Разработка культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек

Раев, Сергей Алексеевич

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Раев, Сергей Алексеевич Москва 2009 г.

Ученая степень: кандидата ветеринарных наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Разработка культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек

На правах рукописи

Раев Сергей Алексеевич

РАЗРАБОТКА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНОЙ ЛЕЙКЕМИИ КОШЕК

Специальность 16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

- з вгн 2009

Москва-2009

003486448

Работа выполнена на кафедре биологии, вирусологии и генной инженерии ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» и НПО «НАРВАК».

Научный руководитель: доктор биологических наук

Непоклонов Евгений Анатольевич (МГУПБ)

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Кунаков Альберт Александрович (МГУПБ) доктор ветеринарных наук, профессор Уласов Валентин Ильич (ФГУ ВГНКИ)

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко,

Защита диссертации состоится « » ууа&^а. 2009г. в IX часов на заседании диссертационного совета Д.212.149.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу 123022, г. Москва, ул. Таллалихина, 33, тел. 253-14-91.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии».

Автореферат разослан « » ноября 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, профессор

Серегин И.Г.

¡.ОБЩАЯХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.¡.Актуальность работы. Вирус лейкемии кошек (Feline leukaemia virus, FeLV или BJ1K) - РНК-содержащий вирус семейства Relroviridae, является одним из наиболее распространенных возбудителей инфекционных заболеваний кошек. В США, где система по обнаружению и изоляции инфицированных животных, а также профилактической вакцинации кошек действует в течение 20 лет, распространенность данного заболевания (среди клинически здоровых животных) составляет 2%. У больных особей, и кошек, принадлежащих к группе риска, эта цифра варьируется от 6 до 33% (Hartmann С., 2006). Инфицированность животных вирусом лейкемии в ЦентральноЧерноземном районе Российской Федерации достигает 12,6% (Федосов Д.В., 2007). В связи с этим, контроль за распространением заболевания и профилактика лейкемии кошек является актуальной проблемой.

Основной путь передачи вируса - горизонтальный, также возможно трансплацентарное инфицирование плода. В организме животных вирус вызывает дегенеративные, пролиферативные и неопластические процессы в клетках гемопоэтического ряда. У персистентно инфицированных кошек это приводит к лейкемии, фибросаркомам или, чаще всего, к супрессии иммунной системы животного, на фоне которой проявляются оппортунистические инфекции (Hardy W.D., 1980).

Основной метод контроля за распространением инфекции, вызываемой BJIK, - выявление и изоляция инфицированных животных (Hartmann С., 2006), а также профилактическая вакцинация кошек. Вакцинированные кошки, у которых происходит синтез вируснейтрализующих антител к поверхностному гликопротеину gp70 BJIK подгруппы А, устойчивы к заражению вирулентным штаммом вируса (Russell Р.Н., 1978).

За рубежом для специфической профилактики вирусной лейкемии кошек разработано несколько видов вакцин, причем установлено, что культуральная инактивированная и рекомбинантная субъединичная вакцины обладают наибольшей эффективностью (Sparkes А.Н., 1997).

1.2.Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек и методов определения ее антигенной активности.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Оптимизировать условия культивирования культуры клеток F422 для получения максимального выхода поверхностного гликопротеина gp70 BJIK.

2. Отработать условия инактивации культуралыюго BJIK.

3.Приготовить экспериментальные серии культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек.

4. Изучить безвредность, реактогенность и антигенную активность экспериментальных серий культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на кошках и лабораторных животных.

5. Определить оптимальную иммунизирующую дозу, способ и схему введения культуральной инактивированиой вакцины для получения напряженного и длительного иммунитета к ВЛК у иммунизированных животных.

6. Получить рекомбинантный белок г§р70 вируса лейкемии кошек и использовать его в иммуноферментном анализе для определения уровня антител к §р70 ВЛК в сыворотке крови кошек.

1.3.Научная новизна. Изысканы оптимальные условия культивирования перевиваемой хронически инфицированной вирусом лейкемии кошек культуры клеток и определены оптимальные условия его накопления.

Отработаны режимы инактивации вируса

Разработана схема изготовления культуральной инактивированиой вакцины против ВЛК.

Определена безвредность и антигенная активность культуральной инактивированиой вакцины против ВЛК на кроликах и кошках.

Изучено влияние хранения на антигенную активность вакцины.

Подобраны праймеры для амплификации гена §р70.

Получен и охарактеризован рекомбинантный оболочечный гликопротеин вируса лейкемии кошек (^70).

Разработана иммуноферментная тест-система для выявления вирус-специфических антител к оболочечному гликопротеину §р70 ВЛК в сыворотке крови кошек.

1.4.Практическая ценность работы. Разработана безвредная и эффективная инактивированная вакцина против вирусной лейкемии кошек.

Научно обоснованы принципы изготовления и биологического контроля инактивированиой вакцины против вирусной лейкемии кошек.

Экспериментально установлена иммунизирующая доза препарата, показана возможность оценки антигенной активности на лабораторных и естественно-восприимчивых животных.

Разработана нормативная документация на культуральную инактивированную вакцину против вирусной лейкемии кошек.

Разработана иммуноферментная тест-система для определения уровня антител к §р70 ВЛК в сыворотке крови кошек.

1.5.Основные положения, выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

-схема изготовления и методы биологического контроля вакцины против вирусной лейкемии кошек,

-результаты исследований по изучению антигенных свойств культуральной инактивированиой вакцины против ВЛК на лабораторных и естественно-восприимчивых животных,

- разработка иммуноферменпой тест-системы по определению уровня антител к оболочечному гликопротешу gp70 BJIK в сыворотке крови кошек.

1.6.Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: 6-ой Мездународной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2007); 7-ой Международной конферщции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2008); 2-ой ежегодной конференции молодых учен,к ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН; заседании Ученого совета МГУПБ (2009), межлабораторном совещании МГУПБ.

1.7.Публикация результатов исакдований. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

1.8. Объем и структура работы. Работа выполнена на базе НПО «НАРВАК». Диссертация 1зложена на 109 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, праетические предложенгя и список литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 8 рисунюми. Список использованной литературы включает 119 отечественных и зарубокных авторов.

Автор выражает признательность за практтескую помощь в проведении исследований Алиперу Т.И., Блиновой JI.C., Богдановой B.C., Валихозу А.Ф., Верховскому O.A., Забережному А.Д., Мусиенсо М.И., Мухину А.Н., Непоклонову Е.А., Непоклоювой И.В., Орлянкин} Б.Г., Селиверстрову A.C., Цибезову В.В.

2.СОБСГВЕИНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2, ¡.Материалы и методы. В качестве источника культурального антигена, а также в качестве источника гена оболочечвдго гликопротеина gp70 и первых 34 аминокислот трансмембранного белка р15Е BJIK, использовали суспензионную перевиваемую культуру клеток лияфомы кошки F422, хронически инфицированную BJIK подгруппы А. Клетки выращивали в пластиковых флаконах и ролл;рах при использовании среды RPMI 1640, содержащей 10% фетальной сыюротки крупного ротого скота, 100 ЕД'см3 пенициллина и 100 мкг/ Ы стрептомицина. Т^кже в экспериментах использовали перевиваемую кулпуру клеток почки кешки (CRFK).

Определение количества поверхностного пикопреггеина gp70 BJIK проводили с помощью KOMMepjecKofl тест-систе.\ы «Feline leukaemia virus antigen ELISA» (Biologicals Lti, Нидерланды). Постановку ИФА, учет и интерпретацию результатов реакции проводыш согласно инструкции производителя.

Для инактивации вируса к кульгуральноиу антиген; добавляли 40% раствор формальдегида. Полноту инактивации вируса лс%емии кошек определяли путем серийного пассировав инактивированноко вируса (3

пассажа) в перевиваемой культуре клеток почки кошки (CRFK). Наличие вируса определяли по ЦПЭ. Отсутствие ЦПЭ свидетельствует о полной инактивации вируса.

В качестве адъювантов использовали 6% гидроксид алюминия (ГОА) и Montanide Gel (Seppic, Франция), которые добавляли к инактивированной вируссодержащей жидкости до конечной концентрации 10% и 20% от общего объема вакцины соответственно. Полученные препараты смешивали на аппарате «Vortex» в течение 10 минут и вводили животным не ранее чем через 18 часов после приготовления.

В опытах использовали клинически здоровых беспородных кошек различного возраста, кроликов массой от 2,5 до 3 кг, морских свинок массой от 350 до 400 г, а также белых мышей массой от 18 до 20 г, соответствующие группы были сформированных по принципу аналогов. Кошкам и кроликам испытуемый препарат вводили двукратно, в дозе 0,5-1 см3 с интервалом - 21 сутки. Пробы крови, которую исследовали на наличие антител к gp70 ВЛК с помощью тест-системы «Feline leukaemia virus gp70 antibody ELISA» отбирали у всех подопытных и контрольных животных до вакцинации, на 21-е и 42-е сутки после вакцинации, а также-дополнительно у кошек - через 6 и 12 месяцев после вакцинации (Biologicals .Ltd., Нидерланды).: Сыворотку крови кошек исследовали на наличие матриксного белка р27 ВЛК в твердофазном ИФА с помощью тест-системы «Feline leukaemia virus-p27 antigen ELISA» этого же производителя. Постановку ИФА, учет и интерпретацию результатов реакции проводили согласно прилагаемых инструкций.

Тотальную РНК выделяли из суспензии клеток с использованием набора для выделения РНК «Tri-reagent» («Sigma», США) по методике производителя.

Ген оболочечного гликопротеина gp70 и первых 34 аминокислот белка р15Е (rgp70) был получен при помощи обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Обратная транскрипция проводилась с использованием набора «RevertAid™ First. Strand cDNA» (Fermentas) по методике производителя. Полученная кДНК служила матрицей для ПЦР. >

ПЦР проводилась, с использованием набора «High Fidelity PCR Enzyme Mix» (Fermentas) с применением следующих праймеров:

1) ААТ AAG GAT CCG GCC ААТ ССТ AGT CCA САС CAA ATA

2) ATT АТС TCG AGG GCT GTT TCA AGG AGG GCT TTA

Праймеры содержали сайты рестрикции:'BamH I (праймер №1) и Xho I

(праймер №2). ¡

Использовали следующие параметры ПЦР: 95°С - 40 с, 59°С - 25 с, 72°С -50 с (для последнего цикла- 15 мин); 28 циклов.

ПЦР-продукт, кодирующий ген оболочечного гликопротеина gp70 и первые 34 аминокислоты трансмембранного белка р15Е, был очищен методом выделения из агарозного геля с помощью набора «DNA Extraction Kit» (Fermentas). Очищенный ПЦР-продукт клонировали в экспрессионный вектор рЕТ23ь (Novagen) по стандартной методике.

Полученная плазмида pET23b+gp70+pl5E была просеквенирована на участке вставки, для чего были использованы праймеры №1, №2, а также два дополнительных прайиера, имеющих места посадки внутри гена gp70:

3) САС CCA GAA GGG AAG АСА AG

4) GGT CGA GAA АСС AGG CAG AG

Секвенирование проводили с помощью набора «ABI Prism BigDye Terminator v.3.1 Cycle» Sequencing Kit» с использованием автоматического секвенатора «Applied Biosystems 3130-GA» и компьютерной программы «SeqMan».

Рекомбинантный белок очищали из биомассы клеток E.coli (штамм (BL21(DE3) pLysS) на NI-NTA агарозе (Qiagen, США) в нативных и денатурирующих условиях по модифицированной методике фирмы-производителя.

Концентрацию белка в полученном препарате определяли с помощью набора «Micro BSA Protein Assay Kit» («Pierce», США).

Идентификацию и степень чистоты целевого продукта проверяли методом электрофорез в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) с использованием додевилсульфата натрия (ДСН), его активность и специфичность - метсдами сэндвич-варианта ИФА и иммуноблотгинга с использованием моноклональных антител 3-17 (мкАТ 3-17), а также референтных положитиьных и отрицательных сывороток крови кроликов, любезно предоставленных д-ром Хервиненном (Европейская Ветеринарная лаборатория, Нидерланды).

В опытах исполвовали полевые и референтные положительные и отрицательные сыворотки крови кошек (любезно предоставленные д-ром Хервиненном, Европейыая Ветеринарная лаборатория, Нидерланды).

Для оценки иммунологической активности белка rgp70 в лунки иммунологического планшета («Greiner», Германия) вносили по 0,1 см3 мкАТ 3-17, разведенных в 0,1 M карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5, КББ). Планшет инкубировали 18 ч при 4°С. Свободные участки иластика блокировали 1% растворэм «Тор Block» («Yuro», Швейцария) в ФСБ (1ч при 37°С). После 5-ти кратной промывки планшета ФСБТ (0,01 M фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, 9,1 % твин-20, рН 7,4) в лунки вносили 0,1 см3 'очищенного белка rgp70e рабочем разведении. (Оптимальную концентрацию антигена -1 мкг/мл, и разедение мкАТ - 1:1000, подбирали в предварительных экспериментах методом шахматного» титрования). Планшет инкубировали I час при 37°С, отмывали а избытка реагентов и вносили по 0,1 см3 сывороток крови кошек (разведеше 1:150) в ФСБТ с добавлением 0,5 % бычьего сывороточного альбумиы. Планшет инкубировали 1 час при 37°С, отмывали и добавляли 0,1 см3 мечегнх пероксидазой хрена антител к иммуноглобулину G кошек («Sigma», США) Планшет инкубировали 1 час при 37 С, отмывали от избытка реагентов и добавляли субстратный раствор: 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (7М5, «МДЛ», Россия). Реакцию останавливали 1 M H2S04. Интенсивность окраски в лунках определяли на спектрофотометре с

вертикальным лучом «Multiscan МСС» («Flow», Англия) при длине волны 450 нм (А45о)-

Учет и интерпретация результатов ИФА:

1.Вычисляли среднее арифметическое значение А450 для всех проб К (А45оК%), К" (AtsoK'cp) и для каждой опытной пробы (А^оОГу.

2. Вычисляли величину (A450K+cp - А,5оК"ср), которая должна составлять >

0,5.

3. Вычисляли коэффициент связывания (Ксв) для каждой испытуемой сыворотки по формуле: Ксв= (А45оОПср- А45оК"ср / А450К ср - А^оК'ср) х 100.

Пробу считали отрицательной, если величина Kcs < 30%; если величина Кса> 30% пробу считали положительной.

2,2.Результаты собственных исследований.

2.2. ¡.Изучение условий культивирования культуры клеток F422. Оптимизация условий культивирования клеток F422 (рис.№1) привела к следующим результатам: максимальное накопление оболочечного гликопротеина gp70 BJIK наблюдается при культивировании клеток в роллерах с использованием в качестве питательной среды RPM1 1640 с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и добавлением 100 ЕД пенициллина и 100 f_ig стрептомицина на 1см3 среды, при этом концентрация клеток достигала 1-1,2x106, а титр оболочечного гликопротеина gp70 BJIK в ИФА - 1:32.

Культура клеток F422.

Рис. №1

Изучение влияния длительности культивирования культуры клеток Р422 на уровень содержания оболочечного гликопротеина £р70 ВЛК в культуральной жидкости показало, что пик концентрации клеток и, соответственно, максимум концентрации белка gp70 (таб.№1) наблюдается через 72 ч культивирования, дальнейшее культивирование не приводило к увеличению концентрации клеток и концентрации gp70.

Влияние времени культивирования культуры клеток Р422 на уровень содержания оболочечного гликопротеина йр70 ВЛК в культуральной жидкости.

Таб.№1

Время культивирования, час Концентрация клеток Титр антигена в ИФА

24 Зх 1О'/мл 1:4-1:8

48 5x105/мл 1:16

72 ЫО'/мл 1:32

96 1хЮь/мл 1:32

120 1x107мл 1:32

2.2.2.Инактивация вируса. По результатам проведенных исследований было установлено, что 40 % формальдегид в концентрации 3 мкл на 1 мл вируссодержащей суспензии полностью инактивировал вирус лейкемии кошек при экспозиции 24 часа.

2.2.3.0пределение антигенной активности культуральной ичактивированной вакцины против ВЛК на лабораторных животньос. Для определения антигенной активности в качестве экспериментальной модели использовали кроликов, которых разбили на 13 групп (по 4 животных в каждой группе). Опытным животным вводили вакцину двукратно с интервалом в 21 сутки. Животных 13-ой группы не вакцинировали.

Состав вакцин, дозы, пути введения и полученные результаты представлены в таб. № 2.

Определение антигенной активности культуральной инактнвироваиной вакцины против ВЛК на лабораторных животных.

Таб. Л«2

Номер группы Адьювант Концентрация от общего объема препарата, % Путь введения Доза препара та, мл Средний геометрический титр антител к £р 70 ВЛК вИФА

Одень 21 сут 42 сут

1 ГОА 10 в/м 1 1:2 1:11 1:54

2 ГОА 10 в/м 0,5 1:2 1:8 1:32

3 ГОА 20 в/м 1 1:2 1:13 1:64

4 ГОА 20 в/м 0,5 1:2 1:11 1:45

5 Мог.шш'де ве! 10 в/м 1 1:2 1:23 1:76

6 Моп1ашс1е ве1 10 в/м 0,5 1:2 1:27 1:64

7 Моп1ашс1е бе1 10 п/к 1 1:2 1:32 1:76

8 МоШаш£1е ве! 10 п/к 0,5 1:2 1:23 1:108

9 МотапИе 20 в/м 1 1:2 1:45 1:215

Gel

10 Mor.tanide Gel 20 в/м 0,5 1:2 1:45 1:108

11 Montanide Gel 20 п/к 1 1:2 1:27 1:181

12 Montanide Gel 20 п/к 0,5 1:2 1:3.8 1:90

13 Не вакцинировали 1:2 <1:2 <1:2

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что у всех вакцинированных животных наблюдалась выраженная сероконверсия, а уровень антител к gp70 BJ1K через 3 недели после 2-ой вакцинации составил от 1:32 до 1:320. При этом антигенная активность вакцин, в которых в качестве адъюванта использовали Montanide Gel, была выше по сравнению с вакцинами на основе ГОЛ. Максимальный уровень иммунного ответа (средний геометрический титр антител по группе 1:215) установлен у животных 9-ой группы, иммунизированных внутримышечно вакциной, в которой в качестве адъюванта использовали Montanide Gel в концентрации 20% от общего объема препарата в дозе 1,0 мл.

Клинические обследования, проводившиеся в течение всего эксперимента, не выявили у вакцинированных кроликов каких-либо местных и общих негативных реакций на введение препаратов. Только у животных, которым вводилась вакцина, содержащая ГОА, было отмечено образование умеренного отека в месте инъекции, который исчезал в течение недели после иммунизации.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что приготовленные нами инактивированные вакцины против вирусной лейкемии кошек вызывают у кроликов синтез специфических антител к поверхностному гликопротеину gp70 ВЛК. Антигенная активность вакцин, где в качестве адъюванта использовали Montanide Gel, выше аналогичных препаратов с ГОА.

2.2.4.0пределение антигенной активности культуралъной инактивированной вакцины против ВЛК на кошках. Для определения антигенной активности в качестве экспериментальной модели использовали кошек, которых разбили на 13 групп (по 4 животных в каждой группе). Опытным животным вводили вакцину двукратно с интервалом в 21 сутки. Животных 13-ой группы не вакцинировали. Состав вакцин, дозы, пути введения и полученные результаты представлены в таб. №3.

Определение антигенной активности культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на кошках.

Таб. т

Номер группы Адъювант Концентрация от общего объема препарата, % Путь введения Доза препарата, ем3 Средний геометрический титр антител к gp 70 в ИФА

0 день 21 суг 42 суг 6 мес 12 мес

] ГОА 10 в/м 1 1:10 1:17 1:68 1:30 1:10

2 ГОА 10 в/м 0,5 1:10 1:23 1:52 1:30 1:17

3 ГОА 20 в/м 1 1:10 1:52 1:118 1:52 1:30

4 ГОА 20 в/м 0,5 1:13 1:17 1:90 1:52 1:23

5 Montanide Gel 10 в/м 1 1:10 1:52 1:205 1:156 1:90

6 Montanide Gel 10 в/м 0,5 1:10 1:52 1:156 1:90 1:68

7 Montanide Gel 10 п/к 1 1:10 1:90 1:205 1:156 1:90

8 Montanide Gel 10 п/к 0,5 1:10 1:39 1:118 1:90 1:52

9 Montanide Gel 20 в/м 1 1:13 1:11S 1:810 1:615 1:270

10 Montanide Gel 20 в/м 0,5 1:13 1:118 1:355 1:270 1:156

11 Montanide Gel 20 п/к 1 1:10 1:156 1:615 1:546 1:270

12 Montanide Gel 20 п/к 0,5 , 1:10 1:68 1:270 1.205 1:156

13 Не вакцинировали 1:10 1:10 1:10 1:10 1:10

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что у всех вакцинированных животных наблюдалась выраженная сероконверсия, а уровень антител к gp70 BJIK через 3 недели после 2-ой вакцинации составил от 1:30 до 1:810. При этом максимальный уровень иммунного ответа (средний геометрический титр антител по группе 1:810) установлен у животных иммунизированных вакциной в дозе 1,0 мл внутримышечно, в которой в качестве адъюванта использовали Montanide Gel в количестве 20 % от общего объема препарата. У кошек, которым аналогичную вакцину вводили подкожно, уровень антител был ниже, и в среднем составил 1:546.

Известно, что протективный титр антител, определяемый в ИФА, при экспериментальном заражении кошек вирулентным штаммом Glasgow-1 ВЛК равен 1:256, а в случаях длительного контакта здоровых кошек с BJIK-инфицированными -1:100 (Jarrett О., 1977; Clark N., et. al., 1991).

Следовательно, большинство вакцинированных нами животных (более 83%) способно противостоять контрольному заражению вирулентным BJIK и все они будут защищены от инфицирования при контакте с больными кошками.

Ежедневные клинические обследования подопытных и контрольных кошек не выявили у животных отклонений в состоянии здоровья и побочных эффектов. Все животные сохраняли нормальные поведенческие реакции, у них не наблюдалось снижения аппетита и появления угнетенности, однако у кошек иммунизированных вакцинами, содержащими ГОА, наблюдалось образование умеренного отека в месте инъекции, который исчезал в течение от 1-ой до 2-х недель после иммунизации.

Известно, что выявление в крови кошек матриксного белка р27 ВЛК свидетельствует о наличии виремии у животных (Hardy W., 1991; Hartmann С., 2006). В ходе эксперимента нами не был выявлен антиген р27 ВЛК в сыворотке крови всех подопытных и контрольных кошек в течение всего периода наблюдения. Исходя из этого, был сделан вывод о том, что разработанная нами культуральная инактивированная вакцина против вирусной лейкемии кошек не способна инфицировать животных или вызывать реактивацию латентной инфекции.

Важной характеристикой любой вакцины является способность длительно поддерживать уровень антител, способный препятствовать инфицированию животных. Исходя из этого, мы определяли уровень антител к gp70 и наличие антигена р27 у вакцинированных кошек через шесть и двенадцать месяцев после вакцинации (таб. №3., рис №2).

В результате проведенных исследований установлено, что через шесть месяцев после вакцинации уровень антител к gp70, превышающий 1:100 (защищающий при контакте с инфицированными кошками), наблюдали у кошек, которых иммунизировали вакцинами с 10% концентрацией Montanide Gel в дозе 1,0 см3 и у кошек, иммунизированных вакциной с 20% концентрацией Montanide Gel в дозе 0,5-1,0 см3. Кроме того, титр антител более 1:256 (защищающий при контрольном заражении) был отмечен у кошек, которым вводили вакцину с 20% Montanide Gel в дозе 1,0 см3 (группы 9 и И). Через двенадцать месяцев после иммунизации титр выше 1:256 был отмечен у животных этих же групп (20% Montanide Gel, доза 1,0 см3), а титр антител выше 1:100 отмечали б группах 9, 10, 11, 12 (20% Montanide Gel, доза 0,5-1, 0 см3).

Длительность иммунитета у кошек, иммунизированных различными вариантами вакцины против ВЛК.

Рис. №2

решвный титр антител при мнше с инфицированной кошкой •-•

1ротешваь!й тнтрантител яри контрольном заражении -------•

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

номер группы

В 42 день В 6 мес □ 12 мес

Результаты, полученные в ходе нашего эксперимента, показали, что использование Montanide Gel в качестве адъюванта в вакцине предпочтительнее ГОА, поскольку при внутримышечном введении в дозе 1,0 см3 данный препарат обеспечивает выработку антител к gp70 BJ1K в количестве, значительно превышающим протективный показатель у 100% привитых кошек, а использование его в вакцине с 20%-ой концентрацией позволяет получать показатели антител, сохраняющиеся на высоком уровне до 12 месяцев (срок наблюдения) после вакцинации. При этом вакцина с Montanide Gel была абсолютно безопасной для кошек, так как не вызывала побочных эффектов, кроме того, у вакцинированных животных не было отмечено появления в крови матриксного белка р27 ВЛК - маркера виремии.

Таким образом, для дальнейшей работы нами была выбрана вакцина против вирусной лейкемии кошек, содержащая в качестве адъюванта Monianide Gel в конечной концентрации 20%, которая при двукратном подкожном или внутримышечном введении обладает выраженной антигенной активностью в отношении ВЛК, является безвредной и ареактогенной и сохраняет у вакцинированных кошек напряженный иммунитет длительностью не менее 12 месяцев (время наблюдения).

2.2.5.Изготовление и контроль опытных серий вакцины против вирусной лейкемии кошек. Учитывая результаты проведенных исследований, нами была разработана технологическая схема изготовления культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек.

Для приготовления 3-х опытных серий вакцины использовзли предварительно инактивированную культуральную жидкость, содержащую

суспензию клеток в концентрации не менее 8x105 клеток/см3, с титром в ИФА не менее 1:32. Антиген смешивали с адъювантом Montanide Gel до конечной концентрации 20% от общего объема вакцины, перемешивали на аппарате «Vortex» в течение 10 минут и инкубировали не менее 18-ти часов при температуре +4°С. Затем расфасовывали по 1 см3 в стерильные флаконы объемом 3 см3, закрывали резиновыми пробками и закатывали пластмассовыми колпачками.

Каждую опытную серию вакцины проверяли на стерильность (ГОСТ 28085-89), полноту инактивации вирусного компонента, безвредность и реактогенность, а также антигенную активность.

Безвредность проверяли на белых мышах и морских свинках. Морским свинкам (п=5 на каждую серию) вакцину вводили подкожно в дозе 1,0 см3, белым мышам (п=5 на каждую серию) - внутрибрюшинно в дозе 0,2 см3. За привитыми животными наблюдали в течение 21-го дня. Все животные после введения препаратов остались живы, у них не было отмечено никаких общих или местных реакций на введение вакцин.

Антигенную активность экспериментальных серий вакцины определяли по уровню специфических антител к оболочечному гликопротеину gp70 BJIK подгруппы А в сыворотке крови иммунизированных кроликов. Животных (по 5 голов в каждом опыте) двукратно (с интервалом в три недели) иммунизировали испытуемой вакциной внутримышечно в дозе 1,0 см3. Сыворотку крови животных исследовали в ИФА на наличие специфических антител до вакцинации и через 21 сутки после проведения вакцинации.

Аналогичным образом исследовали все экспериментальные серии вакцины через 3, 6 и 12 месяцев (время наблюдения) после приготовления (препараты хранились при + 4°С).

Результаты проверки антигенной активности 3-х серий культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек представлены в таб. К»4.

Влияние времени хранения инактивированной вакцины против ВЛК на нх антигенную активность. ________Таб. №4

№ серии Средний геометрический татр антител к gp 70 в ИФА

свежеприготовленная 3 мес. 6 мес. 12 мес.

1 1:215 1:215 1:215 1:181

2 1:215 1:215 1:181 1:181

3 1:215 1:215 1:215 1:181

Из данных, приведенных в таблице № 4, видно, что введение кроликам экспериментальных вакцин против вирусной лейкемии кошек, хранившейся в вышеуказанных условиях, вызывало образование специфических антител, при

этом не установлено статистически достоверных различий в содержании антител в сыворотке крови животных, вакцинированных свежеприготовленными препаратами и хранившимися 3, б и 12 месяцев соответственно.

То есть, при хранении препаратов при температуре +4°С в течение года (срок наблюдения) антигенная активность вакцины снижается незначительно.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что все приготовленные нами экспериментальные серии инактивированной культуральной вакцины против вирусной лейкемии кошек стерильны, безвредны и ареактогенны, обладают выраженной антигенной активностью и могут храниться при температуре +4 °С не менее 12 месяцев с момента изготовления, не теряя своих свойств.

2.2.6.Получение и характеристика рекомбинантного оболочечного гликопротеина ВЛК gp70 (г%р70). После выделения тотальной РНК из культуры клеток Р422 при помощи обратной транскрипции была получена кДНК. Участок генома, кодирующий оболочечный гликопротеин gp70, а также первые 34 аминокислоты белка р!5Е был амплифицирован при помощи ПЦР с применением подобранных нами праймеров (см. раздел «Матералы и методы»). Очищенный ПЦР-продукт клонировали в экспрессионный вектор рЕТ23ь, а полученная плазмида рЕТ23ь+§р70+р15Е была трансфецирована в клетки Е.соИ штамм (ВЬ21(ОЕЗ)рЬуз8.

Анализ полученной электрофореграммы (рис. № 3) показал, что после индукции произошло появление ярких окрашенных белковых полос в области, соответствующей 50 кДа (области расположения рекомбинантного негликозилированного белка ^р70), т.е. в результате индукции произошло значительное накопление рекомбинантного белка в клетках Е.соИ.

Результаты экспрессии рекомбинантного белка в рЕТ экспресеионной системе.

Рис.ЛЙ.

ЩШ

>Т<\

1- клетки Е.соЬ до индукции; 2 - клетки Е.соИ после индукции

Поскольку полученный в результате экспрессии рекомбинантный белок gp70 имеет на С-конце шесть гистидиновых остатков, то он может быть очищен из клеточного лизата с помощью металло-аффинной хроматографии. Поэтому исследования в этом направлении заключались в определении степени растворимости экспрессируемого рекомбинантного белка в клетках Е.соП.

С этой целью применялось два основных способа очистки: в денатурирующих и не денатурирующих условиях, в зависимости от того, в каком виде белок находится в бактериальной клетке. Белок может быть в растворимом, трудно растворимом и нерастворимом состоянии.

Результаты эксперимента представлены на рисунке №4.

Анализ полученной электрофореграммы показал, что рекомбинантный белок gp70 находится в Е.соН как в растворимом, так и в нерастворимом виде. Причем в нерастворимом виде содержится значительно большее количество белка. Поэтому, в дальнейшем, выделение рекомбинантного белка проводилось в денатурирующих условиях.

Определение степени растворимости экспрессируемого ^р70 белка в клетках

Е.соН.

Рис.№4.

! 2 3 4 5 кОа

1 - лизат клеток Е.соЬ после индукции, 2 - белок, элюированный с М-Г^ТА агарозы раствором ТБР с 50 мМ имидазола 3 -белок, элюированный с №-МТА агарозы раствором ТБР с 50 мМ имидазола, 6М" мочевины; 4 - белок [г§р70], элюированный с №-ЫТА агарозы раствором ТБР с 250 мМ имидазола, 6М мочевины. Фракции разведены в 50 раз.

Специфичность очищенного белка г§р70 подтверждена иммуноблоттингом с референтной положительной к ВЛК кроличьей сывороткой (рис.4В), а также в ИФА с этой же сывороткой (рис. №5). Выход очищенного белка ^р70, в среднем, составил 0,04% от веса сырой клеточной массы.

ДСН-электрофорез в 12% ПААГ (А) и иммуноблоттииг (В) белка rgp70 to специфической против BJIK сывороткой крови кролика.

Рис. №5

1 2

1-лизат клеток E.colr, 2 - очищенный белок rgp70\ 3 - метчик молекулярной массы

белков

2.2.7.Разработка тест-системы по определению антител к оболочечному гликопротеину вируса лейкемии кошек gp70. Была изучена возможность применения в ИФА полученного нами рекомбинантного антигена [rgp70] для определения антител к gp70 в сыворотке крови. И проведены сравнительные исследования разработанной нами тест-системы с набором-прототипом «Feline leukaemia virus gp70 antibody ELISA Biologicals Ltd». (Нидерланды).

Взаимодействие белка ^р70 с референтным» положительной и отрицательной против ВЛК сыворотками крови кролика.

Рис. №6

-положительная сыворотка кролика . отрицательная сыворотка кролика

концентрация гдр70

Из результатов, представленных на рис. №6 видно, что для сенсибилизации планшета достаточно 0,5-1,0 мкг/мл антигена.

В дальнейшем использовали rgp70 в концентрации 1,0 мкг/мл. Сорбированный на планшете комплекс антиген-антитело проявляли мечеными пероксидазой AT к IgG кошки в разведении 1:16 ООО.

Анализ данных, полученных при сравнении результатов параллельного исследования панели сывороток крови (п = 35), а также референтной сыворотки крови кошки (рис. №7) с использованием тест-системы на основе синтезированного в E.coli белка [rgp70] и набора фирмы Biologicals Ltd. (Нидерланды) показал, что коэффициент корреляции результатов, полученных с помощью двух иммуноферментных тест-систем, составил 0,95.

Титрование референтной положительной сыворотки крови кошки на прототипной и разработанной тест-системах.

Рис. №7

|—протатпная тест-система —■— разработанная тест-система |

разведение сыворотки, 1од2

Таким образом, сравнительный анализ результатов сравнения прототипной и испытуемой тест-системами позволяет сделать вывод о перспективности применения разработанной тест-системы для выявления уровня антител к оболочечному гликопротеину gp70 ВЖ в сыворотке крови кошек.

3.ВЫВОДЫ

I .Оптимизированны параметры выращивания хронически инфицированной вирусом лейкемии кошек культуры клеток лимфомы кошки. Установлено, что максимальное накопление оболочечного гликопротеина gp70 ВЛК наблюдается при культивировании культуры клеток И422 в роллерах с использованием в качестве питательной среды ЯРМ1 1640 с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и добавлением 100 ЕД пенициллина и 100 ЦБ стрептомицина на 1см3 среды, при этом концентрация клеток достигает

максимума через 72 часа культивирования (1-1,2х106), а титр оболочечного гликопротеина gp70 BJIK в ИФА -1:32.

2. Отработаны условия инактивации BJIK формалином с целью получения безопасных и антигенно активных препаратов. Формалин в конечной концентрации 0,3% полностью инактивирует вирус лейкемии кошек в течение 72 часов при 37°С.

3. Разработан способ изготовления инактивированной вакцины против BJ1K, обеспечивающий изготовление препарата со стабильными значениями показателей качества.

4. Определена безвредность, реактогенность и антигенная активность экспериментальных серий инактивированной вакцины против BJIK на кроликах и кошках. Иммунизация кошек различными вариантами вакцины против BJIK показало, что вакцина, содержащая в качестве адъюваита Montanide Gel в конечной концентрации 20% при двукратном подкожном или внутримышечном введении, является безвредной и ареактогенной и вызывает у вакцинированных кошек синтез специфических антител к поверхностному гликопрогеину gp70 BJIK, сохраняющийся на уровне 1:270 не менее 12 месяцев (срок наблюдения) со дня вакцинации.

5. Определены оптимальные условия синтеза рекомбинантного белка rgp70 BJIK в рЕТ экспрессионной системе. Отработаны оптимальные условия выделения rgp70 ВЛК методом металло-аффинной хроматографии, при этом выход очищенного белка составил 0,04% от веса сырой клеточной массы. Методами ИФА и иммуноблоттинга определена активность и специфичность очищенного продукта

6. На основе рекомбинантного белка rgp70 ВЛК разработана тест-система ИФА для определения уровня антител к gp70 у кошек.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛДОЖЕНИЯ

Результаты исследований, изложенных в диссертации, использованы при разработке стандарта организации СТО 42418073-0001-2009 «Вакцина против вирусной лейкемии кошек».

¡.СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Раев С.A., Rob van Hervvijnen, Мухин А.Н., Непоклонова И.В., Орлянкин Б.Г., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. Разработка и оценка антигенной активности вакцины против вирусной лейкемии кошек,'/ Ветеринария, 2009, №3, С.22-24.

2. Раев С.А., Rob van Herwijnen, Мухин А.Н., Непоклонова И.В., Орлянкин Б.Г., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А., Мусиенко М.И., Верховский O.A., Цибезов В.В., Селиверстов A.C. «Леоминор» - новая вакцина против вирусной лейкемии кошек.// Труды Московского Международного ветеринарного конгресса, 2009, С.6-7.

3. Раев С.А., Rob van Hervvijnen , Богданова B.C., Грабовецкий В.В., Забережный А.Д., Верховский O.A., Непоклонова И.В., Алипер Т.И., Мухин А.Н., Орлянкин Б.Г., Непоклонов Е.А. Разработка и оценка антигенной

активности рекомбинантной субъединичной вакцины против вирусной лейкемии кошек. // Ветеринария, 2009, №12, С.25-29.

4. Раев С.А., Мухин А.Н., Непоклонов Е.А. Лейкоз кошек: лабораторная диагностика и специфическая профилактика.// Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2007. - С.273-274.

5. Раев С.А. Непоклонов Е.А. Особенности применения вакцин против лейкоза кошек. // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы VII Международной научной конференции студентов и молодых ученых. -М.: МГУПБ, 2008. - С.275-276.

Подписано в печать 19.11.09 Усл. печ. л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 10/02 МГУПБ. 109316 Москва, ул. Талалихина, 33.

ООО «Полисувенир», 109316 Москва, ул. Талалихина, 33. Тел. 677-03-86

Оглавление диссертации Раев, Сергей Алексеевич :: 2009 :: Москва

Оглавление.

Список используемых сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Характеристика возбудителя вирусной лейкемии кошек

2.1.1 История.

2.1.2 Таксономия и классификация возбудителя.

2.1.3 Вирион и структура генома.

2.2. Эпизоотология заболевания.

2.3. Особенности патогенеза.

2.4. Клинические симптомы.

2.5. Методы диагностики вирусной лейкемии кошек.

2.6. Лечение.

2.7. Средства специфической профилактики.

3. Собственные исследования.

3.1 Материалы и методы.

3.1.1 Вирусы, культуры клеток и питательные среды.

3.1.2 Определение количества и жизнеспособности клеток.

3.1.3 Криоконсервация культуры клеток.

3.1.4 Инактивация вируса.

3.1.5 Адъюванты.

3.1.6 Определение стерильности.

3.1.7 Экспериментальные животные.

3.1.8 Выделение РНК.•.

3.1.9 Амплификация и клонирование гена gp70 в E.coli.

3.1.10 Приготовление питательной среды LB и L-arapa.

3.1.11 Получение компетентных клеток.

3.1.12 Трансформация компетентных клеток E.coli.

3.1.13 Наращивание.

3.1.14 Индукция.

3.1.15 Сыворотки.

3.1.16 Очистка рекомбинантного белка rgp70 методом металло-хелатной аффинной хроматографии (МХАХ).

3.1.17 Определение концентрации белка.

3.1.18 Оценка иммунологической активности белка rgp70.

3.1.19 Учет и интерпретация результатов ИФА.

3.1.20 Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН).

3.1.21 Статистическая обработка результатов.

3.2 Результаты собственных исследований.

3.2.1 Изучение условий культивирования культуры клеток F422.

3.2.2 Инактивация вируса.

3.2.3 Определение антигенной активности культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на лабораторных животных.

3.2.4 Определение антигенной активности культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на кошках.

3.2.5 Изготовление и контроль опытных серий вакцины против вирусной лейкемии кошек.

3.2.6 Получение и характеристика рекомбинантного оболочечного гликопротеина ВЖ gp70 (rgp70).

3.2.7 Разработка тест-системы по определению антител к оболочечному гликопротеину вируса лейкемии кошек gp70.

4. Обсуждение.

5. Выводы.

6. Практические предложения.

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Раев, Сергей Алексеевич, автореферат

1.1.Актуальность работы. Вирус лейкемии кошек (Feline leukaemia virus, FeLV или BJIK) - РНК-содержащий вирус семейства Retroviridae, является одним из наиболее распространенных возбудителей инфекционных заболеваний кошек. В США, где система по обнаружению и изоляции инфицированных животных, а также профилактической вакцинации кошек действует в течение 20 лет, распространенность данного заболевания (среди клинически здоровых животных) составляет 2%. У больных особей, и кошек, принадлежащих к группе риска, эта цифра варьируется от 6 до 33% (Hartmann С., 2006). Инфицированность животных вирусом лейкемии в Центрально-Черноземном районе Российской Федерации достигает 12,6% (Федосов Д.В., 2007). В связи с этим профилактика вирусной лейкемии кошек является актуальной проблемой.

Основной метод контроля за распространением инфекции, вызываемой ВЖ - выявление и изоляция инфицированных животных (Hartmann С., 2006), а также профилактическая вакцинация кошек. Вакцинированные кошки, у которых происходит синтез вируснейтрализующих антител к поверхностному гликопротеину gp70 ВЛК подгруппы А, устойчивы к заражению вирулентным штаммом вируса (Russell Р.Н., 1978).

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Оптимизировать условия культивирования культуры клеток F422 для получения максимального выхода поверхностного гликопротеина gp70 ВЛК.

2. Отработать условия инактивации культурального ВЛК.

4. Изучить безвредность, реактогенность и антигенную активность экспериментальных серий4 культуральной* инактивированной вакцины против ВЛК на кошках и лабораторных животных.

5. Определить оптимальную иммунизирующую дозу, способ и схему введения культуральной инактивированной вакцины для получения напряженного и длительного иммунитета к ВЛК у иммунизированных животных.

6. Получить рекомбинантный белок rgp70 вируса лейкемии кошек и использовать его в иммуноферментном анализе для определения уровня антител к gp70 ВЛК в сыворотке крови кошек.

Отработаны режимы инактивации вируса.

Разработана схема изготовления культуральной инактивированной вакцины против ВЛК.

Определена безвредность и антигенная активность культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на кроликах и кошках.

Изучено влияние хранения на антигенную активность вакцины.

Подобраны праймеры для амплификации гена gp70.

Получен и охарактеризован рекомбинантный оболочечный гликопротеин вируса лейкемии кошек (rgp70).

Разработана иммуноферментная тест-система для выявления вирус-специфических антител к оболочечному гликопротеину gp70 ВЛК в сыворотке крови кошек.

Научно обоснованы принципы изготовления и.биологического контроля инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек.

Разработана иммуноферментная тест-система для определения уровня антител к gp70 BJIK в сыворотке крови кошек.

1.5,Основные положения, выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения: схема изготовления и методы биологического контроля вакцины против вирусной лейкемии кошек,

- результаты исследований по изучению антигенных свойств культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на лабораторных и естественно-восприимчивых животных,

- разработка иммуноферментной тест-системы по определению уровня антител к оболочечному гликопротеину gp70 BJIK в сыворотке крови кошек.

1.6.Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: 6-ой Международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2007); 7-ой Международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2008); 2-ой ежегодной конференции молодых ученых ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН; заседании Ученого совета МГУПБ (2009), межлабораторном совещании МГУПБ.

1.7.Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

1.8,Объем и структура работы. Работа выполнена на базе НПО «НАРВАК». Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и список литературы. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 8 рисунками. Список использованной литературы включает 135 отечественных и зарубежных авторов.

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек"

5. ВЫВОДЫ

1 .Оптимизировании параметры выращивания хронически инфицированной вирусом лейкемии кошек культуры клеток лимфомы кошки. Установлено, что максимальное накопление оболочечного гликопротеина gp70 ВЛК наблюдается при культивировании культуры клеток F422 в роллерах с использованием в качестве питательной среды

RPMI 1640 с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и j добавлением 100 ЕД пенициллина и 100 jxg стрептомицина на 1см среды, при этом концентрация клеток достигает максимума через 72 часа культивирования (1-1,2x106), а титр оболочечного гликопротеина gp70 ВЛК в ИФА - 1:32.

2. Отработаны условия инактивации ВЛК формалином с целью получения безопасных и антигенно активных препаратов. Формалин в конечной концентрации 0,3% полностью инактивирует вирус лейкемии кошек в течение 72 часов при 37°С.

3. Разработан способ изготовления инактивированной вакцины против ВЛК, обеспечивающий изготовление препарата со стабильными значениями показателей качества.

4. Определена безвредность, реактогенность и антигенная активность экспериментальных серий инактивированной вакцины против ВЛК на кроликах и кошках. Иммунизация кошек различными вариантами, вакцины против ВЛК показало, что вакцина, содержащая в качестве адъюванта Montanide Gel в конечной концентрации 20% при двукратном подкожном или внутримышечном введении, является, безвредной и ареактогенной и вызывает у вакцинированных кошек синтез специфических антител к поверхностному гликопротеину gp70 ВЛК, сохраняющийся на уровне 1:270 не менее 12 месяцев (срок наблюдения) со дня вакцинации.

5. Определены оптимальные условия синтеза рекомбинантного белка rgp70 ВЖ в рЕТ экспрессионной системе. Отработаны оптимальные условия выделения rgp70 ВЛК методом металло-аффинной хроматографии, при этом выход очищенного белка составил 0,04% от веса сырой клеточной массы. Методами ИФА и иммуноблоттинга определена активность и специфичность очищенного продукта.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛДОЖЕНИЯ

Результаты исследований, изложенных в диссертации, использованы при разработке проекта СТО 76418883-0002-2009 Вакцина «ЛЕОМИНОР».

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2009 года, Раев, Сергей Алексеевич

1. Вирусология методы. 1988. Под редакцией Мейхи Б.// Москва, Мир.

2. Гуненков В.В. 1978. О лабораторной диагностике вирусных пневмо-энтеритов телят. // Ветеринария. 8: 90-93.

3. Жданова В.М., Гайдамович С.Я. 1982. Общая вирусология. // Москва, Медицина 2: 186-220.

4. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. 1990. Статистическая обработка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах. // Москва. 40-43.

5. Инфекционные болезни животных. 1987. Под редакцией Осидзе Д.Ф. // Москва, Агропромиздат.

6. Коляков Я.Е. 1986. Ветеринарная иммунология.// Москва, Агропомиздат.

7. Ларски З.И. 1980. Диагностика вирусных болезней животных.// Москва, Колос.

8. Методы исследования в иммунологии. 1981. Под редакцией Лефковитса И., Перниса Б.// Москва, Мир 95-118.

9. Орлянкин Б.Г. 1998. Классификация и номенклатура вирусов позвоночных. // Методичекое пособие. Россельхозакадемия, ВИЭВ 34-36.

10. Сергеев В.А. 1976. Репродукция и выращивание вирусов животных. // Москва, "Колос".

11. Сюрин В.Н. 1966. Руководство по ветеринарной вирусологии. // Москва, "Колос".

12. Сюрин В.Н., Фомина Н.В. 1990. Частная ветеринарная вирусология. // Москва.

13. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. 1991. Диагностика вирусных болезней животных.// Справочник. Москва, В.О. Агропромиздат.

14. Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Миме С., Сембрук Д., Уайт Д. 1977. Биология вирусов животных. // Москва.

15. Федосов Д.В. 2007. Исследование ретровирусных инфекций кошек. // Сб. трудов 6-ой Всероссийской' научно-практической конференции с международным участием. Москва. 111-115.

16. Фримель Г.М. 1987. Иммунологические методы.// Медецина.

17. Babyak S.D., Groves M.G., Dimski D.S. 1996. Evaluation of a saliva test kit for feline leukemia virus antigen. // J!. Am. Anim. Hosp. Assoc. 32:397-400.

18. Barr M.C. 1996. FIV, FeLV, and FIPV: interpretation and misinterpretation of serological test results. // Semin. Vet. Med. Surg. Small. Anim. 11:144-153.

19. Bucher MH, Evdokimov AG, Waugh DS. Differential effects of short affinity tags on the crystallization of Pyrococcus furiosus maltodextrin-binding protein.// Biol Cryst -2002-Vol.5-p.392-397.

20. Carroll E.E., Dubielzig R.R., Schultz R.D. 2002. Cats differ from mink and ferrets in their response to commercial vaccines: a histologic comparison of early vaccine reactions. // Vet. Pathol. 39:216-227.

21. Cattori V., Hofmann-Lehmann R. 2008. Absolute quantitation of feline leukemia virus proviral DNA and viral RNA loads by TaqMan real-time PCR and RT-PCR. // Methods Mol. Biol. 429:73-87.

22. Chaga G, Bochkariov DE, Jokhadze GG, Hopp J, Nelson P Natural poly-histidine affinity tag for purification of recombinant proteins on cobalt(II)-carboxymethylaspartate crosslinked agarose. //J.Chromatogr.A.-1999b-Vol.864-p.257-256.

23. Clark N., Kushner N.N., Barrett C.B. 1991. Efficacy and*safety.field trials of a recombinant DNA vaccine against feline leukemia virus infection. // J. Am: Vet. Med. Assoc. 199:1433-1443.

24. Coffin J.M. 1979. Structure, replication, and recombination of retrovirus genomes: some unifying hypotheses. // J. Gen. Virol. 42, 1-26.

25. Cotter S.M. 1979. Anaemia associated with feline leukemia virus infection. 1979. //J. Am. Vet. Med. Assoc. 175(11):1191-4.

26. Cotter S.M. 1990. Feline viral neoplasia. // In Greene CE (ed), Infectious diseases of the dog and cat, ed l. WB Saunders, Philadelphia, PA: 316-334.

27. Cotter S.M. 1996. Unpublished data. Tufts University, North Grafton, MA.

28. Cotter S.M. 1997. Changing epidemiology of FeLV. Proceedings of the 15th Annual ACVIM Forum, Lake Buena Vista, FL.

29. Cotter S.M. 1998. Feline viral neoplasia, pp 71 84. // In Greene CE (ed), Infectious diseases of the dog and cat, ed 2. WB Saunders, Philadelphia, PA.

30. Cummins J.M., Tompkins M.B., Olsen R.G. 1988. Oral use of human alpha interferon in cats. // J. Biol. Response. Mod. 7:513-523.

31. Donner L., Fedele L.A., Garon C.F., Anderson S.J., Sherr C.J. 1982. McDonough feline sarcoma virus: characterization of the molecularly cloned provirus and its feline oncogene (v-fms). // J Virol. 1982. 41(2):489-500.

32. Ellis J.A., Jackson M.L., Bartsch R.C. 1996. Use of immunohistochemistry and polymerase chain reaction for detection of leukemia'viruses in formalin-fixed, paraffin-embedded fibrosarcomas from cats. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 204:767771.

33. Ettinger S.N. 2003. Principles of treatment4 for feline lymphoma: // Clin. Tech. Small. Anim. Pract. 18: 98-102.

34. Francis D.P., Cotter S.M., Hardy W.D. Jr. 1979. Comparison of virus-positive and virus-negative cases of . feline leukemia and lymphoma. // Cancer Res. 39:3866-3870.

35. Fulton R., Gasper P.W., Ogilvie G.K., Boone T.C., Dornsife R.E. 1991. Effect of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on hematopoiesis in normal cats. // Exp. Hematol. 1991. 19(8):759-67.

36. Gabor L.J., Jackson M.L., Trask B. 2001. Feline leukaemia virus status of Australian cats with lymphosarcoma. // Aust .Vet. J. 79:476-481.

37. Gobar G.M., Kass P.H. 2002. World Wide Web-based survey of vaccination practices, postvaccinal reactions, and vaccine site-associated sarcomas in cats. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 220:1477-1482.

38. Hardy W.D. Jr., Geering G., Old L.J., de Harven E., Brodey R.S., McDonough S.K. 1970. Serological studies of the feline leukemia virus. // Bibl. Haematol. 36:343-54.

39. Hardy W.D. Jr., Hirshaut Y., Hess P. 1973. Detection of the feline leukemia virus and other mammalian oncornaviruses by immunofluorescence. Unifying concepts of leukemia. // Bibl. Haemat. 39:778-799. •

40. Hardy W.D. Jr., Zuckerman E.E. 1991. Ten-year study comparing enzyme-linked immunosorbent assay with the immunofluorescent antibody test for detection of feline leukemia virus infection in cats. // J. Am: Vet. Med: Assoc. 199:1365-1373.

41. Griessmayr P., Egberink Hi, Jarrett O. 20021 Comparison of different new tests for feline immunodeficiency virus and feline leukemia virus infection, p 25. //

42. Abstracts from the 6th International Feline Retrovirus Research Symposium, Amelia Island, FL.

43. Hardy W.D. Jr. 1991. General principles of retrovirus immunodetection tests. //J. Am. Yet. Med. Assoc. 10:1282-1286.

44. Hardy W.D., Hess P.W., MacEwen E.G. 1976. Biology of feline leukemia virus in natural environment. // Cancer Res. 36: 582-88.

45. Hardy W.D. Jr. 1981. The feline sarcoma viruses. // J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 17:981.

46. Hardy W.D. Jr. 1981. The feline leukemia virus. // J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 17:951-980.

47. Hartmann C. 2006. Infectious diseases of the dog and cat. 105.

48. Hartmann K., Block A., Ferk G., Vollmar A., Goldberg M., Lutz H. 1998. Treatment of feline leukemia virus-infected cats with paramunity inducer. // Vet. Immunol. Immunopathol. 65:267-75.

49. Hartmann K., Gerle K., Leutenegger C. 1998b. Feline leukemia virus—most important oncogene in cats, p 39. // In Abstracts from the 4th International Feline Retrovirus Reseach Symposium, Glasgow, Scotland, UK.

50. Hartmann K., Werner R.M., Egberink H. 2001. Comparison of six in-house tests for the rapid diagnosis of feline immunodeficiency and feline leukaemia virus infections. //Vet. Rec. 149:317-320.

51. Hartmann K. 2005. FeLV treatment strategies and prognosis. // Suppl. Compend. Contin. Educ. Pract. Vet. 27:14-26.

52. Hartmann K. 2006. Antiviral and immunodulatory chemotherapy. In: Greene CE (Ed). // Infectious Diseases,of the Dog and. Cat. 3rd edition. Elsevier Saunders, St. Louis, USA,: 10-25.

53. Hawkins E.C. 1991. Saliva and tear tests for feline leukemia virus. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 199:1382-1385.

54. Hayes К.A., Rojko J.L., Mathes L.E. 1992. Incidence of localized feline leukemia vims infection in cats. // Am. J. Vet. Res. 53:604-607.

55. Hendrick M.J., Goldschmidt M.H., Shofer F.S. 1992. Postvaccinal sarcomas in the cat: epidemiology and electron probe microanalytical identification of aluminum. // Cancer Res. 52:5391-5394.

56. Hendrick M.J., Shofer F.S., Goldschmidt M.H. 1994. Comparison of fibrosarcomas that developed at vaccination sites and at nonvaccination sites in cats: 239 cases (1991-1992 ). //J. Am. Vet. Med. Assoc. 205:1425-1429.

57. Hines D.L., Cutting J.A., Dietrich D.L. 1991. Evaluation of efficacy and safety of an inactivated virus vaccine against feline leukemia virus infection. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 199:1428-1430.

58. Hisasue M., Okayama H., Okayama T. 2001. Hematologic abnormalities and outcome of 16 cats with myelodysplastic syndrome. // J. Vet. Intern. Med. 15:471477.

59. Hochuli E, Bannwarth W, Dbeli H, Gentz R, Stber D. Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. //Bio/Technology-1988-Vol. 6-p.1321-1325.

60. Hochuli E, D. and H, Schacher A New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptide containing neighbouring histidine residues. // J Chromatogr -1987-Vol.411 -p. 177-184.

61. Hofinann-Lehmann R., Huder J.B., Gruber S. 2001. Feline leukaemia provirus load during the course of experimental infection and in naturally infected cats. //J. Gen: Virol: 82:1589-1596:

62. Hoover E.A., Mullins J.I.1991. Feline leukemia virus infection and diseases. // J: Am. Vet. Med: Assoc. 199:1287-1297.

63. Hoover E.A., Olsen R.G., Hardy W.D. Jr. 1976: Feline leukemia virus infection: age-related variation in response of cats to experimental infection. // J. Natl. Cancer. Inst. 57:365-369.

64. Hoover E.A., Rojko J.L., Olsen R.G. 1980. Factor influencing host resistance to feline leukemia virus. // In: Olsen R.G., ed. Feline leukemia. Boca Raton, 69-76.

65. Hoover E.A., Rojko J.L., Olsen R.G. 1979. Pathogenesis of experimental feline leukemia virus infection. // J.Natl. Cancer Inst. 63: 759-768.

66. Hoover E.A., Olsen R.G., Mathes L.E. 1977. Relationship between feline leukemia vims antigen expression and viral infectivity in blood, bone marrow, and saliva of cats. // Cancer Res.37: 3707-3710.

67. Jackson M.L., Haines D.M., Meric S.M. 1993. Feline leukemia virus detection by immunohistochemistiy and polymerase chain reaction in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor tissue from cats with lymphosarcoma. // Can. J. Vet. Res. 57:269-276.

68. Jackson M.L., Haines D.M., Meric S.M. 1993. Feline leukemia virus detection by immunohistochemistry and polymerase chain reaction in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor tissue from cats with lymphosarcoma. // Can. J. Vet. Res. 57:269-276.

69. Jackson M.L., Haines D.M., Taylor S.M. 1996. Feline leukemia virus detection by ELISA and PCR in peripheral blood from 68 cats with high, moderate, or low suspicion of having FeLV-related disease. // J. Vet. Diagn. Invest. 8:25-30.

70. Jarrett O., Golder M.C., Steward M.F. 1982. Detection of transient and persistent feline leukaemia virus infections. // Vet. Rec. 110:225-228.

71. Jarrett O., Pacitti A.M., Hosie M.J. 1991. Comparison of diagnostic methods for feline leukemia virus and feline immunodeficiency virus. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1991:1362-1364.

72. Jarrett O. 1995. Detection of FeLV antigen. // Vet. Rec. 137:127.

73. Jarrett W.F.H., Crawford E.M., Martin W.B. 1964. A virus-like particle associated with leukemia (lymphosarcoma ). //Nature 202:567-568.

74. Kass P.H., Barnes W.G., Spangler W.L. 1993. Epidemiologic evidence for a causal relation between vaccination and fibrosarcoma tumorigenesis in cats. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 203:396-405.

75. Kass P.H., Spangler W.L., Hendrick M.J. 2003. Multicenter case-control study of risk factors associated with development of vaccine-associated sarcomas in cats. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 223:1283-1292.

76. Katti SK, LeMaster DM, Eklund H Crystal structure of thioredoxin from Escherichia coli at 1.68 resolution. //J Mol Biol. -1990-Vol.212-p. 167-184.

77. Knowles J.O., Gaskell R.M., Gaskell C.J., Harvey C.E., Lutz H. 1989. Prevalence of feline leukaemia virus and antibodies to FIV in cats with chronic stomatitis. //Vet. Rec. 124(13):336-8.

78. Kociba G.J. 1986. Hematologic consequences of feline leukaemia virus infection p448. // In Kirk RW (Ed): Current Veterinary Therapy. Vol XIII. WB Saunders, Philadelphia.

79. Lafrado L.J. 1994. Evaluation of a feline leukemia virus vaccine in a controlled natural transmission study. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 204:914-917.

80. LaVallie ER, Lu Z, Diblasimo-Smith EA, Collins-Racie LA, McCoy JM Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. //Methods Enzymol.- 2000-Vol. 326-p.322-340.

81. Lauring A.S., Anderson M.M., Overbaugh J. 2001. Specificity in receptor usage by T-cell-tropic feline leukemia viruses: implications for the in vivo tropism of immunodeficiency-inducing variants. // J Virol. 75(19):8888-98.

82. Legendre A.M., Hawks D.M., Sebring R. 1991. Comparison of the efficacy of three commercial feline leukemia virus vaccines in a natural' challenge exposure. //J. Am. Vet. Med. Assoc. 199:1456-1462.

83. Legendre A.M., Mitchner K.L., Potgieter L. 1990. Efficacy of a feline leukemia virus vaccine in a natural exposure challenge. // J. Vet. Intern. Med. 4:9298.

84. Levy J., Richards J., Edwards D. 2001. Feline retrovirus testing and management. // Compend. Cont. Educ. Pract. Vet. 22:652-657.

85. Levy J.K. 2000. FeLV and non-neoplastic FeLV-related disease. In Ettinger SJ, Feldman EC (eds). //Textbook of veterinary internal medicine. WB Saunders, Philadelphia, PA: 424-432.

86. Lopez N.A., Jacobson R.H., Scarlett J.M. 1989. Sensitivity and specificity of blood test kits for feline leukemia virus antigen. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 195:747-751.

87. Lopez N.A., Jacobson R.H., Scarlett J.M. 1989. Sensitivity and specificity of blood test kits for feline leukemia virus antigen. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 195:747-751.

88. Lopez N.A., Jacobson R.H. 1989a. False-positive reactions associated with anti-mouse activity in serotests for feline leukemia virus antigen. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 195:741-746.

89. Louwerens M., London C.A., Pedersen N.C., Lyons L.A. 2005. Feline lymphoma in the post- -feline leukemia virus era. // J. Vet. Intern. Med. 19(3):329-35.

90. Lutz H., Pedersen N.C., Durbin R. 1983' Monoclonal antibodies to three epitopic regions of feline leukemia virus p27. and their use in enzyme-linked immunosorbent assay of p27. // J. Immunol. Methods. 56:209-220.

91. Macy D.W. 1991. Testing cats for feline leukemia virus. // Vet. Med. Mar:278 288.

92. Macy D.W. 1995. The potential role and mechanisms of FeLV vaccine-induced neoplasms. // Semin. Vet. Med. Surg . 10:234-237.

93. Madewell B.R., Griffey S.M., McEntee M.C. 2001. Feline vaccine-associated fibrosarcoma: an ultrastructural study of 20 tumors (1996-1999 ). // Vet. Pathol. 38:196-202.

94. Marciani D.J., Kensil C.R., Beltz G.A., Hung C., Cronier J., Aubert A. 1991. Genitically-engineered subunit vaccine against feline leukemia virus: protective immune response in cats. // Vaccine. 9: 89-96.

95. Marker L., Munson L., Basson P.A. 2003. Multicentric T-cell lymphoma associated with feline leukemia virus infection in a captive Namibian cheetah (Acinonyx jubatus ). //J. Wildl. Dis. 39:690-695.

96. Maruyama S., Kabeya H., Nakao R. 2003. Seroprevalence of Bartonella henselae, Toxoplasma gondii, FIV and FeLV infections in domestic cats in Japan. // Microbiol. Immunol. 47:147-153.

97. Mathes L.E., Olsen R.G., Hebebrand L.C. 1978. Abrogation of lymphocyte blastogenesis by a feline leukemia virus protein. // Nature. 274: 687689.

98. McCaw D.L., Boon G.D., Jergens A.E., Kern M.R., Bowles M.H., Johnson J.C. 2001. Immunomodulation therapy for feline leukemia virus infection. //J. Am. Anim. Hosjb. Assoc. 37:356-63.

99. Miyazawa Т., Jarrett O. 1997. Feline leukaemia vims proviral DNA detected by polymerase chain reaction in antigenaemic but non-viraemic ('discordant) cats. // Arch. Virol. 142:323-332.

100. Ogilvie G.K., Tompkins M.B. 1988. Clinical and immunologic aspects of FeLV-induced immunosuppression: // Vet: Microbiol. 17:287-296.

101. Orosz C.G., Zinn N.E., Olsen R.G., Mathes L.E.1985. Retrovirus-mediated immunosuppression. II. FeLV-UV alters in vitro murine T lymphocytebehavior by reversibly impairing lymphokine secretion. I I J. Immunol. 135(1):583-90.

102. Orosz C.G., Zinn N.E., Olsen R.G., Mathes L.E. 1985. Retrovirus-mediated immunosuppression. I. FeLV-UV and specific FeLV proteins alter T lymphocyte behavior by inducing hyporesponsiveness to lymphokines. // J. Immunol. 134(5):3396-403.

103. Pacitti A.M., Jarrett O. 1985. Duration of the latent state in feline leukaemia virus infections. // Vet. Rec. 117:472-474.

104. Pacitti A.M., Jarret O., Hay D. 1986. Transmission of feline leukaemia virus in the milk of a non-viremic cat. // Cancer Res. 118: 381-84.

105. Pedersen N.C., Meric S.M., Ho E. 1984. The clinical significance of latent feline leukemia virus infection in cats. // Feline. Pract. 14:32-48.

106. Pedersen N.C. 1988. Feline leukemia virus infection, p 83. In Pedersen NC (ed). // Feline infectious diseases. American Veterinary Publications, Santa Barbara, CA.

107. Perryman L.E., Hoover E.A., Yohn D.S. 1972. Immunologic reactivity of the cat: immunosuppression in experimental feline leukemia. // J. Natl. Cancer Inst. 49(5):1357-65.

108. Phipps A.J., Hayes K.A., Al-dubaib M. 2000. Inhibition of feline leukemia virus; subgroup. A infection by coinoculation with subgroup B. // Virology. 277:40-47.

109. Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. // Nature -1975-Vol.258-p.598-599.

110. Poulet H., Brunet S., Boularand C. 2003. Efficacy of a canarypox virus-vectored vaccine against feline leukaemia. // Vet. Rec. 153:141-145.

111. Quackenbush S.L., Dean G.A., Mullins J.I. 1996. Analysis of FeLV-FAIDS provirus burden and productive infection in lymphocyte subsets in vivo. // Virology. 223:1-9.

112. Quigley J.G., Burns C.C., Anderson M.M. 2000. Cloning of the cellular receptor for feline leukemia virus subgroup С (FeLV-C), a retrovirus that induces red cell aplasia. //Blood. 95:1093-1099.

113. Reinacher M., Theilen G. 1987. Frequency and significance of feline leukemia virus infection in necropsied cats. // Am. J. Vet. Res. 48(6):939-45.

114. Reinacher M. 1987. Feline leukemia virus-associated enteritis—a condition with features of feline panleukopenia. // Vet. Pathol. 24(1): 1-4.

115. Rojko J.L., Hoover E.A., Quackenbush S.L. 1982. Reactivation of latent feline leukaemia virus infection. // Nature. 298:385-388.

116. Salerno R.A., Lehman E.D., Larson V.M., Hilleman M. 1978: Feline leukemia virus vaccine: Preparation and evaluation of immunizing potency in guinea pig and cat.// Jl Natl. Cancer Inst, 61,1487.

117. Sarma P.S;, Log "Т., Skuntz S; 19781 Experimental horizontal transmission of feline leukemia viruses of subgroups А, В and C. // J. Natl. Cancer Inst. 60:871-874.

118. Scott D.W., Schultz R.D., Post J.E., Bolton G.R., Baldwin: C.A. 19731 Autoimmune haemolytic anemia in the.cat. // J.Am. Anim. Hosp. Assoc. 9: 530-47.

119. Sleeman J.M;, Keane J.M., Johnson J.S. 2001. Feline leukemia virus in a captive bobcat.//J. Wildl. Dis. 37:194-200:

120. Sparkes A.H. 2003. Feline leukaemia virus and vaccination. // J. Feline Medicine and surgery. 5, 97-100.

121. Stewart, E. J., Aslund, F. & Beckwith, J. Disulfide bond formation in the Escherichia coli cytoplasm: an in vivo role reversal for the thioredoxins. // EMBO J -1998-Vol.l7-p. 5543-5550.

122. Tartaglia J., Jarrett O., Neil J.C. 1993. Protection of cats against feline leukemia virus by vaccination with a canarypox virus recombinant, ALVAC-FL. // J. Virol. 67:2370-2375.

123. Tenorio A.P., Franti C.E., Madewell B.R., Perdersen N.C. 1991. Chronic oral infections of cats and their relationship to persistent oral carriage of feline calici-, immunodeficiency, or leukemia viruses. // Vet. Immunol. ImmunopathoL 1-2:1-14.

124. Uthman A., Moestl K., Zetner K. 1996. Detection of sequences of feline leukemia virus in chronically'inflamed oral tissue of FeLV-non-viremic cats by using polymerase chain reaction. // Hematol. 19(8):759-67.)

125. Weijer K, van Herwijnen R. 1995. Detection of FeLV antigen. // Vet. Rec. 137:127.

126. Zenger E. 2000. FIP, FeLV, FIV: making a diagnosis. // Feline Pract. 28:16-18.