Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ СЕЛЕКТИВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE

О?- Ъ¥ъг$

На правах рукописи

КЛРЛБЛИОВЛ ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ СЕЛЕКТИВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АСТШОВАСИХШ РЬЕ1ЖОР№1ШОМАЕ

Специальность 16.00.03 - Ветеринарная микроб пол опт,

вирусология, эпизоотология, микология с м н кого кеч I ко л огней н иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

МОСКВА 2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии Московского государствен кого университета прикладной биотехнологии.

Научный руководитель: - доктор ветеринарных наук, профессор

Д.И. Скородумоп

Официальные оппоненты: - доктор ветеринарных наук

Н.Т. Татарнике» (МГУПБ)

- доктор ветеринарных наук Л.Д. Демидова (ВНШ1ВСГЭ)

Ёедущзп оргаштция - Всероссийский научпо-исследователмжин институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ).

Зашита диссертации состоится «2?» 200 ^г. в « 1% часов

на заседании Диссертационного совета Д 212.149,03 при Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу: 109316, Москва, ул. Талалихина, д.ЗЗ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ,

Автореферат разослан « ¿£> 200?г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук

I И.Р.

тарных наук

Смирнова 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди респираторных инфекций свиней широко распространены болезни, вызываемые представителя ми семейства Pas-teurellaceae, В пределах данного семейства, наряду с P.muhockh, значительную роль в инфекционной патологии свинен играет Actinobacillus pleuropneumonias - возбудитель актинобациллезной пневмонии свиней (М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, 19S6; Л.Я. Романова, В.Ф. Финснко, 1987; М.А. Сидоров, Ш.М. Мнцаев Д.И. Скородумов, 1989; F, Toui], R. Higgins, 1988; J. Hommer, E.M. Kamp, W.L.A. Lioeffen et.ai,, 1999).

В основе борьбы с любой инфекционной болезнью лежит эффективная диагностика. Методы серодиагностики актинобациллезноп пневмонии свиней (РСК, РА, им мун о ф ерментн ыи метод) большинство авторов рассматривают как групповые, полезные преимущественно при оценке эпизоотической ситуации в хозяйстве. Основным методом лабораторной диагностики актинобацпллезноЙ пневмонии свиней остается бактериологическое исследование (М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, Н.И, Лаврентьев, 19S1; Л.Я, Романова, В.Ф. Фнненко, 1987; A. Gunmrson, 1979; K.R. Mittal, R. Higgins, 1984; R. Nielsen, 1988).

При острых вспышках болезни и исследовании свежих легочных поражений изоляция культуры возбудителя не представляет особой сложности. Труднее выделить A. pleuropneumoniae из старых пневмонических очагов и особенно из миндалик, носовой и трахеобронхиальной слизи из-за сильного загрязнения материала сопутствующей микрофлорой. Многие аспекты экологии A. pleuropneumoniae недостаточно ясны, их изучение требует исследования материалов, содержащих значительное количество бактериальных коптаминантов (М.А. Сидоров, Д.И, Скородумов, 1978; М.Ф, Мильков J9S7; F. Castryck,-!9S4-; Т. Gram, 1996; U. Hinrichs, V.F, Ohlinder, S. Pesh et. al., 1999). Таким образом, для повышения эффективности бактериологической диагностики актннобацпллезноЙ пневмонии свиней и изучения экологии возбудителя необходимо применение питательных сред с селективными свойствами. В зарубежной литературе имеются единичные сообщения о попытках конструирования м использования питательных сред подобного типа (К.A. Gilbride, 1983; MJ. Jacob sen, 1995),

Отечественные бактериологи целенаправленных исследований в данном направлении не проводили. В связи с изложенным, мы поставили перед собой задачу по конструированию и испытанию селективных питательных сред для культивирования A.pteuropneumoniae.

Цель н задачи исследования. Разработать жидкую среду обогащения (накопительную) и плотную селективную среду для диагностического культивирования A. pleuropneumoniae.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

ЦНв МСХА Фона, ня^чиой лтч^уггу;*»'

fi?.

- оптимизировать состав жидкой и плотной питательных, сред для диагностического культивирования А. рЬигорпеитотае, с использованием в качестве основы доступных отечественных коммерческих питательных сред;

- определить качественный состав и оптимальное количественное соотношение противомикробных веществ в селективных питательных средам для культнвирования А. р]еигорпеитотае;

- провести оценку разработанных селективных питательных сред по основным параметрам, характеризующим рост А. р1еигорпеитотае, и селективным свойствам;

- испытать сконструированные селективные питательные среды для выявления А, ркигорпеитошае в животных тканях.

Научная новизна. Научно обоснованы:

- оптимальный состав жидкой и плотной питательных сред для диагностического культивирования А, р1еигорпеитотае с использованием в качестве основы доступных отечественных коммерческих микробиологических сред;

- качественный состав и оптимальное количественное соотношение противомикробных веществ в селективных жидких и плотных питательных средах для А. ркигорпеитошае;

- использование жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред в схеме бактериологического исследования на актино-бациллезную пневмонню свиней.

Практическая ценность работы. Разработаны жидкая накопительная и плотная селективная питательные среды для культнвирования А. ркигорпеитошае.

Определена целесообразность использования сконструированных селективных питательных сред для выделения А. ркигорпеитошае из материала, контамшироваиного сопутствующей микрофлорой.

Предложена схема бактериологического исследования на актииобациллезную пневмонию свиней, предусматривающая применение жидкой и плотной селективных питательных сред.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: межкафедральном заседании сотрудников ветеринарно-санитаркого факультета МГУПБ (2003) и Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, (2003).

Публикации. Материалы диссертации отражены в четырех опубликованных печатных работах.

Основные положения, выносимые на защиту: • Состав оптимизированных жидкой и плотной питательных сред для диагностического культивирования А. ркигорпеитошае.

• Состав жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред для A. pleuropneumonias.

• Схема бактериологического исследования на актинобацил лезную пневмонию свиней с использованием жидкой и плотной селективных питательных сред.

Объем it структура диссертации. Диссертационная работа наложена на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, выводов и списка литературы, содержащего 166 библиографических ссылок, в том числе иностранных 85, Работа иллюстрирована 19 таблицами и 26 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

Работа выполнена в период с 2000 по 2003 гг. на кафедре микробио-- логин и иммунологии Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Материал для бактериологического исследования брали от убойных евнней на Таганском мясокомбинате н ЗАО ((Кузнецовекий свинокомплекс», а также от павших п убитых с диагностической целью животных из хозяйств, неблагополучных по респираторным болезням свиней (АОЗТ «Комплекс» Череповецкий район Вологодской области; СПК «Кущее-скнй», Краснодарский кран)- Всего бактер! гол о п 14 ее кому исследованию подвергнут материал от 42 свиней, в том числе от 19 клинически здоровых н 23 с явлениями пневмонии,

В опытах использовали референтные штаммы A. pleuropneumonias ССМ 5869, ССМ 5870, ССМ 5871, М 62, К 17, К 98; штаммы из музеев бактериальных культур кафедр микробиологии и иммунологии МГУПБ и МГАВМнБ: B.subtilis, S, aureus NCTC 8530, S.epidermidis AFCC 14990, S. typhimurium № 415; coli 02; P. multocida P19 (серовар D), а также С, albicans.

При конструировании питательных сред применял«: питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой (НПО «Питательные среды», г. Махачкала); агар для культивирования микроорганизмов, сухой (ГРМ-агар, МНПД ГИП г. Оболенск); питательный агар сухой АСД (Ставропольский НИИ вакцин и сывороток, г. Ставрополь); МПА; питательный бульон для культивирования микроорганизмов, сухой (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), бульон на переваре Хоттиигера с содержанием 120 мг/% а минн о го азота; МПБ,

В качестве добавочных ростовых н антитоксических компонентов питательных сред использовалп дрожжевой экстракт, глюкозу, стерильную сыворотку крови крупного рогатого скота (ООО «Биолог», Санкт-Петербург).

В качестве селективных факторов применяли: кристалвиолет (фабрика химреактнвов, г. Львов); раствор бриллиантового зеленого 1%-й (ОАО «Московская фармацевтическая фабрика»); Амфотернцин В (АКО «Синтез», г. Курган); Bacitracin, В - 5150; Tylosin, РА 9503; Cloxacillin sodium Ю6Н0826; Nistatin (Sigma chemical CO). Для определения чувствительности A. pleuropneumonias к антибиотикам использовали также стандартные бумажные диски с 27 антибиотиками.

Чувствительность A. pieuropneumoniae к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с применением стандартных бумажных дисков и методом серийных разведений в жидких питательных средах (М.Д. Биргер, 1973). Ингибирующее действие красителей выявляли методом предельных разведений. Общее количество бактериальных клеток устанавливали при помощи стандарта мутности ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича и нефеломет-рически. Количество жизнеспособных бактериальных клеток определяли методом посева серийных десятикратных разведений исследуемой взвеси бактерий на поверхность плотной питательной среды, а также методом предельных разведений в жидкой питательной среде с вычислением концентрации микробных клеток методом наиболее вероятных чисел (КС. Егоров, 1986).

Выбор оптимального соотношения исследуемых компонентов в составе базовых н селективных питательных сред осуществляли согласно методу В.В. Бирюкова (1968).

Оценку качества сконструированных питательных сред проводили по следующим показателям: чувствительность питательной среды; скорость роста, период генерации; выход бактериальных клеток на 1 мл среды; селективные свойства среды; сохранение стабильности биологических свойств культивируемого микроорганизма (Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям, 1980).

При исследовании материалов от свиней выделены и идентифицированы на уровне рода или вида 156 культур бактерий.

На первоначальном этапе идентификации, после установления формы клетки и окраски по Граму, использовали идентификационные схемы P.J. Quinn и соавт. (1994), В случае необходимости у бактерий, отнесенных к определенному роду или группе родов, изучали дополнительные ферментативные характеристики с использованием рутинных тестов, а также пластик биохимических для днфференциадин энтеробактерий (ПБДЭ) производства Нижегородского ШШЭМ.

Зависимость бактерий от НАД определяли в тесте "сателлитного" роста на сывороточном питательном агаре. Полученный цифровой материал обрабатывали, используя общепринятые методы математической статистик» (И.П Ашмарин, A.A. Воробьев, 1962; Н.С. Ростова, 1977).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Сравнительная оценка ростовых свойств общеупотребительных коммерческих жидких н плотных питательных сред

На первом этапе исследований провели сравнительную оценку доступных для диагностических лаборатории коммерческих плотных и жидких питательных сред с целью выбора наиболее оптимальных, как основы для конструирования селективных питательных сред. О ростовых свойствах испытанных питательных сред судили по выходу бактериальных клеток A.pleuropneumoniae на 1 мл среды. Результаты исследований показали, что в испытанных жидких питательных средах накопление клеток в 1 мл сред через 20 ч инкубирования колебалось в пределах 8,86 — 9,12, в плотных - 9,17 -9,27 (log). Исходя из представленных результатов, в качестве базовых питательных сред, как доступных и достаточно эффективных, для дальнейшей работы взяли питательный бульон и питательный агар производства НПО «Питательные среды» г. Махачкала.

Конструирование оптимальном жидки и пптателыюи среды для A. pleuropneumoniae

Исследовали влияние на рост A. pleuropneumonias в базовой питательной среде добавочных компонентов: дрожжевого экстракта, сыворотки крови крупного рогатого скота, глюкозы. В качестве показателя выхода процесса использовали накопление общего количества бактериальных клеток в 1 мл питательной среды через 20 ч инкубирования при 37-38 °С. Для каждого единичного фактора предварительно определяли «лимитирующую», «стационарную» и «интнбирующую» области, путем варьирования его содержания в среде на фоне постоянного уровня остальных факторов. На рис. 1 приведены результаты испытания различных концентраций глюкозы. Аналогичным образом исследовали влияние на рост A.pleuropneumoniae дрожжевого экстракта и сыворотки крови.

На следующем этапе определяли эффект совместного влияния дрожжевого экстракта, сыворотки крови и глюкозы на величину урожая микробных клеток.

aïs

Рис. 1. Влияние концентрации глюкозы в жидкой питательной среде на рост A. pleuropuiuiuoniae

Схемы планирования эксперимента для трех факторов на трех уровнях представлены в табл. I н 2. Анализ полученных данных показывает, что наибольший выход бактериальных клеток на 1 мл среды (1,3х!09) был получен в питательной среде № 4, где компоненты находились на втором уровне. Увеличение пли уменьшение содержания компонентов дает отрицательный эффект. В соответствии с полученными результатами для А. pieu гор neumoniae в данной питательной среде оптимальное содержание дрожжевого экстракта и сыворотки крови крупного рогатого скота составляет 3,5% (объем/объем), глюкозы - 0,2% (вес/объем).

Таблица 1

Схема планирования эксперимента для трек факторов на трех уровнях и накопление микробных клеток A.plcuropneuinoniae в ! мл жидкой питательной среды

№ варианта Дрожжевой Сыворотка Глкжоза, "А М.кЛ|л,

питательной среды экстракт, % КРС, % 1 х 10*

1 5,5 1,5 0.1 0,8

2 1,5 5,5 0,2 1,0

3 1,5 3,5 0,3 0,95

4 3,5 3,5 0,2 1,3

5 3,5 1,5 0,3 <ш

б 3.5 5,5 0,1 1,2

7 5,5 5,5 0,3 1,0

S 5,5 3.5 0,1 1,1

9 5,5 1,5 0,2 0,95

Таблица 2

Влияние различных концентраций компонентов питательной среды на накопление общего количества клеток А. ркигорпеипютае

Компоненты Содержание компонентов питательной среды

питательных сред на различных уровнях

1 уровень II уровень ¡11 уровень

Дрожжевой экстракт, % 13 15

эффект -0,07 0,07 0.02

Сыворотка КРС, % 1.5 15 15

эффект ■0,18 0,13 0,08

Глюком, % 0.1 ш аз

эффект 0,04 0,09 -0,11

Конструирование жидкой накопительно л питательной среды для А, р1еигорненп1отае

После оптимизации состава жидкой питательной среды исследовали чувствительность А. р1еигорпешпошае к некоторым антибиотикам и красителям с целью отбора веществ, не оказывающих существенного лнгнбн-рующего действия на рост А. р I еигорпеи топ 1 ае.

Для качественной оценки действия антибиотиков на рост А. рки-горпеитотае использовали метод диффузии в агар с применением стандартных бумажных дисков (27 антибиотиков различных групп). Из красителей были испытаны кристален о лет и бриллиантовый зеленый.

Результаты исследования показали целесообразность дальнейшего испытания лшкомишша, кпоксацнллнна, тилозина, амфотерицина В, нистатина, бацитрацнна и крпсталвиолета. У этих антибиотиков и красителей была определена МПК, Результаты определения МПК антибиотиков представлены в табл. 3.

Таблица 3

МПК антибиотиков для А. р1еигорпеитошае (п =6)

№ Лннкоми- Бацитра- Тнлознн Клокса- Амфо- Нистатин

в/п Ц11Н Д11Н <0,9-250 ЦПЛЛИН теряшшВ (3,5-30

(13-122 (9,7-625 мкг/мл) (4,5-143 (1,2-19,5 мкг/мл)

мкг/мл} М1;г/мл> МКГ/МЯ) мкг/мл)

1 53 > 312.5 31,2 18 > 19,5 > 30

2 26 > 312.5 62,5 20.1 > 19.5 > 30

3 26 > 312.5 62,5 17.25 > 19,5 > 30

4 13 > 312.5 31,5 28.7 > 19,5 > 30

5 13 > 312.5 31,2 18 > 19,5 > 30

6 26 > 312.5 62,5 17,25 > 19,5 > 30

X 26,1 > 312.5 46,55 19,К > 19,5 > 30

Принимая во внимание, помимо ингибирующих свойств, спектр биологического действия, стоимость антибиотиков, удобство их растворения, для дальнейших испытаний взялн бацитращш, тнлознн, амфотерицин В и кристалвиолет.

Результаты оптимизации количественного соотношения указанных ингибиторов в жидкой питательной среде представлены в табл. 4 и 5. В качестве базовой жидкой питательной среды использовали среду с оптимизированным составом добавочных компонентов.

Из табл. 4 видно, что максимально близкий к контролю показатель выхода процесса наблюдали в среде №8; сходный с ним показатель - в среде № 1. Однако расчет эффектов (табл. 5) свидетельствует об оптимальности только компонентного состава среды №8 (кристалвиолет в разведении 1:1 ООО ООО; бацитрашш - 220 мкг/мл; тнлозин - 1 мкг/мл; амфотерицин В - 5 мкг/мл).

Таблица 4

Схема планирования эксперимента для четырех факторов на четырех уровнях н накопление микробных клеток в 1 мл жидко» накопительной пнтателыюн среды

№ варианта питательной среды Кристалвиолет (разведения, г/мл) Бацитрацнн, мкг/мл Тнлознн, мкг/мл Амфотери-инн В, мкг/мл М.к./мл 1 х 10*

1 1 1200 000 55 1 20 1

2 1 1200 000 ПО 1* 5 0,73

3 1 1200 000 165 16 15 0,59

4 1 1200 000 220 й 10 0.69

5 1 1000 ООО ПО 6 20 0,9

6 1 1000 000 55 16 10 0,55

7 1 1000 000 165 11 15 0,59

8 1 1000 000 220 1 5 1.06

9 1 :КОО ООО 165 11 10 0,54

10 1 :800 000 220 1 15 0,89

П 1 :Щ) 000 55 6 5 0,78

12 1 :800 000 110 16 20 0,44

13 1 :600 000 220 16 5 0,27

14 1 :6(Ю 000 165 6 20 0,37

15 1 :600 000 110 1 10 0,42

16 I :600 000 55 11 15 0,30

17 ■ ■ - - 1.1 контроль

Таблица 5

Влияние различных концентраций ингибиторов на накопление общего количества клеток A. pleuvopneumoniae

Компоненты питатель- Содержание компонентов питательной

нон среды средь« на различных уровнях

I уровень 11 уровень 111 уровень (V уровень

Кристалшголет. г/мл эффект 1:1200 ООО 0,12 1:1000 000 0.15 1 :КОО 000 0,03 1:600000 -0,29

RàiiHTpaunH, мкг/ыл 55 110 165 220

эффект 1 f о |о -0.01 -0,10 0.10

Тнлозин. мкт/м.ч эффект 1 0,21 6 0,05 11 -0,09 16 -0,17

Амфотсринин В. мкг/мл эффект 5 O.OS 10 -0,08 5 -0,04 20 0,05

Сравнительна!! оценка ростовых свойств оптимальней жидкой и накопительной питательных сред

На данном этапе работы провели сравнительную оценку разработанных жидкой накопительной и базовой оптимальной питательных сред.

При культивировании на каждой из питательных сред определяли следующие параметры роста A. pleuropneumoniae: продолжительность лаг - фазы и экспоненциального роста, время генерации, чувствительность питательной среды. Также исследовали частоту диссоциации Л. pleiiropiieumoniae на этих средах.

На рис. 2 представлены графики, выражающие зависимость количества колониеобразуюших единиц (КОЕ) от времени культивирования в базовой и накопительной питательных средах.

1,3

1 2 3 4 5 6 7 6 9 101112131415161718192021222324

t, час

['по. 2. Крив.!« ростj A. pleurojHieuoioime на оптимальной н сс.кжтнвпол жидких питательных ср?д

При росте в оптимальной питательной среде лаг-фаза составляла два часа, экспоненциальная фаза занимала 7 ч, время генерации равнялось 1,01 ч. При развитии популяции на накопительной питательной среде отмечаются те же закономерности, но продолжительность лаг-фазы в фед-нем увеличивалась до трех часов, время генерации равнялось 1,35 ч; КОЕ достигает своего максимума на 1—2 ч позднее, чем на оптимальной среде.

Но, несмотря на некоторое отставание в росте во времени, количество колон не образующих единиц на накопительной питательной среде в итоге достигает почти того же количества, что и на оптимальной питательной среде.

Чувствительность жидких оптимальной и накопительной питательных сред выясняли путем определения количества микробных клеток в одной и той же взвеси бактерий методом наиболее вероятных чисел (НВЧ) прн посеве на эти среды. Чувствительность накопительной среды была на 13,4% меньше оптимальной, что для многих накопительных сред с выраженным» селективными свойствами обычное явление.

Для изучения влияния ингибиторов жидкой накопительной питательной среды на частоту диссоциации A.pleuropneumoniae сопоставляли этот показатель при культивировании на жидких оптимальной и накопительной питательных средах. На оптимальной и накопительной питательных средах данный показатель в зависимости от штамма соответственно составил 2,2 % и 2,6 %, т.е. частота диссоциации A.pleuropneumoniae на сравниваемых средах существенно не отличалась.

Конструирование оптимальной плотной питательной среды для А. pleuropneninoniat*

В качестве базовой среды использовали питательный агар производства НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) на основе панкреатического гидролизата панциря криля. Прн выборе оптимальных соотношений в составе питательной среды дрожжевого экстракта, сыворотки крови крупного рогатого скота и глюкозы испытывали те же концентрации добавок, которые брали для жидкой питательной среды. Посевы инкубировали 20 ч при 37-38 °С.

Схема планирования опыта и полученные результаты представлены в табл. 6 и 7. По результатам данного исследования видно, что наибольшее накопление бактериальных клеток получено на средах № б и № 8. Однако оценка эффектов показала, что наивысшие их значения соответствуют содержанию в питательной среде дрожжевого экстракта и сыворотки крови на III уровне (5,5 %), а глюкозы на 1 уровне (0,1 %). Исходя из полученных результатов дополнительно была испытана питательная среда состава: глюкоза - 0,1 сыворотка крови и дрожжевой экстракт - 5,5 %. Плотная питательная среда данного состава обеспечила выход микробных

клеток в расчете на 1 мл среды выше, чем в питательных средах вариантов № 6 и № 8 - 1 ,85х109м.к./мл.

Таблица б

Схема планирования эксперимента для трех факторов на трех уровнях и выход бактериальных клеток А. р1сигорпеитрошае на 1 мл оптимальной плотной питательной среды

№ варианта питательной среды Дрожжевой экстракт, % Сыворотка КРС, % Глюкоза, % М.к./мл 1 х 10*

1 1,5 1.5 0,1 0,95

2 1,5 5.5 0.2 1Л

1,5 3,5 0,3 0,9

4 3,5 5,5 0,2 1,5

5 3,5 1,5 0,3 1.0

6 3,5 5,5 0,1 1,83

1 5,5 5,5 0,3 1,5

% 5,5 3,5 0,1 1,83

9 5.5 1,5 0,2 1,74

Таблица 7

Влияние различных концентраций компонентов питательной среды на накопление общего количества клеток A. pleu го pneumoniae

Содержание компонентов питательной

Компоненты питательных сред среды на разпичных уровнях

I уровень II уровень III уровень

Дрожжевом экстракт, % LS 1Â 15

эффект -0,33 0,062 0.3

Сыворотка. % L5 15 5.5

эффект -0,16 0,03 0,53

Глюкст. % од 0,2 ÇL3

эффект 0,16 009 -0,25

Конструирование плотной селективной питательной среды

В качестве базовой использовали оптимизированную плотную питательную среду. За основу был взят качественный состав н базовые уровни ингибиторов, использованные прн конструировании жидкой накопительной питательной среды. Результаты исследований представлены в табл. 8 и 9.

Как видно, оптимальное соотношение антибактериальных веществ соответствует варианту среды №8, содержащей 220 мкг/мл бацитрацина; 1 мкг/мл тилозина; 5 мкг/мл амфотеркцнна В и кристалвнолета в разведении 1:1 ООО ООО. Среда данного состава в наименьшей степени ингнбирует рост А.р1еигорпеитогизе,

Таблица 8

Схем» опыта н результаты оптимизации количества антибактериальных веществ в плотном селективной питательной среде

Антибактериальные вещества

№ варианта питательной среды Крнсталвиолет разведения, г/мл Баш пра- цчн, мкг/мл Тндозпн, мкг/мл Амфотерицпн В, мкг/мл Накопление микробных клеток в расчете на 1 мл питательной среды 1х.104м.кЛш

1 1:1200 ООО 55 1 20 1,72

2 1:1200 000 ПО И 5 1,08

1:1200 ООО 165 16 15 0,74

4 1:1200 000 220 6 10 1Д

5 1:1000 000 ПО 6 20 1,15

6 1:1000 000 55 16 10 0,72

7 1:1000 000 165 П 15 0,83

8 1:1000 000 220 1 5 1,74

9 1:800000 165 11 10 0,7

10 1:800 000 220 1 15 1,55

И 1:800 ООО 55 6 5 1,03

12 1:800000 110 16 20 0,63

¡3 1:600 000 220 16 5 0,33

14 1:600 ООО 165 6 20 0,47

15 1:600000 110 1 10 0,45

16 1:600000 55 11 15 0,32

!7 - - - - 1,75(сонтр.)

Таблица 9

Влияние различных концентраций селективных факторов плотной питательно» среды на накопление общего количества клеток Л. р1еигорпеитошае

Компоненты Содержание компонентов питательных сред

питательных на различных уровнях

сред

I уровень II уровень III уровень IV уровень

Кристалвиолет 1:1200001) 1:1000 000 1:800 000 1:600 000

эффект 0,25 0,2 0,07 -0,51

Башггоацин 55 110 165 220

эффект 0,04 -0,08 -0,23 0,27

Т1 [ЛОЗИН 1 6 11 16

эффект 0,46 0,03 -0,18 -0.3

Амфотетжшш В 5 10 15 20

эффект ОД 4 -0,17 -0,05 0,03

Сравнительна» оценка ростовых свойств оптимальной н селективной плотных питательных сред

Учитывали скорость роста А.р1еигорпе«тотае, выход бактериальных клеток на 1 мл среды, чувствительность питательной среды и ее влияние на биологические свойства возбудителя.

Результаты исследований показали, что на оптимальной плотной среде макроскопически видимый рост возбудителя появляется через 6,5 -7,0 ч, на селективной - через 7,5 - 8,0 ч.

Выход бактериальной массы на оптимальной среде составил 1,8x109 м.к./мл, на селективной - 1,75х№9 м.к./мл. Плотная селективная среда незначительно уступает оптимальной по чувствительности.

С целью изучения возможности сочетанного применения жидкой накопительной и плотной селективной питательных сред провели последовательные пассажи культур А,р!еигорпеитошае (3 штамма) на жидкой и плотной селективных средах, а также на аналогичных средах без ингибиторов. Па плотной селективной питательной среде через 20 - 24 ч инкубирования определяли в популяции процент колоний с признакам» диссоциации н ферментативную активность субкультур, отвитых из Б-колоний.

Результаты опытов показали, что процент колоний с признаками диссоциации составил 4,8 % после пассажей на оптимальных питательных средах, на селективных — 5,1 %. Таким образом, последовательное культивирование А.р1ешорпеитотае на селективных средах обоих типов не приводило к существенному увеличению частоты диссоциации.

Ферментативная активность культур в результате последовательного пассажирования через жидкую и плотную селективные питательные среды не изменилась.

Были проведены исследования по приданию плотной селективной среде дифференциально-дна гностических свойств в результате добавления в нее мочевины и индикатора фенолрота. Установлено, что включение в состав среды 10 мл 20%-ного раствора мочевины и 0,6 мл 0,2%-ного раствора фенолрота (на 100 мл среды) позволяет выявить колонии A.plenropneumoniae через 20 ч инкубирования за счет экстрацеллюлярного выделения фермента уреазы (среда вокруг колонии розовеет).

Изучение селективных свойств сконструированных жидкой и плотной питательных сред

На следующем этапе исследовали селективные свойства сконструированных жидкой и плотной питательных сред.

Для изучения селективных свойств жидкой среды сравнивали ее чувствительность с чувствительностью оптимальной жидкой питательной среды без ингибиторов для следующих бактерий: P. m и Кос ¡da; S. typhi-murium; Е. coli; В. subtilis; S, aureus. Чувствительность среды определяли посевом одной и той же культуры с вычислением количества КОЕ методом НВЧ. Количество микробных клеток конкретного вида бактерий в исходной культуре, определенное посевом в оптимальную среду, принимали за 100 %. Исходя из данного показателя, выражали в процентах содержание этого же вида бактерий в исходной культуре, установленное посевом в среду с ингибиторами. Культуру С.albicans высевали только на селективные среды.

Анализ полученных данных показал, что жидкая накопительная среда практически полностью ингибпрует рост грамположительных бактерий (рис. 3) к дрожжеподобного гриба. В меньшей степени выражены селективные свойства по отношению к грамотрицательным бактериям из семейства энтеробактерип и существенны по отношению к P.multicida.

Количество м.к. в 1 ил исходной культуры бактерий, %

100 ео so

40 20 о

■-irv'i;1

f

му

□оптимальная питательная среда Шглекгнлна* питательная среда

тип питательной среды

Рис. 3. Количество клеток ^аигси$ ь исходной культуре, определенное посевом в жидкую селективную питательную среду

Определяли ннгибнрующие свойства селективной плотной питательной среды по отношению к грам отрицательным (P.multocida, S.typhinaurium, E.coli) и грам положительным (B.subtílis, S.aureus) бактериям. Использовали те же штаммы, что и в предшествующем опыте. Выявлены аналогичные закономерности: полностью ингибирует рост бацилл, стафилококков и C.albicans, значительно угнетает рост P.multocida и в небольшой степени подавляет рост S.typhimurium и E.coli.

На следующем этапе исследовали селективные свойства сконструированной жидкой питательной среды путем культивирования в ней А. pleuropneumonias в смешанной культуре с другими видами бактерии.

С указанной целью штаммы A. pleuropneumonias засевали в виде чистой культуры и в сочетании с В, subtilis, S. aureus, P. muJtocida, E. coti, S.typhimurium в жидкую оптимальную и накопительную питательные среды. В процессе культивирования, через 6, 8, 10, 12, 24 и 4S ч производили подсчет КОЕ A. pleuropneumoniae в чистых и смешанных культурах. Результаты некоторых опытов представлены на рис. 4 и 5.

КОЕ/мл ^pleuropneumonias (1*10*)

1

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 о

Время культивирования, ч

Fue. 4. Влияние S.aureus на рост A.pleuropneiinioime ß жидкой оптимальной питательной среде

Результаты опытов показали, что испытанные гетерологичные виды бактерий в смешанных культурах на оптимальных жидких питательных средах тормозят рост A.pleuropneumoniae.

(1

10

12 24

4Я

□ КОЕечистой

культуре В КОЕ в смешанной культура_

КОЕ/мл A.pteuropneumoníaе {1x10*1

1,2 1

О,В 0,6 0,4 0.2 0

m

ÍLJ

ь

□ КОЕв чистой

культуре QKOE в смешанной культуре

10 12 24 43

Время культивирования, ч

Рис. 5. Влияние S.aureus на рост А. р leu гор neu пюп be в жидкой илк'опнтельнон питательной срезе

Использование жидкой накопительной питательной среды позволяет практически полностью избежать антагонистического влияния грамполо-жптельных бактерий. Для минимизации отрицательного влияния на рост А,ркигорпеипющае грамотрицательных бактерий (Е.со1), ЗлурЫтипит, Р,ти11оас1а), высев из жидкой накопительной среды на плотную, по нашему мнению, целесообразно проводить через 7 - 8 ч инкубирования, т.е. в конце фазы логарифмического роста.

Результаты испытания сконструированных селективных питательных сред для выделения А.р1еигорпеипюшае из животных тканей

С целью изучения влияния на рост А. р1еигорпештюшае бактерий, наиболее часто обнаруживаемых в верхних дыхательных путях, мы подвергли бактериологическому исследованию миндалины 19 клинически здоровых убойных свиней. По одной схеме исследования тканевый го-могенат инкубировали в теченине 8-9 ч в жидкой питательной среде без ингибиторов и затем рассевали на аналогичную плотную питательную сред)'. По второй схеме материал последовательно культивировали на жидкой н плотной селективных питательных средах. Результаты исследований представлены в табл. 10.

Как видно, в миндалинах убойных свиней обнаруживаются с различной частотой представители 14 родов бактерий. При использовании жидкой накопительной н плотной селективной питательных сред полностью подавляется рост грамположительной микрофлоры, увеличивается частота изоляцниактинобацилл.

1S

Таблица 10

Результаты бактериологического исследования миндалин убойных

свиней (п= 19)

Схема посева материала и количество выделенных

культур бактерий

Род или С ывороточно-лрожжевой Накопительная жидкая пита-

вид бактерии бульон, высев на плотную тельная среда, высев ¡га

оптимальную с эеду плотную селективную среду

Абс, % Абс. %

Micrococcus sp. 3 15,7 - -

Staphylococcus sp. 19 100 - -

Streptococcus sp. 16 U2 - -

а- в р-гемолптич.

Bacillus sp. 3 15.7 - -

Corynebacterium sp. 6 31,6 - -

E.rl)usiopathiae 1 5,3 - -

E.coli 6 31,6 6 31,6

Actinobacillus sp. 3 15,7 5 26,3

Haemophilus sp. 1 5,3 0 -

Bordetella sp. 1 5,3 2 10,5

Klebsiella sp. 2 10,5 2 10,5

Enterobacter sp. 1 5,3 ] 5,3

Neisseria sp. 2 10,5 2 10,5

Pasteurella sp. 2 10,5 1 5,3

Для исследования характера действия микрофлоры естественных микробноцинозов миндалин на рост A.pleuropneumoniae тканевый гомоге-нат миндалин от пяти животных с наиболее типичной микрофлорой (Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Corynebacterium sp., Actinobacillus sp., Pasteurelia sp., E.coli) искусственно кйнтаминировали A.pleuropneumoniae. Затем такой материал вносили в жидхие селективную и неселективную питательные среды, инкубировали 7 ч и высевали из накопительной среды на плотную селективную, а из обычной жидкой среды на плотную среду без ингибиторов, Из 5 проб, посеянных на оптимальные среды без ингибиторов, A.pleuropnetimoniae выделили в 20 % случаев, из тех же проб на селективных питательных средах A.pleuropneumoniae выделили в 100 % случаев.

Как видно, бактериальная микрофлора миндалин при культивировании на оптимальных питательных средах без селективных факторов, существенно подавляет рост возбудителя, и при заведомом наличии в материале A.pleuropneumoniae рензолировать культуру удается не всегда. Таким образом, применение селективных питательных сред значительно увеличивает вероятность выделения А. pleuropneumoniae из материала, контамини-ровакного сопутствующей микрофлорой.

На следующем этапе испытывали разработанные селективные питательные среды для выделения А. р1еигорпеитогиае из материала от свиней, больных пневмонией (п=23). Результаты этих исследований приведены в табл. 11. Как видно, максимальное количество культур А. р1еигорпеипютае было изолировано из различных материалов по схеме исследования с посевом в накопительную жидкую питательную среду и последующим высевом через 7-8 ч инкубирования на плотную селективную среду. При исследовании миндалин и бронхиальной слизи частота изоляции А.ркигорпешиотае в этом случае увеличивается в 1,8 раза.

Таблица 11

Результаты бактериологического исследования материалов

от свиней с поражениями легких

Характер исследуемого материала Кол-во проб Схема бактериологического исследования и количество выделенных культур А.ркигорпеитошае

КроняноЙ агар с "кормилкой" Плотная селективная среда Жидкая накопительная питательная среда с последующим высевом на плотную селективную среду

Схема I Схема II Схема III

Аос, % Абс, % Абс, %

Пораженная легочная ткань 23 8 34,8 8 34,8 10 43,5

Бронхиальная СЛИЗЬ 23 5 21,7 6 26,1 9 39,1

Миндалины 11 4 36,4 5 45,5 8 72,7

Всего 57 17 29,8 19 33,3 27 47,4

Полученные результаты позволяют рекомендовать для выделения А.р1еигорпещнотае из коитаминированного посторонней микрофлорой материала сконструированные нами жидкую накопительную н плотную селективную питательные среды по схеме, приведенной ниже.

Исследуемый Посев в жидкую 11н куб про- Высей на плотную

материал накопительную ванне 7-8 ч —■ селективную

питательную среду при 37-38 "С среду

Изучение

Инкубирование Отоор колоний Микроскопа- Определение прочих фер-20-24 ч при ~ уреазопозитлвных ческое пссле- НАД-дависи- =эментативиых 37-38 "С бактерий дованпе мости характеристик

Рис. 6. Схема бактериологического исследования ко нтамн ни ро ванного материала для выделения А.р1счг<>рпеитотае с применением селективных питательных сред

выводы

1. Наиболее пригодны в качестве основы при конструировании селективных питательных сред для культивнрования А. р1еигорпеишоп1ае, из числа испытанных отечественных коммерческих сред, питательный бульон на основе панкреатического гидролнзата кильки и питательный агар на основе панкреатического гидролнзата панциря криля производства НПО «Питательные среды», г. Махачкала.

2. Результаты исследования показали, что оптимальное содержание добавочных ростовых компонентов в базовом питательном бульоне следующее: дрожжевой экстракт VI сыворотка крови крупного рогатого скота - 3,5 % (объем/объем), глюкоза - 0,2 % (вес/объем); в питательном агаре дрожжевой экстракт и сыворотка крови крупного рогатого скота - 5,5 % (объем/объем), глюкоза - 0,1 % (вес/объем).

3. В качестве ингибиторов посторонней микрофлоры в жидкие и плотные селективные питательные среды для А. р1еигорпеитопЬе следует добавлять бацнтрацин {220 мкг/мл), тилозин (1 мкг/мл), амфотерицин В (5 мкг/мл), кристалвиолет (1:1 ООО ООО),

4. Для придания плотной селективной среде дифференциально-диагностических свойств в нее целесообразно вносить мочевину (10 мл 20 %-ного раствора) и фенолрот (0,6 мл 0,2 %-ного раствора), что позволяет дифференцировать колонии А.ркигорпешпошае от уреазонегативных бактерии.

5. Разработанные селективные питательные среды целесообразно использовать для выделения А.р1еигорпеитогиае по следующей схеме: посев исследуемого материала в накопительную питательную среду, инкубирование 7-8 ч при 37-38 °С, высев смешанной культуры на плотную селективную среду, инкубирование 20-24 ч, отбор колоний уреазопозэтивных бактерий с последующим изучением свойств отвитых культур по стереотипной схеме.

6. Сконструированные селективные питательные среды при исследовании контаминированного посторонней микрофлорой материала (миндалины, бронхиальная слизь) позволяют увеличить частоту изоляции А.р1еигорпеитошае в 1,8 раза.

СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКИМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработаны и используются в учебном процессе:

1. Методы лабораторной диагностики пастереллеза и актинобацил-лезной пневмонии свиней: Методические указания к лабораторным занятиям для студентов специальности 310800 - Ветеринария. М.: МГУПБ, 2003.

2. Бактериологическая диагностика актшгобациллезнон пневмонии свиней с применением селективных питательных сред: Методические указания к самостоятельной работе для студентов специальности 31ÛSOO -Ветеринария. (Рассмотрены и одобрены на заседании Ученого совета ве-терннарно-санитарного факультета МГУПБ от 24 декабря 2003 г., протокол № 3).

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Для выделения A.pleuropneumoniae из котаминированного посторонней микрофлорой материала рекомендуем применять разработанные накопительную и плотную селективные питательные среды,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ НССЕРТАЦИН

1. Карабанова О.В. Оптимизация состава питательных сред для культивирования Actmobacillus pleuropneumoniae // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Материалы международной научно-практической конференции. - Щелково, 2003. С. 88 -89.

2. Карабанова О.В. Разработка жидкой и плотной питательных сред с селективными свойствами для культивирования Actitiobacillus pleuropneumoniae // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Материалы международной научно-практической конференции, - Щелково, 2003. С.90 - 92.

3. Скородумов Д.И., Карабанова О.В., Родионова К.П., Костенко Т.С. Дифференциация культур Actinobadllus pleuropneumoniae второго биовара и сходных видов бактерий, выделяемых от убойных свиней // Все о мясе. 2003, № 2. С.37 - 39.

4. Скородумов Д.И., Родионова К.П., Карабанова О.В. Методы лабораторной диагностики пастереллеза и актинобацнллезной пневмонии свиней // Методические указания к лабораторным занятиям для студентов специальности 310800 - Ветеринария. -М.: МГУПБ, 2003,

Подписано в печать 12.01.2004. Печать лазерная.

Объем 1,5 п.л. Тираж ЮОэкз. Заказ .

ГУПП «Печатник», 109316, Москва, ул. Талалихина, 33.