения 10 образцов

^животного происхождения

3-4 часа

1-2 часа

8-10 часов

^растительного происхождения

3-4 часа

1-2 часа

8-10 часов

*** смешанного происхождения

3-4 часа

1-2 часа

8-10 часов

^животного происхождения

АгвоАгво

1,8+0,03

1,8+0,05

1,8+0,06

Степень очистки ДНК о отношению поглощения оптических плотностей

* ^растительного происхождения

Агбо-Агво

1,8340,03

1,79+0,05

1 >79+0,06

***смешанного происхождения

А26С1А280

1,79+0,02

1,80+0,04

1,81+0,06

^животного происхождения

Агбо/Агзо

2,2+0,04

2,2+0,03

2,2+0,05

^^растительного происхождения

АгбоАгзо

2,2+0,05

2,2+0,06

*** смешанного происхождения

А260/А230

2,15+0,05

2,19+0,05

2,2+0,06

* Пельмени быстрозамороженные «Тройные» (ТУ 9214-002-53124469-2002) из говядины, свинины, баранины; говяжье сердце; конина

** соевая мука; *** смешанный фарш из мяса и соевой муки

Как видно из результатов, представленных в таблице 1, соотношение оптических плотностей А2«уА28о приблизительно равно 1,8, что свидетельствует о достаточно хорошей очистке ДНК от белка. При этом

достаточная очистка происходит как при выделении ДНК с применением детергента СТАВ, так и с использованием СТАВ и иммуномагнитосепарадии. Поскольку в случае использования иммуномагнитосепарадии не требуется обработки органическими растворителями и осаждения этанолом, время анализа сокращается до 1 -2 часов.

Использование классической методики выделения и очистки ДНК по Мармуру с применением органических растворителей значительно увеличивает время анализа, а дополнительное использование сорбента или органических растворителей делает анализ более трудоемким. Неоднократное осаждение и переосаждение ДНК приводит к ее потерям.

Вследствие этого предпочтительнее использование детергента СТАВ и иммуномагнитосепарадии.

2. Определение видовой принадлежности мяса с использованием тест-систем ORBIT, PRIME, SOFT, PROFIT (США)

После выделения белковых фракций в соответствие с представленной выше схемой проводили идентификацию компонентов в смешанных фаршах.

Для этого использовались специфические сыворотки к белкам крови соответствующих животных.

Принцип реакции (метод иммуиодиффузии по Оухтерлони) основан на диффузии диагностических антител и испытуемого антигена из пропитанных дисков в гель, при этом в случае их взаимодействия образуется полоса преципитации между противоположными дисками.

Компонентами анализа являются испытуемый материал (сырое мясо, мясопродукты), диски с иммобилизованными антителами к белкам оленины и других животных и диски сравнения с иммобилизованными антигенами. В исследованиях использовали набор реагентов и материалов для идентификации оленины. Данная тест-система может быть использована для исследования только сырого мяса и не предназначена для анализа термообработанных продуктов.

На первом этапе идентификацию мяса проводили с использованием тест-систем ORBIT, PRIME, SOFT, PROFIT. Производство данных тест-систем стандартизовано по международным требованиям системы ИСО 9000.

На оборотной стороне чашки Петри фломастером ставили номер фильтра. При этом использовали преципитирующие диски с антителами на различные виды животных и диски с антигенами. Линия преципитации между дисками с антителами и антигенами указывала на работоспособность дисков. Чашки Петри помещали в термостат при 37°С на 18 -24 часа. Затем чашки извлекали и определяли линии преципитации между дисками.

Линия преципитации между дисками с антителами и антигенами позволяла определять видовую принадлежность исследуемого образца. Для визуализации линии преципитации использовали флуоресцентную лампу.

Результаты анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Идентификация продукции на основе иммунодиффузии с применением тест-систем серии ORBIT, PRIME, SOFT, PROFIT

№ п/п Испытуемые образцы Специфичные антигены для идентификации образцов методом иммунодиффузии

свинина говядина баранина конина мясо кур

1 Свинина + _ _ -

2 Говядина _ + _ _ -

3 Баранина _ _ + _ -

4 Мясо кур _ _ _ +

5 Колбаса «Докторская» + + - _ -

6 Колбаса полукопченая из конины «Конская особенная» высший сорт - - + -

7 Говядина 50 %, свинина 50 % + + - -

8 Говядина 80 %, свинина 20 % + + - - -

9 Говядина 95 %, свинина 5 % + + - -

Таблицы 2 (продолжение)

1 2 3 4 5 6 7

10 Говядина 96 %, свинина 4 % + + _ _ -

11 Говядина 97 %, свинина 3 % + _ _ -

12 Говяжье сердце _ + _

13 Свинина 50 %, говядина 50 % + + _ -

14 Свинина 80 %, говядина 20 % + + _ _ -

15 Свинина 95 %, говядина 5 % + + -

16 Свинина 96 %, говядина 4 % + + - - -

17 Свинина 97 %, говядина 3 % + _ _ _ -

18 Полуфабрикаты мясные рубленые быстрозамороженные «Шницель» + - - - -

19 Пельмени быстрозамороженные «Тройные» из говядины, свинины, баранины + + +

20 Пельмени быстрозамороженные «Двойные» из говядины, свинины + +

+ положительная реакция иммунодиффузии - отрицательная реакция иммунодиффузии

Как видно из данных, представленных в таблице 2, линия преципитации наблюдалась только между гомологичными системами. При этом чувствительность реакции в различных фаршевых смесях составляла 4%. Эти показатели были несколько выше, чем в работах E.H. Морозовой (2005) и Д.Г. Узуняна (2006) для свинины и мяса кур, что, вероятно, объясняется методикой подготовки проб. В продукции, состоящей из многокомпонентных смесей, как, например, пельмени быстрозамороженные «Тройные» из говядины, свинины, баранины и пельмени быстрозамороженные «Двойные» из

говядины, свинины наблюдалось две линии преципитации, соответствующие различным видам мяса.

Методика с использованием систем серии ORBIT, PRIME, SOFT, PROFIT была достаточно специфична и позволяла с чувствительностью 4% определять в фаршевых смесях различные виды мяса. Однако эта система ограничивала ассортимент идентифицируемой продукции, поэтому в дальнейшем мы перешли на специфичные сыворотки отечественного производства.

3. Усовершенствование определения компонентного состава с применением отечественных преципитирующих сывороток

Для проведения реакции иммунодиффузии готовый гель расплавляли в колбе на кипящей водяной бане и разливали в чистые обезжиренные чашки Петри с толщиной слоя 2-3 мм.

После застывания геля в нем делали лунки специальным трафаретом-пробойником. При идентификации различных образцов использовали трафарет с шестью лунками, расположенными по кругу. Седьмая лунка находилась в центре. Диаметр лунок составлял 2-3 мм, а расстояние между лунками - 6 мм.

Выреза1шые фрагменты геля удаляли из лунок с помощью тонкой иглы или маленького пинцета.

В лунки по периферии с помощью дозатора осторожно вносили исследуемые элюированные образцы, а в центральную лунку преципитирующую диагностическую сыворотку к белкам того или иного вида животного. В последнем случае проводился анализ многокомпонентных смесей.

При заполнении лунок необходимо избегать их переполнения. При каждом новом добавлении образца необходимо менять наконечник дозатора.

Чашки Петри с исследуемым материалом закрывали крышкой и помещали в термостат при 37 °С на 24 часа.

Реакцию преципитации оценивали по наличию или отсутствию полосы

преципитации между противоположными лунками.

Наличие полосы преципитации между лункой с вытяжкой из исследуемого материала и лункой с диагностической сыворот- ., преципитирующей белки того или иного вида животного или растения, указывала на принадлежность образца к определенному виду. При этом реакция преципитации с другими сыворотками должна быть отрицательной.

Модификация методики заключалась в предварительном нанесении геля в чашки Петри и формировании лунок для испытуемого белка и сыворотки заранее. Чашки Петри закрывали и обертывали черной бумагой. При проведении испытаний анализ осуществляли в соответствии с методикой, изложенной в п. 4.

Предварительная подготовка чашек Петри с гелем позволяла значительно ускорить анализ (в 1,5-2 раза) и упрощала его при проведении испытаний. Кроме того, в периферийные лунки вносили образцы разного разведения для определения чувствительности метода.

Модификация методов иммунодиффузии с использованием лунок также позволяет проводить определение компонентного состава; кроме того, расширяется спектр идентифицируемых видов мяса, в который, помимо указанных видов, входят конина, оленина, лосятина, а также соя.

4. Модифицированная методика определения видовой принадлежности с использованием мембранных фильтров, пропитанных отечественными преципитнрующимн сыворотками

Для проведения идентификации мембранные фильтры «Владипор №6» предварительно пропитывали отечественными преципитирующими сыворотками к говядине, свинине, мясу птицы, конине, лосятине (Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов).

Кроме того, предварительно готовили чашки с агарозным гелем. Для проведения реакции иммунодиффузии готовый гель расплавляли в колбе на

кипящей водяной бане и разливали в чистые обезжиренные чашки Петри с толщиной слоя 2-3 мм. При разливе геля чашки Петри должны находиться на г'лэого горизонтальной поверхности. Подготовленные чашки оборачивали в .тую бумагу. Фильтры с преципитирующими сыворотками могли храчиться в течение 6 месяцев.

При определении компонентов различных смесей проводили экстракцию с помощью ТРИС-буфера в течение 1 часа.

После экстракции элюат переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 1000-2000g в течение 15-20 минут. В случае образования в верхней фазе жирового слоя его удаляли с помощью фильтровальной бумаги.

Чистый фильтр пропитывали элюатом и помещали в центр чашки Петри. По периферии размещали предварительно подготовленные фильтры с преципитирующими сыворотками. Далее чашки помещали в термостат при 37°С на 20 часов.

Результаты реакции регистрировали по полосе преципитации между фильтром с исследуемым образцом и фильтрами со специфичными преципитирующими сыворотками, что позволяло проводить идентификацию следующих видов мяса: свинины, говядины, баранины, мяса птицы, конины, оленины, лосятины.

Чувствительность методики, так же как и при использовании тест-систем ORBIT, PRIME, SOFT, PROFIT, составляла 4%.

С помощью данной методики удается определить компонентный состав пельменей, состоящих из говядины, свинины, баранины или из говядины и свинины, а также определить сою в фаршевой смеси для приготовления колбас.

5. Разработка модифицированной методики определения компонентного состава на основе ДНК-зондов

Из исследуемых образцов выделяли ДНК с помощью детергента СТАВ и иммуномагнитосепарации с сорбентом «Silica» (S1O2), иммобилизовали в

виде точек на мембранные нитроцеллюлозные фильтры и проводили гибридизацию со специфичными ДНК-зондами на животные и растительные компоненты, меченные биотином.

После реакции с конъюгатом и субстратом по степени окрашивания точек с гибридными молекулами определяли наличие растительного или животного компонента.

В качестве контроля использовали ДНК, не имеющую гомологии ни с растительной ДНК, ни с ДНК животных компонентов.

ДНК из различных мясных термообработанных и нетермообработанных полуфабрикатов выделяли иммуномагнитосепарацией, проводили денатурацию кипячением и иммобилизовали денатурированную ДНК 6ХССР (стандартно-солевой раствор) на мембранные нитроцеллюлозные фильтры Миллипор в объеме 0,2 мкм. Точки с иммобилизованными ДНК предварительно подписывали, подсушивали под лампой дневного света, затем помещали во флаконы, добавляли гибридизационный раствор и денатурированные биотинилированные ДНК-зонды. Проводили гибридизацию в течение 4-6 часов при 42°С. Отмывали от неспецифической сорбции в ССР. Добавляли конъюгат (стрептавидинфосфотазу) и краситель.

Результаты реакции определяли визуально по наличию окрашенных гибридных молекул. В качестве ДНК-зонда на говядину брали участок ДНК, кодирующий бычий колпастатин, используемый ранее в работах Макарова М.М. (2002):

-5'-ТСССТСССТГСАОТТАССГСТС ВОБ-Ш;

-5'-ССССГСССААТТТТСАСОАТО ВОБ-Ь2

Как видно из рисунка 2, окрашенные гибридные молекулы наблюдались только при гибридизации сои с соей или говядины с говядиной. Таким образом, удавалось проводить определение компонентного состава колбасы и фаршевых смесей, состоящих из растительных и животных ингредиентов.

1 2 3 4

о О ф вин w

1- отрицательный контроль (ДНК конины + ДНК-зонд на говядину)

2- отрицательный контроль (ДНК свинины + ДНК-зонд на говядину)

3- положительный контроль (ДНК сои + ДНК-зонд на сою)

4- положительный контроль (ДНК говядины + ДНК-зонд на говядину)

Рис. 2. Результаты гибридизации ДНК-зондов на говядину и сою с иммобилизованными на фильтрах исследуемыми ДНК

Проведенные исследования показали возможность использования данного подхода для определения растительных и животных компонентов в смешанных продуктах (в колбасах вареных и в фаршевой смеси для приготовления вареных колбас).

Таким образом, разработанная модифицированная методика позволяла осуществлять одновременное определение животных и растительных ДНК.

В отличие от предложенных ранее методов на основе ДНК-гибридизации, использование детергента СТАВ и иммуномагнитосепарации с сорбентом «Silica» (Si02) давало возможность одновременно выделять из смешанных продуктов и растительную, и животную ДНК и проводить их идентификацию. При этом за счет ускоренного выделения ДНК значительно уменьшается время проведения анализа, по сравнению с классическими методами выделения ДНК по Мармару или только с детергентом СТАВ.

Чувствительность методики составляет 1% исследуемого ингредиента в смешанной системе. Результаты по определению чувствительности методики представлены на рисунке 3.

Результаты гибридизации

1. По оси ординат - концентрация

2. По оси абсцисс - степень окрашивания гибридных молекул

Рис. 3. Гистограмма количественного определения сои в смеси говядина-соя.

6. Разработка модифицированной методики определения компонентного состава сырья и продукции на основе амплификации с последующей гибридизацией

Как было показано ранее (Морозова E.H., 2005; Узунян Д.Г., 2006), идентификацию мяса можно осуществлять с помощью тест-системы SureFood на основе амплификации с последующей ДНК- гибридизацией с иммобилизованными на плашках ДНК- зондами.

Нами разработана модифицированная методика, которая заключалась в предварительном разделении белка и ДНК, выделении ДНК в соответствии с представленной схемой, амплификации с неспецифическими гексонуклеотидными праймерами и последующей гибридизации с ДНК-зондами и регистрации конечного результата по иммуноферментному типу.

Разработку модифицированной методики идентификации проводили на модельной системе из смешанного фарша из говядины и сои на основе ПЦР и ДНК-гибридизации.

Для выделения ДНК использовали СТАВ-буфер, состоящий из 3%- СТАВ, 1.4М-№СЦ ЮОмМ ТшНСЬ до рН 7.8-8.0 и ЗОмМ БЭТА.

Общая схема модифицированной методики представлена на рисунке 4.

Осадок

Очистка ДНК с помощью детергента СТАВ и иммуномагнитосепарации и

сорбентов

Амплификация с неспецифичными гексонуклеотидными праймерами, меченными <|иотином

Связывание ампликонов, меченных биотином со стрептавидином, иммобилизованном в лунках иммуноферментного планшета

Гибридизация связанных со стрептавидином ампликонов со специфическими ДНК-зондами (на животные или растительные белки), меченные пероксидазой

Реакция с конъюгатом и субстратом

Отмывка неспециф|ческой сорбции

Регистрация конечного результата по интенсивности окрашивания иммобилизованных в лунках гибридных молекул (визуально или с помощью вертикального фотометра)

Рис. 4. Схема определения ингредиентного состава на основе амплификации с последующей ДНК гибридизацией и регистрацией конечного результата по иммуноферментному типу

Результаты исследований показали, что методика на основе тест-системы БигеРоос! и наша модифицированная методика позволяли проводить идентификацию мяса. Кроме того, в модифицированной нами методике мы использовали ДНК сои, что давало возможность проводить определение как животных, так и растительных компонентов.

При определении чувствительности методов на основе амплификации с последующей гибридизацией показано, что чувствительность методов составляет 0,1%, причем идентификацию можно проводить в смесях, содержащих как растительные, так и животные компоненты.

При обнаружении растительных компонентов определяли принадлежность их к ГМО. С этой целью проводили амплификацию с праймерами на 358-промотор и МОБ-терминатор. Остальные этапы идентификации осуществляли аналогично методике, представленной выше.

Результаты исследований показали возможность определения генно-модифицированных компонентов в смешанных продуктах.

Чувствительность методики, как и в случае определения не генно-модифицированных компонентов на основе амплификации с последующей гибридизацией, составляла 0,1%. Данная методика позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью определять компонентный состав нетермообработанной и термообработанной продукции животного и растительного происхождения, включая ГМО.

В отличие от методики с электрофоретической детекцией ампликонов данный метод, на наш взгляд, является более удобным и дает возможность автоматизации, как на стадиях пробоподготовки (магнитная сепарация), так и на стадии регистрации конечного результата с применением автоматических фотометров.

7. Сравнительное изучение методов определения компонентного состава сырья, термообработанных и нетермообработаииых полуфабрикатов

Представленные методы определения компонентного состава были использованы при исследовании сырья и различных видов продукции. При

этом было проанализировано по 5 образцов однородного вида продукции согласно нормативной документации (говядина, свинина, конина, оленина, лосятина, полуфабрикаты мясные рубленые быстрозамороженные; пельмени быстрозамороженные «Тройные» из говядины, свинины, баранины; пельмени быстрозамороженные «Двойные» из говядины, свинины; фарши для приготовления колбас, состоящие из растительных и животных компонентов; колбаса полукопченая из конины «Конская особенная» высший сорт; колбаса «Докторская»).

Как показали проведенные исследования, методы иммунодиффузии однозначно позволяли проводить определение компонентного состава в нетермообработанной продукции (фаршевые смеси, полуфабрикаты мясные рубленые быстрозамороженные; пельмени быстрозамороженные «Тройные» из говядины, свинины, баранины; пельмени быстрозамороженные «Двойные» из говядины, свинины).

Метод иммунодиффузии не давал возможности проводить определение компонентного состава в термообработанной продукции (колбасы).

Различные модификации ПЦР и ДНК-гибридизации позволяли проводить идентификацию животных и растительных компонентов в термообработанной продукции (колбаса «Докторская»; колбаса полукопченая из конины «Конская особенная» высший сорт).

Проведенные исследования сырья и продукции показали возможность эффективного применения разработанных методов определения компонентного состава ингредиентов животного и растительного происхождения. Причем для скрининговой видовой идентификации нетермообработанной мясной продукции достаточно специфичными и чувствительными показали себя методы иммунодиффузии и амплификация.

Методы на основе иммунодиффузии и ДНК-гибридизации не требуют специального оборудования и могут быть использованы в скриниговых анализах в различных ветеринарно-санитарных лабораториях.

Методы амплификации позволяют быстрее проводить анализ как термообработанной, так и нетермообработанной продукции, определять растительные и животные компоненты, включая ГМИ, однако при этом необходим термоциклер и система для электрофореза или гибридизации.

Характеристики методов дифференциального определения ингредиентов растительного и животного происхождения представлены в таблице 3.

Таблица 3

Характеристики методов дифференциального определения ингредиентов

растительного и животного происхождения

Определяемые ингредиенты Критерии анализа Модифицированные методики

Иммунодиф-фузия ДНК- гибридизация Амплификация с последующей ДНК-гибридизацией

Животные и растительные компоненты Время анализа 20 часов 18 часов 16 часов

Чувствительность 4% 1% 0,1%

Специфичность Нетермо-обработанная продукция Дифференциация термообрабо-танных мясных и растительных ингредиентов Дифференциация термообратанных мясных и растительных ингредиентов, включая ГМО

ВЫВОДЫ

1. Предложены усовершенствованные методы определения компонентного состава продукции на основе анализа белка методами иммунодиффузии и ДНК методами гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими ДНК-зондами и амплификации с последующий ДНК-гибридизацией, позволяющие выявлять животные и растительные компоненты, включая компоненты из генно-модифицированных источников.

2. Усовершенствована методика идентификации мяса на основе иммунодиффузии с использованием мембранных дисков, позволяющая дифференцировать ингредиенты в смешанных продуктах животного и растительного происхождения с чувствительностью 4%, сокращать время анализа в 1,5 раза и расширять спектр идентифицируемых видов (конина, оленина, лосятина).

3. Модифицирована методика определения растительных и животных компонентов, включая термообработанную продукцию, с чувствительностью 1% на основе ускоренного выделения ДНК с применением детергента СТАВ и иммуномагнитосепарации, ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с использованием биотинилированных ДНК-зондов и последующей детекции гибридных молекул по степени окрашивания после реакции с конъюгатом и субстратом.

4. Усовершенствована методика определения компонентного состава продуктов из растительных и животных ингредиентов, включая ГМИ, на основе ускоренного выделения ДНК с применением детергента СТАВ и иммуномагнитосепарации, амплификации ДНК с гексонуклетиотидными праймерами, ДНК-гибридизации со специфичными ДНК-зондами и регистрацией конечного результата по иммуноферментному типу Чувствительность методики 0,1%. Методика упрощает анализ по сравнению с методом электрофоретического детектирования, позволяет проводить идентификацию термообработанной продукции и сократить время анализа в 1,5 раза.

5. Разработанные методики могут быть использованы для скрининговых и количественных тестов при идентификации продукции и выявлении недекларированных компонентов растительного или животного происхождения.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании результатов исследований разработаны «Методические рекомендации по определению состава сырья и продукции, состоящих из мясных и растительных компонентов с помощью реакции ДНК и иммунодиагностики» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 07.04.2008 г.).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Рощупкина Л.В. /Определение ГМИ при помощи метода амплификации с последующей гибридизацией // Сборник трудов ГНУ ВНИИВСГЭ «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии», Москва, 2006, том.118. - С. 223228.

2. Рощупкина Л.В. /Идентификация продукции и определение фальсифицирующих примесей И Материалы международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва A.A., Воронеж, 2006. - С. 1090-1091.

3. Рощупкина Л.В. /Определение компонентного состава смешанных фаршей // Материалы VI международной научной конференции студентов и молодых ученых, МГУПБ «Живые системы и биологическая безопасность», Москва, 2007. - С. 282-283.

4. Рощупкина Л.В., Смирнов A.M., Писарева В.М., Каверин A.B., Морозова E.H., Светличкин В.В. /Методы определения генетически модифицированных организмов // Ветеринария, №2,2008. - С. 57-59.

ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии г. Москва, Звенигородское шоссе, 5 Заказ И9/9 . Тираж 100 экз.

Оглавление диссертации Рощупкина, Луиза Владимировна :: 2009 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Качество, безопасность и фальсификация продукции в условиях реформы технического регулирования.

1.2 Идентификация сырья, продуктов животного и растительного происхождения. Методы исследования.

1.3 Методы определения^ компонентного состава сырья и продукции животного и растительного происхождения

1.4 Методы определения ГМИ.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы и методы.

2.1.1 Методика определения видовой принадлежности мяса на основе иммунодиффузии (по Оухтерлони)

2.1.2 Методика определения видовой принадлежности мяса с использованием тест-систем иммунодиффузии серии 34 ORBIT, PRIME, SOFT, PROFIT (США).

2.1.3 Модифицированная методика определения видовой принадлежности с использованием мембранных фильтров, ^ пропитанных отечественными преципитиругощими сыворотками.

2.1.4 Методика выделения ДНК с использованием детергента СТАВ.

2.1.5 Методика выделения и очистки ДНК с использованием ^ детергента СТАВ и иммуномагнитосепарации.

2.1.6 Методика определения^ компонентного состава на основе ^ ДНК-гибридизации с ДНК-зондами, меченными биотином

2.1.7 Методика идентификации мяса на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией с использованием тест- 37 систем SureFood.

2.1.8 Модифицированная методика, определения компонентного состава сырья и продукции на основе амплификации с 39 последующей гибридизацией.

2.1.9 Методика качественного определения ГМО на основе амплификации с последующей гибридизацией.

2.1.10 Статистическая обработка результатов.

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Разработка схемы последовательного разделения белков и

ДНК, позволяющей проводить параллельное определение ^ компонентного состава продукции на основе анализа белка или нуклеиновых кислот.

2.2.2 Разработка модифицированной методики определения ^ компонентного состава сырья и мясной продукции на основе иммунодиффузии

2.2.3 Усовершенствование определения компонентного состава с применением отечественных преципитирующих 48 сывороток.

2.2.4 Модифицированная методика определения видовой принадлежности с использованием мембранных фильтров, ^ пропитанных отечественными преципитирующими сыворотками.

2.2.5 Разработка модифицированной методики определения ^ компонентного состава на основе ДНК-зондов.

2.2.6 Разработка модифицированной методики определения компонентного состава сырья и продукции на основе 61 амплификации с последующей гибридизацией.

2.2.7 Сравнительное изучение методов определения компонентного состава сырья, термообработанных и не термообработанных полуфабрикатов.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.

Введение диссертации по теме "Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза", Рощупкина, Луиза Владимировна, автореферат

Актуальность темы

В соответствии с Федеральным законом о «Техническом регулировании» производитель и продавец не должны вводить в заблуждение покупателя о составе своей продукции. Продукция должна отвечать всем требованиям технического регламента и соответствующего стандарта. Однако в некоторых случаях недобросовестные производители фальсифицируют продукцию.

Продукция, содержащая белок или ДНК генно-модифицированных источников, должна соответствующим образом маркироваться. Сырье и продукция, содержащие компоненты животного и растительного происхождения, отличающиеся от декларированного содержания компонентов в нормативных документах (технические условия, международные национальные и отраслевые стандарты), являются фальсифицированными.

Подтверждение соответствия сырья и продукции нормативным документам является важным элементом Федерального закона «О техническом регулировании» и проводится на разных стадиях оборота продукции: от производства до реализации в торговых точках. Естественно, что хорошо оснащенные аккредитованные Испытательные лаборатории могут осуществлять контроль с помощью высокочувствительных и специфичных методов на стадиях сертификации и регистрации сырья и продукции. Однако практические лаборатории ветеринарно-санитарного контроля нуждаются также и в экспрессных скрининговых методах.

- В связи с этим актуальным является разработка и совершенствование методов, позволяющих проводить определение компонентного состава на основе анализа белка или ДНК при скрининговых или арбитражных исследованиях. Наиболее перспективными в этом направлении являются методы ДНК- и иммунодиагностики (И.Н. Комарова, 2004; A.M. Смирнов и др., 2005; В.В. Светличкин, 2005; С.С. Huang, Т.М. Pan, 2005).

Цель и задачи исследований

В задачи исследований входило:

- усовершенствовать методику определения растительных и животных компонентов на основе ДНК-зондов;

- усовершенствовать методику определения компонентного состава сырья и продукции на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией; провести сравнительное изучение методов определения компонентного состава сырья, термообработанных и нетермообработанных полуфабрикатов и мясных изделий, содержащих животные и растительные компоненты.

Научная новизна

Предложены усовершенствованные методы идентификации растительных и животных компонентов продукции на основе анализа белка методами иммунодиффузии и на основе ДНК методом гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими ДНК-зондами, а также с помощью модифицированной методики на основе амплификации, позволяющей выявлять животные и растительные компоненты, включая компоненты из генно-модифицированных источников. При этом разработана модификация метода иммунодиффузии с фильтрами, пропитанными отечественными сыворотками, расширяющая спектр определяемых компонентов, включающий растительные белки, оленину, конину, лосятину, и позволяющая проводить идентификацию в нетермообработанных полуфабрикатах с чувствительностью 4%.

Усовершенствована методика определения компонентного состава продуктов, состоящих из ингредиентов животного и растительного происхождения, на основе ПЦР, включающая ускоренную пробоподготовку с применением детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида) и иммуномагнитосепарации, амплификацию ДНК и детектирование ампликонов по имму но ферментному типу с чувствительностью определения ДНК животного происхождения и ДНК ГМИ растений 0,1%.

Практическая ценность

На основании результатов исследований разработаны: -Методические рекомендации по определению состава сырья и продукции, состоящих из мясных и растительных компонентов с помощью реакции ДНК и иммунодиагностики (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 07.04.2008 г. Рощупкина Л.В.)

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- Международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва A.A. (Воронеж, 2006 г.);

- Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007 г.);

- межлабораторном совещании ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии (2009 г.).

Публикации Результаты исследований отражены в 4 научных статьях, из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Заключение диссертационного исследования на тему "Совершенствование определения компонентного состава сырья и продуктов животного и растительного происхождения"

ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании результатов исследований разработаны: - Методические рекомендации по определению состава сырья и продукции, состоящих из мясных и растительных компонентов с помощью реакции ДНК и иммунодиагностики (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 07.04.2008 г. Рощупкина Л.В.)

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2009 года, Рощупкина, Луиза Владимировна

1. Александрова H.A. и др. /Методы оценки качества мяса и мясопродуктов за рубежом//, Москва, 1997, с. 156. Кн

2. Ахмичева, О.В. Использование энзимов при производстве мясных изделий / Ахмичева О.В. // Мясная индустрия. 2005. - №1.-С. 30-31.

3. Базарнова, Ю.Г. Повышение пищевой ценности мясных продуктов / Базарнова Ю.Г., Соскин В.И. // Мясная индустрия.-, 2005, №2, С. 42-43.

4. Белова, В.Ю. Пищевые ингредиенты — забота о качестве / Белова В.Ю. // Мясная индустрия 2005, №1, С. 69-72.

5. Боровков, М.Ф. Определение видовой принадлежности мяса животных: Методическое пособие / Боровков М.Ф., Швец О.М., Кириллов А.К. -Москва: АМБагро, 1998.- 34 с.

6. Буркин, A.A. Иммунохимические аспекты микотоксикологии / Буркин

7. A.A., Кононенко Г.П. // Материалы 7-го Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России» Москва, 2003. - С. 87-88.

8. Ш.Бурков, В.И. Ветсанэкспертиза мяса и жира диких животных и пернатой дичи / Бурков В.И., Боровков М.Ф., Колесниченко И.С., Касаткин B.C. // Ветеринария. 2003. - № 2. - С. 55 - 60.

9. Н.Вельков, В.В. Оценка агроэкологических рисков производства трансгенных энтомоцидных растений / Вельков В.В., Соколов М.С., Медвинский А.Б. // Агрохимия. 2003. - № 2. - С. 74-96.

10. Версан, В.Г. Актуальные проблемы введения в действие Федерального закона «О техническом регулировании» / Версан В.Г. // Стандарты и качество. 2003. №5. - С. 30-32.

11. Витт, C.B. Об анализе аминокислот методом газо-жидкосткой хроматографии / Витт C.B., Сапоровская М.Б., Беликов В.Н. // Журнал аналитической-химии. 1966. т. 21, №2, С. 227-231.

12. Галкин A.B., Комаров В.Н., Иванова Е.А. /Иммуноферментный метод экспресс контроля продовольственного сырья и пищевых продуктов на содержание потенциально опасных химических соединений// Хранение и переработка сельхозсырья, № 5,1998, с. 21-24.Ж

13. Горобчук, Е.А. Оценка безопасности и качества сырья и продуктов животного происхождения на основе ДНК-диагностики / Горобчук Е.А., Маргиева С.А., Родин В.И., Хоменец Н.Г., Каверин A.B., Светличкин

14. B.В., Узунян Д.Г./Материалы 5-ой Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины,ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции", МГУПБ Москва, 2004. - С. 45-46.

15. Горожанина, Е.С. Разработка метода идентификации сырья и продуктов животного и растительного происхождения на основе SDS-электрофореза: Автореферат диссертации кандидата биологических наук: 16.00.06 / Горожанина Е.С.; Москва, 2007 г.

16. ГОСТ Р 52 723-2007 Продукты пищевые и корма. Экспресс-метод определения сырьевого состава (молекулярный). Москва: Изд-во Стандартинформ, 2007.-43 С.

17. Гугушвили, H.H. Определение видовой принадлежности мяса домашних и диких птиц люминесцентным и фотоколориметрическим методами / Гугушвили H.H., Гудиев В.Г., Сенченко Б.С. // Профилактика и лечение болезней животных. 2001,- №387 (415). - С. 160-163.

18. Долгов, В.А. Методические аспекты оценки качества и безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья / Долгов В.А., Лавина С.А. // Сб. трудов 7-го всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России» Москва, 2003. - С.162.

19. Донченко, Л.В. Безопасность пищевого сырья и продуктов питания / Донченко Л.В., Надыкта В.Д. //Москва, Пищепромиздат. 1999. - с. 352.

20. Доценко, С.М. Полуфабрикаты из мясорастительного фарша / Доценко С.М., Скрипко О.В., Парфенова С.Н. //Мясная индустрия.- 2005. №2, С. 28-30.1. I

21. Дубцова, Г.Н. Мясные кулинарные изделия, обогащенные растительным белком- / Дубцова, Г.Н., Кирюхина М:Н., Дубцов Г.Г. // Сб. трудов 7-го всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России» -Москва, 2003. С. 166-168.

22. Езерская, Е.Я. Идентификация видоспецифичных мышечных белков сельскохозяйственных животных и птицы / Езерская Е.Я., Галочкин В.А.I

23. Сельскохозяйственная биология. Сер. биология животных. 1999. -№ 6. - С.3-9.

24. Езерская, Е.Я. Анализ видовой принадлежности мяса и мясопродуктов / Езерская Е.Я. // Ветеринария. 2001. - № 6. - С.45.

25. Жаринов, А.И. Вторичное белоксодержащее сырье: способы обработки и использования / Жаринов А.И'., Хлебников И.В., Мадалиев И.К. // Мясная промышленность. 1993. - №2, С. 22-24.

26. Иванов, A.A. Деятельность, учреждений госсанэпидслужбы России по гигиене питания (по надзору за ГМИ в 2003 году) / Иванов A.A., Галкина И.И., Мясникова В.В. // Информационный сборник. Федеральный центр Госсанэпиднадзора Москва. - 2004 г. - 17 с.

27. Ивановцев, В.В. Идентификация трансгенной сои в продуктах и кормах / Ивановцев В.В., Светличкин В.В., Каверин A.B.// Ветеринария и кормление. 2006. - №6. - С. 21-22

28. Ивчина, Е.Ю. Анализ эпизоотической ситуации сырьевой зоны мясоперерабатывающего предприятия с учетом результатов послеубойной ветсанэкспертизы мяса / Ивчина Е.Ю. // Ветеринарная патология. 2008.-№1(24).-С. 30-31.

29. Каверин, A.B. Совершенствование методов идентификации примесей ГМИ: Автореферат диссертации кандидата биологических наук: 16.00.06 /Каверин, А.В; Москва, 2006 г.

30. Каверин, A.B. Количественное определение ГМИ методом ПНР в реальном времени / Каверин A.B. // Труды ГНУ ВНИИВСГЭ Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Москва, 2006. - С. 34-37.

31. Комаров A.A. Определение видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах для собак и кошек методом ПЦР / Комаров A.A., Обухов И.Л. // 8-й Международный конгресс по проблемам ветеринарной медицины мелких домашних животных Москва, 2000. - С. 27-28.

32. Комаров, A.A. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных / Комаров A.A., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н. // Ветеринария. 2001. - №3. - С. 59-62.

33. Лушников, К.В. Использование иммуноферментного анализа для определения генетически-модифицированных источников в пищевой продукции / Лушников К.В., Патрушев М.В., Возняк М.В., Возняк В.М. // Партнеры и конкуренты. 2001. - №2.- С. 36-39.

34. Макаров, М.М. Разработка методов определения видовой принадлежности мяса на основе ДНК-диагностики и иммунодиффузии в геле: Автореферат диссертации кандидата биологических наук: 16.00.06 / Макаров М.М.; Москва, 2002 г.

35. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Маниатис Т., Фритч Э., Сэмбрук Дж. // М.: Мир, 1994. -159-172 с.

36. Маурер, Г.Р. Диск-электрофорез / Маурер, Г.Р. // Москва, Мир. 1969. -с. 247.

37. Морозова, E.H. Гармонизация критериев и методов оценки качества и безопасности продуктов животного происхождения: Автореферат диссертации кандидата биологических наук: 16.00.06 / E.H. Морозова Москва, 2005.

38. Парук, А.П. Использование биофизических методов при определении фальсификаций мяса / Парук А.П., Курмакаева Т.В. // Практик. 2004. -№7-8, С.14-17.

39. Писарева, В.М. Электрофоретический метод в анализе пищевых продуктов / Писарева В.М. // Вопросы питания. 1998. - №3. - С. 41-42.

40. Попова, М.Ю. Определение содержания и выделение ПЦР-пригодной ДНК из коммерческих препаратов переработки сои / Попова М.Ю., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Жаринов А.И., Рогов И.А., Скрябин К.Г. // Биотехнология. 2003. - № 2, С. 86-94.

41. Рогов, И.А. Новые технологии производства продуктов здорового питания / Рогов И.А. // Сб. трудов 7-го всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России» Москва, 2003. - С. 440-441.

42. Родин, В.И. Сравнительная оценка методов ветеринарно-санитарного контроля пищевого сырья и готовых продуктов / Родин В.И. И Материалы международной научно-технической конференции «Пищевой белок и экология», Москва, 2000. С. 188-189.

43. Романенко, Г.А. Обеспечение качества и безопасности сельскохозяйственной продукции / Романенко Г.А. // Сб. трудов 7-го всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России» -Москва, 2003. С. 444-445.

44. Румянцева, Г.Н. Свойства белков сои и гороха, полученных биотехнологическим способом / Румянцева Г.Н., Осадько М.И. // Мясная индустрия. 2005. - №2, С. 44-45.

45. СанПин 2.3.2. 1078-01 «Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», Москва, Минздрав России. -2002 г., 164 с.

46. Сафронова, A.M. Анализ потребления мясопродуктов населением России / Сафронова A.M., Батурин А.К., Старовойтов M.JI. // Сб. трудов 7-го всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России» -Москва, 2003. -С.464-466.

47. Светличкин В.В. /Теоретическое обоснование и разработка тест-систем ускоренной оценки безопасности и качества объектов ветеринарно-санитарного контроля//автореферат диссертации, Москва, 2002, с. 40.

48. Светличкин В.В. Определение видовой принадлежности мяса и мясопродуктов на основе иммунодиффузии / Светличкин В.В., Писарева В.М., Кононенко А.Б. // Практик. 2004. - № 7-8. С. 28-31.

49. Светличкин, В.В. Видовая принадлежность мяса на основе ДНК-диагностики / Светличкин В.В., Писарева В.М., Кононенко А.Б, Галкин A.B., Морозова E.H., Тихомирова Т.А., Маргиева С.А., Соколова Ю.Н. // Практик. 2004. - №3-4. - С. 30-33.

50. Светличкин, В.В. Сертификация животноводческой продукции / Светличкин В.В. // Материалы международной научной конференции «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Москва, 1999. -С. 21-31.

51. Сингер, М. Гены и геномы / Сингер М., Берг П. // Москва: Мир, 1998. т.1, 373 с.

52. Смирнов, A.M. Ветеринарно-санитарная и экологическая безопасность продукции животноводства / Смирнов А.М, Светличкин В.В. // Аграрный вестник Урала. 2006. - №3 (33)., С.51-55.

53. Смирнов, A.M. Состояние и перспективы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии / Смирнов A.M., Симецкий М.А., Таланов Г.А. // Ветеринария. 2001. - № 10. - С. 3-7.

54. Тертон, М. Новые методы иммуноанализа / Тертон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. и др. // Пер. с англ. Москва: Мир, 1991. - 280 с.

55. Узунян, Д.Г. Разработка методов и технических средств идентификации мяса на основе ДНК- и иммунодиагностики: Автореферат диссертации кандидата биологических наук: 16.00.06 / Узунян Д.Г.; ГНУ ВНИИВОГЭ Москва, 2006 г.- с.

56. Фомичев, Ю.П. Техническое регулирование и контроль качества молока в процессе производства / ФомичевТО.П. // Практик. 2004. - № 7-8. С.8 -13.

57. Фрумгарц, Л.Ф: Получение флуоресцентной меченой ДНК и использование ее в качестве зонда при молекулярной гибридизации / Фрумгарц Л.Ф., Киприянов С.М., Калачиков С.М. и др. Биоорганическая химия, 1986. №14. - С. 1508-1513.

58. Хвыля, С.И. Микроструктурный анализ, идентификация и фальсификация мясных продуктов / Хвыля С.И. // Пищевая промышленность. 1998. - №5. - С. 68-69.

59. Хвыля, С.И. Практическое применение гистологических методов анализа / Хвыля С.И., Авилов1 В.В., Кузнецова Т.Г. // Мясная промышленность. 1994. - №6. - С. 9-11.

60. Хвыля, С.И. Соевые белковые продукты и возможности их идентификации / Хвыля-С.И. // Сб. трудов 7-го всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России» Москва, 2003. - С. 539-540.

61. Чан, Т.В1 Гибридизация нуклеиновых кислот / Чан Т.В. // Молекулярная клиническая диагностика. Методы, Москва, 1998. Мир. - С. 374-394.

62. Черняева, М;Н. Анализ видовой принадлежности мяса и мясопродуктов / Черняева М.Н. // Ветеринария. 2001". - №6. - С.47-50.

63. Чумак, P.M. Иммуноферментный анализ и рекомбинантные антигены / Чумак P.M. // Лаб. Диагностика. 1999,- №3. - С. 3-6.

64. Шибата, Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биотопов / Шибата Д.К. // Молекулярная клиническая диагностика. Методы, Москва, Мир. 1999, с. 395-425.

65. Яшин, Я.И. Анализ пищевых продуктов и напитков с помощью хроматографических методов / Яшин Я.И., Яшин А.Я. // Сб. трудов 7-го всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России» -Москва, 2003. С. 595-596.

66. Ahmed, F.E. Detection of genetically modified organisms in foods / Ahmed F.E. // Trends Biotechnol. 2002. - №5. -P. 215-223.

67. Antoniuk, V. Isolation of lectin from horse chestnut (Aesculus hippocastanum L.) seeds and study of its interaction with carbohydrates and glycoproteins / Antoniuk V. // Ukr Biokhim Zh. 1992. - Vol. 64, №5. - P. 47-52.

68. Birch, A. Interactions between plant resistance genes, pest aphid populations and beneficial aphid predators / Birch A. ,Geoghegan L.E., Majerus M., Hackett, C., Allen J. // Annual Report of the Scottish Crop Research Institute, 1996;-P. 68-72.

69. Buntjer, J.B. Species identification by oligonucleotide hybridisation: the influence of processing of meat products / Buntjer J.B.,Lamine A.,Haagsma N.,Lenstra J.A. // Sc. Food Agr. 1999. - V. 79, № 1. - P. 53-57.

70. Carlini, C.R. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides / Carlini C.R., Grossi-de-Sa M.F. // Toxicon, 2002.-Vol. 40.-P. 1515-1539.

71. Chen, Y. Degradation of endogenous and exogenous genes of roundup-ready soybean during food processing / Chen Y, Wang Y, Ge Y, Xu B. // Agric Food Chem. 2005. - Vol. 53. - P. 10239-10243.

72. Chowdhury, E. Rapid'isolation of high quality, multimeric plasmid DNA using zwitterionic detergent / Chen Y, Wang Y, Ge Y, Xu B. // Biotechnol. 2005. -Vol. 119, №10. -P. 343-347.

73. Church, R.B. Method for study of hybridization! and reassociation of nucleic acids axtracted from cells of higher animals / Church R.B. // Molecular techniques and approach in developmental biology, ed. by M. J. Chrispeels. -1973.-P. 223-301.

74. Coura, R. An alternative protocol for DNA extraction from formalin fixed and paraffin wax embedded tissue / Coura R, Prolla JC, Meurer L, Ashton-Prolla P. // Clin Pathol. 2005. - Vol. 58, №8. - P. 894-895.

75. Denhardt, D.T. A membrane filter technique for the detection of complementery DNA / Denhardt D.T. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1966. Vol. 23. - P. 641-646.

76. Ding, H. Identification of broiler chicken meat using a visible/near-infrared spectroscopic technique / Ding H.,Xu R.-J.,Chan D. // Sc. Food Agr. -1999.-Vol. 79, №11. -P. 1382-1388.

77. Erlich, H.A. PCR technology / Erlich H.A. // Stockton Press, 1989.

78. Ewen, S. Health risks of genetically modified foods / Ewen SW, Pusztai A. // Lancet. 1999/ - Vol. 354. - P. 684.

79. Fei, S. Species identification of meats and meat products by PCR / Fei S., Okayama T., Yamanoue M., Nishikawa I., Mannen H:, Tsuji S. // Anim. Sc. Technol. 1996. - Vol. 67, №10. - P. 900-905.

80. Forster, A: Non-radioactive hybridization probes prepared by chemical labeling of DNA and RNA with novel reagent, photobiotin / Forster A., Modness J., Skingle D. // Nuc. Acid Res. 1985. - №3. - P.745.

81. Gillespie, D. A quantive assay for DNA-RNA hybrids with DNA-RNA immobilized on a membrane / Gillespie D., Spiegelman S. // Molecul. Biol. — 1965. -Vol. 12.-P.829-842.

82. Hardegger, M. Quantitative detection of the 35S promoter and the nos terminator using quantitative competitive PCR / Hardegger, M., Brodmann, P., and Hermann, A. //European Food Research Technology. 1999 Vol. 209. -P. 83-87.

83. Hemmer, W. Foods Derived from Genetically Modified Organisms and Detection Methods / Hemmer, W. // Biosafety Research and Assessment of

84. Technology Impacts of the Swiss Priority Program Biotechnology. 1997. -№2.- Vol. 97-P. 61.

85. Hird, H. Determination of percentage of RoundUp Ready soya in soya flour using real-time polymerase chain reaction: interlaboratory study / Hird H, Powell J, Johnson ML, Oehlschlager S // AO AC Int. 2003.- Vol. 86, №1. -P. 66-71.

86. Hopmar, A. A no-radioactive in situ hybridization method based on mercurated nucleic acid probes and sulfhydryl-hapten ligands / Hopmar A., Wiegant J., Tesser G. // Nucl. Acud. Res. 1986. - Vol. 14, №16. - P. 64716488.

87. Hopwood, A J. An actin gene-related polymerase chain reaction (PCR) test for identification of chicken in meat mixtures / Hopwood A.J., Fairbrother K.S., Lockley A.K., Bardsley R.G. // Meat Sc. 1999. - Vol. 53, № 4. - P. 227-231.

88. Hotzel, H. Recovery and characterization of residual DMA from beer as a prerequisite for the detection of genetically modified ingredients / Hotzel, H., Muller, W., Sachse, K. // European Food Research and Technology. 1999. -Vol. 209.-P. 192-196.

89. Huang, C. Event-specific real-time detection and quantification of genetically modified Roundup Ready soybean / Huang C., Pan T. // Agric Food Chem. 2005. - Vol. 53, №10. - P. 3833-3839.

90. James, C. Global Review of Commercialized Transgenic Crops: 2000/ISAAA / James C. // Briefs №. 23. Ithaca, New York: International Service for the Acquisition of Agribiotech Applications (ISAAA). 2001. - P. 94.

91. Jannsen, E. Method adapted to PhastSystem / Jannsen E. // Lebensm. Unterrs. Forsh. 1986. - Vol. 182. - P. 479-483.

92. Jia, C. Transformation of tomato with the BADH gene from Atri-plex improves salt tolerance / Jia C., Zhu Z., Chang F., Li Y. // Plant Cell Rep. -2002,- Vol.21.- P. 141-146.

93. Koh M. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprints for identification of red meat animal species / Koh M., Lim C., Chua S., Chew S., Phang S. // Meat Sc. 1998. - Vol. 48, № 3/4, - P. 275-285.

94. Macedo-Silva, A. Hamburger meat identification by dot-ELISA / Macedo-Silva A.JBarbosa S.F.C.,Alkmin M.G.A.,Vaz A.J.,Shimokomaki M., Tenuta-Filho A. // Meat Sc.- 2000.- Vol. 56, №2. P. 189-192.

95. Mao, D. Detection of the genetically modified organisms in genetically modified soybean and maize by polymerase chain reaction method / Mao D., Mu W., Yang X. // Wei Sheng Yan Jiu. 2002. - Vol. 31, №3. - P. 184-187.

96. Marmur, J. Heterogeneity in deoxyribonucleic acids. I. Dependens on composition of the configurational stbility of deoxyribonucleic acid / Marmur J., Doty P.// Nature. 1959. - Vol. 183. - P.1427-1431.

97. Marmur, J. Thermal renaturation of deoxyribonucleic acid. / Marmur J., Doty P. // Molecul. Biol. 1961. - Vol.3. - P.585-594.

98. Martin, R. Detection and quantification of goats chees in ewes chees using a monoclonal antibody and two ELIS A formats / Martin R., Haza A., Horales P. // Sc. Food Agr. 1997., Vol. 79, № 7. - P. 35-41.

99. Martm, R. Non-radioactive techiques for the labelling of nucleic acids / Martm R. H. // Biotech. Adv. 1991. - Vol. 9. - P. 185-196.

100. Minunni, M. Biosensors as new analytical tool for detection of Genetically Modified Organisms (GMOs) / Minunni M, Tombelli S, Mariotti E, Mascini M, Mascini M. // Anal Chem. 2001. - Vol. 369, №7, P. 589-93.

101. Monma, K. Detection of genetically modified organisms in foreign-made processed foods containing corn and potato / Monma K, Araki R, Sagi N,

102. Satoh M, Ichikawa H, Satoh K, Tobe T, Kamata K, Hino A, Saito K. // Shokuhin Eiseigaku Zasshi. 2005. - Vol. 46, №3. - P. 79-85.

103. Nakama, A. Examination of DNA extract from kernels and processed, foods using silica-base resin / Nakama A, Morishita F. // Shokuhin- Eiseigaku Zasshi. 2004. - Vol.5, №4. - P. 207-211

104. Orlandi P. Analysis of flour and food samples for cry9C from bioengineered corn. / Orlandi P., Lampel K., South P., Assar S., Carter L., Levy D. // Food Prot. 2002. - Vol. 65, №2. - P. 426-431.

105. Ouchterlony, O. Progress in Allergy. 1958. Vol. 6. - P. 30.

106. Phipps, R. Detection of transgenic and endogenous plant DNA in rumen fluid, duodenal digesta, milk, blood, and feces of lactating dairy cows / Phipps RH, Deaville ER, Maddison BC. // Dairy Sei. -2003. Vol. 86, №12. - P.4070-4078.

107. Rehbein, H. Application of PCR-SSCP to cpecies identification of fishery products / Rehbein H., Kress G., Schmidt T. // Sei of Food and Agric. -1997. Vol. 74, № 1. - P. 35-41.

108. Renz, M. A colorimetric method for DNA hybridization / Renz M., Kiirz C. // Nlicleic Acids Res. 1984.- Vol. 12, № 8. - P. 13435-13444.

109. Sakurai, M. Production and characterization of monoclonal antibodyes that zecognize bovine kit zeceptor / Sakurai M., Hikono H., Ohta M. //Veter. Immunol. Immunopathol. 1997. - Vol. 68, № 2/4. - P. 101-112.

110. Sausern, J. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electroohoresis / Sausern J. // Molec.Biolog. 1975. - №98 -P. 503.

111. Smith, D.M. Immunoassays in Process Control and Speciation of Meats / Smith D.M. // Food technologi. 1995. - №2 - P. 116-117.

112. Stagliano, K. Real-time polymerase chain reaction quantitation of relative expression of genes modulated by p53 using SYBR Green I. / Stagliano K., Carchman E., Deb S. // Methods Mol Biol. 2003. - Vol. 234. - P. 73-91.

113. Studer, E. Quantitative competitive PCR for the detection of genetically modified soybeans and maize / StuderE., RhynerC., LuthyJ. // Lebensm. Unters. Forsch A. 1998. Vol. 207. - P. 207-213.

114. Tani, H. Quantification of genetically modified soybean by quenching probe polymerase chain reaction / Tani H., Noda N., Yamada K., Kurata S., Tsuneda S., Hirata A., Kanagawa T. // Agric Food Chem. 2005. - №6, Vol. 53. - P. 2535-40.

115. Tartaglia, M. Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds: a molecular approach to test for the presence of bovine-derived material / Tartaglia M., Saulle E., Pestaloza S. // Journal of food protection. 1998. -Vol. 61,№5.-P.513-518.

116. Tchen, P. Time-resolved fluoromentri, a sensitive method to quantify DNA-hybrids / Tchen P., Ranki M. // Nucl. Acid Res., 1986. №2. - P. 10171028.

117. Thomas, A. /Miniprimer PCR, a New Lens for Viewing the Microbial World / Thomas A. Isenbarger, Michael Finney, Carlos Rios-Velazquez, Jo Handelsman and Gary Ruvkun // Appl Environ Microbiol., 2008, № 74(3) P. 840-849.

118. Todd, D. Dot-hybridization assay for chicken anemia agent using a cloned DNA probe / Todd D., Creelan J. L., MeNulty M. S. // Clin. Microbiol. -1991.- Vol. 29, №5. P. 933-939.

119. Urbanek-Karlowska, B. Detection of genetic modification in maize and maize products by ELISA-test / Urbanek-Karlowska B., Sawilska-Rautenstrauch D., Jedra M, Badowski P. // Rocz Panstw Zakl Hig. 2003. -Vol. 54.-P. 345-53.

120. Van der Hoeven, C. Variability of organ-specific gene expression in transgenic tobacco plants / Van der Hoeven C., Dietz A., Landsmann J. // Transgenic Research. 1994. - Vol. 3. - P. 159-165.

121. Vollenhofer, S. Genetically modified organisms in foods screening and specific detection by polymerase chain reaction / Vollenhofer S., Burg K., Schmidt J., Kroath H. // Agric.Food Chem. 1999. - №47(12), P. 5038-5043.

122. Windels, P. Characterisation of the Roundup Ready soybean insert / Windels P., Taverniers I., Depicker A., Van Bockstaele E., De Loose M. // Eur. Food Res. Technol. 2001. - P. 107-112.

123. Wolf, C. PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: differentiation of fish species / Wolf C., Burgener M., Hubner P., Luthy J. // Food Sc. Technol. -2000.- Vol.33, № 2. P. 144-150.

124. Yoshimura, T. Applicability of the quantification of genetically modified organisms to foods processed from maize and soy // Agrie Food Chem. 2005. -P. 2052-2059.

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Совершенствование определения компонентного состава сырья и продуктов животного и растительного происхождения

Оглавление диссертации Рощупкина, Луиза Владимировна :: 2009 :: Москва

Введение диссертации по теме "Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза", Рощупкина, Луиза Владимировна, автореферат

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2009 года, Рощупкина, Луиза Владимировна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций