Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка и усовершенствование средств и методов диагностики чумы плотоядных

619: 616. 988 -076: 636. 934

- 9 (|/{)/1 На правах рукописи

Аспирант Дибиров Шамиль Сиражутинович

□РАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Покров 1997

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском инстит; ветеринарной вирусологии и микробиологиии

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Член-корреспондент РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор

ВИШНЯКОВ И.Ф. " /

^ ••—----|

*

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: • доктор ветеринарных наук, профессор ЧЕРНЯЕВ Ю.А. (ВНИИЗЖ) кандидат биологических наук ЩЕТНИКОВА Л.А". (ВНИИВВиМ)

Ведущее учреждение -Всероссийский НИИ экспериментальной ветерин

рии

Защита состоится 26 июня 1997 г. в 12 часов на заседании диссерт ционного совета Д -120.61.01 во Всероссийском научно-исследовательском и ституте ветеринарной вирусологии и микробиологиии по адресу 601120, г. П кров Владимирской области, ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан 23 мая 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета -

ФЕДОРОВ Г.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Чума плотоядных (ЧП) - высоко контагиозная вирусная болезнь, [сражающая многие виды семейств собачьих, куньих, енотовидных, ;арактеризующаяся весьма разнообразными клиническими признаками. 1атологоанатомические изменения не характерны. Восприимчивость и ровень смертности у различных видов животных варьируют в широких [ределах. В популяциях неимунных собак и пушных зверей смертность реди взрослых животных может достигать до 30-40 %, а среди молодняка до 80-100 %. Переболевшие особи часто месяцами остаются скрытыми (ирусоносителями, являясь источником инфекции. Они отстают в росте, у (зрослых особей снижаются воспроизводительные способности. Как »тмечают многие исследователи, чума является одной из самых опасных юлезней плотоядных, причиняющей огромный экономический ущерб.

Решающее значение в борьбе с болезнью имеет своевременное фоведение эффективных противоэпизоотических мероприятий. Одним из >сновных мероприятий в борьбе против болезни является ранняя фижизненная диагностика - обнаружение антигенов вируса в выделениях 5ольного животного в начальной стадии заболевания (в слюне, моче, сале, в смывах из глаз, выделениях из носовой полости). Многие ^следователи отмечают, что эффективность профилактической »акцинации при ЧП зависит от иммунного состояния животных в момент шмунизации. В связи с этим возникает необходимость определения уровня специфических антител перед вакцинацией. Не менее важен юпрос определения посгвакцинального иммунитета.

Для этого необходимо иметь высокочувствительные, специфичные и жспрессные методы обнаружения антигенов и антител.

До последнего времени для лабораторной диагностики ЧП и шределения специфических антител в сыворотках крови в нашей стране гагользовали РДП, РСК, МФА, РН. В затруднительных случаях

проводили биопробу на щенках восприимчивых животных, с последующей идентификацией вируса в реакции нейтрализации.

Основным недостатком РДП и РСК является низкая чувствительность методов.

РН чувствительна и специфична, но требует длительного времени постановки и больших трудовых и материальных затрат.

МФА чувствителен, специфичен и прост в постановке. Метод с успехом применяется для обнаружения антигенов вируса в пробах органов павших или вынужденно убитых животных. Но для исследований проб выделений больного животного, а следовательно, ранней прижизненной диагностики болезни, метод не пригоден.

Указанные причины обусловили необходимость разработки средств и методов, обеспечивающих обнаружение вируса в выделениях больного животного в начальной стадии болезни и определения антител в сыворотках крови животных.

Методы ИФА специфичны, экспрессны, не сложны в постановке, позволяют проводить количественную оценку результатов. Чувствительность метода обеспечивает обнаружение минимальных количеств антигена в исследуемом материале, что гарантирует раннюю диагностику болезни.

В нашей стране методы ТФ ИФА еще не нашли широкого практического применения при диагностике ЧП. В научной литературе имеется одно сообщение о разработке и использованию метода Дот -ИФА для диагностики данной болезни.

Цель работы

Разработка и усовершенствование средств и методов диагностики чумы плотоядных.

Задачи исследования.

1. Получить активные антигены ВЧП, пригодные для иммунизации животных и использования в серологических реакциях.

2. Получить специфичные к ВЧП сыворотки крови животных, пригодные для изготовления диагностических иммунореагентов.

3. Изготовить иммунореагенты для методов ТФ ИФА, ГХ ИФА и МФА, определить оптимальные условия постановки реакций для выявления специфических антигенов вируса и антител к нему.

4. Определить пригодность разработанных средств и методов для диагностики ЧП и определения специфических антител в сыворотках крови больных, переболевших и вакцинированных животных.

Научная новизна

Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:

- адаптирован ВЧП шт "ВНИИВВиМ-88" к культуре клеток почки сайги. На основе адаптированного вируса и культуры клеток ПС получены активные культуральные антигены ВЧП, пригодные для использования в лабораторной диагностике болезни;

- разработан "Сендвич" вариант ТФ ИФА, пригодный для обнаружения антигенов вируса. Метод позволяет выявлять антигены ВЧП в пробах из секретов глаз и ротовой полости, полученных в первые сутки появления клинических признаков, т.е. проводить раннюю, прижизненную диагностику болезни;

- разработан вариант ингибирования ТФ ИФА, пригодный для определения специфических к ВЧП антител в сыворотках крови животных;

- отработан ГХ ИФА, пригодный для обнаружения антигенов ВЧП в зараженных культурах клеток и в мазках-отпечатках проб внутренних органов.

Практическая значимость

На основании экспериментальных исследований разработаны и

рекомендованы для лабораторной диагностики ЧП чувствительные, специфичные, производительные и экспрессные методы ТФ ИФА, ГХ ИФА и МФА. Разработанные методы позволяют выявлять антигены ВЧП в выделениях больных животных в начальной стадии болезни (в день появления клинических признаков), в органах и тканях павших животных и в вируссодержащих культуральных материалах. Метод ИТФ ИФА позволяет обнаруживать специфичные к ВЧП антитела в сыворотках крови инфицированных и вакцинированных животных.

Сконструирован "Набор препаратов по выявлению специфических антигенов и антител при чуме плотоядных твердофазным иммуноферментным анализом", и оформлена нормативно-техническая документация на набор, утвержденная директором ВНИИВВиМ.

Апробаиш работы

Материалы диссертации доложены на научных конференциях ВНИИВВиМ (г. Покров 1994, 1996 гг), и на заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ (г.Покров 1994-1996гг).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 научных работы.

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту

1. Результаты экспериментов по определению оптимальных условий получения специфических культуральных антигенов ВЧП, пригодных для применения в лабораторной диагностике болезни.

2. Результаты исследований по разработке "Сэндвич" варианта ТФ ИФА, позволяющего обнаруживать антигены ВЧП в пробах из глаз и ротовой полости инфицированных животных, т.е. проводить раннюю, прижизненную диагностику болезни, в пробах органов павших животных и в культуральных вируссодержащих материалах.

3. Результаты исследований по разработке варианта ИТФ ИФА, позволяющего обнаруживать антитела специфичные к ВЧП в сыворотках крови вакцинированных, больных и переболевших животных.

4. Результаты исследований по разработке прямых вариантов ГХ ИФА и МФА, позволяющих обнаруживать антигены ВЧП в цитоплазме клеток внутренних органов павших животных и зараженных культур клеток.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 117 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (115 источника, в том числе 26 отечественных). Работа иллюстрирована 24 таблицами и дополнена приложениями.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы.

Вирусы и антигены.

В работе использовали ВЧП: вакцинный щт "ВНИИВВиМ-88" и вирулентный шт "Snyder Hill". В качестве специфических антигенов для ТФ ИФА использовали лизаты клеточных культур, инфицированных шт "ВНИИВВиМ-88", а также органные антигены из печени зараженных шт "Snyder Hill", тхорзофреток.

Для контроля специфичности разработанных методов использовали антигены, приготовленные из органов интактных тхорзофреток, незаряженных культур клеток, а также антигены гетерологичных вирусов: гепатита собак, энтерита норок, болезни Ауески, чумы КРС.

Сыворотки

Использовали нормальные и специфичные к ВЧП сыворотки крови собак и пушных зверей, а также сыворотки крови, специфичные к гетерологичным вирусам болезней плотоядных: энтерита норок, гепатита собак, болезни Ауески.

Сыворотки получены из лаборатории "Диагностика" ВНИИВВиМ.

Животные.

Для клинического воспроизведения ЧП, получения органного антигена и специфических к ВЧП сывороток крови использовали тхорзофреток в возрасте 6-12 месяцев.

Для получения специфических к ВЧП сывороток крови, кроме тхорзофреток использовали: овец в возрасте 6-24 месяцев, массой 40-50 кг; коз, в возрасте 6-8 мес, массой 15-25 кг; свиней, в возрасте 4 месяцев, массой 25-35 кг. Для получения антивидовых сывороток крови использовали беспородных кроликов, массой 2,5-3 кг. Животных получали из научно-экспериментальной базы лабораторных животных, питомников "Светлые горы" и "Столбовая" АМН РФ, а также из хозяйств Владимирской области. До начала эксперимента животных выдерживали под наблюдением в течение 15-30 дней. Кормление осуществляли в соответствии с рационами.

Культуры клеток

Для "выделения, культивирования, титрования и накопления ВЧП и антигенов ВЧП использовали одно-двухсуточные перевиваемые

культуры клеток почки сайги (ПС) и почки африканской зелёной мартышки (CV-1). Культуры клеток получали в лаборатории "Биологии и культивирования вирусов" и "Культуры клеток с музеем клеточных штаммов" ВНИИВВиМ.

Методы.

Серологические методы исследования.

Для проверки активности и специфичности препаратов антигенов, сывороток крови, а также для сравнения диагностической ценности разработанных методов использовали РДП, РН, МФА, НМФА.

Получение антигенов.

Специфические культуральные антигены вируса получали с использованием вакцинного ВЧП шт "ВНИИВВиМ-88" и культур клеток ПС и CV-1. При определении инфекционной активности, культуральный вирус титровали в культуре клеток CV-1, титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча, выражая в цитопатических дозах в миллилитре (ЦПД50/МЛ). Специфический органный антиген получали из органов тхорзофреток, зараженных вирулентным ВЧП шт "Snyder Hill". Нормальные культуральные и органные антигены получали из интактных культур клеток и тхорзофреток, аналогично специфическим антигенам.

Получение специфических сывороток крови.

Для получения специфических к ВЧП диагностических сывороток крови использовали овец, коз, свиней, проводя иммунизацию культуральным антигеном, а также тхорзофреток, гипериммунизировав их органным антигеном вирулентного штамма вируса. Активность полученных антигенов определяли в РДП и ТФ ИФА, а культурального антигена, кроме того, титрованием в чувствительной культуре клеток.

Активность специфичных к ВЧП сывороток крови определяли в РН, в РДП, в НМФА.

Хуоматографические методы исследования. Выделение IgG из сывороток крови проводили путем высаливания сернокислым аммонием, с последующей гельпроникающей хроматографией на Ультрагеле АсА-34. Очистку полученных коньюгатов проводили: пероксидазного - на сефакриле S-200, ФИТЦ - на сефадексе G-50.

Конъюгирование IsG. Коньюгирование IgG с пероксидазой хрена проводили по методу периодатного окисления (Wilson & Nakane 1978), а с ФИТЦ - на основе ряда методов, предложенных ранее (П.Фогт, 1972; Л.Форни, 1981; Б.Эрнст, 1979).

Результаты собственных исследований Получение специфических антигенов Для получения активных специфических культуральных антигенов, исследовали чувствительность различных видов перевиваемых культур клеток к ВЧП: к вакцинному шт "ВНИИВВиМ-88" и вирулентному шт "Snyder Hill". Вирулентный штамм не репродуцировался ни в одной из исследованных культур клеток. Вакцинный штамм хорошо репродуцировался в культуре клеток ПС и CV-1. Исследовали зависимость накопления вируса от множественности заражения, сроков культивирования, процентного содержания сыворотки КРС в культуральной среде. Оптимальной множественностью заражения оказалась доза 0,025-0,0025 ЦПД/кл, а содержание сыворотки крови КРС в пределах 1-10% не влияло на уровень накопления в обеих культурах клеток. Оптимальными сроками культивирования для культуры клеток TT Г1 пт,-ячяггагг. 4-7 глттктт. я ттття CV-1 . %4 Ппи тгих углтотшях

культивирования наблюдали максимальное накопление как инфекционного вируса 0g ЦПД5о/мл), так и наивысшую активность его антигенов (в ТФ ИФА), которые составили, соответственно, в культуре клеток СУ-1 - 3,5-4,0 и 1:250; а в ПС - 4,5-5,0 и 1:1250. На основе вакцинного вируса и культур клеток ПС и CV-1 приготовили культуральные антигены ВЧП, пригодные для иммунизации животных-продуцентов специфичных к ВЧП диагностических сывороток крови и использования в серологических реакциях. Для иммунизации чувствительной к ЧП лабораторной модели - тхорзофретки приготовили органный антиген из печени тхорзофретки, зараженной вирулентным ВЧП шт "Snyder Hill". Активность полученных культуральных и органных антигенов представлена в таблице 1.

Таблица 1

Результаты определения активности культуральных и органных антигенов ВЧП

п=3

исследованные антигены активность в

ТФ ИФА РДП

органный 1:31250 1:8

культ., из лизата клеток ПС 1:6250 1:8

культ., из лизата клеток СУ-1 1:1250 1:2

культ, жидкость из культ, клеток ПС 1:1250 0

культ, жидкость из культ, клеток СУ-1 1:250 0

Исходя из активности культурального антигена, для иммунизации нечувствительных животных использовали антиген, полученный из лизата клеток ПС. С целью концентрации и частичной очистки антиген высаливали сернокислым аммонием. Приготовленный таким образом антиген имел активность в РДП 1:16-1:32, а в ТФ ИФА 1:6250.

Получение специфических к ВЧП сывороток крови и приготовление конъюгатов.

Для этого использовали свиней, овец и коз, иммунизируя их частично-очищенным культуральным антигеном, и тхорзофреток, гипериммунизируя их органным антигеном из печени зараженной тхорзофретки.

Овец и коз иммунизировали трехкратно, внутрикожно, с интервалом в 2 недели, по 2 мл смеси антигена и адъюванта Фрейнда (1:1). Активность полученных сывороток крови составила, соответственно, в РДП, в РН и в НМФА: сывороток крови коз - 1:8; 1:1280-1:2560; 1:400-1:800; сывороток крови овец: - 1:2; 1:80-1:160; 1:100-1:200.

Свиней иммунизировали трехкратно, одну группу животных в/мышечно, а вторую - интраназально, по 5 мл антигена, с интервалом между введениями в 2 недели. Разницы в титрах антител у животных, иммунизированных в/мышечно или интраназально, не обнаружили. Активность сывороток крови составила: в РДП 0; в РН 1:1280-1:2560; в НМФА 1:200-1:400.

Для получения специфических сывороток крови тхорзофреток испытали 4 схемы гипериммунизации антигеном с активностью в РДП 1:8, в ТФ ИФА 1:31250. Первую группу иммунизировали 1-кратно, в/мышечно, по 1 мл антигена. Вторую - 4-кратно, в/мышечно, по 1 мл антигена с интервалом в 2 недели. Третья схема предусматривала 3 введения антигена по 1 мл в/мышечно, с интервалом в 2 недели, и 3 введения в/брюшинно по 3 мл антигена с интервалом в 2 суток. Четвертая схема была аналогична схеме иммунизации кроликов для получения антивидовой сыворотки крови. Более активные сыворотки получили от тхорзофреток, гипериммунизированных по 3-й схеме, титр специфических антител в них составил в РДП 1:8; в РН 1:1280-1:2560; в НМФА 1:8001:1600.

Исходя из результатов определения активности, для приготовления пероксидазных и ФИТЦ коньюгатов мы использовали сывортки крови козы и тхорзофретки.

Активность коньюгатов, полученных при коньюгировании с 1§0, выделенными из сыворотки крови тхорзофретки, составила : -пероксидазного 1:800-1:1600, а ФИТЦ 1:64-1:128. Активность как пероксидазного (ПХ), так и ФИТЦ коньюгатов, полученных с ^О, выделенными из сыворотки крови козы, была в 4 раз ниже.

Разработка вариантов ТФ ИФА. Разработку различных модификаций ТФ ИФА вели в двух направлениях:

во-первых, разрабатывали "Сэндвич" вариант ТФ ИФА для обнаружения антигенов вируса в пробах органов павших, выделениях больных животных и в культуральных вир у ссо держащих материалах;

во-вторых, разрабатывали вариант ИТФ ИФА для выявления специфических к ВЧП антител в сыворотках крови инфицированных и вакцинированных животных.

Разработка "Сэндвич" варианта ТФ ИФА При разработке "Сэндвич" варианта ТФ ИФА определяли оптимальное соотношение рабочих разведений ^О для сенсибилизации твердой фазы (ТФ) и специфического ПХ коньюгата. Для иммуноглобулиновых препаратов, полученных из сыворотки крови тхорзофреток, таковыми разведениями оказались: - - 1:6000,

коньюгата - 1:400. Для иммунореагентов, полученных из сыворотки крови козы - 1:1000 и 1:100, соответственно.

Исследовали чувствительность разработанного "Сэндвич" варианта ТФ ИФА для выявления антигенов ВЧП при использовании иммунореагентов, полученных из сыворотки крови козы и тхорзофретки.

Оказалось, что при использовании иммунореагентов, полученных из сыворотки крови тхорзофретки, "Сэндвич" вариант ТФ ИФА в 5 раз для культуральното, и в 25 раз для органного антигена чувствительнее, чем при использовании иммунореагентов, полученных из сыворотки крови козы. Исходя из этих данных и активности самих иммунореагентов, дальнейшую работу мы провели на основе диагностикумов, полученных из сыворотки крови тхорзофретки. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что лучшими продуцентами диагностических сывороток крови при чуме плотоядных являются естественно восприимчивые животные, в частности тхорзофретки. Для определения специфичности и чувствительности разработанного на основе сыворотки крови тхорзофретки "Сэндвич" варианта ТФ ИФА, исследовали различные культуральные и органные, нормальные и специфические антигены, а также антигены возбудителей гетерологичных болезней плотоядных вирусной и бактериальной этиологии. При этом установили, что метод специфичен и чувствителен, выявляет антигены в пробах органов павших животных в разведениях от 1:6250 до 1:156250, а в культуральных вируссодержащих материалах в разведениях от 1:250 до 1:6250, превосходит по чувствительности РДП более чем в 1000 раз. Метод позволяет выявлять антигены всех исследованных штаммов ВЧП и дифференцировать их от антигенов гетерологичных возбудителей болезней плотоядных.

Разработка варианта тгибирования ТФ ИФА.

С примением полученных из сыворотки крови тхорзофреток иммунореагентов, с целью обнаружения специфичных антител в сыворотках крови, разработали вариант ингибирования ТФ ИФА (ИТФ ИФА). При отработке реакции, 1§С для сенсибилизации ТФ и пероксидазный коньюгат использовали в том же рабочем разведении, что и при постановке "Сэндвич варианта ТФ ИФА. При отработке метода

испытали пригодность в реакции различных культуральных и органных антигенов. Установили, что способностью ингибировать взаимодействие специфических антител, сорбированных на ТФ, с антигеном ВЧП, обладают специфичные к ВЧП сыворотки крови, при использовании в реакции в качестве антигена культуральной вируссодержащей жидкости. Нормальные сыворотки крови в разведениях, начиная с 1:10, не ингибируют связывание антигена ВЧП с сорбированными на ТФ специфическими антителами. Результаты исследования чувствительности и специфичности метода свидетельствуют, что вариант ИТФ ИФА является чувствительным и специфичным методом, позволяет выявлять антитела, специфичные к ВЧП, в сыворотках крови вакцинированных пушных зверей в разведениях от 1:80 до 1: 640, а гипериммунизированных - до 1:5120. Нормальные и гетерологичные сыворотки крови дают отрицательные результаты, начиная с разведения 1:10. Титры специфических к ВЧП антител в варианте ИТФ ИФА и в РН совпадают.

Разработка прямого гистохимического ИФА

При разработке гистохимического иммуноферментного анализа (ГХ ИФА) мы исследовали пригодность полученного ПХ коньюгата для обнаружения ВЧП в цитоплазме зараженных клеток и в мазках-отпечатках проб органов павших от ЧП тхорзофреток методм ГХ ИФА.

Для этого, культуру клеток СЛМ, выращенную в 96-ти луночных пластинах, заражали вакцинным ВЧП в 10-ти кратных разведениях от 1:10 до 1:105. Пластины инкубировали в СО2 инкубаторе в течение 2-3 суток. Монослой клеток фиксировали 80 %-ным охлажденным ацетоном в течение 10 мин. В лунках пластины инкубировали специфический пероксидазный коньюгат в рабочем разведении при 37° С в течение 50-60 мин. После отмывки несвязавшегося коньюгата в лунки пластины вносили раствор хромогенного субстрата. Учет результатов проводили

через 30-60 мин инкубирования при комнатной температуре под световым микроскопом.

Для исследования мазков-отпечатков проб органов, последние готовили общепринятым методом. После фиксации препаратов, как изложено выше, их обрабатывали пероксидазным коньюгатом в рабочем разведении, при 37° С в течение 50-60 мин во влажной камере. После отмывки несвязавшегося коньюгата препараты помещали на предметные стекла с раствором хромогенного субстрата. Учет результатов проводили под световым микроскопом. Результаты определения чувствительности и специфичности метода свидетельствуют, что прямой вариант ГХ ИФА чувствителен и специфичен, позволяет обнаруживать в цитоплазме зараженных клеток антигены вакцинного ВЧП шт "ВНИИВВиМ-88" в разведениях до 10-3>М0-4 и дифференцировать их от антигенов возбудителей гетерологичных болезней плотоядных. Метод позволяет выявлять антигены вирулентного ВЧП шт "Snyder Hill" в мазках-отпечатках проб органов павших животных.

Отработка прямого МФА

При разработке прямого МФА, мы исследовали пригодность полученного на основе сыворотки крови тхорзофретки ФИТЦ-коньюгата для обнаружения ВЧП в зараженных культурах клеток и в мазках-отпечатках проб органов павших от ЧП тхорзофреток. Для этого культуру клеток CV-1, выращенную в 96-ти луночных пластинах, заражали вакцинным ВЧП в 10-ти кратных разведениях от 1:10 до 1:10-5. Пластины инкубировали в СОг инкубаторе в течение 2-3 суток. Монослой клеток фиксировали 80 %-ным охлажденным ацетоном в течение 10 мин. В лунках пластины инкубировали специфический ФИТЦ-коньюгат в рабочем разведении при 37° С в течение 30-45 мин. После отмывки несвязавшегося коньюгата, проводили учет результатов под инвертированным Флюоресцентным микроскопом.

Для исследования мазков-отпечатков проб органов последние готовили общепринятым методом. После фиксации препаратов, как изложено выше, их обрабатывали ФИТЦ-коньюгатом в рабочем разведении при 37° С в течение 30-45 мин во влажной камере. После отмывки несвязавшегося коньюгата проводили учет результатов, как изложено выше. Результаты определения чувствительности и специфичности прямого МФА свидетельствуют, что метод специфичен и чувствителен, позволяет обнаруживать в цитоплазме зараженных клеток антигены вакцинного ВЧП шт "ВНИИВВиМ-88" в разведениях до 10-3-5-10"4 и дифференцировать их от антигенов гетерологичных возбудителей болезней плотоядных. Метод позволяет выявлять антигены вирулентного ВЧП шт "Snyder Hill" в мазках-отпечатках проб органов павших животных.

Применение разработанных средств и методов для экспертизных исследований Разработанные методы ТФ ИФА, ГХ ИФА и МФА применили при исследовании проб сывороток, проб патматериала от павших пушных зверей разных видов, полученных из зверохозяиств, а также от экспериментально зараженных тхорзофреток. От экспериментально зараженных животных получали пробы из глаз и роговой полости до заражения и через каждые 2 сут после заражения до гибели животных. После гибели, кроме указанных проб, получали и пробы внутренних органов. От павших в зверохозяйствах животных исследовали пробы внутренних органов: печени, селезенки, легких, почек, м/пузыря, кишечника. Результаты исследований проб, взятых из глаз и ротовой полости экспериментально зараженных тхорзофреток представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты исследований проб из глаз и ротовой полости экспериментально зараженных тхорзофреток

п=3

исследованные материалы ТФ ИФА ГХ ИФА МФА

- до заражения - в день появления клинич. признаков - ч-з 2 сут после появл. клинич. приз. - в период ярко выр.клинич. приз. 0* 1:50 1:250-1:1250 до 1:31250 - -

- в пробах органов после гибели животных 1:62501:156250 + +

Примечание:

- (*) - активность антигена;

- (-) - отрицательный результат;

- (+) - положительный результат.

Данные свидетельствуют, что "Сэндвич" вариант ТФ ИФА позволяет обнаруживать ВЧП в пробах из секретов глаз и слюны экспериментально зараженных животных в первые сутки появления клинических признаков, которые выражались лишь слабой светобоязнью. По мере развития признаков болезни, титр вируса в пробах возрастал и в момент ярко выраженных клинических признаков составил 1:1250-1:31250. Эти данные свидетельствуют о том, что разработанный "Сэндвич" вариант ТФ ИФА может быть использован для обнаружения ВЧП в выделениях больного животного в начальной стадии болезни, т.е. для ранней, прижизненной диагностики.

Результаты исследований экспертизных материалов свидетельствуют, что разработанные методы ТФ ИФА, ГХ ИФА и МФА позволяют обнаруживать антигены ВЧП в пробах органов павших животных и дифференцировать их от гетерологичных возбудителей болезней

Сыворотки крови пушных зверей разных видов, вакцинированных против чумы (более 100 проб), исследовали в РН и ИТФ ИФА. При сравнении полученных данных установили совпадение результатов двух реакций.

Таким образом, в результате проведенных исследований решены поставленные задачи и достигнута цель - разработаны средства и методы позволяющие проводить раннюю, прижизненную диагностику чумы плотоядных. На основе разработанных "Сэндвич" варианта ТФ ИФА и варианта ИТФ ИФА сконструирован "Набор препаратов по выявлению специфических антигенов и антител при чуме плотоядных твердофазным иммуноферментным анализом", который успешно прошел внутриинститутские комиссионные испытания. НТД на вышеназванный "Набор ..." утверждена директором института.

ВЫВОДЫ

1. Адаптирован вакцинный ВЧП шт "ВНИИВВиМ-88" к культуре клеток ПС, в которой он накапливается в титрах 4,5-5,0 1% ЦЩЫмл, На основе адаптированного штамма и культуры клеток ПС получены специфические культуральные антигены ВЧП:

- культуральный антиген ВЧП из культуральной вируссодержащей жидкости с активностью в ТФ ИФА 1:250-1:1250, пригодный для применения в варианте ИТФ ИФА при определении в сыворотках крови специфических к ВЧП антител;

- универсальный культуральный антиген ВЧП из лизата клеток с активностью в РДП 1:8, в ТФ ИФА 1:6250, пригодный для использования в лабораторной диагностике ЧП.

2. Установлено, что лучшими продуцентами специфических диагностических сывороток крови при ЧП являются естественно восприимчивые к болезни животные, в частности тхорзофретки.

3. Разработан "Сэндвич" вариант ТФ ИФА. Метод позволяет обнаруживать ВЧП в выделениях больного животного в начальной стадии болезни, т.е. проводить раннюю, прижизненную диагностику болезни, а также выявлять антигены ВЧП в пробах органов павших животных и в культуральных вирусеодержащих материалах.

4. Отработаны прямой вариант ГХ ИФА и прямой вариант МФА. Методы позволяют обнаруживать ВЧП в пробах органов павших животных и в зараженных культурах клеток.

5. Разработан метод ИТФ ИФА. Метод позволяет обнаруживать антитела к ВЧП в сыворотках крови вакцинированных, больных и переболевших животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕПЛОЖЕНИЯ

1. На основе вакцинного штамма "ВНИИВВиМ-88" вируса ЧП, адаптированного к росту на культуре клеток ПС, получены специфические культуральные антигены ВЧП, пригодные для использования в лабораторной диагностике болезни,

2. Разработан и предложен для применения в диагностических исследованиях "Набор препаратов по выявлению специфических антигенов и антител при чуме плотоядных твердофазным иммуноферментным анализом". НТД на данный "Набор ..." утверждена директором ВНИИВВиМ.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дибиров Ш.С., Карпов Г.М., Вишняков И.Ф.

"Получение сывороток свиней против вируса чумы плотоядных и их использование в диагностике данной болезни". //Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. Материалы научно-практической конференции "КЧС - неотложные проблемы науки и практики". ВНИИВВиМ. Покров, 1995 г, с. 155.

2. Дибиров Ш.С., Вишняков И.Ф., Бабкин М.В.

"Получение культурального антигена вируса чумы плотоядных". Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых. 1-2 апреля. Харьков 1997 г, с. 23,

3. Дибиров Ш.С., Вишняков И.Ф.

"Универсальный диагностический набор при чуме плотоядных". //Тезисы докладов IV Национального конгресса "Человек и лекарство", 8-12 апреля. М., 1997 г, с. 193

4. Дибиров Ш.С., Вишняков И.Ф., Карпов Г.М.

"Получение специфической к вирусу чумы плотоядных сыворотки с целью изготовления диагностических препаратов". //Тезисы докладов IV Национального конгресса "Человек и лекарство", 8-12 апреля. М., 1997 г, с. 193