Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Совершенствование методов идентификации примесей ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения

На правах рукописи

Каверин Артем Валерьевич

Совершенствование методов идентификации примесей ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождении

16.00.06 — Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена В отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринаркой санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадешш (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Светличкин Вячеслав Владимирович

(ГНУ ВНИИВСГЭ)

Официальные оппоненты;

- доктор ветеринарных наук, профессор кафедры товароведения и безопасности сырья и

продуктов биотехнологии Сон Константин Николаевич

(Московский

Государственный университет прикладной биотехнологии)

- кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

Кононенко Анна Борисовна (ГНУ ВНИВСГЭ)

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства (ГНУ ВНИИЖ)

Защита состоится «30» ноября 2006 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д.006.008.01, при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, г, Москва, Звенигородское шоссе, 5).

Автореферат разослан «__»_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного I

кандидат биологических наук — Е.С, Майстренко

диссертационного совета

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

В последние годы значительно увеличилось производство и импорт трансгенной продукции. Общая площадь посевов трансгенных культур в мире в 2005 году составила 90,0 млн. га. За девять лет, с 199бг по 2005г, общая площадь, засеянная трансгенными культурами, возросла более чем в 53 раза (с 1,7 млн. га в 1996г. до 90,0 млн. га в 2005г.)- По прогнозам специалистов общая площадь посевов трансгенных культур и число фермеров, выращивающих их, будет возрастать. По данным на 2005 год посевные площади под трансгенными культурами-продуцентами продуктов растительного происхождения занимают в США 49,8 миллиона гектаров, в Аргентине - 17 миллионов гектаров, в странах ЕС - около ОД миллиона гектаров, в России трансгеные культуры пока не выращиваются. За десять лет коммерческого использования ГМ-культур объемы потребления, в частности, модифицированной сои составили: в России - 300 тысяч тонн, в странах ЕС - 50 миллионов тонн, в США - 500 миллионов тонн. Список разрешенных для использования в питании и кормах сельскохозяйственных культур на 2005 год, по данным Food and Drug Administration (США), включает более 100 генетически модифицированных продуктов. При этом, согласно данным Роспотребнадзора, ежегодный импорт товаров, произведенных с использованием биотехнологии, оценивается в 650 млн. долл. США. Внутренний ежегодный объём российского рынка биотехнологических товаров превышает 1 млрд. долл. США. В связи с этим увеличивается вероятность поступления пищевой продукции, полученной из ГМИ или содержащей компоненты из ГМИ, на внутренний рынок Российской Федерации.

В настоящие время разработаны правовые документы, регулирующие генно-инженерную деятельность и использование ГМ-продуктов, которые в

обязательном порядке должны подвергаться экспертизе и проходить госрегистрацию, а продукты, содержащие ГМИ, заггем маркироваться.

Для Российской Федерации проблема контроля за содержанием в продуктах питания генетически модифицированных компонентов и информацией о содержании ГМИ в продуктах питания, которая доводится изготовителем до потребителя, становится актуальнее год от года. Во многом это определяется активным присутствием на рынке импортных пищевых продуктов, содержащих растительные компоненты.

В настоящее время значительная часть импортируемых в Россию продуктов содержат компоненты из ГМИ (в основном сои). Трансгенные белки сои постоянно возрастающими темпами заменяют в продуктах питания биологически полноценные животные белки и растительные белки традиционных культур. Важно, что современные регламенты производства любых продуктов питания не ограничивают содержание в них трансгенных растительных белков, а только требуют их маркировки. Учитывая, что замена трансгенпым соевым белком белков животных - сверхвыгодный бизнес, и это создает условия для фальсификации продукции животного происхождения. Сейчас средний россиянин съедает в год 32 кг натурального мяса и рыбы, что на 40% меньше медицинской нормы. При продолжающейся замене животных белков соевыми он в 2006-2007 годах уже будет съедать только 20-25 кг животных белков (Монастырский O.A., 2004).

По данным исследований, проведенных Росаотребнадзором РФ (Иванов A.A., 2004) в 2004 г. по сравнению с 2003 г. было исследовано в три раза больше проб на наличие генетически модифицированных источников (ГМИ) - 12 956 проб продовольственного сырья и пищевых продуктов. Наибольшее количество проб, содержащих ГМИ, в абсолютных значениях, в 2004 г. выявлено в мясной продукции - 946 (в 2003 г. - 272) и «прочей» продукции, основу которой составили растительные белки — 466 (в 2003 г. —

129), В незначительном количестве ГМИ встречались в хлебобулочных и мукомольно-крупяных изделиях (44 пробы), птице и птицеводческих продуктах (29 проб), продуктах детского питания (13 проб) и консервах (13 проб).

В связи с этим необходимо идентифицировать продукцию содержащую примеси ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения. На сегодняшний день это является одной из актуальнейших задач биотехнологии. Для этого необходимы разработка и создание высоко эффективных диагностических тест-систем для выявления трансгенных растений в пищевых продуктах, продовольственном сырье, семенном материале, кормах животных, лекарственном сырье. Основой современных методик служат качественные и количественные методы. Данные методики должны позволять проводить определение ГМИ как в термообработанных продуктах, так и нативных.

Цель и задачи исследований.

Целью исследований являлось совершенствование методов идентификации примесей ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.

В задачи исследований входило:

• разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения для качественного и количественного определения ГМИ;

- сравнительная характеристика методик выделения ДНК;

- совершенствование методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов;

- разработка модифицированной методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;

- совершенствование методики количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;

проведение мониторинговых исследований по выявлению фальсифицирующих примесей из ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

Научная новизна:

Разработаны модифицированные высокоэффективные методики выделения ДНК с использованием ионного детергента СТАВ (цетиятриметиламмониум бромида), а также с использованием сорбента Silica (S1O2). Разработанные методики позволяют получать свободную от ицгибиругощих примесей и в необходимых количествах ДНК из различных продуктов, содержащих компоненты животного и растительного происхождения. ДНК пригодна для качественного и количественного анализа. Методики Moiyr использоваться для экстракции и очистки ДНК как многокомпонентных смесей, так и од покомпонентных.

Усовершенствованы методики качественного определения ГМИ (сои и кукурузы), включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (S1O2) или ионного детергента СТАВ (цетиятриметиламмониум бромида), постановку ПЦР с использованием праймеров на лектии н крахмальную синтазу и последующим электрофоретическим разделением ампликонов.

Проведены исследования по совершенствованию методик определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени, включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (S1O3) или использование ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), амплификации ДНК с мечеными ДНК-зондами (представляющие собой олигопуклеотид, несущий флуоресцентный краситель и флуоресцентный гаситель), используемые для качественной и количественной оценки продукта.

Разработана модифицированная методика качественного обнаружения ГМИ с использованием 35S промотора, NOS терминатора и внутреннего положительного контроля в одной реакционной смеси, включающую

ускоренную пробоподготовку и оценку результатов на основе ПЦР в реальном времени.

Показала высокая чувствительность и специфичность разработанных количественных методик модифицированных методик количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени (сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2, кукурузы линии MON 810), позволяющих обнаруживать в образце ГМИ менее 0,1 % как в сырье, так и в продуктах питания, в том числе термообработанных. Время анализа сокращается в 1,5-2 раза.

Проведены мониторинговые исследования в сырье и продуктах питания с использованием разработанных методик, показавших возможность использования их для скрининговых и количественных тестов выявления недекларированных ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

Практическая ценность.

На основании результатов исследований разработаны:

- Методические рекомендации «Качественное определение ГМИ в продуктах, . содержащих компоненты животного и растительного происхождения» (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 20.10.2006 г.)

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены

на:

- V Международной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2004 г.).

- заседании Ученого совета ГНУ ВНИИВСГЭ (2005 г.);

- межлабораторном совещании ГНУ ВНИИВСГЭ (2006г.);

- V международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» Москва, МГУ ПБ, 2006 г.

Публикации. Результаты исследований отражены в 5 научных статьях.

Положения, выносимые на защиту.

- разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения для качественного и количественного определения искомой ДНК;

- совершенствование методик качественного определения ГМИ на основе ПНР с электрофор етической детекцией ампликонов;

- совершенствование методик качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;

- совершенствование методик количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;

- сравнительная оценка методов по специфичности, чувствительности и быстродействию;

проведение мониторинговых исследований по выявлению фальсифицирующих примесей из ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений.

Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 150 источников отечественных и зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 .Материалы и методы исследований.

Работа проводилась в период с 2003 по 2006 гг. Работа выполнена в отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН).

Экспериментальная часть работы проводилась в Всероссийском научно-исследовательсом институте сельскохозяйственной биотехнологии (ВНИИСБ) на базе ЗАО "Синтол" и лаборатории "Союзэкспертша" Торгово-промышленной палаты РФ.

Для исследований использовали тест-наборы на основе ПЦР производства России, предоставленные фирмой ЗАО "Синтол", а также тест-наборы серии SureFood на основе ПЦР и ГИФА производства Германии (для идентификации и определения ГМИ). Исследования проводились на приборах отечественного ('Терцик" ДНК-технологии, "АНК-16", "АНК-32", ИАнП РАН) и зарубежного производства ("ICycler", Bio-Rad, "ABI Prism 7000", Applied Biosystems)

Для обнаружения ГМИ каждая проба анализировалась в 5 повторностей проб.

2.2 Результаты исследований.

2.2.1 Разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения.

За основу нашей методики был взят протокол предложенный Мюррай и Томпсоном (Murray and Thompson, 1980). Этот метод подходит для выделения и очистки ДНК из растений и продуктов растительного происхождения. Полученная ДНК свободна от полисахаридов, полифенолов и других ингибиторов ПЦР. Данный протокол широко используется в современной генной инженерии растений, а также используется для обнаружения ГМИ и рекомендован Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ).

Принцип модифицированного метода заключается в следующем: растительные клетки разрушаются ионным детергентом СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), который образует затем нерастворимый комплекс с нуклеиновыми кислотами в буфере с низкой концентрацией соли. При этом полисахариды и другие примеси остаются в супернатанте и удаляются. Комплекс ДНК-СТАВ переходит в растворимое состояние с

увеличением концентрации соли. Затем полученная ДНК осаждается этанолом, а супернатант, содержащий примеси, удаляется. Полученная ДНК сушится и растворяется в ТЕ-буфере.

Модифицированный и оптимизированный метод требует существенно меньшее время, затрачиваемое на выделение ДНК по сравнению с исходным протоколом. Время анализа сократилось с 5-6 часов до 3-4 для 8 образцов, что особенно важно При скрининговых исследованиях, используемых для выявления и идентификации ГМИ. .Для данного протокола характерен широкий спектр объектов для исследований и высокий выход ДНК, что позволяет использовать его для арбитражных решений. При этом выделяется высококачественная ДНК, свободная от различных ингибиторов ПЦР, и пригодная для качественного и количественного анализа ПЦР в реальном времени.

В тоже время при большинстве скрининговых исследований для определения фальсифицированных примесей ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения, анализируются образцы, содержащие значительное количество ДНК, такие как колбасы, изоляты, консервы, мука и т.д. При анализе этих продуктов нет нужды использовать методики выделения ДНК дающих большой выход. Однако, затрачиваемое время и качество получаемой ДНК имеет, по-прежнему, огромное значение. Исходя из этих требований, был предложен простой и быстрый протокол выделения и очистки ДНК.

Принцип метода заключается в следующем: растительные клетки разрушаются ионным детергентом СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), который образует затем нерастворимый комплекс с нуклеиновыми кислотами в буфере с низкой концентрацией соли. При этом полисахариды и другие примеси остаются в супернатанте и удаляются. Комплекс ДНК-СТАВ переходит в растворимое состояние с увеличением концентрации соли. ДНК остается абсорбированной на Silica. Затем абсорбированная ДНК

промывается этанолом, а примеси, находящиеся в супернатанте, удаляются. Искомая ДНК сушится и растворяется в ТЕ-буфере.

Полученный модифицированный и оптимизированный метод позволяет экслрессно и высококачественно выделять ДНК для последующего анализа. Время для выделения ДНК из S образцов составляет 2-2.5 часа, что особенно важно при скрининговых исследованиях, связанных со значительным количеством обработки продуктов животного и растительного происхождения, возможно, содержащих ГМИ. Метод характеризуется хорошим выходом ДНК. Однако возможны потерн ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также вследствие отмывок. Выделяемая ДНК высококачественна и свободна от различных ингибиторов ПЦР, способных вызвать непригодные результаты анализов. Полученная ДНК пригодна для качественного и количественного анализа методом ПЦР в реальном времени.

2.2.2 Сравнительная характеристика методик выделения ДНК.

Предлагаемые модифицированные и оптимизированные методы позволяют экспрессио и высококачественно выделять ДНК для ПЦР анализа. Необходимое время для выделения 8 образцов СТАВ-методом составляет 3-4 часа, а с использованием Silica 2-2.5 часа, что особенно важно при скрининговых исследованиях, связанных со значительным количеством обработки продуктов животного и растительного происхождения, возможно, содержащих ГМИ. Методы характеризуются высоким выходом ДНК. Однако при использовании сорбента Silica возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также вследствие отмывок. Выделяемая ДНК высококачественна и свободна от различных ингибиторов ПЦР, способных вызвать непригодные результаты анализов.

Чистота полученной ДНК доказана спектрофотометрически. Отношение по белку А260А280 для полученных ДНК обоими методами равно 1.8. По полисахаридам А2«уАи<> примерно 2.2. Полученная ДНК пригодна

для качественного и количественного анализа методом ПЦР в реальном времени.

Таблица 1

Результаты сравнительных исследований методик выделения ДНК.

ДНК-СТАВ ДНК-СОРБЕНТ

Необходимое время дня выделения 8 образцов 3-4 часа 2-2,5 часа

АмоАгзо 1.8 1.8

Ака/Адо 2.2 2.2

Выход ДНК высокий Возможны потери

Работа с агрессивными средами нет Нет

Наличие специального оборудования нет Нет

Методы выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов, по сравнению с зарубежными аналогами, отличаются более низкой стоимостью и доступностью реактивов, не уступая им по остальным критериям.

Предложенные нами методы выделения имеют практическое значение для каждодневной лабораторной практики. Выделенная и очищенная данными методами ДНК позволяет проводить, как скрининг продуктов и продовольственного сырья, так научные исследования, требующие наличия высококачественной ДНК, При этом предложенные методы просты и экпрессны, характеризуются высоким выходом свободной от различных примесей ДНК. что подтверждается спекгрофотометрией и сравнением с характером кривой экспоненциального роста накопления продуктов апмлифихации ДНК, выделенной классическим методом, описанный Мармуром. Метод включает в себя ферметативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот

метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако, он довольно трудоемок и предполагает работу с таким агрессивным и вредным веществом, как фенол. Разработанные нами методики исключают работу с такими агрессивными и вредными реагентами, как фенол, изопропанол, не требуют наличия высококвалифицированного персонала и сложного оборудования. Экстракцию и очистку ДНК возможно проводить в небольших и передвижных лабораториях, обладающих необходимым оборудованием.

2.23 Совершенствование методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией амплнконов.

Для качественного определения ГМИ на основе ПЦР были выбраны следующие мишени: 35S промотор, NOS терминатор, ген лектипа, ген крахмальной синтазы и модифицированные гены сои и кукурузы.

Для индикации ГМИ использовали усовершенствованную методику пробоподготовки и амплификацию с 35S промотором и NOS терминатором. Эти два участка ДНК наиболее часто встречаются в современных генно-инженерных конструкциях. Наличие хотя бы одного из них позволяет судить о наличии генномодифицированной вставки и делает целесообразным дальнейший анализ.

Для методики обнаружения трансгенной ДНК в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения, использовали промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. Подобранные праймеры позволяют получить только один ПЦР-лродукт, что говорит о их высокой специфичности. Перекрестных реакций между продуктами, содержащими промотор 35S и не имеющими его, не наблюдалось. Наличие яркой и четкой полосы амцдикона свидетельствовало о оптимально подобранных условиях и составе ПЦР-смеси. Амплификация проходила только с продукцией содержащей ГМИ. Таблица 2

и

Таблица 2.

Качественное определение ГМИ по 35S промотору.

Исследуемые образцы Наличие ПЦР-продукта

Соя негеном од нфицнрованная Her

Кукуруза неге ном одифшшро ванная Нет

Соя ГМИ линии 40-3-2 Да

Кукуруза ГМИ линии Mon 810 Да

Компонент №1 (ISP-1-95), содержащ. ГМИ Да

Компонент №2 (ISP-2-95), содержащ. ГМИ Да

Изолят соевого белка, не содержащ, ГМИ Нет

Для методики обнаружения трансгенной ДНК в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения, мы использовали NOS терминатор Agrobacterium tumefeciens.

Таблица 3.

Качественное определение ГМИ по NOS терминатору.

Исследуемые образцы Наличие ПЦР-продукта

Соя и еге ном одифицнро ванная Нет..

Кукуруза негеномодифицированная Нет

Соя ГМИ линии 40-3-2 Да

Кукуруза ГМИ линии Mon 8 ! 0 Да

Компонент №1 (ISP-1-95), содержащ. ГМИ Да

Компонент №2 (1SP-2-95), содержащ. ГМИ Да

Изолят соевого белка, не содержат. ГМИ Нет

Подобранные праймеры позволяли получить "только один ПЦР-продукт, что говорит о их высокой специфичности. Перекрестных реакций между продуктами содержащими, NOS терминатор и не имеющими его, не наблюдалось. Наличие яркой и четкой полосы ампликона свидетельствовало о оптимально подобранных условиях и составе ПЦР-смеси, Специфичные

амгашконы обнаруживали только в продукции, содержащей ГМИ, п отсутствовали в ^модифицированной.

Для определения наличия в анализируемом образце ДНК сои использовали ген лектина Lee. В случае обнаружения в образце вставки 35$ промотора, NOS терминатора и гена лектина, проводили идентификацию трансгенной ДНК по сое линии 40-3-2, устойчивой к глифосату. Дня этого использовали последовательность специфичную для сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2. Данная линия получила широкое распространение и наиболее часто встречается в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.

Для методики обнаружения ДНК сон в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения, мы использовали ген лектина. Подобранные праймеры позволяли получить только один фрагмент ПЦР-продукг, что говорит о их высокой специфичности. Перекрестных реакций между продуктами, содержащими ген лектина и не имеющими его, не наблюдалось. Наличие яркой и четкой полосы амшшкона свидетельствует о хорошо подобранных условиях и составе ПЦР-смеси. Амплификация идет только с продукцией, содержащей сою.

Для методики обнаружения трансгенной сои линии 40-3-2, устойчивой к глифосату, в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения использовали специфичную последовательность ДНК. Подобранные праймеры позволяли получить только один ПЦР-продукг, что говорит о их высокой специфичности. Наличие яркой и четкой полосы амгшикона свидетельствует о хорошо подобранных условиях и составе ПЦР-смеси. Амплификация идет только с продукцией содержащей, сою линии 40-3-2.

Для определения наличия в анализируемом образце ДНК кукурузы использовали ген крахмальной сшггазы SSllb. В случае обнаружения в образце участков вставки 35S промотора, NOS терминатора и гена крахмальной синтазы S S lib кукурузы, проводили идентификацию

трансгенной ДНК по кукурузе линии MON 810, устойчивой к стеблевому мотыльку. Последовательность использовали специфичную для трансгенной кукурузы MON 810. Данная линия получила широкое распространение и наиболее часто встречается в продуктах содержащих компоненты животного и растительного происхождения

.Для методики обнаружения ДНК кукурузы в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения, мы использовали ген крахмальной синтазы S S lib. Подобранные праймеры позволяли получить только один ПЦР-продукг, что говорит о их высокой специфичности. Перекрестных реакций между продуктами содержащими ген крахмальной синтазы и не имеющими его не наблюдалось. Наличие яркой и четкой полосы амшшкона свидетельствует о хорошо подобранных условиях и составе ПЦР-смеси. Амплификация идет только с продукцией содержащей кукурузу.

Для методики обнаружения трансгенной ДНК кукурузы линии MON 810, устойчивой к стеблевому мотыльку, в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения, мы использовали специфичный модифицированный ген. Подобранные праймеры позволяют получить только один ПЦР-продукг, что говорит о их высокой специфичности. Перекрестных реакций между продуктами содержащими специфичный модифицированный ген и не имеющими его не наблюдалось. Наличие яркой и ■wwftaû полосы ампликона свидетельствует о хорошо пож^р4"™ ijx условиях и составе ПЦР-смеси. Амплификация идет только с продукцией содержащей кукурузу линии MON 810.

В результате проведенных исследований были усовершенствованы методики качественного определения ГМИ (сои и кукурузы), включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (S1O2) или ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), постановку ПЦР с использованием праймеров на яектин и крахмальную синтазу и последующим электрофоретическим разделением ампликонов.

2.2.4 Разработка модифицированной методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени.

При проведении большого числа мониторинговых исследований сначала используют недорогой качественный ПЦР -анализ. Схема анализа, основанная на здектрофоретической детекции ампликонов, весьма трудоемка, требует наличия отдельного помещения для постановки электрофореза, отдельного персонала, не контактирующего с другим персоналом во избежание контаминации. Однако, главным недостатком диагностических наборов, основанных на классической схеме с использованием электрофореза, является не возможность проведения точной количественной оценки искомой ДНК. Поэтому были предложены методики на основе полимерззной цепной реакции в режиме реального времени. Эта технология не требует постановки электрофореза, способна следить за ходом реакции в режиме реального времени и позволяет количественно оценивать искомую ДНК.

На основе технологии ПЦР В реальном времени были предложены усовершенствованные методики качественного и количественного определения ГМ растений.

Качественная методика предназначена для скрининговых исследований продуктов, содержащих компоненты животного и растительного происхождения. Используется для выявления широко распространенных линий ГМ растений содержащие, участки вставки 35S промотор и NOS терминатор. Для слежения за ходом реакции используется внутренний положительный контроль.

В скрннннговой методике используется усовершенствованная методика выделения ДНК и мультиплексная реакция. В одной пробирке одновременно, независимо друг от друга идут три реакции:

1 реакция - для определения терминатора NOS бактерии Agrobacterium tumefaciens. Этот участок используется в генно-инженерных конструкциях, предназначенных для получения трансгеиных растений,

Используемый гибриднзационный зонд метили флуоресцентным красителем РАМ, в качестве флуоресцентного тушителя использовали ВН<31.

2 реакция - для определения промотора 35Я вируса мозаики цветной капусты. Этот ген применяется в генно-инженерных конструкциях, предназначенных для получения трансгенных растений. Используемый гибриднзационный зонд метили флуоресцентным красителем КОХ, в качестве флуоресцентного тушителя использовали ВНС>2.

3 реакция - внутреннего положительного контроля, для исключения ложноотрицател ьных результатов. Используемый гибриднзационный зонд метили флуоресцентным красителем Су5, в качестве флуоресцентного тушителя использовали ВН<33.

1 2 1 А £ • г в i ia il .13 iíi< i* « if i( ffl a îi » ïs ai я )• ir » » » я as ?) и ж* я » » «41 « «м «S « « л

Рисунок !. Результаты качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени.

2.2.5. Совершенствование методики количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени.

В случае обнаружения в образце генов вставки 35S промотор, NOS терминатор и Lee лектина, проводили количественную оценку и идентификацию трансгенной ДНК сои линии 40-3-2, устойчивой к

глифосату. Для этого была усовершенствована методика количественного анализа ГМИ.

В количественной методике также используется усовершенствованная профподготовка и мультиплексная реакция. В одной пробирке одновременно, независимо друг от друга идут две реакции:

1 реакция - ген лекпша, присутствующий как в ГМ так и в обычной сое. Исполъзусмый гибридизационный зонд метили флуоресцентным красителем R6G, в качестве флуоресцентного тушителя использовали BHQ2.

2 реакция - фрагмент ДНК, специфичный для сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2. Используемый гибридизационный зонд мстили флуоресцентным красителем ROX, в качестве флуоресцентного тушителя использовали BHQ2.

Результаты анализа представлены на рисунке 2.

Рисунок 2, Результаты количественного определения ГМИ сои на основе ПЦР в реальном времени.

В случае обнаружения в образце генов вставки 35 S промотор, NOS терминатор и крахмальной синтезы SSllb, проводили идентификацию и количественную оценку трансгенной Д(ПС по кукурузе линии MON 810,

устойчивой к стеблевому мотыльку. Для зггого была усовершенствована методика количественного анализа ГМИ.

В количественной методике также используется усовершенствованная пробоподготовка и мультиплексная реакция. В одной пробирке одновременно, независимо друг от друга идут две реакции:

1 реакция - ген крахмальной синтазы SSIlb кукурузы, который присутствует как в трансгенной, так и в обычной кукурузе. Используемый габридизационный зонд метили флуоресцентным красителем R6G, в качестве флуоресцентного тушителя использовали BHQ2.

2 реакция - ген специфичный для кукурузы линии MON 810. Используемый шбридизационный зонд метили флуоресцентным красителем ROX, в качестве флуоресцентного тушителя использовали BHQ2.

Результаты анализа представлены на рисунке 3.

Рисунок 3. Результаты количественного определения ГМИ кукурузы на основе ПЦР в реальном времени.

Результаты анализа представленные на рисунке 2,3 позволяют говорить о положительной динамике хода ПЦР в реальном времени для образца содержащего ГМИ.

2.2.6 Проведение мониторинговых исследований по выявлению фальсифицирующих примесей.

За время исследований были проведены мониторинговые исследования 110 образцов различных продуктов питания и пищевого сырья (колбас, сосисок, консервов, пельменей, муки и крупяных изделий, молочных продуктов, овощей, жировых растительных продуктов и прочих (рисунок 4)).

рМукв и крупяшв иэдалня * Колбасы и продукты мясопврераФотки

□ Пельмени

□ Сосиски тКонсервы

в Молочные продукты •Преду»™ детского питания о Свищи .

■Жировые растительные лрадуод л Прочна__

Рисунок 4. Проанализированная продукция.

Мониторинг исследуемой продукции показал возможность применения разработанных методик для качественного и количественного определения иедекларировапных компонентов из ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

ВЫВОДЫ

1. Разработанные модифицированные высокоэффективные методики выделения ДНК с использованием ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), а также с использованием сорбента Silica (S1O2), позволяют получать свободную от ингибирующих примесей ДНК и ускоряют время выделения ДНК в 1,5-2 раза.

2. Предложенные методики используются для экстракции и очистки ДНК как одпокомпонентных, так и многокомпонентных смесей животного и

2. Предложенные методики используются для экстракции и очистки ДНК как о дно компонентных, так и многокомпонентных смесей животного и растительного происхождения в целях последующего качественного и количественного анализа.

3. Усовершенствованные методики качественного определения ГМИ (сои и кукурузы), включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (БЮг) или ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), постановку ПЦР с использованием праймеров на лектин и крахмальную синтазу и последующим электрофоретическим разделением ампликонов, ускоряют определение ГМИ в продуктах растительного и животного происхождения.

4. Разработанная модифицированная методика с использованием 35S-промотора, NOS-терминатора и внутреннего положительного контроля в одной реакционной смеси, включающая ускоренную пробоподготовку и оценку результатов на основе ПЦР в реальном времени, сокращают время качественного определения ГМИ в продуктах растительного и животного происхождения до 4 часов.

5. Модифицированные методики количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени (сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2, кукурузы линии MOM 810),высоко специфичны и позволяют обнаруживать в образце ГМИ менее 0,1 % как в сырье, так и в продуктах питания, в том числе термообработанных.

6. Разработанные методики определения и идентификации ГМИ по основным характеристикам не уступают зарубежным аналогам, имеют более низкую стоимость и сокращают время анализа в 1,5-2 раза.

7. Проведенные мониторинговые исследования продукции животного и растительного происхождения с использованием разработанных методик показали возможность их использования для скрининговых и количественных тестов выявления недекларированных ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Для использования в научных учреждениях и исследовательских лабораториях могут быть рекомендованы разработанные нами:

- Методические рекомендации "Качественное определение ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения" (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 20.10.2006 г;)

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Е.А. Горобчук, С.А. Маргиева, В.И. Родин, Н.Г. Хоменец, A.B. Каверин, В.В. Светличкин, Д.Г. Узунян. /Оценка безопасности и качества сырья и продуктов животного происхождения на основе ДНК-дналгостикиЛ Материалы S-ой Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции", МГУПБ, Москва, 2004, стр. 45-46.

2. Каверин A.B. / Количественное определение ГМИ методом ПЦР в реальном времени// Труды ВНИИВСГЭ "Проблемы ветеринарной санитарии и экологии", Москва, 2006, стр. 34-37

3. Каверин A.B., Рощупкина Л.В., Горожанина Е.С., Бутко МЛ./ Тестирование сои в стерилизованных консервах на основе ПЦР, ДНК-гибридизации и ИФА Л Материалы 5-оЙ международной научной конференции "Живые системы и биологическая безопасность населения", МГУПБ, Москва 2006, стр. 42-47

4. Каверин A.B., Рощупкина Л.В., Горожанина Е.С., Галкин A.B./ Использование метода ПЦР в экспертизе пищевых продуктов для видовой идентификации сырья животного происхождения.// Материалы 5-ой международной научной конференции "Живые системы и биологическая безопасность населения", МГУПБ, Москва 2006, стр. 48-52

5, Ивановцев D.B., Светличкик В.В., Каверин A.B. / Идентификация трансгенной сои в продуктах и кормах.// Журнал "Ветеринария и кормление", Москва 2006, №6 стр. 21-22

ВНИИВСГЭ. г. Москва, Звенигородское шоссе, 5 Заказ <2 /^ . Тираж 100 экз.

Актуальность темы.

В последние годы значительно увеличилось производство и импорт трансгенной продукции. Крупнейшими производителями генетически модифицированных организмов (ГМО) выступают такие корпорации, как DuPont Canada Agricultural Product, Bayer CropScience, AgrEvo, Pioneer Hi-Bred, Dekalb Genetics, Northrup King, Rhone-Poulens, Plant Genetic Systems, N. V, Seminis Vegetable Seeds, AstraZeneca, Aventis, Novartis, Asgrow и абсолютный лидер - американская транснациональная корпорация Monsanto. Она же - мировой лидер в производстве и внедрении в сельское хозяйство наиболее продаваемых гербицидов: Раундап и Раундап-био. Фирмой созданы трансгенные устойчивые к этим гербицидам пищевые культуры сои, кукурузы, риса, пшеницы, ячменя, сахарной свеклы, картофеля. Фирма является также разработчиком технологий возделывания трансгенных культур с использованием этих гербицидов.

За десять лет коммерческого использования ГМ-культур объемы потребления, в частности модифицированной сои, составили: в России - 300 тысяч тонн, в странах ЕС - 50 миллионов тонн, в США - 500 миллионов тонн. Список разрешенных для использования в питании и кормах сельскохозяйственных культур на 2005 год, включает более 100 генетически модифицированных продуктов. При этом ежегодный импорт товаров, произведенных с использованием биотехнологии, оценивается в 650 млн. долл. США. Внутренний ежегодный объём российского рынка биотехнологических товаров превышает 1 млрд. долл. США. В связи с этим увеличивается вероятность поступления пищевой продукции, полученной из ГМИ, или содержащей компоненты из ГМИ, на внутренний рынок Российской Федерации.

Увеличение объемов производства связано с использованием генетически модифицированных источников в пищевой отрасли. В связи с потенциальной опасностью ГМИ, были разработаны правовые документы, регулирующие генно-инженерную деятельность и использование генно-модифицированных продуктов (ГМ-продуктов), которые в обязательном порядке должны подвергаться экспертизе и проходить госрегистрацию, а продукты, содержащие белок или ДНК, затем маркироваться.

Рынок продукции содержащей компоненты животного и растительного происхождения постоянно расширяется (8, 21, 22, 28). В связи с этим проблема контроля содержания в продуктах питания ГМ-компонентов становится актуальнее год от года. Во многом это определяется активным присутствием на рынке импортных пищевых продуктов, и особенно, сырьевых растительных компонентов, количество которых в будущем будет увеличиваться (29). Учитывая, что маркировка ГМ-продуктов не была в России обязательной до июля 2000 года, существуют опасения, что российский рынок переполнен ГМ-продуктами из Северной Америки, которые невозможно продать в Европе.

В настоящее время значительная часть импортируемых в Россию продуктов содержат компоненты из ГМИ (в основном сои). Трансгенные белки сои постоянно возрастающими темпами заменяют в продуктах питания биологически полноценные животные белки и растительные белки традиционных культур. Современные регламенты производства любых продуктов питания не ограничивают содержание в них трансгенных растительных белков, а только требуют их маркировки. Учитывая, что замена трансгенным соевым белком белков животных - сверхвыгодный бизнес, и без того весьма скудных по биологической полноценности, рацион не менее 100 млн. россиян станет на 60-70% еще хуже. Это обострит и без того весьма неблагополучное положение со здоровьем большей части населения России, особенно молодежи. Сейчас средний россиянин съедает в год 32 кг натурального мяса и рыбы, что на 40% меньше медицинской нормы. При продолжающейся замене животных белков соевыми он в 2006-2007 годах уже Будет съедать только 20-25 кг животных белков (20).

В 2005 г. территориальными управлениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по субъектам Российской Федерации, исследовано 18872 пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов (2004 г. - 12956, 2003 г. -4300). При проведении исследований выявлено 1443 пробы (2004 г. - 1552, 2003 г. - 511), содержащие компоненты ГМО, что составило 7,6% (2004 г. -12%, 2003 г. - 11,9%). В импортируемых пищевых продуктах компоненты ГМО содержались в 6,5% (2004 г. - 14,51%, 2003 г. -14.8%) (9).

Наиболее часто ГМО встречаются в мясных продуктах - 15,8% (2004г. - 20,5%, 2003 г. - 14,8%), группа продуктов "прочие" (в основном растительные белки) - 10,8% (2004 г. - 16,7%, 2003 г. - 16,4%), птицеводческие продукты - 9,1% (2004 г. -15,4%, 2003 г. - 29,5%).

В связи с этим необходимо идентифицировать продукцию содержащую примеси ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения. На сегодняшний день это является одной из актуальнейших задач биотехнологии. Для этого необходимо разработка и создание высоко эффективных диагностических методик для выявления трансгенных растений в пищевых продуктах, продовольственном сырье, семенном материале, кормах животных, лекарственном сырье. Основой современных методик служат качественные и количественные методы. Данные методики должны позволять проводить определение ГМИ как термообработанных продуктах так и нативных.

Цель и задачи исследований.

Целью исследований являлось совершенствование методов идентификации примесей ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.

В задачи исследований входило:

- разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения для качественного и количественного определения ГМИ;

- сравнительная характеристика методик выделения ДНК;

- совершенствование методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов;

- разработка модифицированной методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;

- совершенствование методики количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;

- проведение мониторинговых исследований по выявлению фальсифицирующих примесей из ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

Научная новизна.

Разработаны модифицированные высокоэффективные методики выделения ДНК с использованием ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), а также с использованием сорбента Silica (Si02). Разработанные методики позволяют получать свободную от ингибирующих примесей и в необходимых количествах ДНК из различных продуктов, содержащих компоненты животного и растительного происхождения. ДНК пригодна для качественного и количественного анализа. Методики могут использоваться для экстракции и очистки ДНК как многокомпонентных смесей, так и однокомпонентных.

Усовершенствованы методики качественного определения ГМИ (сои и кукурузы), включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (Si02) или ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), постановку ПЦР с использованием праймеров на лектин и крахмальную синтазу и последующим электрофоретическим разделением ампликонов.

Проведены исследования по совершенствованию методик определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени, включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (SiC^) или использование ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), амплификации ДНК с мечеными ДНК-зондами (представляющие собой олигонуклеотид, несущий флуоресцентный краситель и флуоресцентный гаситель), используемые для качественной и количественной оценки продукта.

Разработана модифицированная методика качественного обнаружения ГМИ с использованием 35S промотора, NOS терминатора и внутреннего положительного контроля в одной реакционной смеси, включающую ускоренную пробоподготовку и оценку результатов на основе ПЦР в реальном времени.

Показана высокая чувствительность и специфичность разработанных количественных методик модифицированных методик количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени (сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2, кукурузы линии MON 810), позволяющих обнаруживать в образце ГМИ менее 0,1 % как в сырье, так и в продуктах питания, в том числе термообработанных. Время анализа сокращается в 1,5-2 раза.

Проведены мониторинговые исследования в сырье и продуктах питания с использованием разработанных методик, показавших возможность использования их для скрининговых и количественных тестов выявления недекларированных ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

Практическая ценность.

На основании результатов исследований разработаны:

- Методические рекомендации «Качественное определение ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.» (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 20.10.2006 г.)

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- V Международной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2004 г.).

- заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2005 г.);

- межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2006г.);

- V Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» Москва, МГУ ПБ, 2006 г.

Публикации. Результаты исследований отражены в 5 научных статьях.

Положения, выносимые на защиту.

- разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения для качественного и количественного определения искомой ДНК;

- совершенствование методик качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов;

- совершенствование методик качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;

- совершенствование методик количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;

- сравнительная оценка методов по специфичности, чувствительности и быстродействию; проведение мониторинговых исследований по выявлению фальсифицирующих примесей из ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

выводы

1. Разработанные модифицированные высокоэффективные методики выделения ДНК с использованием ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), а также с использованием сорбента Silica (Si02), позволяют получать свободную от ингибирующих примесей ДНК и ускоряют время выделения ДНК в 1,5-2 раза.

2. Предложенные методики используются для экстракции и очистки ДНК как однокомпонентных, так и многокомпонентных смесей животного и растительного происхождения в целях последующего качественного и количественного анализа.

3. Усовершенствованные методики качественного определения ГМИ (сои и кукурузы), включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (БЮг) или ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), постановку ПЦР с использованием праймеров на лектин и крахмальную синтазу и последующим электрофоретическим разделением ампликонов, ускоряют определение ГМИ в продуктах растительного и животного происхождения.

4. Разработанная модифицированная методика с использованием 35S-промотора, NOS-терминатора и внутреннего положительного контроля в одной реакционной смеси, включающая ускоренную пробоподготовку и оценку результатов на основе ПЦР в реальном времени, сокращают время качественного определения ГМИ в продуктах растительного и животного происхождения до 4 часов.

5. Модифицированные методики количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени (сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2, кукурузы линии MON 810),высоко специфичны и позволяют обнаруживать в образце ГМИ менее 0,1 % как в сырье, так и в продуктах питания, в том числе термообработанных.

6. Разработанные методики определения и идентификации ГМИ по основным характеристикам не уступают зарубежным аналогам, имеют более низкую стоимость и сокращают время анализа в 1,5-2 раза.

7. Проведенные мониторинговые исследования продукции животного и растительного происхождения с использованием разработанных методик показали возможность их использования для скрининговых и количественных тестов выявления недекларированных ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании результатов исследований разработаны: - Методические рекомендации «Качественное определение ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения» (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 20.10.2006 г.)