Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка и усовершенствование лабораторных методов диагностики лихорадки ку животных

РГ8 ОД

9 П Н^П 1935

На оравах рукописи

ЮСЛ10В руста! РАСЫХОШЧ

РАЗРАБОТКА И УСОНЕРШЕНСТЯШНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ЛИХОРАДКИ КУ 2ИВ0ТНЫХ

16.00.03 - "Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, мйкологвя и иммунология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Казань - 1995

Работа выполнена на кафедре биохимии Казанской государственной академии ветеринарной медицины им.Н.Э.Баумана и лаборатории иммунологии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института (г.Казань).

Научный руководитель:

- лауреат Государственной премии СССР, заслуженный деятель

науки РТ и РФ, доктор ветеринарных наук, профессор

Хазипов Н.Э.

Официальные оппоненты:

- доктор ветеринарных наук, профессор Госманов Р.Г.

- доктор ыедицинрких наук Лоздеев O.K.

Ведущая организация - Всероссийский нау iuo-исследователь-сксй институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко.

Защита состоится // декабря 1995 г. в " /3 " часов на заседании диссертационного совета Д-120.22.01 в Казанской государственной академии ветеринарной медицины им.Н.Э.Баумана (420074, Казань, академия ветеринарной медицины).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанской государственной академии ветеринарной медицины им.Н.Э.Баумана.

Автореферат разослан <1 1996 г.

Ученый секретарь . диссертационного совета, доцвнт -

Чеботарев В.Е.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

I.I. Актуальность темы. Лихорадка Ку од!и из опасных болезной животных_ и людей, продолжает оставаться важной проблемой ве--------------

теринарии и медицины. Её значение становится очевидным, если учесть наличие массивных природных очагов инфекции, включающих практически всех млекопитающих, птиц, многие виды клещей, образование вторичных антропургических очагов, стойкость возбудителя к факторам внешней среды, разнообразия путей передачи, а также высокую чувствительность к ко:;сиелл8м ненкмуншис лодей я животных (Н.И.Федорова, 1968; К.И.Лобан, 1974; А.Б.Дайтер а др., 1978; А.И.Коршун и др., 1983; Р.Г.Госманов и др., 1984, 1985; Р.Х.Юсу-нов, 1387; Р.И.Ситдинов, 1989; и.а.тартсевич Я Др., IODO).

У сельскохозяйственных животных болезнь протекает энзоотически, преимущественно бессимптомно с накоплением специфических антител в крови и аллергизэцввй организма (Р.Г.Госманов и др., Р.Х.Юсупов, 1987; Р.И.Ситдиков в др., 1989). Инфекция может протекать остро и хронически; острый процесс продолжается 2 месяца и заканчивается выздоровлением. Хроническая же патология длятся долго, вплоть до 2 лет, часто клинически напоминая бруцеллез.

По данным Р.Г.Госманова, P.X.Юсупова (1988, 1989) подтверждением диагноза болезни явмотся выделение коксиелл Бернота из крови, мочи или мокроты, что возможно лишь после заражения этими материалами морских свинок и белых мишей от больных животных. Одного ото осуществимо лть в специализированных лабораториях.

В связи о большими трудностями распознавания лихорадки Ку по клиническому симлтомскокшлексу правильный диагноз может быть установлен лишь с учетом эпидемиологических, клинических и лабораторных данных (Б.П.Богомолов и др., I960; К.Д.Демидов, 1981; И.В.Тарасевач и др., 1988; Р.Г.Госманов 0 др., 1989). Однако лабораторные методы (РА, РДСК и бвопроба) в той юга иной степени обладают различными недостатками. Так, баодогичэокая проба требует продолжительного времени наблвдепия за подопытными азвотнныа - до 12-24 суток, постановка РДСК дает положительные результаты только при наличии определенной концентра дни антител в сыворотке крови подозрительных в заражении животных.

В последнее время для ускоренной лабораторной диагнезтйки инфекционных болезней вивотных весьма успешно разрабатывается

метод иммуноферментного анализа (ИфА), основанный на использовании антител и антигенов, меченных ферментом (И.Ф.Вишняков и др., 1983; Н.З.Хазипов и др., 1983; Г.Х.Ияьясова и др., 1983, 1995; Н.А.Хисматуллина и др., 1985; Г.Ф.Коромычлов и др., 1985; Л.К. Эрнст и др., 1989; Р.X.Юсупов и др., 1989, 1995; В.А.Мищенко и др., 1995; E^vj// etat. , 197 Voller ¿1 dl. , 1978 и др.). К его преимуществам относят высокую чувствительность, простоту постановки реакции, воспроизводимость, возможность обследования больших количеств проб в предельно короткие сроки. В специальной литературе имеется, в частности, сообщения по применению ишуноп^роксидазной реакции для обнаружения антигена возбудителя лихорадки Ку в органах больных лвдей (И.В.Тарасевич и др., 1988; Н.К.Токаревич и др., 1989). Однако к началу наших исследовании этот метод в ветеринарии не разрабатывался для обнаружения возбудителя лихорадки Ку и специфических к нему антител. В плане усовершенствования методов диагностики лихорадки Ку, как показывают единичные сообщения, перспективным является ЫФА - метод флуоресцирующих антител (Е.Ковачевз, 1989; Р.И.Ситдиков и др., 19Ь9). Таким образом, дальнейшее усовершенствование и изыскание аффективных методов диагностики лихорадки Ку по-йрежнему остается очень важной задачей практики здравоохранения а ветеринарной медицины.

1.2. Цель й задачи исследований. Основная цель исследований - дать научно-практическое обоснование эффективности применения метода ИМ и МФА дяя ускоренной диагностики лихорадки Ку и титрования специфических антител в сыворотке крови зараженных животных.

В связи с этим били поставлены следующие задача:

1. Разработать твердофазный метод ИФА и МФА для выявления антигена возбудителя лихорадки Ку, изучить эффективность их в сравнении с оиопробой на мышах, РДСК и установить возможность их применения,

2. Разработать непрямой вариант твердофазного метода ИФА для титрования антител к возбудителю лихорадки Ку, изучить эффективность, его в сравнении с РДСК, установить возможность его применения.

3. Изучить некоторые иммунобиологические свойства возбудителя лихорадки Ку (патогенность в отношении овец, антигенность в ИФА и РДСК после очистки).

4. Разрзоотать проекты наставлений по применению иммунофер-

мвнтяого анализа й метода флуореснируоздх зктател дг.я дзборгзторной диагностики лихорадки Ку жявотннх.

___________1.3. Еяервис в ветеринарной практике----------

раиработан способ мзготовяеякя кммупс-фермонтннх коиъвгатов для ИФЛ с исподьзоьаиаем Еккукоглсбуязг'ов кролвкоз к возбудителе ли-хорсдки Ку с сохранением зктивнеотв ^ермгцтв, вноской опедафв-ческой активности иммупоглобулвна, оптвизлшл отношением фермента н иммуноглобулина в конызгате. Показана высокая чувствителъ-ьость прямого вэреянта ЛФА о асиользояангек годучошюго коньета-?з, для диагностики лихорадка Ку по обиаружи^ю возбудителя з патологическом материале. Разработан непрямой вариант ИФА для выявления специфических антител при ляхородж Ку .«явотянх. Шсрвне ус;аииьлена возможность использования для сепсйбздязации шганшет специфического антигена возбудителя лихорадка Ку I фазы, полученного нами по методике Р.Г.Госманова в др. (1984) для РДСК. Получен глобулин флуоресцирующий для выявления возбудителя лихорадки Ку методом флуоресцирующих антитез в мазквх-отпечатках из органов бальных яивотных. Новизна полученных результатов подтварзданн рационализаторскими предложениями # 10 в & 12.

1.4, Прщтвчесрад.щтооть_тйртц._ Но оонзвапва эксяоргыся-тальных исследований получены специфические якмунофсрнаннша конъюгат я гшушлиобулан флуоресцирующий, позволяйте ссответат-2Ышо с помощью ИФА и М'М выявлять антиген возбудителя лтаорздкя Ку в течение 2-5 часов в 93-Г СО.? случаях. Ш оскодавви вримэнеивя антигена для РДСК разработан метод иммунофериепткого анализа для выявления специфических антвтол в сыворотка крови баташх в ранние сроки по сравнении РДСК. Составлены Времешге наставления по их применению.

1.5. Апробация результатов исследований. Ооцовныз результаты работ доложены на:

- научной конференции студентов в преподавателей Вузов ТАССР (г.Казань, 1991);

- Республиканской нэучно-провзводо¥венной копферендзя (г.Казань, 1991, 1992, 1994);

- научной конференции Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусология и микробиологии (г.Шжроэ, 1992); ,

- Всероссийской науч'до-прокзводственноЗ яонфаренцдв "Гигиена,

эетсанитария н экология животноводства" (г.Чебоксары, 1994); - заседаниях Ученых Советов КШ (1991-1994 гг.).

1.6. Публикация результате.) исследований. По теме диссертации опубликовано 7 статей и 2 рационализаторских предложения.

1.7. Внедрение результатов исследований. Результаты проведенных исследований внедрены в лаборатории иммунологии BlfflKi (г.Казань) в используются при диагностических исследованиях на лихорадку Ку с.-х.животных и изготовлении соответствующих диагностических наборов.

1.8. Основные положения, вынесенные на защиту;

1.8.1. Научно-практическое и экспериментальное обоснование возможности применения ИСА и МФА в качестве ускоренных методов диагностики лихорадки Ку животных по обнаружении возбудителя и специфических к нему антител.

1.8.2. Результаты отработки оптимальных условий приготовления основных компонентов И<М и МФА и определения режимов их применения.

1.8.3. Разработка наставлений по применению №А и МФА для ускоренной лабораторной диагностики лихорадки Ку животных,

1.9. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Материала диссертации иллюстрированы 8 фотографиями, 2 схемами и 12 таблицам". Список литературы включает 216 источников (145 отечественных ь 71 зарубежных авторов).

2..СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы. В опытах использовали два штамма возбудителя лихорадки Ку - штамм "Грата" (референтный) и штамм "Барабинский" (эпизоотический). Дня поддержания и опытов штвмы "Грата" из П фазы перевел» в фазу I со методике Р.Г.Госмалова я Р.Х.Юсупова (1984) путем пассаже через оршшзм белых мышей. Всего проведено 8 последовательных пассажей на 32 белых мышах. Опыты осуществляли с участием кандидатов наук Н. А.Хисматулляной и Э.А.Курбановой. Штамм "Барабинский" выделен ироф.Р.Г.Госмановым (1984) вз организма больной лихорадкой Ку коровы в эпизоотическом очаге и находится в I фазе.

Для изучения некоторых показателей патогенеза заболевания в спит бшга сняты 12 голов оаец и виру-даные штагдл; "Грята" и "БарэЗлчсггяй". С ккздш штамм « зепзвяеля по 4 яавогкшс, -/рл атом -— двум овцэм возбудитель~г.водяли"в!^трибршйнно, двум - ПНутрИВеК-но в виде риккетсаосодержаще£ суспензия с юйоног. Селит. 5шшей и дозе 10 ил. Контрольном ивцпм (•* гол.) соответственно тауттавеч-ко н виутрзбршшпо вводили суопензка селезенки вптвктамх мпшей также в объеме 10 мл. 3- животными вели ?;л одическое кзбдадскве, ежедневно изкерявд температуру тело, для ог зде^°ная форкогшчх зломевтоп :гоозь брэлз через I, 3, 7, 1л 15, 20 и 30-й до,.ь после зьргхеаая. При постановке РДСК и разработке етдмунсфермектпого анализа использовали кнактивг'ровавн?^ рнт?гг°н из птзглсв "Грига" л . "Багабаисгай", илгогоаленного по методяте Р. ".Гссмгь-оз?, по^а и др. (138»). Приготовлено 5 серзй антягв" нслользогеш" селезеики ГЗ ^елых мышей.

Специфические гипериммушше счворотяз получали на кролта.с в овцах по схемам, рззрзоояшаш Н. Лисша. лявной и Э.А.Курбаш-вой. Аь/игеном для иммунизации служил возбудвтми лдасородкв Ку, штаммы "Грата и "Барабинсява". Ввделенпе иммуногх 1уликов аз си-вороток крови иммунизированных и' зотпых осуществляв путам осее-дения нясшдекнм.! таствотк^г сульфата »мог 'я, поаиэткдшган4.о*ем (ПЭГ) м 6000, хроматографией на колонке о ДОАЭ - дэл-юдозоЕ и гель-Филь~рзцией на сефздоксэ 6' -200 по цзпеотЕШ методикам.

Ппро:гсидаз1Ш'' конъюгаты г^'соевлй перлодзтшм жзтойпм. npe.Tt.o-ЕСННШ бакане (1974), в моднфэкзщш П.М.Гаври.«озэй и др.(1979). Использовали лксокоочигеннув пероксидазу из ярода (Н1Ь "Бис .ар" Республика Латвия).

Постановка метода ИФА зущестллшш ¿а чикроллашпетзз: с Эб-а луягамв вз „олистирола УпЬго СИ'; Соок М;сго*, $рг в отечественных - производственного объединения НОТ медицинской техники, ' :есетэ; "Медполгшр", Ленинград. ' ■

И<М разрабатывала в двух направлениях: для щявления актвге-на возбудителя лихорадки Ку и обнпуяенв^ антител. При рямом сандБпч-варианте ИФА щ тк няли спап^фгтеский к возбудителю лихорадки Ку ш „эоксг.изннй коныэгат, при нзпрямгч - а'ш'цтело дпзгно-стическзе прет гг. Г*Ч кролика ■ иечешше верогсеядазоц эпидемиологии и мпкробаологии т.'Н.<г.Гзкадез АМН СССР). Результата реакций учитывала виг"ально и спектрометрии ч :а сри длиы вгпнн

492 ны в 45U км, используя сканирующий спектрофотометр " hteti¿K m.iüt¡sk.ün Ч фирмы uf¡owkborito*a. Положительными считали пробы, значение оптической плотности которых в 2 и более раз превышало таково? отрицате' ъных контролем (коэффициент специфичности Коп).

В сери», опытов по разработке катода ИФА для обнаружения антигена возбудителя лихорадки Ку исследовали органы и '.кани белых мышей U4Q гол.), морских свинок U5 гол.) в овец (7 гол.), экспериментально зараяенных u'-акпми "Грита" и "Барабинский". Исследовали так* _р. 1ны 7 морских свинок, иммунизированных инактиви-роваиньм антигеном возбудителя лихорадки Ку (штамм "Грита"), а также интвктннх мышей морских свинок и овец (в качестве контроля).

Л опытах по обнаружению специфических антител непрямым методом ИФА ис ледовали 106 проб сывороток крови, в том числе овец (66), морск. .с сванок (20) и белш. мышей (20), экспериментально отраженных возбудителем лихорадки К„ в условия" лаборатории иммунологии ЕНИШ, 124 пробы сывороток крова коров учебно-опытного хоз. Лства "В"; 423 про.ы сыворотки крови овец из разлвЧ1шх хозяйств РФ. Одновременно все г оба сывороток на наличие специфических антител исследовала в РДЗК по методике Р.Г.Госаанова и др.VÍ985).

Метод флуоресцирующих ггител (ЫФА) ^яя обнаружения специфического антигена разрабатывался наш о учетом описания Р. И. . итдакова в Р.Х.Юсупова (1989). В качества специфических антитез и«, лользпш.'ч глобулины кролика, иммунизированного возбудителем лихорадки Ку. Имму1. глооулины метили с ФИТЦ по общепринятой методике. В опыта использовали проб» органгч овец (7 гол.), морских свинок (15) я белых мышей (200 гот.), экспериментально зараженных возбудителем Л1^орадки Ку (штаммы "Грита" и "Барабинский").

Данные опытов подвергали о^тистаческой обработке на прог-рамгчрупци.. микрокалькулятора типа "Электроника" МК-56 (Р.Х. Тукшаитов и др., 198ч).,

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Лучение юг. зичьоких и некоторых имщ юбвологическг^ показателей у овец, зажженных возбудителем лихорадки Ку.

Результаты вссчедований показали, что на 3-5 су! .си после введения возбудителя лихорадщ. Ну внутрибршинно в внутривенно отмечено повышена температуры тела у аиптных до +40,9-42°С.

В последующие дни чаблвдалось снижение температуры тэлв. Очередные рецидивы лихорадки отмечет на 21-4.J и 47-55 дни после зарз-веная. "оказано, что в период лодкчмв температуры тела ь^бавдала полный или частичный отказ яйвотных от корма, угнетенное состояние, малоподвижность и понос, у двух боль—ас овец отеечали серозные н катаральный риниты, конъюнктивиты, синганс^ть слиэисчх оболочек ротовой 1. носовой полостей. Одноврег^шю выявлены сдвиги в покпзател х белой ..рови. Оки характеризовались умеренным сражением количества лейкоцитов на 5-7 день л увеличением на 1520 сутки опыта.

При вскрытии убитых гивотннх на 30-8 день после зарагения (2 гол.) обнаруживали несг^цяфиче^тао ттзтолэгогтптсмячесппе менгния в лимфатических узлох и селезенке.

Т&ким образом, результаты клинических ш лшогоанэтомичеи-ких исследсла-ий подтвердили сведен! 1 о том, что у зараяонных животных болезнь протекает бессимгг-омно, вяло, что затрудняет диагностику только на основании эти: данных.

2.2.2. Результаты разработки иммуяоферментче -о ака»азя (ИФА) для выявления антигена возбудителя лихорадки Ку в саганах и тканях экспериментально зараженных I лвотных.

Для определения антигена возбудителя лихорадки Ку в исследуемых пробах использовали принцип прямого метода ИФ,..

Извес гно, что высокая чувствительность в сн«1гфичность метода И4БА зависит от ведущих фаг-оров: качества (специфичность и активность) конъюгата, его рабочей дозы, концентрации иммуноглобулина гчя сенсибилизапи носителя, рГ£ комплексиругацего буф-ра, техники проведения лита, стабильности коньюгат , субстрата и т.д. (Б.Б.Дзантвев, 1979; 0./..Пантелеев ь ¿р., 1987; Н.А.Хйилз-тую.лна, 19&8 и др.).

Резулттаты исследован** показали, Что в качества специфических иммуноглобулинов для изготовления конъвгатов I >гу.'служить гвнериымушше сыворотки крови кроликов. Установлено, что чем выше специфическая активность иммупс тюбулваа в РДОК. тем дг-ъ активность коньегатов в У. Л. Показано, ч о титр иммуноглобулина должен сос1-,влят1> в РДОК не менее 1:^20.

¡качество конъюгата, кречо того, завысило от опти. зль«ого соотношения фермента и иммуноглобулина. Для перокейдазного кои**п ■ та оно составляет а лу молекулу порокеида. к на одну молеку у иммуноглобулина. К.зффицйент связывания долген быть около 1,5

< Üäkäne Kixvoi А. , 1978).

"эзультаты i шкх опытов показах !, что конъюгаты с коэффицаен-том связывания, равным 0,45...0,6 - высокоактивны, а шшо 0,4 были непригодна к работе.

Установлено, что наибольшс 1 активности (1:1600) обладает коиьюгат. приготовленный на основе иммуноглобулина класса & , ..ыделеш")го из сыворотки методом хроматографии на колонке с ДЗАЭ-г глдшозной (Кен = 17,8+21). ßuconyja активность (1:800) проявляли tdk2ö конъюгаты из ишуноглобу-инов, полученных вз сыворотки методом Г"ль фильтрации на сефздексе G -200 (Ксы = 17,64+0,19) и осакдоние.-л насыщенным раствором сульфата аммония (Ken = 9,76+ 0,15).

А. ли из иру я р^зультаи исследований по оптимизации постановки прямого сэадвич-варианта ИФА для выявления антиге а возбудителя дчхор_дии Ку, следует подчеркнуть, что наиболее приемлемой является сенсибилизация планшетов Icj в течение 18 ч при +4°С в концерта гош 16 ыкг/мл. Оптимальной является инкубация исследуемого антигена п кс.легата в течение I ч при +37°С.

Изучение стабильности T(j , иммобилизованного на иммунологическим планшете, показано, что T<j сохраняет свою активность в течение 6 месяцев (срок кайдвдения) при +4°С. Применение заранее сенсвбшшзврованнгга ЛГ<] планшета сокращало время получения ответа до 3-4 ч без потери чувствительности метола.

Установлено, что разработанный прямой сэндвич-вариант Шк позволяй- обнаружить апт ¡ген возбудителя лихорадки Ку в органах (селезенка, лимфатические узлы, печень) белых ыьг.зй, морских свинок и овец, экспериментально заракзщшх указанным возбудителем. При этом специфический антиген ЕШгвлен во всех исследованных öjh ганзх,- независимо с ■ вида вивотных м втэйма возбудителя, использованного прг заракешш. Наличие возбудителя подтверждали исследования ьшзк-в-отпечг-ков ызтидом П. Ф.Здрздовского ч др. (1972).

Приведены наследования по опавни^ельной оценке прямого варианта IM и РДСК пра выявлении антигена в селезенке 40 мышей, зпрвЕепяых во"5удвтелем „ихорадни Ii? (штеш "Грит; "). Исследования покозрии, что прямоЧ катод IШ позволяет выявлять антиген возбудители! во воех пробах, в то время как комплемент"вязыважде антигены l 8 пробах на бнлв об.лруаены. Исходя вз вал оконного, Homo заключить, .fo разработанные нами вярианты прямого метода

v могут битт использованы для обнаружения антигена возбудителя юрадкя Ку в пробах, в которых "алпчие его не удается выявись 5ДСК.-----------------------------------------------------------------

На основании пг-оведешшх исследований наш с orne гно с Н.А. зматуллиной и Э.А.Курбановой разработано "Временное наставление применении набора компонентой дум выявления : чтигена возбудите-лихорадки iíy в патматериале истодом ¡чмуноферментного рчэлесэ 1-ЛГ.

2. _. 3. Результаты разработки непрямого варианте Ifc'A 1ения специфических антител при лихорадке Ку животных.

При разработке нырямого варианта ИФА для титроЕэийя епегр-lecKüx антител при сенсибилизации шинше ов исп яьзоввли антиген i РДСК, пригг-овленннй нами из I 'Ъаэц возбудителя лихорадки Ку гейм "Барабинскай") по методике Р.Г.Госманова и др. (1984).

Подбор условий иммобилизации антиге"ч осуществляй ' /тем из-<епия рН греды, температура и времени инкубации. Вдияние заряда pepa на иммобилизации антигога изучали при диапазоне рН 7,2... ,0, используя 0,01 M фосфатный и карбонатно-бикарбонатный буфер-з растворы. Данные исследования показали, что максим?'чьное свя-зппио антигена возбудителя лихорадки Ку (штамм "Т>:рабипскзйи), юлягтиролом отмечается при условии, когда рН буферного рэство-равен 9,6. Сдвиг этого показателя в ту пли другую сторону пришло к уменьшению адсорбционной способности антигена в лупки задета. Нопи дашше согласуют я а результатами onuîud Н.А.Хисма-злышй (1980) при бешенстве с.-х.хивоттк.

Значительное влияние пв иммобилизацию лтигена возбудителя сорадкя Ку (штамм "Барабинский"), в лукяв полвстяраловых лланше-1 оказывала продолжительность ее экспозиции (1...18ч). Наивысшее зчение коэффициента специф !чности било получено при иммоб.лаза-s антигена в течение 3 ч при 37°С. Это срок и. был крутят за оп~ дальний дрч проведения непрямого ИФА при выявлении специфических зозбудвтелю лихорадки Ку антитез.

Изучение степени адсорбции антигешз возбудител :• лихорадки Ку з содеряэнии его 15, 30, 60 и LJ0 мкг/ил пра собладении устано^-шых Emue опти/яльных условий показало, что. маг игжяьноя величи-коэффицаент^ специфичности отмечается при адсорбь,Л! антигена в щ.нтрагии 60 юг/га. Дальнейшее уменьшение má увеличение его щентращш приводило к снягению специфичности реякцча.

л^лее результаты исследований показали, что оптимальным срок инкуба: зи специфических антите" с иммобилизовинным антигеном явля ется 2 ч гри Чри этом достигается максимальная чувствитело

' ность реакции (титр антител ч ИФА составил 1:100000 при Ксп1= 2,44^0,014; Ксп2= 2,37+0,015). В более короткий срок инкубации па нога связывания антигена с сыворотками не происходило, а увеличен ее продолжительности не только удлиняло время постановки ¿.¿акции, но к способствовало появлении фонового окрашивания (титр антител при 6-часовйй инкубаци" антиген-антитело составил в ИФА 1:50000 п Нсп1 = 2,221.0,013; Ксп2 = 2,25+0,016).

Специфичность, активность и эффективность разработанного вар анта ИФА была доказан« при исследовании 106 проб сывороток крови овец, кроликов и белых мышей, зараженных возбудите~ем лихорадки К (штаммы "Грита" и "Барабинский") или иммунизированных пробив ; таза иного возбудителя. Установлено, что в ИФА специфические антител выявлены во всех случаях. Следует отметить, что существует опреде ленная коррелятивная связь между г г ром специфических антител, вы являемых в ?ДСК и показателя?"1 ИФА. Так, сыворотки крови зараженн в иммунизированных ко..сиедл ш Бернета (штаммы "Барабинский", "Гр Та") овец, кроликов и белых мышей, с.титром компяементсвязывающих антител в пределах 1:10 - 1:20, в №А дали положительные результа ты соответствег 'о в разведении 1:800 и т:3200. По мере увеличения отитра комплементсвязывапцих антител, возрастал и титр антител, вы являемых в ИФА.

Следует отметить, что в ИФА были исследованы 8 проб сывоюто крови зъ¿еженных подопытных животных, в которых с помощью РДСК не были обнаружены специфические комплементсвязывапцие антитела. При атом убе,г 'тельно показано наличие специфических антител к возбуди тело лихорадки Ку в титре ^:400.

Далее с применением ИФА о РДСК были исследованы 124 пробы сы вороток крови крупного рогатого скота, принадлежащих Учебно опытн му хозяйству Казанской государственной акаде :ии ветеринарной меди даны вм.Н.¿.Баумана. При иоихедовании всех проб сывороток, как № так и РДСК дали отрицательные результаты, т.е. в этих пробах отсу отвовали специфические антитела к возбудителю лихорадки Ку. Анало гичные отрищ-же^ыше результаты получены при Нефедовании 423 про сывороток крови овец, принадлежащим двум племенным хозяйствам Саратовской области, экспортируемых за границу. По результатам серо логических исследований в ИФА в РДСК дана рекомендация о возмог-

сти экспортировать этих ливотных, яак спбодных от лихорадки Разработало "Временное наставление по применении непрямого рианта ИФЛ для обкаружг :вя спе;.:фическзх антител к возбудитед! хорадкй Ку аивотних".

2.2.4. Результ гы изучения возможности применение Н^А для нарушения возбудителя лихорадки Ку в гчганах и тканях яивотнцх.

Исследования пказал'', что окрашенные спец»)фическви фкуорес-руицнм глобулином препар гы из органов и тканей яивотны.., экспе-ментально зараженных возбудителем лихора^чи Ку, имели яркую зе-но-зелтую пли отчетливо выраженную зелено-гелтую лгаи-есценцив темном серъ-зеленом поле. В кочтрольнъх отрицательных препара-х подобного свечения не било. Установлено, что антиген ко онелл рпетз обнаруживается у с-ец через 7 дней посла поражения в мэз~ х-отпечатках из лимфатических уз., jb (глубокопаховие, брыжеечные, юдостзнные, няяечелюстные), селезенки и печени. На 14-й день ¡следования, кромв перечисленных органе-, вн-иген выявился в чпочечниках и повысилась интенсивность свечения препаратов из ;чени. При исследовпии с пс .ощыо МФА проб органов морских сванок 5 гол.) положительные результаты лолучен» во все:, случаях (100$). мазках-отпечатках из селезенки белых мышей положительные резул:,-гч получены в 9Ь случаях из 100 (штамм "Барабинский") и в 97 ./чаях из 100 (штамм "Грита").

Таким образом, анализ показывает, что разработанный нами ве-шнт МФА с применением специфического меченного ФИТИ вммуноглобу-ша, обеспечивает вышление аьтвгеш. возбудвтеля лихор дка Ку, ¡зависимо от штаммовой характер..ствкв, в пробах внутренних оргь-5B, полученных от сраженных животных. Для апробации данного мато-s в у ловиях практических лабораторий разработано 'Временное нападение по применении глобулина флуоресцирующего для диагчости-1 лихорадки Ку» аивотных". в

2.2.5. Результат» очистки кокоиелл LepHeTa в градиенте плот-зет и сахарозы.

Метода, очистки риккетсий, по да^шм специальной литературы, згут быть различными (О.А.Ковонсза в др., "ГЭД9; В.А.Яблонская, 389).

Мы предщ няли очистку коксие^хы Бернета методг ч дифференци-ш'^го центрифугировагия в градиенте плотности сахарозы. Пр.. этом ^спензии тканей селезенки, содер ащие возбудителя лихорадки Ку,

осьадоли при 16000 об/мин в течение 40 мин. Осадок ресуспензирова ли в физиологическом расворе, рН 7,0-7,2 в первоначальном объеме Суспензию частично очищенных р.жкетсий наслаивали на 30%-ную ьаха. розу и це.1трачугирс-лли при 20000 об/мин в течение 6и минут. Осад! дважды промывали 0,85;£-ным .из"аяогичесхим раствором, рН 7,0-7,2, затем наслаивали на ступенчатый градиент плотности сахарозы 60$, 45а, ЗС£-ной концентрации (соответственно,1,296 г/мл; 1,216 г/ыл; 1,133 г/мл) и пвторно центрифугировали пра 20000 об/мин в течени< 60 минут. Полосы на границах плотностей отмывали дважды 0,85^-кым Физиологическим раствором, рН 7,2-7,4 с последупцим центрифугкровг нием при 18000 об/мин в течение 40 минут.

Процесс очистки контролировали взятием на капом ее этапе прс "ля иссльдования на наличие -озбудителя лихорадки Ку, определения антигенноств в РДСК и ИФА, а также количества белки. Степень очисч ки оценивали соотношением антигг ной активности возбудителя лихорадки ^ с концентрацией белка в сочетании о микроскопией мазков-отпечатков.

Исходный материал имел концентрацию белка 30 иг/мл, а активность в ИФа 1:512 (Ксп>2,1), фракция в плотк сти сахарозы - 1,135 г/ыл; белка - 0,23 мг/мл, активность в ИФА - 1:2048; осадок материала в плотности сахарозы - 1,296 г/мл; белка - 12,8 мг/мл в ак-т"зность в ИФА - 1:512; фракция в плотности сахарозы - 1,216 г/мл, соответственно, д,2 кг/мл и 1:512 (Ксп> 2,1).

Высокий титр внтигена в ИФА (1:2048, Ксп>2,1), РДСК (1:32), положительная микрокартина в мазках-отпечатках, а также малое коли чество белка (0,28 мг/мл) во фракции плотности сахарозы 1,133 г/мл указывает на высокую степень ее чистоты. По сраг :ению с исходным селезеночным материалом эта фракция очищена в 428 раз, что дает возможность непосредственного изучения возбудителя лихорадки Ку.

3. ВЫВОДЫ

1. Впервые в ветеринарии представлено научно-практическое и экспериме. гадьное обоснование эффективности ИФА и МФА для ускоренной лабораторной диагностики лихорадке Ку животных путем обнаружения возбудителя — специфических к нему антител.

2. Сэцдгчч ^вариант тверд-фазного ИФА высоко- увствителен и позволяет в более короткие сроки (3-7 ч) по сравнению с биогробой в РДСК выявлять антиген возбудителя лихорадки Ку во всех случаях в

гологаческом материале от экспериментально зараженных животных зцы, морские свинки й белые иыяш). Показано совпадение резуль-сов ИФА с данными биопробы на белых ыншах в 100£ случаев.

3. Метод флуоресцирующих антител о применением предлагаемо-наыи коныигата позволяет в течение 2-3 часов обнэруа^ть воэбу-геля лихорадки Ку в мазках-отнечатках из внутренних органов затаенных животных в 95-1(Х$ случаев.

4.Разработанный непрямой вариант ИФА обеспечивает обнаружо-

} специфических антител в сыворотке кровв различных видов жявот-[, зараженных возбудителей или иммунизированных против лихорадка

5. Шервые установлена возможность использования специфичес-то антигена возоудителя лихорадки Ку I фазы для Р1£1' при рззра-:ка непрямого ИФА, обеспечивающего выявление специфических знти-I при лихорадке Ку.

6. Рекомендуется лабораторный регламент очистки коксиелл Берга от балластных белков с использованием метода ультра центрифу-эованяя на градиенте плотности сахарозы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Па основании результатов собственных исследований разработа-и утверждены в ¿995 г- директором ШИШ:

- временное наставление по применению глобулина фя^оресцирую-го для диагностики лихорадки Ку животных;

- Временное наставление по применению набора компонентов для тения антигена возбудителя лихорадки Ку в патматериале методом ¿уноферментного анализа (ИФА);

- Временное наставление по применению набора компонентов для тления специфических антител к возбудители лихорадки Ку методом (уноферментного анализа (ИФА).

Рационализаторские предложения:

- "Способ получения диагностических сывороток при лехорадке •Л 10 от 10.10.94 г.;

- "Способ ускоренной диагностики лихорадки Ку животных методом «уноферментного анализа" * 12 от 10.10.94 г.

Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Юсупов P.P. К вопросу лабораторной диагностики лихорадки Ку животных методом имыуноферментного анализа // Достижения Каза1 ской ветеринарной школы в практику производства: Тез.докл.Респ. каучно-производств.конф. - Казань, 1991. - С.II.

2. Юсупов P.P. Экспериментальное заражение овец штаммом "Ба-рабинсквй" Еозбудвтеля лвхорэдкв Ку // Актуальные вопросы ветеринарии и зоотехнии: Тез.докл.Респубд.научно-производ.конф. - Kasai 1992. - С.56.

3. Хисматудяина H.A., Курбанова Э.А., Юсупов P.P. Иммунофер-житный метод в диагностике лихорадки Ку // Тр. ин-та / Взерос.на-учно-нсследов.ин-т вет.вирусологии в микробиол. / Вопросы ветери-нариой вирусология, микробиологии и эпизоотологии. - Покров, 199;

- 4 П. - С.274-275.

4. Юсупов P.P., Хисматуллина H.A., Курбанова Э.А. Очистка коксведл Бернета в градиенте плотности сахарозы // Материалы на-учно-произв.конф.по проблемам ветеринарии и животноводства: Мат. научно-цровзв.конф. - Казань, 1994. - С.13-14.

5. Юсупов P.P., ХвсматуллЕнз H.A. Диагностика лихорадки Ку методом ИФА // Материалы научно-производ.конф.по проблемам ветер] парии и животноводства: Мат.научно-произв.конф. - Казань, 1994.

- С.34,

6. Езулов P.P., Хвсмэтуллвна H.A. К вопросу диагностики лих! радки Ку методом ИФА // Гигиена, ветсанитария и экология животноводства» Мат.Всерос.научно-производ.конф. - Чебоксары, 1994. - С 498.

7. Хисматуллина H.A., Курбанова Э.А., Юсупов P.P. Обнаружен антител к коксиеллэм Бернета методом иммуноферментного анализа/ Тр. ин-та / Казанская гос.академия ветеринарной медицины / Вопрос: инфекционной патологии животных. - Казань, 1994. - С.32-35.