Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка иммуноферментного метода диагностики стрептококковой инфекции



На правах рукописи

АШУРОВА ЗЕБУНИССО ДЖАМАЛОВНА

Разработка иммуноферментвого метода диагностики стрептококковой

инфекции

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва 2005

Работа выполнена в научно- исследовательской лаборатории

инфекционной патологии и биотехнологии Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, член корр. РАСХН, профессор

Давудай Абдулсемедович Девришов

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук, член корр. АСХНРТ Музафар Аноятбеков

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор

Валентин Александрович Бурлаков

доктор ветеринарных наук Михаил Константинович Пирожков

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ).

Защита состоится -часов на заседании диссертационного

совета Д.220.042.01 в ФГОУ ВПО МГАВМиБ им К.КСкрябина по адресу: 109472, Москва, ул. А кадемика Скрябина,23

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И.Скрябина.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

В.Е. Брылина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. С целью разработки более эффективных и адекватных методов диагностики, средств специфической профилактики болезней животных требуются новые методические подходы и решения, основанные на современных достижениях биологической науки и научно-технического прогресса в целом.

В связи с этим одним из главных направлений ветеринарной диагностики является создание простых в использовании и высокоспецифичных иммунных методов экспресс-диагностики инфекционных болезней животных. Этот подход важен, когда речь идет о диагностике таких бактериальных инфекций как стрептококкозы. Из-за особенностей идентификации стрептококков при бактериологическом анализе не всегда удается выявить их как этиологический агент. Применение антибиотиков, появление атипичных, плохо дифференцируемых форм бактерий существенно снижают эффективность бактериологического исследования. Трудности бактериологического анализа стрептококковой инфекции также связаны с несовершенством питательных сред и дороговизной или отсутствием в практических лабораториях некоторых ингредиентов, необходимых для идентификации. Поэтому представляется перспективным использовать методы иммунохимической диагностики стрептококковой инфекции и иммунологического мониторинга.

Стрептококкозы регистрируют в крупных и мелких животноводческих хозяйствах Дании, Германии, Франции, США, Англии, Словакии, России и ряда других стран. Значительное распространение и экономический ущерб от заболеваний, вызываемых стрептококками (слагаемый из гибели животных, затрат на диагностику, лечебные, профилактику), актуализируют задачу создания современных методов лабораторной диагностики.

Широкое распространение кокков затрудняет установить этиологическую роль только по результатам бактериологических данных и в этой связи высокочувствительные методы выявления специфических антител позволиют правильно интерпретировать результаты бактериологических исследований, а также по уровню титров антител поставить точный диагноз.

Классические иммунологические тесты, такие как РА, РДП, РП по выявлению специфических антител к стрептококкозам животных недостаточно специфичны и чувствительны. Перспективным для широкой лабораторной практики является иммуноферментный метод, для которого имеются стандартизированные реагенты, автоматизированные системы и, следовательно, возможность масштабных обследований при высокой чувствительности.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследований явилась разработка ИФА теста для диагностики стрептококковой инфекции.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

- отработка режимов выделения и очистки антигена-штамма 8. ецш БиЬвр.

гооер1с1е1шс118 и изучение его

!

разработка схемы гипериммунизации и получение

специфической сыворотки и иммуноглобулина к стрептококковым антигенам;

- отработка параметров коньюгирования иммуноглобулинов (гаммаглобулина) перексидазой хрена и получение специфического конъюгата;

- составление набора ИФА для выявления противострептококковых антител в биологических жидкостях, подбор оптимальных параметров постановки ИФА;

- экспериментальные испытания ИФА выявления антител к Б. equi яиЬвр. гооер1бегтси8.

Научная новизна. Впервые для серологической диагностики инфекционных болезней животных, вызываемых Б^ш БиЬвр. гооер1с1е1Шси8 разработана тест-система ИФА. Метод показал высокую чувствительность и специфичность и позволял выявлять поствакцинальные и постинфекцинные специфические антитела.

Разработаны биотехнологические параметры получения кроличьих гипериммунных референс-сывороток и иммуноглобулинов к растворимым антигенам Б. еяш виЬвр. гооер1ёе!тси8.

Изучены условия адсорбции антигенов стрептококка на полистироловых планшетах.

Практическая значимость работы. Разработана тест-система для диагностики стрептококкозов животных, вызываемых 8. eqш виЬвр. гооер1(1е1тси5, методом ИФА и нормативная документация на опытно-промышленное производство антигенного иммуноферментного стрептококкового диагностикума (СТО (Технические условия), инструкция по применению). Практическое применение антигенного иммуноферментного стрептококкового диагностикума позволит повысить диагностическую значимость лабораторных исследований, проводить серологический мониторинг и прогнозировать стрептококкозы у животных.

Материалы исследований включены в учебные программы кафедр иммунология и биотехнология ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И.Скрябина. Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследований по обоснованию и разработке ИФА • теста для серологической диагностики стрептококковой инфекции, вызываемой Б.еяш БиЬвр. гооер1ёеппси8 .

2. Результаты экспериментальных испытаний разработанного ИФА • теста для серологической диагностики и моноторинга стрептококковой инфекции у животных.

Апробация работы. Основые положения диссертации были доложены на научно-практическом конференции (г. Душанбе, 2004г) и обсуждены на межкафедральном совещании сотрудников кафедр микробиологии, эпизоотологии, иммунологии, биотехнологии и научно-исследовательской лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована/0рисунками и 16 таблицами. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы,

результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 184 источника, из которых 100 иностранных и приложение.

Собственные исследования

1. Материалы и методы.

Работа выполнена в период с 2002 по 2005 год в научно исследовательской лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии и кафедры иммунологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И.Скрябина.

Микроорганизм и его культивирование. В работе использовали производственный штамм Б. ечш виЬвр. гооер1с1егтсш «К-ДЕП» серогруппы С. Бактерии выращивали на МТТБ с добавлением 10% сыворотки КРС или с добавлением 1% глюкозы при температуре 37°С в течение 24 часов. (Рекомендации по индикации и идентификации стрептококков, 1976, Методические указаниям по лабораторной диагностике стрептококкозова животных, 1987).

Вирулентность используемоемого штамма устанавливали на беспородных белых мышах, которых заражали 18-20-часовой бактериальной культурой стрептококков внутрибрюшинно 109 микр. кл/мл в объеме 0,5 мл. Среднюю смертельную дозу (ЛД50) микробов определяли по методу Кербера.

Антиген. Антиген Б^ш БиЬБр. гооер1с1егтси5 получали тремя методами: а) методом многократного замораживания-оттаивания 18-час. бульонной культуры (Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, 1973); б) методом прогревания на водяной бане при 56°С предложенный Р.С.Москаликом (1974); в) ультразвуковой дезинтеграции. В последнем случае зиЬэр.

гооер1ёеписиз после культивирования при температуре 37°С в течение 18 часов отмывали от компонентов питательной среды центрифугированием и суспендированием в стерильном физиологическом растворе. Процедуру отмывки бактериальных клеток повторяли 3-4 раза. Центрифугат разводили до нужной концентрации при помощи стандартных образцов мутности (ОСО) 0С042-28-85-' 04П ГНИИСиКМБП им. Л.А. Тарасевича. Ультразвуковую дезинтеграцию осуществляли на установке УЗДН-2Т при 22 кГц, в течение 2,5 минут, поддерживая температуру +2...+5°С. Неразрушенные клетки и субклеточные субстанции ' осаждали центрифугированием при 1500§ в течение 40 минут. Надосадок использовали в качестве антигена. В полученных препаратах определяли содержание белка по методу Лоури, углеводов по методу Хагедорна-Иенсена, фосфолипидов (по фосфору).

Группоспецифическую антистрептококковую сыворотку получали путем иммунизации кроликов породы Шиншила, живой массой 2,5-3,5 кг. Для получения высокоспецифичных иммунных сывороток были испытаны четыре схемы.

Активность и специфичность полученных пулов гипериммунной сыворотки определяли в перекрестных реакциях агглютинации и преципитации с антигеном стрептококка группы А и С по общепринятым методам.

Иммуноферментный анализ. В работе использовали конкурентный метод твердофазного ИФА, предусматривающий адсорбцию на носителе антигена 8. едш

subsp. zooepidemicus. В лунки полистиролового планшета вносили раствор антигена в количестве 100 мкл в концентрации 1мг/мл на 0,2 М Na-карбонатном буферном растворе, pH 9,6. Планшеты инкубировали при температуре 37 С в течение 14-16 часов. Затем после промывания в лунки (за исключением контрольных лунок) вносили смесь растворов: испытуемые сыворотки и меченные пероксидазой видоспецифические антитела, после каждого этапа и добавление субстрата ферментативной реакции проводили отмывание несвязавшихся реагентов. Результат учитывали с помощью автоматического считывающего спектрофотометра Sumal РЕ2 фирмы CARLZEISS JENA DDR, при OD 492 нм, автоматически вычитая из всех показаний оптическое поглощение контрольной лунки планшета. Положительная реакция соответствовала слабому окрашиванию лунок (0п<0,35), так как с антигеном соединяются фермент-меченые антитела меньше, чем в контрольных (0п>0,4). Количество (титр) антител находили по разнице между контрольными и испытуемыми лунками.

Испытуемым материалом служили сыворотки крови вакцинированных животных: кроликов, гипериммунизированных антигеном S.equi subsp. zooepidemicus; щенят вакцинированных вакциной "Стрептоевак"; котят вакцинированных вакциной "Стрептоевак"; а так же сыворотки крови экспериментально инфицированных взвесью суточной культуры S. equi subsp. zooepidemicus щенят и котят.

Получение гамма-глобулина Глобулины из иммунных сывороток получали, методом высаливания насыщенным раствором сернокислого аммония С этой целью предварительно все компоненты, необходимые для высаливания, охлождали до температуры +3 + 4°С. При этой температуре также проводили все операции по осаждению глобулиновых фракций. Сыворотку осаждали равным объемом насыщенного аммония при постоянном помешивании. Смесь помещали в холодильник на 30 минут для формирования осадка, центрифугировали при 10000g 30 минут, декантат удаляли. Переосаждение глобулинов проводили дважды сульфатом аммония, 50% от насыщения. Осадок глобулинов растворяли в ФБР и диализовали против 0,01 М Na-карбонатного буфера. Время окончания диализа определяли пробой на присутствие аммония с помощью реактива Несслера следующим образом: в одну пробирку вносили 10 мл раствора сульфата аммония 1:300000 (контроль), в другую - диализат. Добавляли в обе пробирки по 0,3 мл 0,3% раствора сегнетовой соли, смешивали, приливали 0,3 мл реактива Неслера и встряхивали. Диализ считали законченным при одинаковом цвете контрольным и исследуемых растворов.

Приготовление конъюгатов антител Конъюгацию гамма-глобулина пероксидазой (RZ>3) проводили по методу, предложенному Nakane P. and Kawaoi А. (1974) в модификации Гавриловой В.М. (1979). В результате было получено 4 серии иммунопероксидазных конъюгатов.

Статистическую обработку результатов проводили при помощи программы STATGRAFF.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Культивирование S.equi subsp. zooepidemicus серогруппы С.

Штамм S. equi subsp. zooepidemicus был предварительно проверен по морфологическим, культурально-биохимическим и патогенным свойствам. Штамм хорошо рос на обогащенных питательных средах как в аэробных, так и в анаэробных условиях, с образованием рыхлого придонного белого осадка и полным просветлением надосадочной питательной среды. В мазках клетки располагались цепочками, не обладали подвижностью, спор не формировал, по Грамму окрашивались положительно. На средах с сахарами расщеплял сахарозу, глюкозу, лактозу, мальтозу и сорбит без образования газа. Не ферментировал маннит, инулин, арабинозу.

По гемолитической активности S. equi subsp. zooepidemicus относился к ß-стрептококкам. На МПА с 5%-м содержанием дефибринированной крови барана рос в виде округлых, мелких (0.5...0.8 мм), выпуклых, гладких полупрозрачных форм колоний, окруженных прозрачной зоной полного гемолиза.

Получение специфических антистрептококковых сывороток.

С целью получения гипериммунной антистрептококковой сыворотки в качестве продуцентов были отоброны клинически здоровые кролики породы Шиншила, не содержащие в крови антител против стрептококков, массой 2,5-3,5 кг.

Антиген для иммунизации получали по методу, предложенному P.C. Москаликом (1974) и методом многократного замораживания-оттаивания, (Вашакидзе М.Р., Пугачева Н.Л., Есепенок В.А.).

Антиген для иммунизации по методу, предложенному Р.С.Москаликом (1974), получали следующим образом: 18 - 24 часовую бульонную культуру стрептококка, центрифугировали при 2100g в течение 30 мин, осадок трижды промывали 0,85% стерильным раствором NaCI и затем полученную микробную массу (осадок) доводили до концентрации 18 109 микр. тел/мл по ОСО 42-28-85-04П. Полученную взвесь прогревали на водяной бане при 56°С в течение 1,5 час. В работе также использовали антиген без прогревания.

Антиген также получали методом замораживания-оттаивания. 18-24 часовую культуру стрептококка, центрифугировали при 2100g в течение 30 мин. Осадок трижды отмывали от остатков среды физиологическим раствором, полученную микробную массу (осадок) доводили 0,85% стерильным раствором NaCI до концентрации 18 109 микр. тел/мл по ОСО 42-28-85-04П. Затем 4-5 раз замораживали и оттаивали. После центрифугирования прозрачную надосадочную жидкость использовали в качестве антигена для гипериммунизации.

Приготовленные таким образом антигены проверяли на чистоту и отсутствие жизнеспособных микробов путем посева на МПА и МПА с 5%-м содержанием дефибринированной крови барана. В качестве консерванта добавляли мертиолят в окончательном разведении 1:10000 в физиологическом растворе или дистиллированной воде. Антиген хранили при +4±2°С.

В сравнительном аспекте испытали четыри схемы гипериммунизации (таблица 1 и 2). Для I и Ш схем иммунизации использовали антиген,

приготовленный по методу Р.С.Москалика, а для II и IV схем

иммунизации - антиген приготовленный методом замораживания-оттаивания.

Таблица №1

Первая и вторая схема иммунизации кроликов с целью получения

Место введения антигена Метод приготовления антигена Дни инъекций Приме чание

1 8 9 10 18 19

доза мл/ концентрация микр.тел в мл

краевая вена уха Р.С.Моска -лика 0,5/ 500 млн 0,5/ 500 млн 0,5/1 млрд 0,75/ 1,5млр д 1,0/ 2 млрд 1,5/2, 5млрд после 1 и 6 инъекций на 7-8 день пробно взятие крови

краевая вена уха замораживание-оттаивание 0,5/ 500 млн 0,5/ 500 млн 0,5/1 млрд 0,75/ 1,5млр д 1,0/2 млрд 1,5/2, 5млрд

Таблица №2

Третья и четвертая схема иммунизации кроликов с целью получения

Место введения антигена Метод приготовл ения антигена Неделя и доза антигена Приме чание

1 2 3 4 1 2 3 4

мл. млрд. микр. тел/мл

краевая вена уха Р.С.Моск алика 1,0 1,0 1,0 1,0 4; 8; 16 4 4 4 3 дня подряд 4 дня перерыв

краевая вена уха заморажив ание- оттаивание 1,0 1,0 1,0 1,0 4; 8; 16 4 4 4

С помощью реакции агллютинации и преципитации оценивали специфичность и активность полученных сывороток и антигенов. Для этого ставили перекрестные реакции с гомологичными и гетерологичными образцами.

Антистрептококковая сыворотка против стрептококка группы С положительно реагировала с гомологичным ангитгеном, но также вступали в

перекрестную реакцию с антигеном стрептококка серогруппы А, которую удалось устранить путем разведения сывороток до 1:4.

При изучении специфичности и активности полученных образцов гипериммунной сыворотки установили идентичность результатов РДП и РА.

При изучении активности гипериммунной сыворотки в РА и РДП с антигенами, приготовленными по методу P.C. Москалика и методом многократного замораживания-оттаивания, обнаружили, что гипериммунные сыворотки, полученные по схеме Ш и IV, имели более высокие титры антител: 1:32 в РА и 1:64 в РДП (рис.1).

■схема иммунизации I

■схема иммунизации II

■схема иммунизации III ■схема иммунизации1\/

т-1-1-1

Рис.1. Активность антистрептококковой сыворотки в РА и РДП

Таким образом, можно сделать заключение, что антигены полученные разными методами при многократной иммунизации обеспечивают накопление антител в достаточно высоких титрах, повышение дозы антигена и сокращение интервала его введение обеспечивает более высокий иммунный ответ (схема III и IV).

Получение реагентов набора ИФА.

В результате иммунизации кроликов была получена специфическая к S. equi subsp zooepidemicus сыворотка с активностью в РА 1:32 - 1:64, в РДП 1:64. Эту сыворотку мы использовали для выделения гамма-глобулина. Полученный препарат гамма-глобулина был исследован на содержание белка, чистоту и активность.

Как известно, в сыворотке кролика, в отличие от сывороток других животных, в большом количестве содержатся альбумины, соответсвенно гамма-глобулины составляют меньшую часть. В гипериммуной антистрептококковой сыворотке кроликов, полученной нами, гамма-глобулиновая фракция составляла 18%, альбуминовая - в среднем 63,7%, общий белок в среднем 58,35 мг/мл.

При 3-кратном высаливании гамма-глобулиновой фракции из гипериммунной сыворотки кролика сульфатом аммония 50% насыщения, был получен препарат, содержащий, в среднем, 55,4% гамма-глобулина; выход гамма-глобулинов (от исходного уровня) составлял 70,8% при низком содержании альфа и бета-глобулинов (табл. 3).

70

РДП

Таблица №3

Сравнительный белковый состав нормальной кроличьей сыворотки, гипериммунной сыворотки кроликов и препарата гамма-глобулина

Наименование препарата Общий белок мг/мл Альбумин, % Глобулины (%)

а Р У

нормальная сыворотка кроликов 75,0 60,0 10,0 10,0 20,0

гипериммунная антистрептококковая сыворотка 58,35 63,7 12,9 5,4 18,0

гамма-глобулиновая фракция 13,1 26,1 14,3 4,2 55,4

Из таблицы видно, что после осаждения гамма-глобулиновая фракция увеличилась в 4 раза и составила 55,4% по сравнению с их уровнем в гипериммунной сыворотке (18,0%), содержание альбуминов соответственно снизилось с 63,7% до 26,0%. После диализа были получены препараты с концентрацией глобулина от 12,3 мг/мл до 20,5 мг/мл.

Чистоту выделенных препаратов гаммаглобулина определяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией на приборе Нугув 2 фирмы "БеЫа" (рис. 2 и 3), результаты, которых свидетельствуют о достаточно высокой степени чистоты полученных фракций.

Рис.2. Электрофореграмма гипериммунной сыворотки кролика до осаждения гамма-глобулинов сульфатом аммония.

Рис.3. Электрофореграммы белка, полученные после осаждения гамма-глобулинов сульфатом аммония из гипериммунной сыворотки кролика.

Полученные препараты гамма-глобулина были использованы для приготовления иммунопероксидазного конъюгата.

Иммуноферментный анализ с антигенами стрептококка, полученными различными методами.

Нами были проведены исследования в НФА антигенов полученных различными методами со специфическим глобулиновым препаратов к Б. ечш бчЬбр 200ер1с1е1шси8. Антигены получали методом замораживания-оттаивания и ультразвуковой дезинтеграции. Данные сравнительной активности представлены на рис.4.

1

И -реакция со специфическим глобулином

Ш-реакия с отрицтельной сывороткой

А - препарат, полученный методом ультразвуковой дезинтеграции В - препарат, полученный методом замораживания-оттаивания

Рис. 4. Результаты ИФА сравнительной оценки антигенной активности препаратов полученных различными методами

Из рисунка видно, что для препаратов, полученных как ультразвуковой дезинтеграцией, так и замораживанием-оттаиванием, при одинаковой концентрации 1 мг/мл сенсибилизации при разведении сывороток 1:3200 активность реакции с пробами гипериммунной сыворотки была всегда < 0,35 единиц оптической плотности. В то же время, активность реакции с отрицательной сывороткой для обоих препаратов, во всех случаях была выше 0,4 единиц.

Полученные данные показали, что активность в ИФА препаратов, полученных методом замораживания-оттаивания, не уступает активности препаратов, полученных методом ультразвуковой дезинтеграции. Однако для препаратов, изготовленных методом ультразвуковой дезинтеграции, была характерна более высокая активность положительной контрольной сыворотки. Это видимо, связано присутствием в составе клеточных лизатов тейхоевых кислот (С-полисахарида), обладающих выраженной иммунохимической активностью.

Оптимизация условий проведения ИФА

Известно, что эффективность твердофазного ИФА во многом зависит от формирования слоя иммобилизированного антигена или антител путем его адсорбции на твердой подложке, которая в свою очередь зависит от концентрации антигена в иммобилизирующем слое, создание дополнительного покрытия, рН буферных растворов, времени и температуры инкубации, промывания планшетов.

Для того, чтобы определить оптимальную концентрацию антигена при сенсибилизации планшета, мы использовали двукратные серийные разведения антигена с иммунопероксидазным конъюгатом, одновременно проводили подбор буфера определенной рН и ионной силы, оптимальные для адсорбции стрептококкового антигена. На рисунках 5 и 6 показаны кривые титрования антигена 5. едш 8иЬ8р./ооер1с1е1тси8 в 0,2 М натрий-карбонатном буфере рН 9,6; 7,4 и в 0,2 М калий-фосфатном буфере рН 9,6; 7,4.

в"' У У

у

■0,2 М №-карбонатнй буфер рН 9,6

■ 0,2 М №-карбонатный буфер рН 7,4

Рис.5. Титрование антигена Б. ецш $иЬ8р.2ооер1<1етки$ в Ыа-карбонатном буфере рН 9,6; 7,4 (По оси абсцисс - разведение антигена; по оси ордитан -оптическое поглощение при 492 нм).

На рисунке видно, что адсорбция антигена 8. едш БиЬвр. гооер1с1еттси5 ¡скписиБ в 0,2 М натрий-карбонатном буфере с рН 9,6 выше, чем в том же буфере с рН 7,4, при этом график титрования имел прямолинейный участок.

При адсорбции препарата Б. еяш 5иЬзр.гооер1(1епйси8 в 0,2 М калий-фосфатном буфере с рН 9,6; 7,4, график имел отчетливо нелинейный характер. Для оценки уровня неспецифической реакции использовали нормальную кроличью сывортку. Положительная реакция для антигенного препарата стрептококка с положительной сывороткой наблюдалась при концентрации, соответствующей 1 мг/мл и 0,5 мг/мл при сенсибилизации лунок. Реакции препарата антигена данной концентрации с нормальной кроличьей сывороткой не наблюдалось.

У У

у

0,2 М калий фосфатный буфер рН 7,4

0,2 М кали-фосфатный буфер рН 9,6

Рис.6. Титрование препарата 8. ецш БиЬвр. гооер1с1е1тиси8 в калий-фосфатном буфере рН 9,6; 7,4 (По оси абсцисс - разведение препарата; по оси ординат -оптическое поглощение при ОБ 492 нм)

Из приведенных данных видно, что связывание белка с носителем зависит от концентрации, причем совместное влияние рН и ионной силы наиболее отчетливо проявляется при более высоких концентрациях белка в растворе. В связи с этим, нами в дальнейшем для сенсибилизации лунок использовался препарат в. eqш 8иЬ8р.гооер1ёеписи8 в концентрации 1 мг/мл.

В той или иной степени с проблемой фоновой активности приходится сталкиваться практически во всех работах по ИФА. Это связано как с чрезвычайно высокой чувствительностью самого метода, так и с тем, что для сыворотки характерен очень высокий уровень содержания

Мы исследовали влияния «инертного» бежа на снижение фоновых ложноположительных реакций. С этой целью сравнивали две концентрации белка (нативной сыворотки крови северных оленей).

Вариант 1: Сенсибилизированный антигеном планшет промывали трижды дистиллированной водой и трехкратно ФБР, содержащим 0,1% твин-80. Затем в планшет вносили фосфатный буфер рН (7,2±0,2), содержащий 5% нативной сыворотки крови северных оленей и 0,1% твин-80.

Вариант 2: Сенсибилизированный антигеном планшет промывали трижды дистиллированной водой и трехкратно ФБР, содержащим 0,1% твин-80. Затем в планшет вносили фосфатный буфер рН (7,2±0,2), содержащий 10% нативной сыворотки северных оленей и 0,1% твин-80. Планшеты инкубировали при температуре 37°С в течение 60 минут, затем отмывали три раза дистиллированной водой и три раза ФБР содержащим 0,1% раствором твин-80. На рис.7 показаны графики титрования видоспецифического конъюгата на планшете, сенсибилизированном антигеном Б. едш виЬвр. /ооер1ёеписи8 с сывороткой северных оленей (А, В), без сыворотки (С) и в качестве контроля - титрование в лунках без антигена (О).

Рис.7. Влияние «инертного» бежа на титрование конъюгата

Как видно, кривая титрования видоспецифического иммунопероксидазного конъюгата без дополнительной обработки планшета нативной сывороткой северных оленей не имеет характерного линейного профиля. При контрольном титровании - (без антигена) поглощение было значительно ниже. Исследования показали, что обработка носителя "инертным" белком после насыщения его антигеном позволяет заблокировать осгаточные свободные центры связывания, с которыми могли бы неспецифически взаимодействовать молекулы конъюгата.

Для удаления несвязавшихся в реакции гаптенов планшеты промывают после каждой стадии. Процесс промывания, так же как и обработка носителя «инертным» белком, снижает фоновую активность. Поэтому следующим этапом было отработка способов отмывания планшета. Для этого после каждого этапа реакции содержимое планшетов тщательно стряхивали, трижды промывали дистиллированной водой и от 3 до 5 раз фосфатно-буферным раствором, содержащим 0,05 и 0,1% твина-80. Затем планшеты тщательно просушивали механическим стряхиванием, чтобы не изменить концентрации вносимых реагентов. Проведенные опыты показали, что трехкратное отмывание лунок фосфатно-буферным раствором, содержащим 0,1% твина-80, является оптимальным при постановке реакции.

После того как были выбраны оптимальные концентрации антигенных препаратов, сенсибилизируемых на полистирольном планшете, мы приступили к

определению оптимального разведения специфического иммунопероксидазного конъюгата для проявления реакции.

Определение оптимального разведения конъюгата.

Процесс взаимодействия компонентов системы иммуноферментного анализа, как и любой другой иммунохимической системы, во многом зависит от соотношения количества антигена и антител. В ИФА оптимальное соотношение действующих компонентов достигается подбором разведения используемого в ИФА конъюгата. Для достижения максимальной чувствительности твердофазного ИФА необходим некоторый избыток антител (в данном случае - антител в составе конъюгата), так как при заниженной концентрации конъюгата не исключена низкая скорость превращения субстрата в продукт цветной реакции, что заметно снижает чувствительность ИФА. С другой стороны, его избыток не должен превышать некоторого предела из-за возникновения неспецифических фоновых реакций. В нашей работе мы использовали конъюгат антител кролика, связанных с пероксидазой.

Для выбора оптимального разведения конъюгата мы адсорбировали на полистироловом планшете антиген 8. ефц яиЬзр. тооер1ёеписи8 в 0,2 М натрий-карбонатном буфере рН 9,6, инкубировали при 37°С в течение 14-16 часов. Планшет промывали три раза дистиллированой водой, три раза раствором 0,1% твин-80. Затем в лунки планшета вносили серийные разведения конъюгата (1:8 до 1:256). Каждое разведение конъюгата вносили в лунки двух вертикальных столбцов. В последний вертикальный ряд вносили только буферный раствор (отрицательный контроль) Инкубировали при температуре 37°С в течение 60 мин в стационарных условиях. Планшет отмывали, как указано выше, и проявляли реакцию.

При оценке активности реакции мы сравнивали результаты цветных реакций при разных разведениях конъюгата (рис.8). Линейное превращение субстрата в продукт цветной реакции наблюдалось только при разведении 1 :б4, в то время как при других разведениях кинетика превращения субстрата имела нелинейный характер. В дальнейшем мы использовали максимальное разведение конъюгата, соответствующее 1:64.

1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

А - разведение 1:8; В - разведение 1:32; С - разведение 1:64 по оси

абсцисс - время реакции; по оси ординат - оптическое поглощение при 492 нм.

Рис. 8. Активность реакции в зависимости от разведения конъюгата

Определение специфичности иммунопероксидазного конъюгата в ЕЬКА-тесте с антигенами группы А и С, адсорбированных на твердой фазе, показано на рисунке 9, где видно, что оптическая плотность антигена серогруппы С (0,694-0,400) превышала уровень оптической плотности антигена серогруппы А, находившийся на уровне фона и составлявший 0,045-0,055 единиц.

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Л^ л^ л^ л^ л^ > * * / / / ^ /

Стрептококковый антиген группы С - - - -Стрептококковый антиген группы А

Рис.9. Специфичность иммунопероксидазного конъюгата

Таким образом, рабочее разведение конъюгата составляло 1:64, определена активность, специфичность и чувствительность полученных иммунопероксидазных конъюгатов.

Хранение конъюгата пероксидазы в присутствии глицерина (х.ч.) в соотношении 1:1 в течение 6 месяцев (период наблюдений) не сопровождалось заметным снижением активности.

Подбор индикаторной смеси.

Для проявления результатов ИФА с использованием пероксидазы применияются субстрантно-индикаторные смеси, включающие два компонента в буферном растворе: хромотоген и субстрат. Чаще всего для проявления результатов ИФА с использованием пероксидазы применяются индикаторные смеси, содержащие ортофенилендиамин или 5-аминосалициловую кислоту.

Мы решили сопоставить применеие ОФД с ТМБ (тетраметилбензидин). Для проведения сравнительного анализа были использованы одинаковые условия проведения ИФА. Для окрашивания использовали 0,04% раствор ОФД в фосфатно-цитратном буфере, рН 5,0 и вносили 0,4% 3%-го раствора перекиси водорода и готовый раствор ТМБ с субстратным буфером в соотношении 1:4. Планшеты закрывали крышками и инкубировали в темном месте при комнатной температуре до появления слабо желтого окрашивания в лунках для ОФД и голубого

окрашивания в лунках для ТМБ. Реакцию останавливали добавлением во все лунки планшет по 0,5 мл 20%-ной НгЗО^ После этого окраска в лунках изменялась с желтой на оранжевую для ОФД и с голубой на желтую для ТМБ. Оптическую плотность анализируемых субстратов измеряли для ОФД - ОВ492 и для ТМБ - ОБ^

Результаты титрования гипериммунных и контрольных отрицательных сывороток в ИФА при использовании разных хромотогенов в субстратно-индикаторной смеси представлены в табл.4.

Таблица 4

Результаты ИФА с различными индикаторами реакции

Индикаторная смесь Реакция с отрицательной сывороткой Реакция с положительной сывороткой Титр антител

ТМБ 0,419±0,023 0,163±0,019 1:800

ОФД 0,683±0,02 0,350±0,025 1:3200

Как видно из таблицы, при использовании ОФД чувствительность анализа оказалась выше - титр антител составил 1:3200 против 1:800 при использовании ТМБ. Кроме того, при использовании ОФД существенно снижается продолжительность последнего этапа ИФА: с 35 до 20 мин. В дальнейших исследованиях для проявления результатов ИФА мы использовали индикаторную смесь, содержащую ОФД.

3.4. Экспериментальные испытания твердофазного иммуноферментного

анализа

Повышение качества лабораторной диагностики стрептококкозов достигается совершенствованием уже существующих методов и путем разработки новых высокоэффективных экспресс-методов. Одним из методов, который в настоящее время широко применяется для серологических исследований при различных заболеваниях, является иммуноферментный анализ, который сочетает в себе высокую чувствительность, специфичность и простоту в постановке реакции.

Экспериментальные серии диагностикума испытывали для выявления антител к S. equi subsp. zooepidemicus в сыворотке крови щенят и котят трехмесячного возраста привитых вакциной "СТРЕПТОЕВАК" (сыворотки для исследования любезно предоставили соискатели кафедры клинической диагностики и болезней молодняка ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К .И.Скрябина Матвеев А.В.и Жидикова И.Г.). Вакцина "СТРЕПТОЕВАК' представляет собой суспензию лизатов микробных клеток стрептококков, инактивированных формалином. Вакцина применяется для имунизации сельскохозяйственных животных, плотоядных и грызунов против стрептококкозов. Кровь для исследований брали через каждые 7 дней. Пробы сыворотки исследовали в реакциях ИФА, РА, РДП.

Конкурентный ELISA-тест ставили на 96-луночных планшетах (VEB MLW-Германия), используя полученный нами набор реагентов и отработанные условия постановки рекции. Учет результатов проводили на автоматическом считывающем спектрофотометре Sumal РЕ2 фирмы CARLZEISS JENA DDR, при OD 492 нм. Для этого лунки микропанелей сенсибилизировали полученными антигенами в 0,2 М Na-карбонатном буфере, pH 9,6 в концентрации 1 мг/мл, инкубировали 14-16 часов при

+37°С. После промывания лунок ФБР с 0,1% твина-80, для заполнения свободных мест на твердофазном сорбенте (блокировка) применяли ФБР с 0,1% твин-80 и 10% нативной сыворотки северных оленей. Инкубировали 1 час при +37°С. После промывания в лунки вносили смесь растворов: испытуемые сыворотки, начиная с разведения 1:100, и иммунопероксидазный конъюгат в рабочем разведении, равном 1:64 Инкубировали 1 час при температуре +37°С, тщательно промывали лунки микропанелей ФБР, содержащим 0,1% твин-80 и добавляли раствор субстрата -ортофенилендиамина. Реакцию останавливали и учитывали так, как описано выше. Все компоненты тест-системы вносили в объеме 100 мкл, за исключением субстрата - 50 мкл/лунку.

В качестве положительной сыворотки для ELISA использовали полученную нами специфическую антистрептококковую сыворотку кролика с титром 1:3200. Отрицательным контролем служила нормальная (серонегативная) кроличья сыворотка.

Результаты сравнительной оценки результатов ELISA-системы представлены в таблицах 5 и 6. Компьютеризированную статистическую обработку проводили при помощи программы STATGRAFF.

Таблица 5

Сравнительные результаты обнаружения антител к Sr. equi subsp.zooepidemicus в ELISA, РА и РДП у котят привитых вакциной "Стрептоевак"

Сроки взятия крови после иммунизации Результаты средний титр (М±ш)

ИФА РА РДП

после первой иммуни зации 0-й день <1:100 -

7-ой день 84,09±12,5 4±1,26 2,38±0,5

14-й день 141,42±18,87 5,66±1,15 4,76±1,5

после ревакцинации 10-й день 800±251,66 38,05±12 19,03±6

30-й день 1131,37+230,94 45,25±9,24 22,63±4,62

60-й день 951,37±200,0 45,25+9,24 19,03±4

Таблица 6

Сравнительные результаты обнаружения антител к S. equi subsp.zooepidemicus в ELISA, РА и РДП у щенят привитых вакциной "Стрептоевак"

Сроки взятия крови после иммунизации Результаты средний титр (М±ш)

ИФА РА РДП

после первой иммуни зации 0-й день <1:100 - -

7-ой день 79,37±16,67 4±1.76 2.53±0.67

14-й день 251,98±66,67 20.16±5.33 6.35±1.33

после ревакцинации 10-й день 317,48±66,67 25.4±16 10.08±2.67

30-й день 1600+705,53 64±28.22 50.8±10.67

60-й день 1269.92±266.6 50.8±10.67 20.16±5.33

Из таблиц видно, что при исследовании иммунного ответа у щенят и котят, привитых вакциной "СТРЕПТОЕВАК" антитела в сывортке крови, до вакцинации во всех трех сравниваемых реакциях не обнаруживали, после вакцинации титр был на уровне 1400 - 1:800 в ИФА у котят и 1:400-1:1600 - у щенят. На 30 день был выявлен в связи с индивидуальной иммунореактивностьго отмечали большой разброс данных титров антител из-зи чего статистическая ошибка выросла до высоких величин. К 60 дню средний уровень антител хотя и несколько снизился, но у различных животных мы получили более близкие друг к другу значения титров, что и выразилось в снижении уровня величины статистической ошибки.

Аналогичная динамика титров антител и величины статистической ошибки были получены нами и при использовании других методов: РА и РДП, что является, на наш взгляд, свидетельством более высокой информативности разработанного нами метода.

По результатам ИФА напряженность иммунитета в группе вакцинированных животных определяли путем деления количества проб с титром антител 1:400 и выше к общему количеству исследуемых сывороток. Если в 80 и более процентах проб сывороток крови титр антител достигал значения 1:400 и выше животных считали иммунными к стрептококковой инфекции вызываемой Б. equi 5иЪ5р.2ооер1<1егтсш.

Также проводились исследования по выявлению антител к Б. еяш 8иЬ8р.гооер1с1е1тси5 на фоне экспериментального инфицирования щенят и котят взвесью суточной культуры к 8. equi 8иЬ5р.гооер1(1етки8 в концентрации 500млн мик. тел/мл. С этой целью были проведены одно!фатные исследования 20 проб сыворотки крови животных.

Согласно ранее разработанному нами критерию, положительной считали реакцию, в которой величина оптической плотности была менее 0,35 ± 0,05единиц Реакции, где величина оптической плотности была выше 0,451 ± 0,05 единиц, считали отрицательной.

В таблице 7 представлены данные, которые мы получили в результате анализа сывороток двумя методами.

Таблица 7

Сравнительные результаты обнаружения антител к 8. eqш 5иЬ$р.7,ооер\с1ет1си5 в

ЕЬКАиРДП

Показатели Результаты

положительные отрицательные /с

ELISA 18 1 90

РДП 15 3 75

Установлено, что совпадаемость положительных результатов к S. equi subsp. zooepidemicus результатов полученных двумя методами (ELISA/РДП) составила 100%. Из 20 исследуемых образцов сыворотки положительными в РДП были 15 или 75%, в ELISA - 18 или 90%., что указывает о более высокой чувствительности ИФА. Как показали результаты исследований по разработке варианта конкурентного ИФА с видоспецифическими антителами, предложенный нами способ приготовления антигена методом ультразвуковой дезинтеграции является более предпочтительным.

При исследовании сывороток крови животных различных видов, свободных от стрептококкозов, экспериментально инфицированных S. equi subsp.zooepidemicus и иммунизированных вакциной «Стрептоевак» была установлена высокая

чувствительность и специфичность при выявлении антител методом ИФА, что позволяет рекомендовать его для широкого использования в лабораторной практике для диагностики стрептококковой инфекции и иммунологического мониторинга.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и оптимизированы методы получения реагентов тест-системы ИФА для индикации антистрептококковых антител в периферической крови животных.

2. Разработанный конкурентный ИФА тест диагностики стрептококковой инфекции характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с РА и РДП.

3. Оптимизированная схема иммунизации кроликов-доноров и выделение гаммаглобулиновой фракции позволяет получить высокоактивные гипериммунные сыворотки к S. equi subsp.zooepidemicus с титром антител 1:3200 и более.

4. При хранении конъюгатов в присутствии глицерина, х.ч. в соотношении 1:1 в течение 6 месяцев при температуре -20°С, активность их в ИФА не снижается.

5. Перйодатный метод можно рекомендовать для получения иммуноферментных конъюгатов, пригодных для выявления антител к стрептококкам.

6. Метод ультразвуковой дезинтеграции позволяет получить антигены с более высокой иммуногенной активностью в ИФА, чем метод замораживания-оттаивания.

7. Адсорбция стрептококкового антигена в 0,2 М Na-карбонатном буфере, при pH 9,6, происходила более интенсивно, чем в буфере с низким значением pH.

8. Применение ортофенилендиамина в качестве субстратно-индикаторной смеси повышает чувствительность анализа и время постановки реакции в 1,5 раза.

9. Применение нативной сыворотки северных оленей в качестве "инертного" белка позволяет заблокировать остаточные свободные центры связывания на полистироловом носителе.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Конкурентный метод ELISA рекомендуется для серологической диагностики, эпизоотологического и иммунологического мониторинга стрептококковой инфекции.

2. Разработаны проект нормативной документации (СТО и инструкция по применению набора компонентов для диагностики стрептококковых инфекций методом иммуноферментного анализа.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Метод твердофазного ИФА на основе конкурентного метода специфического антигена S. equi subsp.zooepidemicus рекомендуется для внедрения в диагностическую практику ветеринарных лабораторий в качестве

серологического экспресс-метода диагностики стрептококковых инфекций

животных вызываемых 8. едш 5иЬ5р.гооер1йегтси5 и мониторинга иммунного фона.

2. Отработанные технологические параметры и режимы производства с использованием отечественного сырья и оборудования могут быть использованы для изучения антигенной структуры и приготовления тест-систем для ИФА других микроорганизмов.

3. Результаты исследований по разработке иммуноферментной тест-системы выявления стрептококковой инфекции рекомендуется использовать в учебном процессе по дисциплине «Иммунология» в высших учебных заведениях по специальностям 020208 - Биохимия и 310800 - Ветеринария.

Список основных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Девришов Д.А. Изучение биологических свойств и антигенных соотношений, отработка оптимальных параметров получения растворимых антигенов Streptococcus equi subsp zooepidemicus / Девришов Д.А., Ашурова З.Дж. // Ветеринария. - Душанбе, -2004. - №3,- С.22.

2. Ашурова ЗДж. О классификации стрептококков. / Ашурова З.Дж., Девришов Д.А. // Ветеринарная медицина 2005. - №3. - С.25

3. Ашурова З.Дж. Сравнительный биохимический состав специфического глобулина и гипериммунной антистрептококковой сыворотки для ИФА / Ашурова З.Дж., Девришов Д.А. // Ветеринарная медицина. - 2005. - №3. - С.27

4. Ашурова З.Дж. Постановка и проведение иммуноферментного анализа при стрептококкозах животных / Ашурова З.Дж., Девришов Д.А. // Ветеринарная медицина. - 2005. - №3. - С.27

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 20.09.05 Тираж 70 экз. Усл. п.л. 1,31 Печать авторефератов (095) 730-47-74,778-45-60

»Î68J0

РНБ Русский фонд

2006-4 12767

Ветеринарная наука за последние годы достигла значительных успехов в диагностике, профилактике и лечении инфекционных болезней животных. С целью разработки более эффективных и адекватных методов диагностики, средств специфической профилактики болезней животных требуются новые методические подходы, основанные на современных достижениях биологической науки и научно-технического прогресса в целом.

В связи с этим одним из главных направлений ветеринарной диагностики является создание простых в использовании и надежных иммунохи-мических методов экспресс-диагностики инфекционных болезней животных. Этот подход важен, когда речь идет о диагностике таких бактериальных инфекций как стрептококкозы. Из-за особенностей идентификации стрептококков при бактериологическом анализе не всегда удается выявить их как этиологический агент.

Применение антибиотиков, а также появление атипичных, плохо дифференцируемых форм бактерий существенно снижают эффективность бактериологического исследования. Трудности бактериологического анализа стрептококковых инфекций также связаны с несовершенством питательных сред и дороговизной или отсутствием в практических лабораториях некоторых ингредиентов, необходимых для идентификации. Поэтому представляется перспективным использовать методы иммунохимической диагностики стрептококковой инфекции, направленные на выявление постинфекционных или поствакцинальных антител.

Стрептококкозы регистрируют в крупных и мелких животноводческих хозяйствах Дании, Германии, Франции, США, Англии, Словакии, России и ряда других стран (126; 152; 122, 156; 8, 19; 45). Значительное распространение и экономический ущерб от заболеваний, вызываемых стрептококками (слагаемый из гибели животных, затрат на диагностику, лечение,

• профилактику), актуализируют задачу создания современных методов лабораторной диагностики инфекции.

Широкое распространение кокков затрудняет диагностику только по результатам бактериологического исследования и нуждается в дополнительном подтверждении путем выявления реакции антителообразования у инфицированных животных. Этим требованиям отвечают методы, основанные на реакции взаимодействия антигена с антителом и получении иммунного комплекса, который можно выявить с помощью меченного ферментом реагента (62; 152; 16). Результат реакции оценивают по интенсивности окрашивания визуально или используют автоматизированные методы учета.

В ветеринарии иммуноферментный анализ используют для обнаружения возбудителей инфекционных болезней животных и птиц. Метод успешно применяется для выявления антител вирусу лейкоза крупного рогатого скота (84), к возбудителю бруцеллеза (46), для диагностики трихинеллеза, к

• возбудителю вируса болезни Ньюкасла, к возбудителю чумы свиней и др. (15).

При разработке препарата для диагностики стрептококковой инфекции необходимо определить, какие из бактериальных антигенов играют ведущую роль в ходе патологического процесса. В многочисленных исследованиях, посвященных этому вопросу ранее, было показано, что полисахариды клеточной стенки стрептококков играют основную роль в стимуляции иммунного ответа и создании иммунитета к стрептококку гомологичного серотипа (13,97,107,170,180).

Это послужило основанием для использования С-полисахарида в качестве специфического реагента (антигена) в иммуноферментном анализе. Ранее изученные биологические и серотипические свойства С-полисахарида (11; 19; 152; 102, 130; 13) позволили определить оптимальные условия ад

• сорбции его на твердом носителе (полистироловом планшете) и получить высокоактивные гипериммунные сыворотки к стрептококковым антигенам (45; 62; 11,18).

Классические иммунологические тесты, такие как РА, РДП, РП по выявлению специфических антител к стрептококкозам животных требуют титрования. При этом невысокая чувствительность и значительная доля субъективизма в учете этих реакций, связанного с тем, что, как правило, нелегко отличить слабую положительную реакцию от отрицательной с достаточной надежностью (52). Альтернативным является иммуноферментный анализ, позволяющий непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с антителом, а не анализировать вторичные их проявления — агглютинацию, преципитацию или гемолиз.

Результативность метода иммуноферментного анализа зависит от активности, специфичности и стабильности всех компонентов реакции.

В связи с этим, целью настоящего исследования явилась разработка ИФА теста для диагностики стрептококковой инфекции.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Отработка режимов выделения и очистки антигена штамма 8. еяш БиЬБр. 200ер1с1еггисиз и изучение его биохимического состава.

2. Разработка схемы гипериммунизации и получение специфической сыворотки и иммуноглобулина к стрептококковым антигенам.

3. Отработка параметров коньюгирования иммуноглобулинов (гаммаглобулина) пероксидазой хрена и получение специфического конъю-гата.

4. Составление набора ИФА для выявления противострептококковых антител в биологических жидкостях, подбор оптимальных параметров постановки ИФА.

5. Экспериментальные испытания ИФА выявления антител к Б. equi БиЬэр. 2ооер1с1егтси8.

Научная новизна результатов исследования. Впервые для серологической диагностики инфекционных болезней животных, вызываемых Б^ш БиЬБр. 200ер1с1егтси8 разработана тест-система ИФА. Метод показал высокую чувствительность и специфичность и позволял выявлять поствакцинальные и постинфекцинные специфические антитела.

Разработаны биотехнологические параметры получения кроличьих гипериммунных референс-сывороток и иммуноглобулинов к растворимым антигенам 8. ецш БиЬБр. гооер1с1егшси5.

Изучены условия адсорбции антигенов стрептококка на полистироловых планшетах.

Практическая значимость результатов исследования. Разработана тест-система для диагностики стрептококкозов животных, вызываемых Б. ецш БиЬБр. 2ооер1с1етюи8, методом ИФА и нормативная документация на опытно-промышленное производство антигенного иммуноферментного стрептококкового диагностикума (СТО (Технические условия), инструкция по применению). Практическое применение антигенного иммуноферментного стрептококкового диагностикума позволит повысить диагностическую значимость лабораторных исследований, проводить серологический мониторинг и прогнозировать стрептококкозы у животных.

Материалы исследований включены в учебные программы кафедр иммунология и биотехнология ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И.Скрябина.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на научно-практической конференции (г. Душанбе, 2004г) и обсуждены на межкафедральном совещании сотрудников кафедр микробиологии, эпизоотологии, иммунологии, биотехнологии и научно-исследовательской лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии.

По теме диссертации опубликовано 4 научных работ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследований по обоснованию и разработке ИФА теста для серологической диагностики стрептококковой инфекции, вызываемой Б.ецш БиЬзр. гооер1с1е1шси8.

2. Результаты экспериментальных испытаний разработанного ИФА теста для серологической диагностики и мониторинга стрептококковой инфекции у животных.

Структура и объем работы.

• Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 рисунками и 16 таблицами. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 184 источника, из которых 100 иностранных и приложение.

4. В Ы В О Д Ы

1. Разработаны и оптимизированы методы получения реагентов тест-системы ИФА для индикации антистрептококковых антител в периферической крови животных.

2. Разработанный конкурентный ИФА тест диагностики стрептококковой инфекции характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с РА и РДП.

3. Оптимизированная схема иммунизации кроликов-доноров и выделение гамма-глобулиновой фракции позволяет получить высокоактивные гипериммунные сыворотки к Б. equi БиЬБр. гооер1с1е1шси5 с титром антител 1:3200 и более.

4. При хранении конъюгатов в присутствии глицерина, х.ч. в соотношении 1:1 в течение 6 месяцев при температуре —20°С, активность их в ИФА не снижается.

5. Перйодатный метод можно рекомендовать для получения иммуно-ферментных конъюгатов, пригодных для выявления антител к стрептококкам.

6. Метод ультразвуковой дезинтеграции позволяет получить антигены с более высокой иммуногенной активностью в ИФА, чем метод замораживания-оттаивания.

7. Адсорбция стрептококкового антигена в 0,2 М Иа-карбонатного буфере, при рН 9,6, происходили более интенсивно, чем в буфере с низким значением рН.

8. Применение ортофенилендиамина в качестве субстратно-индикаторной смеси повышает чувствительность анализа и время постановки реакции в 1,5 раза.

9. Применение нативной сыворотки северных оленей в качестве "инертного" белка позволяет заблокировать остаточные свободные центры связывания на полистироловом носителе.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Конкурентный метод ELISA рекомендуется для серологической диагностики, эпизоотологического и иммунологического мониторинга стрептококковой инфекции.

2. Разработаны проект нормативной документации (СТО и инструкция) по применению набора компонентов для диагностики стрептококковых инфекций методом иммуноферментного анализа.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Метод твердофазного ИФА на основе конкурентного метода специфического антигена S. equi subsp. zooepidemicus рекомендуется для внедрения в диагностическую практику ветеринарных лабораторий в качестве серологического экспресс-метода диагностики стрептококковых инфекций животных вызываемых S. equi subsp. zooepidemicus и мониторинга иммунного фона.

2. Отработанные технологические параметры и режимы производства с использованием отечественного сырья и оборудования могут быть использованы для изучения антигенной структуры и приготовления тест-систем для ИФА других микроорганизмов.

3. Результаты исследований по разработке иммуноферментной тест-системы по выявлению стрептококковых инфекций рекомендуется использовать в учебном процессе по дисциплине «Иммунология» в высших учебных заведениях по специальностям 020208 - Биохимия и 310800 — Ветеринария.